FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO PAPRASTŲJŲ RASAKILŲ (ALCHEMILLA VULGARIS L.) ŽOLĖJE TYRIMAS

Transkriptas

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA VIKTORIJA JAZOVSKYTĖ FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO PAPRASTŲJŲ RASAKILŲ (ALCHEMILLA VULGARIS L.) ŽOLĖJE TYRIMAS Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas: dr. Raimondas Raudonis KAUNAS, 2017

2 2 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA TVIRTINU: Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO PAPRASTŲJŲ RASAKILŲ (ALCHEMILLA VULGARIS L.) ŽOLĖJE TYRIMAS Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas: dr. Raimondas Raudonis 2017 m. Recenzentas: Darbą atliko: Magistrantė Viktorija Jazovskytė 2017 m. KAUNAS, 2017

3 3 TURINYS SANTRAUKA... 5 SUMMARY... 6 SANTRUMPOS... 7 ĮVADAS... 8 DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI LITERATŪROS APŽVALGA Rasakilų (Alchemilla L.) genties apibūdinimas Paprastųjų rasakilų (Alchemilla vulgaris L.) morfologiniai požymiai Rasakilų genties augalų fitocheminė sudėtis Fenolinės rūgštys Flavonoidai Taninai Kiti junginiai Farmakologinės rasakilų genties augalų ekstraktų savybės Fenolinių junginių ekstrakcija Fenolinių junginių nustatymo metodai Literatūros apžvalgos apibendrinimas TYRIMO METODIKA Tyrimo objektas Naudoti reagentai Naudota aparatūra Ekstraktų ruošimo metodika Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu Suminio flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu Fenolinių junginių analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu Statistinis duomenų apdorojimas TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS Ekstrakcijos sąlygų nustatymas Fenolinių junginių nustatymas paprastųjų rasakilų žolės mėginiuose... 29

4 4 3.3 Flavonoidų nustatymas paprastųjų rasakilų žolės mėginiuose Fenolinių junginių įvertinimas paparastųjų rasakilų žolės ekstraktuose ESC metodu IŠVADOS PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS LITERATŪROS SĄRAŠAS... 43

5 5 SANTRAUKA V. Jazovskytės baigiamasis magistro darbas / mokslinis vadovas dr. R. Raudonis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedra. Kaunas. Pavadinimas: fenolinių junginių sudėties įvairavimo paprastųjų rasakilų (Alchemilla vulgaris L.) žolėje tyrimas Raktiniai žodžiai: Alchemilla vulgaris L., paprastoji rasakila, fenoliniai junginiai, flavonoidai, spektrofotometrija, Folin-Ciocalteu. Tyrimo tikslas: ištirti fenolinių junginių sudėties įvairavimą paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiuose, surinktuose vegetacijos periodu ir skirtingose Lietuvos vietovėse. Tyrimo uždaviniai: nustatyti suminio fenolinių junginių kiekio ir suminio flavonoidų kiekio įvairavimą paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiuose vegetacijos periodu; ištirti suminio fenolinių junginių kiekio ir suminio flavonoidų kiekio įvairavimą skirtingose augavietėse surinktuose paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiuose; atlikti fenolinių junginių analizę efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu, įvertinti koreliacinius fenolinių junginių kiekinės sudėties ryšius. Tyrimo objektas ir metodika: objektas paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiai, surinkti vegetacijos periodo metu (n=7) ir iš skirtingų augaviečių (n=13). Suminis fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis nustatytas spektrofotometrijos metodais. Fenolinių junginių kokybinė ir kiekinė analizė atlikta ESC metodu. Tyrimo rezultatai ir išvados: suminis fenolinių junginių kiekis paprastųjų rasakilų antžeminėje dalyje vegetacijos metu įvairavo nuo 53,69 ± 0,98 mg GAE/g iki 71,42 ± 1,43 mg GAE/g, suminis flavonoidų kiekis įvairavo nuo 23,07 ± 0,60 mg RE/g iki 35,22 ± 1,07 mg RE/g. Skirtingose augavietėse rinktuose mėginiuose bendras fenolinių junginių kiekis įvairavo nuo 37,28 ± 0,45 mg GAE/g iki 78,91 ± 1,28 mg GAE/g, bendras flavonoidų kiekis įvairavo nuo 16,32 ± 0,37 mg RE/g iki 33,12 ± 0,95 mg RE/g. ESC metodu nustatyti junginiai: agrimonijinas, katechinas, tilirozidas ir chlorogeno rūgštis. Paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiuose dominuojantys junginiai agrimonijinas ir katechinas. Tarp suminių fenolinių junginių ir flavonoidų kiekių nustatytas vidutinio stiprumo koreliacinis ryšys. Vidutinė koreliacinė priklausomybė apskaičiuota tarp bendro fenolinių junginių kiekio ir agrimonijino kiekio bei tarp bendro flavonoidų kiekio ir katechino kiekio.

6 6 SUMMARY V. Jazovskyte. Master thesis. Supervisor dr. R. Raudonis / Lithuanian University of Health Sciences Faculty of Pharmacy Department of Pharmacognosy. Kaunas. Title: the evaluation of phenolic compounds variability in herb samples of lady s mantle (Alchemilla vulgaris L.) Keywords: Alchemilla vulgaris L., lady s mantle, phenolic compounds, flavonoids, spectrophotometry, Folin-Ciocalteu. Aim: to evaluate the variety of phenolic compounds in lady s mantle samples collected in various habitats of Lithuania and during vegetation period. Objectives: to investigate the total content of phenolic compounds and flavonoids variability in the aerial part samples of lady s mantle during vegetation period; to evaluate the total content of phenolic compounds and flavonoids variability in the aerial part samples of lady s mantle collected in different habitats of Lithuania; to determine the phenolic compounds composition by high-performance liquid chromatography (HPLC); to evaluate correlation between quantitative composition of phenolic compounds. Object and methods: lady s mantle herbal samples collected in various habitats of Lithuania (n=13) and in same habitat during vegetation period (n=7). Total amount of phenolic compounds and flavonoids was performed by using spectrophotometric methods. Qualitative and quantitative analysis of phenolic compounds was carried out by high-performance liquid chromatography. Results and conclusions: the general amount of phenolic compounds in lady s mantle aerial part samples during vegetation period ranged from 53,69 ± 0,98 mg GAE/g to 71,42 ± 1,43 mg GAE/g, while the total flavonoid content varied from 23,07 ± 0,60 mg RE/g to 35,22 ± 1,07 mg RE/g. The general amount of phenolic compounds in lady s mantle aerial part samples collected in different habitats of Lithuania ranged from 37,28 ± 0,45 mg GAE/g to 78,91 ± 1,28 mg GAE/g, while the total flavonoid content varied from 16,32 ± 0,37 mg RE/g to 33,12 ± 0,95 mg RE/g. The following phenolic compounds were determined chromatographically in herb samples: agrimoniin, catechin, tiliroside and chlorogenic acid. In raw material extracts the largest amount was determined agrimoniiin and catechin. Moderately strong correlation was estimated among phenolic compounds and flavonoids content. Moderate correlation relationships were estimated between phenolic compounds and agrimoniin content and between flavonoid and catechin content.

7 7 SANTRUMPOS ALT alaninaminotransferazė AST aspartataminotransferazė DAD diodų matricos detektorius ESC efektyvioji skysčių chromatografija GAE galo rūgšties ekvivalentai p reikšmingumo lygmuo PGE pirogalolio ekvivalentai RE rutino ekvivalentai r s Spirmeno koreliacijos koeficientas UV ultravioletinė spinduliuotė UV VIS ultravioletinės ir regimosios šviesos spinduliuotė

8 8 ĮVADAS Iki chemiškai susintetintų vaistų pasirodymo rinkoje, vaistiniai augalai buvo laikomi svarbiausia gydymo priemone. Prasidėjus cheminių vaistų plėtrai, ženkliai sumažėjo vaistinių augalų panaudojimas medicinoje bei atliekamų mokslinių tyrimų skaičius [65]. Per kelis pastaruosius dešimtmečius augalinės kilmės vaistų ir maisto papildų vartojimas išaugo apie 80 proc. žmonių pasaulyje gydosi augalinės kilmės preparatais [66]. Vaistiniai augalai naudojami arbatų, alkoholinių ekstraktų, tablečių, kapsulių forma [65]. Nors augaliniai vaistai gali sąlygoti nepageidaujamus reiškinius, toksiškumą ir apsinuodijimus [66], tačiau manoma, kad gydymasis augalinės kilmės preparatais yra saugesnis nei chemiškai susintetintais vaistais [65]. Kaip vaistinė augalinė žaliava gydomiesiems tikslams yra naudojama antžeminė paprastųjų rasakilų (Alchemilla vulgaris L.) dalis [8]. Žaliavai būdingas sutraukiantis, antiseptinis [45], kraujavimą stabdantis, priešuždegiminis [46], antioksidantinis poveikis [7,30]. Įvairių šalių tradicinėje medicinoje rasakilomis gydomi ginekologiniai sutrikimai [10], atliekami skalavimai esant burnos gleivinės uždegimui [46]. Išoriškai vaistinė augalinė žaliava naudojama žaizdų ir odos ligų gydymui [10,67]. Paprastųjų rasakilų žolės farmakologinis aktyvumas siejamas su fitochemine sudėtimi taninais, flavonoidais ir fenolinėmis rūgštimis. Biologiškai aktyvių junginių sudėtis, apibūdinanti žaliavų kokybę, gali įvairuoti, priklausomai nuo augalo vegetacijos tarpsnio, augavietės geografinės padėties, išorinių aplinkos veiksnių. Dėl šios priežasties yrs tikslinga atlikti fitocheminius tyrimus, siekiant nustatyti optimalų paprastųjų rasakilų vaistinės augalinės žaliavos rinkimo periodą ir vietoves, kuriose surinkta augalinė žaliava pasižymi didžiausia fenolinių junginių kiekine sudėtimi. Paprastųjų rasakilų antžeminės dalies fitocheminės sudėties tyrimai gali prisidėti prie vaistinės augalinės žaliavos pritaikymo mediciniams tikslams bei naujų augalinių preparatų kūrimo. Darbo naujumas. Pirmą kartą Lietuvoje atlikti suminio fenolinių junginių kiekio ir suminio flavonoidų kiekio įvairavimo tyrimai su paprastųjų rasakilų antžeminės dalies ėminiais, rinktais vegetacijos metu ir skirtingose augimo vietose. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu vykdyta kokybinės ir kiekinės fenolinių junginių sudėties analizė. Įvertinti fenolinių junginių kiekinės sudėties koreliaciniai ryšiai. Darbo tikslas ištirti fenolinių junginių sudėties įvairavimą paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiuose, surinktuose vegetacijos periodu ir skirtingose Lietuvos vietovėse.

9 9 DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI Tikslas: ištirti fenolinių junginių sudėties įvairavimą paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiuose, surinktuose vegetacijos periodu ir skirtingose Lietuvos vietovėse. Uždaviniai: 1. Nustatyti suminio fenolinių junginių kiekio ir suminio flavonoidų kiekio įvairavimą paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiuose vegetacijos periodu. 2. Ištirti suminio fenolinių junginių kiekio ir suminio flavonoidų kiekio įvairavimą skirtingose augavietėse surinktuose paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiuose. 3. Atlikti fenolinių junginių analizę efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. 4. Įvertinti koreliacinius fenolinių junginių kiekinės sudėties ryšius.

10 10 1 LITERATŪROS APŽVALGA 1.1 Rasakilų (Alchemilla L.) genties apibūdinimas Erškėtinių (Rosaceae Juss.) šeima turi genčių, kurioms priklauso rūšių. Į erškėtinių šeimos sudėtį įeina žolės, medžiai ir krūmai [1]. Rasakilų gentis, priklausanti Rosoideae pošeimiui [1,2], yra labai didelė ir sudėtinga taksonominiu požiūriu [3]. Rasakilų gentį pirmasis apibūdino K. Linėjus, išskirdamas tik 3 rūšis A. vulgaris L., A. alpina L. ir A. pentaphyllea L. [2,4]. Pastaruoju metu šiai genčiai priskiriama daugiau nei 1000 rūšių ir mikrorūšių [2], suklasifikuotų į pogenčius, sekcijas, grupes ir pogrupius [5]. Rūšių identifikavimas dėl nedidelių morfologinių skirtumų yra sudėtingas [2]. Rasakilų genties augalai paplitę Europos ir Azijos teritorijoje, Šiaurės Amerikoje bei rytinėje Afrikos dalyje [2,4] (1 pav.). Europoje priskaičiuojama apie 300 rūšių, iš kurių dauguma yra paprastosios rasakilos mikrorūšys [2]. Lietuvoje yra apie 20 rasakilų rūšių, kurias sunku identifikuoti, tačiau, kaip vaistinė augalinė žaliava, tinkama visų rūšių antžeminė dalis [6]. Paprastoji rasakila (A. vulgaris L.; sinonimas A. xanthochlora Rothm.) yra žinomiausias ir dažniausiai naudojamas augalas rasakilų gentyje [7], įtrauktas į Europos farmakopėją 8.0 [8]. 1 pav. Rasakilų (Alchemilla L). genties augalų paplitimas [4]

11 Paprastųjų rasakilų (Alchemilla vulgaris L.) morfologiniai požymiai Paprastoji rasakila daugiametis žolinis augalas, užaugantis nuo 10 iki 50 cm aukščio [9]. Augalo stiebas pilkšvai žalias arba gelsvai žalias, plaukuotas, tuščiaviduris. Pamatiniai lapai pilkšvai žalios, vietomis rusvai žalios spalvos, inkstiški arba pusrutuliški, paprastai 8 cm skersmens, retais atvejais iki 11 cm, turintys 7-9 arba 11 skiaučių. Viršutiniai lapai smulkesni, susideda iš 5-9 skiaučių, turi porą stambių prielapių, prisitvirtinusių prie pagrindo. Lapų kraštai dantyti, apatinis paviršius padengtas tankiais plaukeliais. Jauni lapeliai apaugę balkšvai sidabriniais plaukeliais, senesni lapai šiek tiek plaukuoti, apatiniame jų paviršiuje matomas gyslotumas. Pamatiniai lapai turi ilgą lapkotį, viršutiniai trumpą arba yra bekočiai. Lapkočiai žali arba geslvai žali, plaukuoti, 1 mm skersmens. Žiedai smulkūs, apie 3 mm skersmens, gelsvai žalios arba šviesiai žalios spalvos, turintys 4 trumpus kuokelius ir 1 piestelę [8]. Paprastoji rasakila yra Lietuvoje dažnas augalas, aptinkamas pievose, mišriuose spygliuočių ir plačialapių medžių miškuose, pamiškėse, paupiuose. Mėgsta drėgmę, tačiau auga įvairaus drėgnumo vietovėse. Palankiausia dirvožemio mechaninė sudėtis priemolis arba molis, neutralios arba šarminės reakcijos. Augalas gali augti tiek saulėtoje vietoje, tiek daliniame pavėsyje [9,10]. Kaip vaistinė žaliava yra naudojama žydėjimo fazėje surinkta ir išdžiovinta antžeminė A. vulgaris L. dalis [8]. Paprastųjų rasakilų žydėjimo periodas apima gegužės spalio mėnesius, tačiau intensyviausias žydėjimas vyksta birželį [9,10]. Nupjauta žolė džiovinama pavėsyje, saugant nuo tiesioginių saulės spindulių, arba džiovyklose, esant o C temperatūrai. Vaistinei augalinei žaliavai būdingas higroskopiškumas, todėl rekomenduojama laikyti sandariai uždarytuose stikliniuose arba mediniuose induose [10]. 1.3 Rasakilų genties augalų fitocheminė sudėtis Rasakilų genties augalai kaupia fenolinius junginius taninus, flavonoidus ir fenolines rūgštis [11,12]. Fenoliniai junginiai sintezuojami augaluose kaip gynybos priemonė nuo ekologinio ir fiziologinio streso, pavyzdžiui, patogeninių mikroorganizmų (bakterijų, grybų), vabzdžių, UV spinduliuotės ar sužeidimų [13,14]. Fenoliniams junginiams būdinga struktūra aromatinių žiedų sistema su

12 12 lokalizuotomis hidroksilo grupėmis [14]. Fenoliniai junginiai randami konjuguotose formose, prisijungę vieną ar daugiau cukraus liekanų per hidroksilo grupes [15]. Fenolinių junginių sudėtis gali kisti priklausomai nuo rasakilų genties rūšies [11,16-18], augalo vegetacijos tarpsnio [19,20], klimatinių veiksnių drėgmės ir saulės spindulių kiekio [19] bei temperatūros [20]. Aukštesnė temperatūra lemia didesnį fenolinių junginių kiekį [20] Fenolinės rūgštys Struktūra ir savybės. Fenolinės rūgštys yra itin plačiai augalų karalystėje paplitę antriniai metabolitai [15,21,22]. Cheminės struktūros pagrindu fenolinės rūgštys klasifikuojamos į dvi klases: hidroksicinamono rūgštys ir hidroksibenzenkarboksirūgštys [15,21]. Į hidroksicinamono rūgščių sudėtį įeina 9 anglies atomai (C6-C3), hidroksibenzenkarboksirūgštys turi trumpesnę anglies atomų grandinėlę, susidedančią iš 7 atomų (C6-C1). Esant klasėms būdingai skeletinei struktūrai, individualius fenolinių rūgščių skirtumus lemia hidroksilo ir metoksilo grupių skaičius ir išsidėstymas aromatiname žiede (1 ir 2 lentelė) [21]. Antioksidantinis fenolinių rūgščių aktyvumas yra susijęs su hidroksilo grupių skaičiumi ir padėtimi molekulėje. Hidroksicinamono rūgščių antioksidantinis potencialas didėja įvedus antrą hidroksilo grupę į orto arba para poziciją, taip pat įvedus vieną ar dvi metoksilo grupes į orto poziciją prie hidroksilo grupės [23]. Fenolinės rūgštys augaluose retai sutinkamos laisvoje formoje, dažniausiai suformuoja esterių, glikozidų ar amidų darinius [13,22]. Hidroksicinamono rūgštys randamos esterių su gliukoze arba karboksirūgštimis (vyno, chino, šikimo) pavidalu. Rozmarino rūgštis yra kavos rūgšties ir 3,4- dihidroksifenilpieno rūgšties esteris [21], chlorogeno rūgštis kavos ir chino rūgščių esteris [22]. Hidroksibenzenkarboksirūgštis galo rūgštis yra struktūrinė hidrolizuojamų taninų (galotaninų ir elagitaninų) dalis [14,21]. Sudėtis. Paprastųjų rasakilų antžeminėje dalyje identifikuotos hidroksibenzenkarboksirūgštys: galo rūgštis [16,19,24-26], protokatecho rūgštis, gentiso rūgštis, salicilo rūgštis, siringo rūgštis [16], vanilino rūgštis [16,26] ir hidroksicinamono rūgštys: sinapo rūgštis, p-kumaro rūgštis [24], kavos rūgštis [16,26], ferulo rūgštis [26], chlorogeno rūgštis [19,24,26], rozmarino rūgštis [24]. Bulgarijos mokslininkų nustatytas fenolinių rūgščių kiekis A. glabra Neygenf. žolės ekstraktuose yra 4,29 mg/g [27].

13 13 1 lentelė. Hidroksicinamono rūgščių struktūra [57] 2 lentelė. Hidroksibenzenkarboksirūgščių struktūra [57] Pavadinimas R1 R2 R3 R4 Cinamo r. H H H H o-kumaro r. OH H H H m-kumaro r. H OH H H p-kumaro r. H H OH H Ferulo r. H OCH 3 OH H Sinapo r. H OCH 3 OH OCH 3 Kavos r. H OH OH H Pavadinimas R1 R2 R3 R4 Benzoinė r. H H H H p-hidroksibenzoinė r. H H OH H Vanilino r. H OCH 3 OH H Galo r. H OH OH OH Protokatecho r. H OH OH H Siringo r. H OCH 3 OH OCH 3 Gentiso r. OH H H OH Veratro r. H OCH 3 OCH 3 H Salicilo r. OH H H H Flavonoidai. Struktūra ir savybės. Flavonoidai yra gausiausia fenolinių junginių klasė [21]. Flavonoidų skeletinė struktūra susideda iš 15 anglies atomų, išdėstytų C6-C3-C6 konfigūracija [28], kurioje du benzeno žiedai sujungti trijų anglies atomų grandinėle, sudarančia uždarą pirano žiedą [14,21]. Remiantis cheminės struktūros ypatumais, flavonoidai skirstomi į 6 subklases: flavonai, flavanonai, flavonoliai, flavanoliai, izoflavonoidai, antocianinai [14,15,21,23]. Individualios flavonoidų struktūrinės variacijos priklauso nuo hidroksilinimo, metoksilinimo, prenilinimo ir glikozilinimo laipsnio [29]. Flavonoidai gali būti laisvoje formoje arba kaip glikozidai dauguma jų yra O glikozidai, bet taip pat žinomas didelis skaičius C glikozidų. O glikozidų struktūroje angliavandenių molekulės prisijungusios prie aglikono hidroksilo grupės 3 arba 7 padėtyje, C glikozidų struktūroje prie aglikono C6 arba C8 atomo. Dažniausiai flavonoidų glikoziduose esantys angliavandeniai gliukozė, ramnozė, galaktozė, arabinozė [21].

14 14 Sudėtis. Paprastųjų rasakilų antžeminėje dalyje identifikuoti flavonoidai ir jų glikozidai: kvercetinas [24,30], kvercetino dariniai: kvercetin-3-o-rutinozidas (rutinas) [24,26,30,31], kvercetin-3-ogliukozidas (izokvercetinas) [31], kvercetin-3-o-arabinofuranozidas (avikuliarinas) [31], kitose rūšyse: kvercetin-3-o-galaktozidas (hiperozidas) [17,18,32,33], kvercetin-3-o-ramnozidas (kvercitrinas) [17,18,32]. Nustatyti kitos struktūros flavonoidai paprastųjų rasakilų žaliavose: kempferolis [24,30], kempferolio darinys kempferol-3-o-(6-p-kumaroil)-gliukozidas (tilirozidas) [31], miricetinas [24], liuteolinas, genisteinas, daidzeinas [24], epikatechinas [24,27], katechinas [27], kitose rūšyse: liuteolin-8- C-gliukozidas (orientinas) [17,18,32], apigenin-8-c-gliukozidas (viteksinas) [17,18,32]. Įvertinta A. vulgaris L. flavonoidų glikozidų kiekinė sudėtis 2,2 2,5 proc. lapuose, 1,0 1,9 proc. žieduose [3] Taninai. Struktūra ir savybės. Taninai sudaro didelę polifenolinių junginių grupę [29]. Šių junginių buvimas augaluose siejamas su gynybos mechanizmu prieš patogenus ir žoliaėdžius [35]. Taninai klasifikuojami į hidrolizuojamus ir kondensuotus taninus. Hidrolizuojamų taninų struktūrą sudaro gliukozės esteriai su galo rūgštimi (galotaninai) arba su heksahidroksifeniline rūgštimi (elagitaninai). Kondensuoti taninai yra flavan-3-olių (katechinų) darinių dimerai arba oligomerai. Jie taip pat vadinami proantocianidinais dėl skilimo į antocianidinus rūgštimi katalizuojamos oksidacijos reakcijos metu, kaitinant parūgštintus alkoholinius tirpalus [29]. Katechinai struktūriškai nuo kitų flavonoidų grupių skiriasi tuo, kad neturi dvigubos jungties tarp C2-C3 bei prie C4 karbonilo grupės [36]. Taninams būdingas kompleksinių junginių su baltymais, makromolekulėmis, smulkiais katijonais, baziniais junginiais, pigmentais ir metalų jonais suformavimas [35,37]. Šios savybės grindžiamos polihidroksiline taninų struktūra [37]. Cheminė taninų struktūra atsakinga už antioksidantinį aktyvumą kelių hidroksilo grupių buvimas orto padėtyje lemia gebėjimą neutralizuoti laisvuosius radikalus. Antioksidantinis elagitaninų efektyvumas tiesiogiai koreliuoja su hidroksilinimo laipsniu ir mažėja, didėjant cukraus fragmentų kiekiui [38]. Sudėtis. Taninų kiekinė sudėtis paprastųjų rasakilų žolėje paprastai svyruoja nuo 5 proc. iki 8 proc.. Europos farmakopėja reikalauja ne mažiau 6 proc. taninų koncentracijos antžeminėje A. vulgaris L. dalyje. Didžiausia taninų koncentracija nustatyta augalo žydėjimo periodu [3]. Rasakilų žaliavose identifikuoti elagitaninai: pedunkulaginas, agrimonijinas [19,39], levitaginas F. Nustatyta, kad agrimonijinas yra vyraujantis elagitaninas A. xanthochlora Rothm. antžeminės dalies ekstraktuose [39].

15 Kiti junginiai Eteriniai aliejai. Eterinio aliejaus kompozicija ištirta tik A. alpina L. ir A. xanthochlora Rothm. žaliavose. Antžeminėje A. xanthochlora Rothm. dalyje didžiausias kiekis rastas cis-3-heksenolio (11,20 ± 0,02 proc.), linalolio (10,36 ± 0,75 proc.), okt-1-en-3-olio (8,98 ± 1,43 proc.), nonanalio (7,83 ± 0,93 proc.), mažesni kiekiai mirtenolio (4,65 ± 0,40 proc.), heksadekano rūgšties (4,59 ± 0,79 proc.), cis-3- heksenil acetato (3,92 ± 0,15 proc.), α-terpineolio (3,10 ± 0,26 proc.) [40]. Antžeminėje A. alpina L. dalyje didžiausią dalį eterinių aliejų sudarė terpenai (36,87 proc.), alkoholiai (30,57 proc.) ir aldehidai (15,36 proc.). Didžiausias kiekis nustatytas α-terpineolio (12,55 proc.), linalolio (11,03 proc.), (Z)-3-heksenolio (10,23 proc.), 2-feniletanolio (9,48 proc.), benzilo alkoholio (6,54 proc.), nonanalio (5,42 proc.), β-pineno (3,47 proc.) [41]. Aminorūgštys. A. flabelata Bus., A. subcrenata Bus. ir A. phegophila Juz. žolėje nustatyta 17 aminorūgščių, iš kurių daugiausia asparto rūgšties, glicino, serino, alanino, mažesni kiekiai treonino, glutamo rūgšties, arginino, histidino, izoleucino, fenilalanino, valino, leucino, prolino, metionino, asparagino, lizino, cisteino [42]. 1.4 Farmakologinės rasakilų genties augalų ekstraktų savybės Rasakilų žolė vartojama įvairių šalių liaudies medicinoje [43-45]. Vaistinei augalinei žaliavai būdingas sutraukiantis, antiseptinis [45], kraujavimą stabdantis, priešuždegiminis [46] bei antioksidantinis poveikis [7,30]. Tradicinėje medicinoje rasakilos vartojamos įvairiems ginekologiniams sutrikimams malšinti menoragijai [45-47], dismenorėjai [44], taip pat menopauzės simptomų lengvinimui [34]. Rasakilų žole gydomi virškinamojo trakto sutrikimai [10], atliekami skalavimai esant burnos gleivinės uždegimui, stabdomas kraujavimas iš nosies [46]. Išoriškai vaistinė augalinė žaliava naudojama žaizdų ir odos ligų gydymui [10,67]. Su paprastųjų rasakilų žaliava yra atlikta nedaug farmakologinio poveikio tyrimų, todėl šioje literatūros apžvalgoje nuspręsta apžvelgti tyrimus, atliktus ir su kitomis Alchemilla L. genties rūšimis. Antibakterinis poveikis. Denev et al. mikrobiologiniuose tyrimuose įvertino acetoninių A. glabra Neygenf. žolės ekstraktų antibakterinį poveikį. Tyrimų rezultatai parodė, kad A.glabra Neygenf. ekstraktai neinhibuoja Salmonella, Listeria monocytogenes ir Pseudomonas aeroginosa augimo, tačiau net

16 16 mažiausia koncentracija efektyviai slopina Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Proteus vulgaris G, Klebsiella pneumoniae ir Candida albicans dauginimąsi. Antimikrobinis veikimas prieš Staphylococcus aureus ATCC ir Escherichia coli buvo silpnas. ESC metodu nustatyta fenolinių junginių kompozicija galo rūgštis, 3,4-hidroksibenzoinė rūgštis, chlorogeno rūgštis, kavos rūgštis, katechinas, epikatechinas ir rutinas [27]. Barbour et al. atlikto tyrimo metu buvo įrodytas A. diademata Rothm. antžeminės dalies metanolinių ir vandeninių ekstraktų antimikrobinis potencialas prieš Staphylococcus aureus [48]. Keskin et al. atliktame tyrime paprastųjų rasakilų lapų etanoliniai ekstraktai parodė antibakterinį aktyvumą prieš Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Kocuria rhizophila, Proteus vulgaris, Enterococcus faecalis, Candida albicans [49]. Hepatoprotekcinis poveikis. Ozbek et al. tyrė metanolinių švelniųjų rasakilų (A.mollis L.) žolės ekstraktų hepatoprotekcinį poveikį, atlikdami kepenų fermentų alaninaminotransferazės (ALT) ir aspartataminotransferazės (AST) koncentracijos pelių kraujo serume matavimus. Naudojant 100 mg/kg ir 200 mg/kg švelniųjų rasakilų ekstraktų dozes, nustatytas reikšmingas ALT kiekio kraujo serume sumažėjimas, siejamas su heptoprotekciniu aktyvumu. Manoma, kad už šį poveikį atsakingi fenoliniai junginiai, ypač flavonoidai, kurie pasižymi stipriomis antioksidantinėmis savybėmis [50]. Priešuždegiminis poveikis. Shrivastava et al. atliktame tyrime buvo vertinamas 3 proc. paprastųjų rasakilų ekstrakto ir glicerolio gelio gydomasis poveikis stomatitui. Nustatyta, kad, naudojant A. vulgaris L. ir glicerolio gelį, per 3 dienų laikotarpį pasveiko 36 iš 48 pacientų (75 proc.). Taikant įprastus gydymo metodus, per 3 dienas pasveiko 16 iš 40 pacientų (40 proc.), netaikant gydymo 16 iš 48 pacientų (33,3 proc.). Tyrimo metu patvirtintas didelis paprastųjų rasakilų ekstrakto efektyvumas gydant stomatitą. Šis farmakologinis poveikis priskiriamas ESC metodu nustatytiems junginiams taninams (0,08 proc.), kvercetinui (0,02 proc.), liuteolinui (0,0002 proc.) [51]. Oz et al. atliktas tyrimas su pelėmis įrodė metanolinių A. mollis Rothm. ir A. persica Rothm. žolės ekstraktų priešuždegiminį aktyvumą, dozuojant 200 mg/kg. Nustatytas reikšmingas abiejų ekstraktų žaizdas gydantis poveikis, siejamas su gausia polifenoline sudėtimi, ypač flavonoidais hiperozidu ir izokvercetinu [52]. Priešvėžinis poveikis. Turk et al. atliko tyrimus in vitro, siekdami nustatyti etanolinių A. erythropoda Juz., A. ikizdereensis Kalheber, A. oriturcica B. Pawl. ir A. trabzonica Hayırlıglı-Ayaz et Beyazoğlu lapų ekstraktų poveikį vėžinėms ląstelėms. Didžiausiu priešvėžiniu aktyvumu dėl veiksmingos vėžinių ląstelių apoptozės ir nekrozės pasižymėjo A. trabzonica Hayırlıglı-Ayaz et Beyazoğlu ekstraktas, kuriame plonasluoksnės chromatografijos metodu buvo identifikuoti flavonoidai hiperozidas, izokvercetinas ir kvercitrinas [32].

17 17 Endometriozės gydymas. Akkol et al. tyrė metanolinių A. mollis L. ir A. persica Rothm. žolės ekstraktų potencialą gydant endometriozę. Tyrimuose su žiurkėmis atliktas histopatologinis cistų formavimosi vertinimas ir citokinų kiekio nustatymas pilvaplėvės skystyje. A. mollis L. antžeminės dalies ekstraktai reikšmingai sumažino cistų formavimąsi ir citokinų kiekį, vartojant 100 mg/kg. A.persica Rothm. žolės ekstraktai silpniau slopino cistų augimą ir reikšmingai nesumažino citokinų koncentracijos. Chromatografinė analizė parodė, kad abiejuose ekstraktuose yra flavonoidų hiperozido ir kvercetino, tačiau didesnis kiekis nustatytas A. mollis L. žolės ekstrakte [33]. Neuroprotekcinis poveikis. Neagu et al. atliko tyrimą in vitro, kurio tikslas buvo įvertinti vandeninių ir etanolinių paprastųjų rasakilų žolės ekstraktų inhibicinį poveikį fermentams acetilcholinesterazei ir tirozinazei. Šių fermentų inhibavimas siejamas su neurodegeneracinių procesų slopinimu. Nustatyta, kad A. vulgaris L. ekstraktams būdingas stiprus acetilcholinesterazę ir tirozinazę inhibuojantis veikimas, už kurį atsakingi flavonoidai, taninai ir fenolinės rūgštys. Etanoliniai ekstraktai pasižymėjo stipresniu poveikiu ir didesne fenolinių junginių išeiga. Dėl neurodegeneraciją slopinančio efekto, vaistinė augalinė žaliava gali būti pritaikyta kuriant naujus vaistinius preparatus, skirtus Alzheimerio ir Parkinsono ligų gydymui [24]. Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai. Plotnikov et al. atliko tyrimą su žiurkėmis, siekdami nustatyti paprastųjų rasakilų ekstrakto poveikį eritrocitų membranų struktūrai ir funkcijai, esant arterinei hipertenzijai ir padidėjusiam kraujo klampumui. Įvertinus morfologines eritrocitų savybes ir lipidų kompoziciją membranose, buvo nustatyta, kad, vartojant 300 mg/kg dozę, reikšmingai padidėjo fosfolipidų koncentracija eritrocitų membranose (28 proc.) ir sumažėjo negrįžtamai modifikuotų eritrocitų santykis. Tyrimo metu įrodytas paprastųjų rasakilų poveikis eritrocitams gali lemti kraujo klampumo ir trombozės rizikos sumažėjimą. Anot autorių, šios farmakologinės A. vulgaris L. ekstraktų savybės priskirtinos flavonoidams [53]. Takir et al. atliko tyrimą su žiurkėmis, kurio metu buvo nustatytas vazorelaksacinis metanolinių ir vazokonstrikcinis vandeninių paprastųjų rasakilų žolės ekstraktų aktyvumas. Poveikis kraujagyslių tonusui gali būti susijęs su fenolinių junginių sudėtimi. Metanoliniai paprastųjų rasakilų ekstraktai pasižymėjo didesniu suminiu flavonoidų ir kvercetino kiekiu, vandeniniai didesniu galo rūgšties kiekiu [54]. Kitame tos pačios mokslininkų grupės tyrime su žiurkėmis įrodytas A. vulgaris L. žolės metanolinių ekstraktų sistolinį kraujo spaudimą mažinantis poveikis, skiriant 300 mg/kg dozę per os [55]. Tyrimų metu nustatytas farmakologinis veikimas gali lemti augalinės žaliavos pritaikymą gydant su kardiovaskuline sistema susijusius sutrikimus, ypač hipertenziją [54-55]. Antivirusinis poveikis. Makau et al. atlikto tyrimo tikslas buvo įvertinti švelniųjų rasakilų antžeminės dalies vandeninių, etanolinių ir šarminių ekstraktų antivirusinį aktyvumą prieš gripo viruso A

18 18 padermes. Šarminiai švelniųjų rasakilų ekstraktai pasižymėjo didžiausiu antivirusiniu potencialu. Inhibicinis poveikis gripo viruso replikacijai užfiksuotas esant 0,12 proc. ekstrakto koncentracijai, citotoksiškumas nuo 2,5 proc.. A.mollis L. ekstraktai parodė sinergistinį poveikį su zanamiviru, kuris vartojamas gripo gydymui. Autoriai padarė prielaidą, kad už farmakologinį poveikį atsakingi flavonoidų glikozidai (izokvercitrinas, hiperozidas), nes taninai nestabilūs šarminėje terpėje [56]. Apibendrinant apžvelgtus tyrimus galima teigti, kad Alchemilla L. genties augalų ekstraktų farmakologinį poveikį nulemia fenoliniai junginiai flavonoidai, taninai ir fenolinės rūgštys. 1.5 Fenolinių junginių ekstrakcija Norint ištirti fenolinius junginius, pirmiausia vykdoma jų ekstrakcija iš vaistinės augalinės žaliavos. Fenoliai gali būti išgaunami iš šviežios, šaldytos bei džiovintos žaliavos. Prieš atliekant ekstrakciją, augalinės žaliavos mėginiai yra homogenizuojami sumalant arba sutrinant. Kadangi ekstrakcija tirpikliais yra nesudėtingas ir efektyvus metodas, todėl pasižymi plačiu pritaikymu [29]. Ekstrakcijos išeigą įtakojantys veiksniai yra temperatūra, ekstrakcijos trukmė, tirpiklio ir mėginio santykis [13,29,57]. Ekstrakcijai vykdyti gali būti pasirenkami įvairūs metodai Soksleto aparatu, mikrobangomis, ultragarsu, superkritiniais skysčiais [29,57]. Nuo ekstrakcijos metodo priklauso fenolinių junginių išeiga bei proceso greitis. Trendafilova et al. atliko tyrimą su švelniųjų rasakilų žole, kuriame palygino skirtingų ekstrakcijos metodų įtaką biologiškai aktyvių medžiagų išeigai, naudojant ekstrahentu 70 proc. (v/v) etanolį. Didesnis suminis fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis buvo gautas ekstrakciją vykdant ultragarsu 30 min. arba mikrobangomis 20 s, lyginant su 24 val. maceracija. Šio tyrimo metu padaryta išvada, kad ekstrakcijos ultragarsu ir mikrobangomis metu ne tik gaunama didesnė fenolinių junginių išeiga, tačiau šie metodai yra pranašesni už maceraciją dėl paprastos technologijos, trumpos trukmės, saugumo aplinkai [58]. Tirpiklio ir jo koncentracijos pasirinkimas įtakoja polifenolinių junginių ekstrakcijos greitį ir išekstrahuotų junginių kiekį [29]. Dažniausiai naudojami ekstrahentai alkoholiai (metanolis, etanolis, propanolis), acetonas, dietilo eteris, etilo acetatas bei jų mišiniai įvairiais santykiais su vandeniu, taip pat vanduo [13,29,57]. Metanolis yra tinkamas norint išekstrahuoti nedidelės molekulinės masės fenolinius junginius, o didesnės molekulinės masės junginiai ekstrahuojami vandens ir acetono mišiniu. Etanolis tinkamas solventas, ypač todėl, kad yra netoksiškas ir saugus [29]. Vaher et al. metanoliniuose paprastųjų

19 19 rasakilų ekstraktuose nustatė 6,5 karto didesnį suminį fenolinių junginių kiekį, lyginant su vandeniniais ekstraktais (atitinkamai 3,11 g GAE/l ir 0,48 g GAE/l) [59]. Atliktas tyrimas su švelniųjų rasakilų antžeminės dalies ekstraktais parodė etanolio koncentracijos įtaką suminiam fenolinių junginių ir taninų kiekiui. Didžiausia fenolinių junginių ir taninų išeiga gauta ekstrahuojant proc. (v/v) etanolio ir vandens mišiniu. Ekstrakciją vykdant 90 proc. (v/v) etanoliu gauta mažiausia fenolinių junginių išeiga [60]. Kito panašaus tyrimo metu įvertinta fenolinių rūgščių, flavonoidų ir suminio fenolinių junginių kiekio priklausomybė nuo etanolio koncentracijos. Didžiausias junginių kiekis gautas ekstrahentu naudojant proc. (v/v) etanolio ir vandens mišinį, mažiausias 90 proc (v/v) [61]. Temperatūros padidinimas ekstrakcijos metu gali sąlygoti didesnę fenolinių junginių išeigą. Aukštesnėje temperatūroje sumažėja tirpiklio klampumas, paviršiaus įtemptis, kyla fenolinių junginių tirpumas, todėl efektyviau vyksta ekstrakcijos procesas [29]. Atlikti tyrimai su A.mollis L. žolės ekstraktais parodė, kad keliant temperatūrą nuo 15 o C iki 90 o C, fenolinių rūgščių, flavonoidų ir taninų išeiga didėja [62]. Tačiau dauguma junginių lengvai oksiduojasi ir hidrolizuojasi, todėl, dėl ilgo ekstrakcijos proceso aukštoje temperatūroje, fenolinių junginių išeiga mažėja. Pasirenkant ekstrakcijos sąlygas yra svarbu užtikrinti fenolinių junginių stabilumą [29]. 1.6 Fenolinių junginių nustatymo metodai Kiekybiniam fenolinių junginių nustatymui augalinėje žaliavoje gali būti taikomas spalvinis Folin-Ciocalteu metodas [63]. Jis grindžiamas fenolinių grupių reakcija šarminėje terpėje su fosforo ir volframo rūgščių reagentu, susidarant kompleksui, turinčiam mėlyną spalvą. Susidariusio komplekso absorbcija matuojama spektrofotometru, esant 765 nm bangos ilgiui. Fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GAE), remiantis galo rūgšties kalibracine kreive [64]. Pastaruosius kelis dešimtmečius atvirkščių fazių efektyvioji skysčių chromatografija yra dominuojantis fenolinių junginių analizės metodas [57]. Remiantis literatūros šaltinių duomenimis, fenolių išskyrimui naudojama C 18 kolonėlė, o kaip mobili fazė acetonitrilas ir metanolis, daugeliu atvejų parūgštinant acto ar skruzdžių rūgštimis, siekiant išvengti jonizacijos (rekomeduojamas ph diapazonas 2-4) [29]. Dažniausiai fenolinių junginių nustatymas vyksta naudojant masių spektromertijos metodą arba diodų matricos detektorių [36], tačiau taip pat taikomi ultravioletiniai regimosios šviesos detektoriai, fotodiodų matricos detektoriai, ultravioletiniai fuorescenciniai detektoriai [29,57]. 3 lentelėje pavaizduota ESC metodika, taikyta fenolinių junginių analizei su įvairių rasakilų rūšių ekstraktais.

20 20 3 lentelė. ESC metodika fenolinų junginių nustatymui įvairių rasakilų rūšių ekstraktuose Ekstraktai Kolonėlė; injekcijos tūris; mobili fazė; tėkėjimo greitis; eliuicija Detektorius Šaltinis Metanoliniai Kolonėlė: C18; mobili fazė: metanolis/vanduo (50:50); tekėjimo greitis: 2.5 ml/min. Vandeniniai ir Kolonėlė: C18 (100 mm 2.1mm); mobili fazė: forminė etanoliniai rūgštis/vanduo (A), forminė rūgštis/acetonitrilas (B); tekėjimo greitis: 0 5min 0.1ml/min; min 0.2 ml/min; min 0.1 ml/min; min 0.2 ml/min; min 0.1 ml/min; eliuicija: gradientinė 0 min 5proc. B; min 5 30 proc. B; min 30 proc. B; min proc. B; min 50-5 proc. B. Etanoliniai Kolonėlė: C18 (5 µm, 4,6 mm x 250 mm); injekcijos tūris: 10 μl; mobili fazė: acto rūgštis/metanolis/vanduo (5:36:59); tekėjimo greitis: 1 ml/min. Acetoniniai Kolonėlė: C18 (5 µm, 4,6 mm x 250 mm); mobili fazė: 0,5 proc. acto rūgštis/100 proc. acetonitrilas; tekėjimo greitis: 0,8 ml/min. - Kolonėlė: C18 (150 x 4.6 mm), injekcijos tūris: 5μl; mobili fazė: acetonitrilas/fosfatinis buferis 40:60 (ph 2.5); metanolis/fosfatinis buferis 45:55; tekėjimo greitis: 1 ml/min. Metanoliniai Kolonėlė: C18 (250 mm x 4.6 mm; 5 µm); mobili fazė: acetonitrilas (A) ir 0.2 proc. fosforo rūgšties (B); injekcijos tūris: 10 μl; tekėjimo greitis: 0.5 ml/min; eliuicija: izokratinė, pradžia A:B (8:92, v/v), 0-10 min. A:B (18:82, v/v), min. A:B (20:80, v/v), min. (25:75, v/v), min. A:B (30:70 v/v), min A:B (100:0, v/v), min A:B (100:0, v/v). - [31] MS [24] UV-Vis [18] UV-Vis [27] UV-Vis [30] DAD [33] 1.7 Literatūros apžvalgos apibendrinimas Mokslinėje literatūroje nurodoma, kad į rasakilų antžeminės dalies sudėtį įeinantys fenoliniai junginiai yra elagitaninai, fenolinės rūgštys, flavonoidai kvercetinas ir kempferolis bei flavonoidų glikozidai. Biologiškai aktyvūs junginiai nulemia rasakilų ekstraktų farmakologinį aktyvumą, pasireiškiantį antimikrobiniu, priešuždegiminiu, priešvėžiniu, neuroprotekciniu ir hepatoprotekciniu veikimu. Norint išskirti fenolinius junginius iš vaistinės augalinės žaliavos, reikia parinkti optimalias ekstrakcijos sąlygas (tirpiklio koncentraciją, ekstrakcijos trukmę), kurioms esant gaunama didžiausia

21 21 fenolinių junginių išeiga. Suminiam fenolinių junginių kiekiui paprastųjų rasakilų ekstraktuose įvertinti gali būti taikomas spektrofotometrinis metodas, naudojant Folin-Ciocalteu reagentą. Individualių fenolinių junginių kokybinė ir kiekinė analizė atliekama greitu ir tiksliu efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

22 22 2 TYRIMO METODIKA 2.1 Tyrimo objektas Tyrimai atlikti su paprastųjų rasakilų antžeminės dalies žaliava, surinkta: 2015 metais Bačiūnų rajone, Šiaulių mieste. Vegetacijos fazė ir rinkimo data: 1. Augimo tarpsnis ( ); 2. Augimo tarpsnis ( ); 3. Butonizacija ( ); 4. Žydėjimo pradžia ( ); 5. Intensyvus žydėjimas ( ); 6. Žydėjimo pabaiga ( ); 7. Vaisių nokimas ( ) metais nuo birželio pabaigos iki liepos vidurio iš 13 Lietuvos augaviečių. Rinkimo vieta ir data: 1. Puskelnių kaimo apylinkės, Marijampolės rajonas ( ); 2. Ąžuolyno parkas, Kauno miestas ( ); 3. Zarasų miesto apylinkės ( ); 4. Jūkainių miškas, Raseinių rajonas ( ); 5. Gailiūnų kaimo apylinkės, Druskininkų rajonas ( ); 6. Maigų miškas, Mažeikių rajonas ( ); 7. Tyrulių parkas, Radviliškio rajonas ( ); 8. Karklės miškas, Klaipėdos rajonas ( ); 9. Trakų miesto apylinkės ( ); 10. Bijeikių kaimo apylinkės, Anykščių rajonas ( ); 11. Molėtų miesto apylinkės ( ); 12. Kalnelio parkas, Joniškio rajonas ( ); 13. Burbiškio parkas, Anykščių rajonas ( ). Apytikslės paprastųjų rasakilų augimo vietos pateiktos 2 paveiksle.

23 23 2 pav. Apytikslės paprastųjų rasakilų augavietės ( 2.2 Naudoti reagentai Išgrynintas vanduo ( Millipore, JAV); etanolis 96,3 proc. (v/v) (,,Vilniaus degtinė, Lietuva); galo rūgšties monohidratas ( Sigma-Aldrich, Vokietija); Folin-Ciocalteu reagentas ( Sigma-Aldrich, Vokietija); natrio karbonatas ( Sigma-Aldrich, Vokietija); aliuminio chlorido heksahidratas ( Sigma- Aldrich, Vokietija); acto rūgštis ( Sigma-Aldrich, Vokietija); rutino trihidratas ( ROTH, Vokietija); heksametilentetraminas ( Alfa Aesar, JAV), acetonitrilas ( Sigma-Aldrich, Šveicarija); trifluoracto rūgštis ( Sigma-Aldrich, Šveicarija). 2.3 Naudota aparatūra Paprastųjų rasakilų (A. vulgaris L.) žaliava ir tyrimams reikalingi reagentai pasverti analitinėmis svarstyklėmis,,sartorius CP64-0CE (Vokietija). Ekstraktų paruošimui naudota ultragarso vonelė Elmasonic P (Vokietija). Kiekybinis fenolinių junginių ir flavonoidų nustatymas atliktas spektrofotometru,,spectronic Camspec M550 (Anglija). Chromatografinė fenolinių junginių analizė

24 24 atlikta chromatografu Waters Alliance e2695 (JAV) su diodų matricos detektoriumi Waters 2998 PDA. Duomenys apdoroti Empower 3 programine įranga (JAV). 2.4 Ekstraktų ruošimo metodika Ekstraktai gaminami atsvėrus 0,25 g susmulkintos paprastųjų rasakilų žaliavos ir užpylus 25 ml 70 proc. (v/v) etanoliu. Ekstrahuojama ultragarso vonelėje 20 min., ekstraktai filtruojami į stiklinius buteliukus. Ruošiama po 3 ekstraktus iš kiekvieno vaistinės augalinės žaliavos mėginio. 2.5 Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu Suminio fenolinių junginių kiekio paprastųjų rasakilų žolėje nustatymui taikytas spektrofotometrinis metodas, naudojant Folin-Ciocalteu reagentą. Tiriamasis tirpalas. 0,25 ml augalinės žaliavos ekstrakto, praskiesto santykiu 1:10, sumaišoma su 1,25 ml darbinio Folin-Ciocalteu reagento ir pridedama 1 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo. Tiriamasis tirpalas laikomas 1 val. kambario temperatūroje, tamsioje vietoje. Darbinis Folin-Ciocalteu reagentas gautas praskiedus motininį reagentą distiliuotu vandeniu santykiu 1:10. Lyginamasis tirpalas. 0,25 ml 70 proc. (v/v) etanolio sumaišoma su 1,25 ml darbinio Folin- Ciocalteu reagento ir įpilama 1 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo. Kalibraciniam grafikui (3 pav.) sudaryti pagaminami 5 žinomų koncentracijų galo rūgšties tirpalai: 0,1 mg/ml, 0,075 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,0125 mg/ml. Etaloniniai galo rūgšties mėginiai ruošiami taip pat, kaip ir tiriamieji, tačiau vietoje augalinės žaliavos ekstraktų įpilama 0,25 ml skirtingų koncentracijų galo rūgšties tirpalų. Tirpalų absorbcija matuojama spektrofotometru, bangos ilgis 765 nm.

25 Absorbcija 25 1,4 1,2 1 y = 12,517x + 0,006 R² = 0,9969 0,8 0,6 0,4 0, ,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 Galo rūgšties koncentracija, mg/ml 3 pav. Kalibracinė galo rūgšties kreivė Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GAE) gramui žaliavos, jam apskaičuoti taikoma formulė: GAE = c V/m, mg/g c iš kalibracinės kreivės nustatyta galo rūgšties koncentracija (mg/ml); V augalinės žaliavos ekstrakto tūris (ml); m atsvertas augalinės žaliavos kiekis (g). 2.6 Suminio flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu Suminio flavonoidų kiekio paprastųjų rasakilų žolėje nustatymui taikytas spektrofotometrinis metodas, augalinės žaliavos ekstraktą veikiant aliuminio chlorido tirpalu acto rūgštimi parūgštintoje terpėje. Tiriamasis tirpalas. Į 5 ml matavimo kolbutę įpilama 0,2 ml augalinės žaliavos ekstrakto, 2 ml 96 proc. (v/v) etanolio, 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo, 0,3 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo ir 0,4 ml 5 proc. heksametilentetramino tirpalo. Praskiedžiama distiliuotu vandeniu iki žymės ir sumaišoma. Po 30 min. spektrofotometru matuojama tiriamųjų mėginių absorbcija, bangos ilgis 407 nm.

26 26 Palyginamasis tirpalas. Į 25 ml matavimo kolbutę įpilama 0,2 ml augalinės žaliavos ekstrakto, 2 ml 96 proc. (v/v) etanolio ir 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo. Praskiedžiama distiliuotu vandeniu iki žymės. Etaloninis rutino tirpalas gaminamas 25 ml matavimo kolbutėje ištirpinus 0,0125 g rutino 70 proc. (v/v) etanolyje. Tiriamasis ir palyginamasis tirpalai gaminami taip pat, kaip ir tiriamieji augalinės žaliavos tirpalai, tačiau vietoje augalinės žaliavos ekstrakto įpilama 0,2 ml paruošto etaloninio rutino tirpalo. Bendras flavonoidų kiekis (proc.) išreiškiamas rutino ekvivalentais (RE) gramui žaliavos, jam apskaičuoti taikoma formulė: ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) m (r) rutino masė, sunaudota etaloniniam tirpalui gaminti (g); V (važ) augalinės žaliavos ekstrakto tūris (ml); A (važ) augalinės žaliavos tiriamojo tirpalo absorbcija; M (važ) augalinės žaliavos masė, sunaudota ekstraktui gaminti (g); A (r) etaloninio rutino tirpalo absorbcija. 2.7 Fenolinių junginių analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu Fenolinių junginių analizė atlikta Waters Alliance e2695 chromatografu su diodų matricos detektoriumi Waters 2998 PDA. Analičių skirstymui panaudota 3 µm ACE C18 analitinė kolonėlė ( mm), temperatūra 25 C. Mobili fazė sudaryta iš 0,1 proc. (v/v) trifluoracto rūgšties vandenyje (A) ir acetonitrilo (B). Gradientinės eliucijos programa pateikta 4 lentelėje. Eliuento tėkmės greitis 0,5 ml/min, bandinių injekcijos tūris 10 μl.

27 27 4 lentelė. Mobilios fazės gradientų kitimas. Laikas, min Eliuentas A, proc. (V/V) Eliuentas B, proc. (V/V) Individualių fenolinių junginių nustatymas atliktas naudojant standartinius tirpalus. Identifikuota remiantis sulaikymo trukme ir spektriniais duomenimis (λ = nm). Kiekinės sudėties nustatymas atliktas remiantis etaloninių tirpalų kalibracinėmis kreivėmis. 2.8 Statistinis duomenų apdorojimas Statistinė duomenų analizė atlikta Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, JAV) ir SPSS 20 (IBM, JAV) programomis. Microsoft Office Excel 2007 apskaičiuotas vidurkis ir standartinės paklaidos, nubraižyti grafikai. SPSS 20 apskaičiuoti Spirmeno koreliacijos koeficientai (R), statistiniam reikšmingumui tarp tiriamųjų grupių įvertinti taikyta vieno faktoriaus dispersinė analizė (ANOVA) su Tukey kriterijumi (reikšmingumo lygmuo α=0,05, statistiškai reikšminga, kai p<0,05). Reikšmės, tarp kurių nenustatyta statistinio patikimumo (p>0,05), grafikuose pažymėtos vienodomis raidėmis. Tyrimai atlikti 3 kartus, rezultatuose pateikiamas matematinis vidurkis ± standartinė paklaida.

28 Fenolinių junginių koncentracija, mg GAE/g 28 3 TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS 3.1 Ekstrakcijos sąlygų nustatymas Ekstrahento koncentracija. Ekstrakcijos sąlygų optimizavimo procesui buvo naudotas atsitiktinai pasirinktas paprastųjų rasakilų žolės mėginys. Augalinės žaliavos ekstraktai pagaminti su 5 skirtingų koncentracijų 40, 50, 60, 70, 80 proc. (v/v) etanoliu, ekstrakciją vykdant ultragarso vonelėje 20 min. Fenolinių junginių kiekis įvertintas Folin Ciocalteu metodu (4 pav.). Daugiausiai fenolinių junginių buvo išekstrahuota 70 proc. (v/v) etanoliu, tačiau šis kiekis statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p>0,05) nuo 40 proc. (v/v) etanoliu išekstrahuoto fenolinių junginių kiekio. Tolimesnių ekstraktų gamybai pasirinktas 70 proc. (v/v) etanolis. 55,00 53,00 51,00 49,00 47,00 45,00 43,00 41,00 39,00 37,00 35, Etanolio koncentracija, proc. (v/v) 4 pav. Suminis fenolinių junginių kiekis ekstrakcijai naudojant skirtingos koncentracijos etanolio tirpalus (n=3) Ekstrahavimo trukmė. Siekiant nustatyti optimalią ekstrakcijos trukmę, ekstrahavimas vykdomas ultragarso vonelėje 4 skirtingais laiko intervalais 10, 20, 30, 40 min.. Ištyrus bendrą fenolinių junginių kiekį Folin Ciocalteu metodu, didžiausia (p<0,05) fenolinių junginių išeiga nustatyta ekstrahavimo procesą vykdant 20 min. (5 pav.). Ekstrahuojant ilgesnį laiką, fenolinių junginių kiekis mažėja, ties 40 min. riba gaunama mažiausia suminio fenolinių junginių kiekio reikšmė, todėl tolimesnių ekstraktų gamybai taikoma 20 min. ekstrakcijos trukmė.

29 Fenolinių junginių koncentracija, mg GAE/g 29 55,00 50,00 45,00 40,00 35,00 30,00 25,00 20, Ekstrakcijos trukmė, min 5 pav. Suminis fenolinių junginių kiekis ekstrahuojant skirtingais laiko intervalais (n=3) 3.2 Fenolinių junginių nustatymas paprastųjų rasakilų žolės mėginiuose Fenolinių junginių kiekio įvairavimas paprastųjų rasakilų antžeminėje dalyje vegetacijos periodu. Bendras fenolinių junginių kiekis vegetacijos metu svyravo nuo 53,69 ± 0,98 mg GAE/g iki 71,42 ± 1,43 mg GAE/g. Didžiausi fenolinių junginių kiekiai įvertinti nuo augalo augimo tarpsnio, gegužės 17 dienos, iki masinio žydėjimo tarpsnio, birželio 28 dienos. Masinio žydėjimo metu rinktuose paprastųjų rasakilų mėginiuose nustatyta didžiausia fenolinių junginių kiekio reikšmė (71,42 ± 1,43 mg GAE/g). Fenolinių junginių koncentracija augalo žydėjimo pabaigoje ima mažėti (61,89 ± 0,97 mg GAE/g). Mažiausias suminis fenolinių junginių kiekis nustatytas gegužės 3 dieną, vaistinių augalinių žaliavų rinkimo pradžioje, ir liepos 26 dieną, vaisių nokimo tarpsniu (atitinkamai 53,69 ± 0,98 mg GAE/g ir 54,73 ± 0,92 mg GAE/g). Fenolinių junginių kiekis paprastųjų rasakilų ėminiuose vegetacijos metu pateiktas 6 paveiksle.

30 Fenolinių junginių koncentracija, mg GAE/g 30 75,00 70,00 65,00 c d c c d b 60,00 55,00 a a 50,00 45,00 40,00 Gegužės 03 d. Gegužės 17 d. Gegužės 31 d. Birželio 14 d. Birželio 28 d. Liepos 12 d. Liepos 26 d. Žaliavų rinkimo data 6 pav. Suminis fenolinių junginių kiekis paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiuose vegetacijos periodu (n=3) Lietuvoje nėra atlikta tyrimų su nei viena rasakilų genties rūšimi, todėl gauti duomenys palyginti su užsienio šalių mokslininkų spektrofotometrinių tyrimų rezultatais. Trouillas et al. (Prancūzija, 2003 m.), naudodami Folin-Ciocalteu metodą, paprastųjų rasakilų ekstraktuose nustatė suminį fenolinių junginių kiekį, išreikštą pirogalolio ekvivalentais 62,5 mg PGE/g [12]. Boroja et al. (Serbija, 2014 m.) atlikto tyrimo metu, naudojant Folin-Ciocalteu reagentą, A. vulgaris L. žolės ekstraktuose įvertintas bendras fenolinių junginių kiekis, kuris siekė 590,22 mg GAE/g [68]. Serbijos mokslininkų gautas suminis fenolinių junginių kiekis yra 7,5 karto didesnis, lyginant su mūsų tyrimo metu nustatyta didžiausia fenolinių junginių reikšme vegetacijos periodo metu. Galima daryti prielaidą, kad suminio fenolinių junginių kiekio skirtumus galėjo nulemti augalo genotipas, skirtinga ekstrakcijos ir eksperimentų metodika, vaistinės augalinės žaliavos augimo vietos dirvožemis ir klimatiniai veiksniai temperatūra, saulės spindulių ir kritulių kiekis, oro drėgmė. Fenolinių junginių kiekio įvairavimas skirtingose Lietuvos vietovėse surinktuose paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiuose. Suminis fenolinių junginių kiekis kito nuo 37,28 ± 0,45 mg GAE/g iki 78,91 ± 1,28 mg GAE/g. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas Molėtų apylinkėse (78,91 ± 1,28 mg GAE/g) rinktuose vaistinės augalinės žaliavos ėminiuose. Dideli fenolinių junginių kiekiai taip pat įvertinti Maigų miške (Mažeikių raj.), Ąžuolyno parke (Kauno m.) ir Burbiškio parke (Anykščių raj.) rinktuose A. vulgaris L. mėginiuose (atitinkamai 77,95 ± 1,67 mg GAE/g, 77,55 ± 1,35 mg GAE/g ir 75,18 ± 1,07 mg GAE/g). Puskelnių apylinkėse (Marijampolės raj.) surinkti paprastųjų rasakilų žolės mėginiai išsiskyrė mažiausia (p<0,05) fenolinių junginių kiekine sudėtimi (37,28 ± 0,45 mg GAE/g).

31 Fenolinių junginių koncentracija, mg GAE/g 31 Tyrulių parke (Radviliškio raj.) rinktose paprastųjų rasakilų žaliavose taip pat nustatytas nedidelis fenolinių junginių kiekis (43,09 ± 0,39 mg GAE/g). Fenolinių junginių kiekis, įvertintas skirtingose augavietėse rinktose žaliavose, pavaizduotas 7 paveiksle. 85,00 80,00 75,00 70,00 65,00 60,00 55,00 50,00 45,00 40,00 35,00 30,00 a g h g h h f g f d d e c c b e f f g h 7 pav. Suminis fenolinių junginių kiekis skirtingose augavietėse rinktuose paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiuose (n=3) 3.3 Flavonoidų nustatymas paprastųjų rasakilų žolės mėginiuose Flavonoidų kiekio įvairavimas paprastųjų rasakilų antžeminėje dalyje vegetacijos periodu. Suminis flavonoidų kiekis A. vulgaris L. žolės mėginiuose svyravo nuo 23,07 ± 0,60 mg RE/g iki 35,22 ± 1,07 mg RE/g. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas birželio 28 dieną, masinio žydėjimo metu, rinktoje vaistinėje augalinėje žaliavoje. Panašus flavonoidų kiekis nustatytas gegužės 17 dieną, augimo fazėje, ir birželio 14 dieną, žydėjimo pradžioje, surinktuose A. vulgaris L. antžeminės dalies ėminiuose (atitinkamai 33,59 ± 0,53 mg RE/g ir 33,68 ± 0,48 mg RE/g). Augalo žydėjimo pabaigoje suminis flavonoidų kiekis sumažėja (26,72 ± 0,64 mg RE/g). Mažiausia flavonoidų koncentracija nustatyta liepos 26 dieną, vaisių nokimo metu, ir gegužės 3 dieną, augimo fazėje, rinktose paprastųjų rasakilų žaliavose (atitinkamai 23,07 ± 0,60 mg RE/g ir 23,15 ± 0,56 mg RE/g). Suminio flavonoidų kiekio dinamika vegetacijos metu pavaizduota 8 paveiksle.

32 Flavonoidų koncentracija, mg RE/g 32 40,00 35,00 c c c 30,00 25,00 a a b b a 20,00 15,00 10,00 5,00 Gegužės 03 d. Gegužės 17 d. Gegužės 31 d. Birželio 14 d. Birželio 28 d. Liepos 12 d. Liepos 26 d. Žaliavų rinkimo data 8 pav. Suminis flavonoidų kiekis paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiuose vegetacijos periodu (n=3) Tyrimo metu gauti rezultatai skyrėsi nuo Serbijos mokslininkų spektrofotometrijos metodu įvertinto suminio flavonoidų kiekio. Boroja et al. (Serbija, 2014 m.) paprastųjų rasakilų žolės metanoliniuose ekstraktuose, naudodami aliuminio chlorido tirpalą, nustatė flavonoidų kiekį, kuris buvo lygus 12,58 mg RE/g [68]. Vegetacijos metu didžiausias bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis gautas birželio 28 dieną, masinio žydėjimo metu, rinktuose paprastųjų rasakilų mėginiuose. Remiantis spektrofotometrinių tyrimų duomenimis, daroma prielaida, kad optimaliausias paprastųjų rasakilų antžeminės dalies rinkimo laikas galėtų būti birželio mėnesio pabaiga. Flavonoidų kiekio įvairavimas skirtingose Lietuvos vietovėse surinktuose paprastųjų rasakilų anžeminės dalies mėginiuose. Suminis flavonoidų kiekis paprastųjų rasakilų žolės ekstraktuose kito nuo 16,32 ± 0,37 mg RE/g iki 33,12 ± 0,95 mg RE/g. Didžiausias suminis flavonoidų kiekis nustatytas Kalnelio parke (Joniškio raj.) (33,12 ± 0,95 mg RE/g), panašūs kiekiai Maigų miške (Mažeikių raj.), Bijeikių apylinkėse (Anykščių raj.) ir Ąžuolyno parke (Kauno m.) surinktuose paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiuose (atitinkamai 32,04 ± 1,02 mg RE/g, 31,44 ± 0,41 mg RE/g ir 30,33 ± 0,89 mg RE/g). Marijampolės rajone (Puskelniuose) rinkta A. vulgaris L. žaliava pasižymėjo mažiausiu (p<0,05) flavonoidų kiekiu. Flavonoidų kiekinės sudėties įvairavimas skirtingose vietovėse rinktose žaliavose pateiktas 9 paveiksle.

33 Flavonoidų koncentracija, mg RE/g 33 35,00 33,00 31,00 29,00 27,00 25,00 23,00 d e f g c d c d e c d e f f g b b c b c e f g b c g c d e f 21,00 19,00 17,00 a 15,00 9 pav. Suminis flavonoidų kiekis skirtingose augavietėse rinktuose paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiuose (n=3) Spektrofotomertijos metodais mažiausias suminis fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis nustatytas Puskelnių apylinkėse (Marijampolės raj.) rinktose žaliavose. Maigų miške (Mažeikių raj.) surinktuose paprastųjų rasakilų antžeminės dalies ėminiuose nustatyti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiai vieni iš didžiausių. Remiantis spektrofotometrinių tyrimų duomenimis, galima daryti prielaidą, kad paprastųjų rasakilų žaliavas, kaip fenolinių junginių ir flavonoidų šaltinį, geriausia rinkti Maigų miške (Mažeikių raj.). Koreliaciniam ryšiui tarp suminio fenolinių junginių kiekio ir suminio flavonoidų kiekio įvertinti apskaičiuotas Spirmeno koreliacijos koeficientas. Nustatyta vidutinio stiprumo koreliacinė priklausomybė (r s =0,630, p<0,01). 3.4 Fenolinių junginių įvertinimas paparastųjų rasakilų žolės ekstraktuose ESC metodu Paprastųjų rasakilų žolės ekstraktuose ESC metodu identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti 4 fenoliniai junginiai katechinas, agrimonijinas, chlorogeno rūgštis ir tilirozidas. Chromatogramos pateiktos 10 ir 11 paveiksluose.

34 34 10 pav. Paprastųjų rasakilų žolės ekstrakto chromatograma, bangos ilgis 280 nm. 1 katechinas, 2 agrimonijinas 11 pav. Paprastųjų rasakilų žolės ekstrakto chromatograma, bangos ilgis 350 nm. 3 chlorogeno r., 4 tilirozidas Užsienio šalių moksininkai yra atlikę keletą rasakilų (Alchemilla L.) genties fenolinių junginių sudėties tyrimų ESC metodu. D Agostino (Italija, 1998 m.) vienas iš pirmųjų atlikęs paprastųjų rasakilų fenolinių junginių analizę ESC metodu, metanoliniuose žolės ekstraktuose identifikavo 4 flavonoidus - izokvercetiną, rutiną, avikuliariną ir tilirozidą [31]. Neagu et al. (Rumunija, 2015 m.) tyrimo objektas taip pat buvo paprastųjų rasakilų ekstraktai vandeninis ir etanolinis. Juose ESC metodu nustatyti junginiai: epikatechinas, kvercetinas, rutinas, miricetinas, kempferolis, liuteolinas, genisteinas, daidzeinas, kvercetin3-β-d-gliukozidas, galo rūgštis, sinapo rūgštis, p-kumaro rūgštis (tik etanoliniame ekstrakte),

35 35 rozmarino ir chlorogeno rūgštys [24]. Kaya et al. (Turkija, 2012 m.) vykdė tyrimus su etanoliniais A. procerrima Fröhner, A. stricta Rothm., A. hirtipedicellata Juz. ir A. sericata Reichb. žolės ekstraktais. Remiantis ESC rezultatais, ekstraktuose buvo identifikuoti flavonoidai: orientinas, viteksinas, hiperozidas, izokvercetinas, kvercitrinas ir rutinas. Izokvercetinas ir kvercitrinas identifikuoti visose rūšyse, išskyrus A. procerrima Fröhner, o hiperozido nerasta tik A. stricta Rothm. ekstrakte. Orientinas nustatytas tik A. procerrima Fröhner ir A. stricta Rothm. ekstraktuose. Rutinas buvo rastas visose tirtose Alchemilla L. genties rūšyse, viteksinas A. stricta Rothm. [18]. Diminš et al. (Latvija, 2013 m.) ESC metodu metanoliniame paprastųjų rasakilų ekstrakte nustatė kavos rūgštį [26]. Condrat et al. (Rumunija, 2010 m.) įrodė, kad etanoliniuose ir metanoliniuose A.vulgaris L. antžeminės dalies ektraktuose yra galo rūgštis, analizę atliekant MS ir ESC metodais [25]. Apibendrinant užsienio šalių mokslininkų tyrimus galima daryti prielaidą, kad fenolinių junginių sudėtis gali kisti priklausomai nuo Alchemilla L. genties rūšies bei geografinės vaistinės augalinės žaliavos augavietės padėties. Visose tirtose rasakilų rūšyse identifikuotas flavonoidas rutinas. Fenolinių junginių analizė paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiuose vegetacijos periodu. Viso vegetacijos periodo metu vyraujantis junginys buvo katechinas, kurio kiekis įvairavo nuo 6,60 ± 0,10 mg/g iki 17,65 ± 0,34 mg/g. Katechino koncentracija nuo gegužės mėnesio pradžios iki birželio mėnesio pabaigos kito neženkliai. Didžiausios katechino kiekio reikšmės nustatytos gegužės 3 ir 17 dieną, augalo augimo fazėse, ir birželio 14 dieną, žydėjimo pradžioje (atitinkamai 17,65 ± 0,34 mg/g, 17,55 ± 0,30 mg/g ir 17,41 ± 0,31 mg/g). Mažiausią katechino kiekį (p<0,05) sukaupė liepos 12 dieną, žydėjimo pabaigoje, rinkta žaliava. Vaisių nokimo metu katechino kiekis padidėjo (9,80 ± 0,13 mg/g). Denev et al. (Čekija, 2014 m.) ESC metodu nustatytas katechino (2,5 mg/g) kiekis A.glabra Neygenf. antžeminėje dalyje buvo 7 kartus mažesnis, lyginant su mūsų tyrimo metu gauta didžiausia katechino kiekio reikšme vegetacijos eigoje [27]. Agrimonijino kiekis, išreikštas galo rūgšties ekvivalentais (GAE), vegetacijos metu kito nuo 2,31 ± 0,04 mg/g iki 11,28 ± 0,21 mg/g. Agrimonijino kiekis visą gegužės mėnesį tolygiai didėjo. Gegužės 31 dieną, butonizacijos tarpsnio metu, rinktuose žaliavų mėginiuose nustatyta didžiausia (p<0,05) agrimonijino koncentracija, kuri iki liepos 26 dienos, vaisių nokimo fazės, mažėjo. Augalo žydėjimo pabaigoje, liepos 12 dieną, paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiuose nustatyti apylygiai agrimonijino ir katechino kiekiai (atitinkamai 6,51 ± 0,09 mg/g ir 6,60 ± 0,11 mg/g). Mažiausiai (p<0,05) agrimonijino buvo sukaupta liepos 26 dieną, vaisių nokimo metu. Katechino ir agrimonijino kiekinė sudėtis vegetacijos metu pateikta 12 paveiksle.

36 Koncentracija, mg/g 36 20,00 18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 e g e i c k e j d i a h b f Katechinas Agrimonijinas Žaliavų rinkimo data 12 pav. Katechino ir agrimonijino kiekių įvairavimas vegetacijos periodu (n=3) Geiger et al. (Šveicarija, 1994 m.) elagitaninų analizės A. xanthochlora Rothm. antžeminės dalies ekstraktuose duomenys parodė 3 kartus didesnį agrimonijino kiekį (35 38 mg/g), lyginant su vegetacijos periodu gauta didžiausia agrimonijino kiekio reikšme [39]. Chlorogeno rūgšties kiekis paprastųjų rasakilų antžeminėje dalyje varijavo nuo 186,44 ± 2,42 µg/g iki 649,30 ± 14,93 µg/g. Didžiausiu (p<0,05) chlorogeno rūgšties kiekiu pasižymėjo gegužės 17 dieną, augimo fazėje, rinkta žaliava. Mažiausia chlorogeno rūgšties koncentracija nustatyta gegužės 31 dieną, butonizacijos tarpsniu, ir liepos 26 dieną, vaisių nokimo metu, rinktuose žaliavų ėminiuose (atitinkamai 186,44 ± 2,42 µg/g ir 188,67 ± 3,39 µg/g). Gauti duomenys skiriasi nuo anksčiau atliktų tyrimų rezultatų. Neagu et al. (Rumunija, 2015 m.) paprastųjų rasakilų žolės etanoliniuose ekstraktuose ESC metodu nustatytas 5 kartus mažesnis chlorogeno rūgšties kiekis (118 µg/g), lyginant su mūsų tyrimo metu gauta didžiausia chlorogeno rūgšties kiekio reikšme [24]. Denev et al. (Čekija, 2014 m.) A.glabra Neygenf. žolės acetoniniuose ekstraktuose nustatė didesnį chlorogeno rūgšties kiekį 800 µg/g [27]. Vegetacijos periodu tilirozido kiekis svyravo nuo 57,51 ± 1,14 µg/g iki 350,94 ± 7,37 µg/g. Iki gegužės 17 dienos tilirozido kiekis kilo ir toliau vegetacijos eigoje mažėjo. Didžiausias (p<0,05) tilirozido kiekis nustatytas gegužės 17 dieną, augimo fazėje, rinktoje paprastųjų rasakilų antžeminėje dalyje. Nustatytos dvi mažiausios tilirozido kiekio reikšmės liepos 12 dieną, žydėjimo pabaigoje, ir 26 dieną, vaisių nokimo tarpsniu (atitinkamai 61,23 ± 1,21 µg/g ir 57,51 ± 1,14 µg/g). Chlorogeno rūgšties ir tilirozido kiekinė sudėtis vegetacijos metu pavaizduota 13 paveiksle.

37 Koncentracija, µg/g ,00 600,00 500,00 400,00 300,00 200,00 100,00 0,00 e k f l a j c i d h b g a g Chlorogeno r. Tilirozidas Žaliavų rinkimo data 13 pav. Chlorogeno r. ir tilirozido kiekių įvairavimas vegetacijos periodu (n=3) Lyginant spektorofotometrinius ir chromatografinius duomenis gauta, kad fenolinių junginių kiekis paprastųjų rasakilų antžeminėje dalyje sumažėja žydėjimo pabaigoje (liepos 12 dieną) ir vaisių nokimo tarpsniu (liepos 26 dieną). Masinio žydėjimo metu (birželio 28 dieną) rinktas paprastųjų rasakilų žolės mėginys, kuriame spektrofotometriškai nustatytas maksimalus fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis, didele ESC metodu identifikuotų fenolinių junginių koncentracija neišsiskyrė. Fenolinių junginių analizė skirtingose Lietuvos vietovėse surinktuose paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiuose. Visuose paprastųjų rasakilų mėginiuose, išskyrus Bijeikių apylinkėse (Anykščių raj.) rinktus mėginius, dominuojantis junginys buvo agrimonijinas, kurio kiekis, išreikštas galo rūgšties ekvivalentais (GAE), įvairavo nuo 4,86 ± 0,06 mg/g iki 26,53 ± 0,58 mg/g. Didžiausias (p<0,05) agrimonijino kiekis nustatytas Maigų miške (Mažeikių raj.) rinktoje paprastųjų rasakilų žolėje, mažiausias (p<0,05) kiekis Puskelnių apylinkėse (Marijampolės raj.) esančioje augavietėje rinktose žaliavose. Įvairiose augimo vietose surinktuose ėminiuose įvertinta didžiausia ir mažiausia agrimonijino kiekio reikšmė skyrėsi daugiau nei 5 kartus. Katechino kiekis įvairių augaviečių mėginiuose kito nuo 4,77 ± 0,06 mg/g iki 19,38 ± 0,36 mg/g. Ąžuolyno parke (Kauno m.) rinktuose paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiuose įvertintas didžiausias (p<0,05) katechino kiekis, mažiausias (p<0,05) Puskelnių apylinkėse (Marijampolės raj.) rinktuose mėginiuose. Puskelinių apylinkėse (Marijampolės raj.) surinktuose A. vulgaris L. žolės pavyzdžiuose nustatyta apylygė katechino ir agrimonijino koncentracija (atitinkamai 4,77 ± 0,06 mg/g ir

38 Koncentracija, mg/g 38 4,86 ± 0,06 mg/g). Agrimonijino ir katechino kiekiai įvairių augaviečių mėginiuose pavaizduoti 14 paveiksle. 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 a k j r s o n d e f e i t b l c p c d o h s o n m e f g f Katechinas Agrimonijinas 0,00 Žaliavų rinkimo vieta 14 pav. Katechino ir agrimonijino kiekių įvairavimas skirtingose augavietėse rinktuose paprastųjų rasakilų mėginiuose (n=3) Skirtingose augavietėse rinktose paparastųjų rasakilų žaliavose tilirozido kiekis įvairavo nuo 37,54 ± 0,52 µg/g iki 168,56 ± 3,71 µg/g. Didžiausiu (p<0,05) tilirozido kiekiu pasižymėjo Zarasų apylinkėse rinkta žaliava. Mažiausias (p<0,05) tilirozido kiekis nustatytas Tyrulių parke (Radviliškio raj.) esančioje augavietėje rinktoje žaliavoje. Chlorogeno rūgšties kiekis svyravo nuo 353,13 ± 7,03 µg/g iki 702,51 ± 14,75 µg/g. Didžiausias chlorogeno rūgšties kiekis gautas Jūkainių miške (Raseinių raj.) ir Molėtų apylinkėse rinktose paprastųjų rasakilų žaliavose (atitinkamai 702,51 ± 14,75 µg/g ir 686,50 ± 13,66 µg/g). Mažiausiu chlorogeno rūgšties kiekiu pasižymėjo Zarasų apylinkėse ir Puskelnių apylinkėse (Marijampolės raj.) surinkti A. vulgaris L. žolės mėginiai (atitinkamai 353,13 ± 7,03 µg/g ir 363,12 ± 3,99 µg/g). Rezultatai pateikti 15 paveiksle.

39 Koncentracija, µg/g ,00 700,00 600,00 500,00 400,00 300,00 200,00 100,00 0,00 g l j n k l e t f r i o a m c s a b r f r d t h p b o Tilirozidas Chlorogeno r. Žaliavų rinkimo vieta 15 pav.tilirozido ir chlorogeno r. kiekių įvairavimas skirtingose augavietėse rinktuose paprastųjų rasakilų antžeminės dalies mėginiuose (n=3) Palyginius spektrofotometrinius ir chromatografinius duomenis gauta, kad didelį fenolinių ir flavonoidų kiekį sukaupusioje Maigų miške (Mažeikių raj.) rinktoje žaliavoje, ESC metodu taip pat nustatytas didelis fenolinių junginių kiekis. Mažiausia fenolinių junginių ir flavonoidų kiekine sudėtimi išsiskyrė Tyrulių parke (Radviliškio raj.) ir Puskelnių apylinkėse (Marijampolės raj.) rinktos žaliavos, kuriose chromatografiškai nustatytas nedidelis fenolinių junginių kiekis. Atlikta koreliacinė spektrofotometrijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodais gautų duomenų analizė. Koreliacijos koeficientai ir reikšmingumo lygmenys pateikti 5 lentelėje. 5 lentelė. Koreliaciniai fenolinių junginių ryšiai ESC nustatytų junginių kiekis Fenolinių junginių kiekis Flavonoidų kiekis Agrimonijinas r s =0,677, p<0,01 r s =0,287, p<0,05 Katechinas r s =0,436, p<0,01 r s =0,556, p<0,01 Chlorogeno rūgštis r s =0,448, p<0,01 r s =0,273, p<0,05 Tilirozidas - r s =0,409, p<0,01