LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Transkriptas

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA Veterinarijos fakultetas Viktorija Rutkauskaitė Bakterijų paplitimas sergančių šunų odoje ir jų jautrumas antibiotikams Prevalence and antimicrobial susceptibility of bacteria in the skin of sick dogs Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS Darbo vadovas: prof. dr. Modestas Ružauskas Kaunas, 2019

2 DARBAS ATLIKTAS MIKROBIOLOGIJOS IR VIRUSOLOGIJOS INSTITUTE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas Bakterijų paplitimas sergančių šunų odoje ir jų jautrumas antibiotikams : 1. yra atliktas mano pačios. 2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje. 3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. (data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) PATVIRTINIMAS APIE DARBO LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ Patvirtinu, kad darbo lietuvių kalba taisyklinga. (data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui. (data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE) (aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė) (parašas) Magistro baigiamojo darbo recenzentas (vardas, pavardė) (parašas) Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas: (data) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas, pavardė) (parašas)

3 TURINYS SANTRUMPOS... 5 SANTRAUKA... 6 SUMMARY... 7 ĮVADAS LITERATŪROS APŽVALGA Odos apsauginis mechanizmas Natūrali odos mikrobiota Patogeniniai odos mikroorganizmai Šunų odos susirgimai ir juos predisponuojantys veiksniai Bakterinės odos infekcijos Seborėjinė piodermija Papulės, pustulės, židininė alopecija ir odos pleiskanojimas Odos erozijos ir opos Opos ir šlapiuojančios žaizdos Mazgeliai arba regioninis patinimas Bakterijų identifikavimas Bakterijų kultivavimas ir jautrumas antibiotikams Dažniausiai naudojamos antimikrobinės medžiagos gydant bakterines odos ligas DARBO METODIKA Tyrimų vieta ir objektai Tiriamųjų bakterijų išskyrimas Išskirtų bakterijų identifikacija Bakterijų identifikacija klasikinės mikrobiologijos metodais Bakterijų identifikacija molekulinės biologijos metodais Bakterijų jautrumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimas Statistinė duomenų analizė REZULTATAI Rizikos veiksniai, predisponuojantys šunų bakterines odos ligas Veislė Amžius Lytis Odos ligų sukėlėjų genčių įvairovė... 32

4 3.3. Išskirtų bakterijų jautrumas antimikrobinėms medžiagoms Iš odos išskirtų bakterijų identifikacija molekulinės biologijos metodais REZULTATŲ APTARIMAS IŠVADOS LITERATŪROS SĄRAŠAS PRIEDAI

5 SANTRUMPOS BLAST bazinių lokalių išsidėstymų paieškos įrankis CLSI klinikinių ir laboratorinių standartų institutas ºC laipsniai pagal Celsijų DNR deoksiribonukleorūgštis E. coli - Escherichia coli EUCAST Europos antimikrobinių medžiagų jautrumo tyrimų komitetas kt. kiti min. minutė mm milimetrai pav. paveikslas proc., (%) procentai ph vandenilio jonu koncentracija PGR polimerazės grandininė reakcija rrnr ribosominė ribonukleorūgštis S. aureus Staphylococcus aureus S. epidermidis Staphylococcus epidermidis S. hyicus Staphylococcus hyicus S. pseudintermedius Staphylococcus pseudintermedius S. schleiferi Staphylococcus schleiferi S. xylosus Staphylococcus xylosus SIG Staphylococcus intermedius grupė s sekundė spp. rūšys sp. rūšis subsp. porūšis μl mikrolitrai 5

6 BAKTERIJŲ PAPLITIMAS SERGANČIŲ ŠUNŲ ODOJE IR JŲ JAUTRUMAS ANTIBIOTIKAMS Viktorija Rutkauskaitė Magistro baigiamasis darbas SANTRAUKA Šunų odos ligų patogenezėje svarbus vaidmuo tenka bakterijoms. Šio darbo tikslas išskirti bakterijas iš sergančių šunų odos, jas identifikuoti ir nustatyti jautrumą antimikrobinėms medžiagoms. Tyrimo metu buvo ištirta 50 šunų odos mėginių, tyrimai atlikti LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos institute metais. Medžiaga tyrimams pristatyta iš įvairių veterinarijos gydyklų Kauno, Vilniaus, Klaipėdos ir kitų rajonų, medžiaga tyrimams pristatyta transportinėse terpėse su lydraščiais. Išskirtos bakterijos identifikuotos klasikinės ir molekulinės mikrobiologijos metodais, o išskirtų bakterijų jautrumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimas atliktas pagal Kirby Bauer metodiką. Iš 50 šunų odos mėginių buvo išskirta 81 bakterijų padermė. Gryna bakterijų kultūra išskirta iš 31 mėginio (62,0 proc.), mišri bakterijų kultūra išskirta iš 19 mėginių (38,0 proc.). Daugiausia išskirta Staphylococcus spp. genties bakterijų (55,6 proc.), o pagrindinis odos ligų sukėlėjas S. pseudintermedius (p<0,05). Dažniausias Staphylococcus spp. jautrumas nustatytas cefoksitinui (97,4 proc.), cefaleksinui (95,6 proc.) ir enrofloksacinui (88,9 proc.). Enterobacteriaceae šeimos bakterijų jautrumas dažniausias buvo sulfametoksazolo ir trimetoprimo kombinacijai bei enrofloksacinui (83,3 proc.). Klasikiniais mikrobiologijos metodais sunkiai identifikuojamos bakterijos buvo identifikuotos atlikus 16S rnrnr sekoskaitą. Taikant šį metodą identifikuotos tokios bakterijos kaip Macrococcus spp., Corynebacterium mucifaciens, Weissella confusa, Acinetobacter lwoffii, Bacillus pseudomycoides, Corynebacterium sp., Actinomyces coleocanis, Pasteurella canis, Staphylococcus epidermidis ir Corynebacterium ammoniagenes. Raktažodžiai: šuo, odos ligos, bakterijos, antimikrobinės medžiagos. 6

7 PREVALENCE AND ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY OF BACTERIA IN THE SKIN OF SICK DOGS Viktorija Rutkauskaitė Master s Thesis SUMMARY Bacteria play an important role in the pathogenesis of canine skin diseases. The aim of the present investigation was to isolate bacteria from the skin of sick dogs, identify them and determine the susceptibility to antimicrobials. During the study, 50 samples of dogs skin were analyzed and conducted at the LSMU VA Institute of Microbiology and Virology in Material for research was delivered from various veterinary clinics located in Kaunas, Vilnius, Klaipėda and other districts, samples were collected in transport media and delivered to the laboratory with accompanying documents. Bacterial isolates were identified by classical and molecular microbiology methods. Antimicrobial susceptibility testing was performed by the Kirby-Bauer disc diffusion method. 81 strains of bacteria were isolated from 50 dog skin samples. Pure bacterial culture was isolated from 31 samples (62.0 %), mixed bacterial culture was detected in 19 samples (38.0 %). The results revealed that the most prevalent cultureble bacteria were Staphylococcus spp. (55.56 %), while S. pseudintermedius was the main causative agent of skin diseases (p<0.05). Staphylococcus spp. were most frequently susceptible to cefoxitin (97.4 %), enrofloxacin (88.9 %) and cephalexin (95.6 %). Bacteria family Enterobacteriaceae had the highest rate of susceptibility to to fluoroquinolones, sulfamethoxazole and trimethoprim combination (83.3 %). The following bacteria that are difficult to identify by classical methods have been identified using 16S rrna sequencing: Macrococcus spp., Corynebacterium mucifaciens, Weissella confusa, Acinetobacter lwoffii, Bacillus pseudomycoides, Corynebacterium sp., Actinomyces coleocanis, Pasteurella canis, Staphylococcus epidermidis and Corynebacterium ammoniagenes. Keywords: dog, skin diseases, bacteria, antimicrobials. 7

8 ĮVADAS Oda yra didžiausias organas, dengiantis kūną. Ji sudaryta iš keleto sluoksnių: viršutinio epidermio, tikrosios odos dermos bei poodžio hipodermos. Epidermis sudaro paviršinį odos sluoksnį ir dėl to jam tenka svarbiausia funkcija atremti įvairius cheminius, fizinius ir biologinius veiksnius (1). Oda sudaro barjerą tarp gyvūno vidaus organų ir aplinkos bei turi didžiausią kontaktą su mikroorganizmais, alergenais ir kitais išoriniais veiksniais. Dėl šios priežasties egzistuoja daug odos susirgimų arba sisteminių susirgimų, kurių infekcijos vartai prasideda odoje pažeidus jos struktūrą ar praėjus odos apsauginius mechanizmus. Dažniausi odos ligų sukėlėjai yra bakterijos, kurios tampa vis labiau atsparios gydymui naudojamoms antimikrobinėms medžiagoms. Tad norint nustatyti ligos diagnozę ir tinkamai parinkti gydymą, labai svarbu tiksliai identifikuoti sukėlėją ir nustatyti jo jautrumą antimikrobinėms medžiagoms. Nustačius bakterijų rūšį ir jautrumą, ne tik palengvinamas veterinarijos gydytojo darbas, bet ir paskiriamas optimalus gydymas išvengiant bereikalingo antibiotikų naudojimo. Tai ypač svarbu ne tik gyvūno sveikatai, bet ir jo gerovei. Be to, tikslingiau panaudojant antibiotikus, sumažinamas jų kiekis, o tai yra svarbus veiksnys kovojant su bakterijų atsparumu antimikrobinėms medžiagoms. Darbo tikslas: medžiagoms. Išskirti bakterijas iš sergančių šunų odos, jas identifikuoti ir nustatyti jautrumą antimikrobinėms Darbo uždaviniai: 1. Išskirti bakterijas iš sergančių šunų odos. 2. Nustatyti išskirtų bakterijų rūšinę sudėtį pritaikant optimalius identifikacijos metodus. 3. Nustatyti išskirtų bakterijų jautrumą antimikrobinėms medžiagoms. 8

9 1. LITERATŪROS APŽVALGA 1.1 Odos apsauginis mechanizmas Oda yra tarsi barjeras, stabdantis patogeninių bakterijų invaziją bei augimą. Nuolatinis raginio sluoksnio atsinaujinimas, lizocimo produkcija, odos rūgštingumas (ph 5), baktericidiniai baltymai defensinai prisideda prie antimikrobinio apsauginio mechanizmo (2). Taip pat esant sausam odos paviršiui sukuriamos nepalankios sąlygos bakterijų dauginimuisi. Negyvos raginio sluoksnio ląstelės keratinocitai atsidalindami nuo odos fiziškai pašalina ir patogenus (2, 3). Be to, odos temperatūra yra truputi žemesnė nei vidinė kūno temperatūra ir nežymiai rūgštinė; dauguma bakterijų auga esant neutraliam rūgštingumui (ph 7) ir kuomet temperatūra siekia 37 C. Jeigu dėl kokių nors priežasčių patogenai sugeba įveikti odos apsauginį barjerą, tuomet įsijungia kiti mechanizmai aktyvinama imuninė sistema (3) (1 pav.). 1 pav. Odos apsauginis mechanizmas (4) Po gimimo sterili oda tampa įvairių rezidentinių bakterijų buveinė, natūrali gyvenamoji aplinka (3). Bakterijų rūšys ir kiekis priklauso nuo anatominės lokalizacijos, taip pat turi įtakos odos drėgnumas, prakaito ir riebalų liaukų sekrecijos intensyvumas, gyvūno amžius bei hormonų sekrecija (4). Ant odos gali augti tiek komensalinės, tiek simbiotinės ar patogeninės bakterijos. Jos geba 9

10 prisitvirtinti prie odos epitelio, tačiau patogeninės bakterijos augdamos ganėtinai sausoje ir rūgštinėje aplinkoje greitai žūsta ir pasišalina kartu su paviršiniu odos sluoksniu (3). Oda, išskirdama baktericidines medžiagas ir toksinius metabolitus, palaiko komensalinių bakterijų, tokių kaip Propionibacterium acnes, augimą, taip apsisaugant nuo patogenų kolonizacijos (2). Kai kurie komensaliniai mikroorganizmai kaip ir odos keratinocitai gamina antimikrobinius peptidus, bei kaip riebalų liaukos gamina laisvąsias riebalų rūgštis. Taip pat bakterijos išeikvoja galimas maisto medžiagas ir taip sutrukdo patogenams prisitvirtinti prie odos paviršiaus ir daugintis. Taip jie konkuruoja dėl maistinių medžiagų, receptorių ir tam tikrų nišų (4). Pavyzdžiui Staphylococcus epidermidis suriša keratinocitų receptorius ir užkerta kelia virulentiško Staphylococcus aureus prisitvirtinimui. Taip pat jie geba išskirti specifines antimikrobines medžiagas, žinomas kaip bakteriocinai. Vienas iš išskirtinių žinomų pavyzdžių yra S. aureus padermė 502A, kuri konkuruoja su kitomis virulentinėmis stafilokokų padermėmis ir išskiria bakteriocinus, slopinančius kitus patogenus (3). Ant odos paviršiaus esančios bakterijos taip pat gali veikti netiesiogiai aktyvuodamos organizmo imuninę sistemą, taip paskatinama antikūnų gamyba, stimuliuojama fagocitozė, interferonų ir citokinų produkcija (4). Puikus netiesioginio poveikio pavyzdys Propionibacterium acnes, ši bakterija paskatina riebalų rūgščių išsiskyrimą ant odos paviršiaus, taip sukuriama rūgštinė aplinka ir užkertamas kelias Streptococcus pyogenes augimui (3) Natūrali odos mikrobiota Natūrali organizmo mikrobiota kolonizuojasi ne tik ant odos paviršiaus, bet ir ant plaukų, plauko folikuluose, odos perėjimo į gleivinę vietose (ties šnervėmis, burna ir analine anga). Skirtingose vietose vyrauja nevienodos bakterijos (1, 5), jų pasiskirstymo dėsningumai pateikti lentelėje (1 lentelė). Ankstesniuose tyrimuose buvo nustatyta, kad vienos iš labiausiai paplitusių sveikų šunų odoje esančių bakterijų yra koaguliazės neišskiriantys stafilokokai, tokie kaip Staphylococcus epidermidis ir Staphylococcus xylosus, hemoliziniai streptokokai, Micrococcus spp., Clostridium spp., Propionibacterium acnes, Acinetobacter spp. ir įvairūs gramneigiami aerobai. Escherichia coli, Proteus mirabilis, Corynebacterium spp., Bacillus spp. ir Pseudomonas spp. laikomi trumpalaikiais rezidentais šunų odoje (6). Kitos bakterijos, tokios kaip Bacillus spp. ir Staphylococcus pseudintermedius, paplitusios daugiausia ant šunų plaukų ir plaukų folikuluose. S. pseudintermedius dažnai išskiriamas iš šnervių, burnos bei tarpvietės srities ir yra laikomas šiuose regionuose gyvenančios mikrobiotos dalimi (7). 10

11 1 lentelė. Natūralios odos mikrobiotos pasiskirstymas skirtingose kūno dangos vietose (5) Gleivinių Odos paviršius Plaukai Plauko folikulai pakraščiai Micrococcus spp. Micrococcus spp. Staphylococcus Micrococcus spp. Gramneigiami Propionibacterium pseudintermedius Alfa hemoliziniai aerobai acnes (šnervės, burna, streptokokai Bacillus spp. Streptococcus spp. analinė anga) Koaguliazei neigiami S. Staphylococcus Bacillus spp. epidermidis, S. xylosus pseudintermedius Staphylococcus Propionibacterium acnes pseudintermedius Clostridium spp. Acinetobacter spp. Gramneigiami aerobai Naujausiuose tyrimuose nustatyta mikroorganizmų rūšinė sudėtis tam tikra prasme nedaug skiriasi nuo sudėties, kuri buvo nustatoma naudojant klasikinius kultivavimo metodus. Tačiau naujausi tyrimai atskleidė, kad mikrobiotos įvairovė šunų odoje yra kur kas didesnė (8). Tyrimai parodė, kad ant sveikų šunų odos gyvena žymiai daugiau mikroorganizmų bendruomenių nei ant sergančiųjų šunų odos (9). Didesnis mikroorganizmų skaičius rastas plaukuotose kūno vietose (ties alkūne, ant ausies kaušelio bei dorsalinėje nosies srityje) nei ties gleivinėmis (šnervės, lūpos, konjunktyva) (8). Moksliniais tyrimais, naudojant naujos kartos sekoskaitą, nustatyti dažniausiai pasitaikantys taksonai, kolonizuojantys sveikų šunų odą. Skirtinguose odos ir gleivinės paviršiuose buvo rasta Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes ir Cyanobacteria skyrių atstovai (10, 11). Tačiau mėginiuose, paimtuose nuo alkūnės, ausies kaušelio bei nosies po proteobakterijų, pagal dažnumą seka Bacteroidetes bei Actinobacteria skyriams priklausančios bakterijos. Rezultatai, gauti surinkus mėginius nuo perianalinės odos srities, buvo dar šiek tiek kitokie, kuomet daugiausiai buvo nustatytos proteobakterijos, po jų Firmicutes, Bacteroidetes, Fusobacteria, ir Actinobacteria (11) (2 pav.). 11

12 2 pav. Kultivuojama ir nekultivuojama šuns odos mikrobiota skirtingose odos vietose (11) 1.3. Patogeniniai odos mikroorganizmai Pastaruoju metu klinikinėje praktikoje vis rečiau aptinkami obligatiniai gyvūnų, ypatingai gyvūnų augintinių bakterinės kilmės ligų sukėlėjai. Dažniausiai išskiriamos oportunistinės bakterijos, kurių patogeniškumą vertinti yra sunku. Bakterinėmis odos ligomis sergančiųjų šunų odoje dažniau kolonizuojasi didesnis skaičius stafilokokų lyginant su sveikų šunų odos mikrobiota (9). Daugeliu atveju vyrauja koaguliazę gaminantys stafilokokai, būtent, S. pseudintermedius, retesniais atvejais išskiriami S. aureus, S. hyicus ar Staphylococcus schleiferi (subsp. Schleiferi arba Coagulans). Kitos, būtent gramneigiamos bakterijos, anot kai kurių šaltinių, randamos kaip antrinės, nors taip pat galinčios sukelti infekcijas (12). Literatūros duomenimis, tokios bakterijos kaip Escherichia coli, Proteus mirabilis, Corynebacterium spp., Bacillus spp. ir Pseudomonas spp. yra vienos iš dažniausiai aptinkamų sąlyginai patogeninių ar patogeninių bakterijų šunų odoje (5). Staphylococcus spp. dažnai nustatomas ir alergizuotų šunų odoje, kas apsunkina diferencinę infekcinės ligos ir alergijos sukelto uždegimo diagnostiką (11). Palyginimui pateikta diagrama, rodanti mikrobiotos skirtumus sveikų ir sergančiųjų (esant alergijai) šunų odoje (3 pav.) 12

13 3 pav. Mikrobiotos įvairovė sveikų ir alergizuotų šunų skirtingose odos vietose (11) Iki šiol yra atlikta nemažai tyrimų, kuriais buvo norima išsiaiškinti, kaip pakinta odos mikrobiota gyvūnams susergant odos ligomis. Nustatyta, kad įjautrintiems šunims alergenai sukelia disbakteriozę, dėlto vietoje įprastos mikrobiotos pradeda aktyviai daugintis patogeninės bakterijos (10). Pirmomis dienomis sparčiai didėja Corynebacteriaceae šeimos bakterijų skaičius, maždaug po savaitės pradeda sparčiai augti Staphylococcaceae šeimos bakterijos ir ypatingai S. pseudintermedius (11). Pasitaiko atvejų, kuomet vienam organizmui normali mikrobiota kitam gyvūnui gali būti patogeninė. Tokie atvejai lengviau pastebimi, pavyzdžiui kuomet gyvūnai susipeša, esant kąstinėms žaizdoms. Natūrali kitų gyvūnų rūšių, pavyzdžiui, kačių burnos mikrobiota (Pasteurella multocida, beta hemoliziniai streptokokai, Corynebacterium spp., Actinomyces spp., Bacteroides spp., Fusobacterium spp.) patekusi į šuns žaizdą gali tapti patogeniška ir sukelti įvairias odos ligas. Taip pat galima ir žarnyno mikrobiotos kontaminacija į žaizdas, ypač tais atvejais, kai gyvūnas nuolat save laižo, yra odos pažeidimų ir gilesnių žaizdų. Taip žarnyno anaerobai, patekę į žaizdą ar kraują, tampa patogeniniai atsiskleidžia jų virulentiškumo veiksniai. Iš tokių patogeninių bakterijų literatūroje aprašomos Actinomyces spp., Clostridium spp., Peptostreptococcus spp., Bacteroides spp., Fusobacterium spp. ir Prevotella spp. (5). 13

14 1.4. Šunų odos susirgimai ir juos predisponuojantys veiksniai Dauguma odos ligų yra uždegiminio pobūdžio. Organizmo atsakomoji reakcija į infekciją priklauso nuo daugelio veiksnių: nuo organizmo reaktyvumo, odos receptorių būklės bei sensibilizacijos (3). Odos ligų pasireiškimui turi įtakos tam tikri predisponuojantys veiksniai, tokie kaip: hiperjautrumas (atopinis dermatitas, blusų įkandimo sukeltas hiperjautrumas, alerginis kontaktinis dermatitas, hiperjautrumas pašarui), odos ragėjimo sutrikimai, autoimuminiai ar medžiagų apykaitos sutrikimai, amžius bei veislė (1, 5). Svarbu paminėti tai, kad lyties predisponacija nebuvo nustatyta (13). Taip pat didelę reikšmę turi tokie veiksniai, kaip laikymo sąlygos, higiena, aplinka, metų laikas ir kita (10). Yra nustatyta veislės predisponacija, pagal kurią galima lengviau identifikuoti ligą bei sukėlėją. Atlikti tyrimai rodo, kad didesnė rizika susirgti odos bakterinėmis ligomis yra šių veislių šunims: bokseriams, bulterjerams, kokerspanieliams, prancūzų buldogams, foksterjerams, vokiečių aviganiams, auksaspalviams retriveriams, labradoro retriveriams, dobermanams, pudeliams, šarpėjams, ir Vakarų Škotijos baltiesiems terjerams (14). Pateikiama keletas šunų veislių ir jiems būdingų susirgimų: bokseriams dažniausiai pasireiškia alerginis dermatitas, demodekozė; auksaspalviams retriveriams celiulitas ir piotrauminis dermatitas; dobermanams demodekozė ir bakterinis folikulitas; vokiečių aviganiams gilioji piodermija, malassezia spp. sukeltas dermatitas, alerginis dermatitas, perianalinės fistulės ir daugelis kitų (1). Taip pat yra pastebėta ir amžiaus predisponacija, tačiau ji ne tokia ryški. Jauniems, iki 6 mėnesių amžiaus šuniukams dažniau nustatoma demodekozė, dermatofitozė, dermoidinės cistos, pėdučių hiperkeratozė, celiulitas bei šuniukų piodermija. Vyresniems, iki 3 metų šunims galima įtarti atopinį dermatitą, histiocitomą, nosies veidrodėlio hiperkeratozę bei kitus odos susirgimus. Vidutinio amžiaus ir senesniems šunims yra didesnė odos neoplazijų tikimybė (13). Dermatologinėmis ligomis sergantiems šunims dažniausiai pasireiškia niežulys, stebimas odos paraudimas, nusikasymas, alopecija, rečiau galima pastebėti pustulių, žaizdų. Tam tikrų specifinių simptomų pasireiškimas priklauso nuo to, kas sukelia odos pažeidimus. Sukėlėjai gali būti įvairūs: bakterijos, virusai, grybai, ektoparazitai, taip pat dermatologiniai susirgimai gali pasireikšti dėl metabolizmo ar endokrininės sistemos sutrikimų, esant hiperjautrumui ir alergijai (5) Bakterinės odos infekcijos Piodermija bakterinis odos uždegimas, pasireiškiantis tam tikrose kūno vietose: ant kūno šonų, pilvo, uodegos, snukio srityje, lūpų kampuose (15). Šia liga labiausiai linkę sirgti šunys, nes jų epidermio raginis sluoksnis yra labai plonas, plaukuotos odos storis siekia vos 0,1 0,5 mm, o tuo tarpu 14

15 pėdos ir nosies veidrodėlio odos storis gali siekti iki 1,5 mm (5). Taip pat šunų odoje yra nedidelis kiekis tarpląstelinės emulsijos lyginant su kitomis gyvūnų rūšimis. Be to, plauko folikulo kaklelis yra atviras, be riebalų kamščio, kas vėlgi neapsaugo nuo patogeno patekimo į gilesnius odos sluoksnius (12). Odos ligų pasireiškimui turi įtakos ir įvairūs pažeidimai (įbrėžimai, nubrozdinimai ar įtrūkimai), padidėjusi odos drėgmė dėl prastos ventiliacijos, nuolatinio laižymosi, maudymosi, suintensyvėjusios riebalų bei prakaito liaukų sekrecijos (15). Dėl odos paviršiaus mikroaplinkos pokyčių sutrinka odos ekosistema, odoje esantys mikroorganizmai, tokie kaip S. pseudintermedius, tampa patogeniški. Patogeniniai stafilokokai sparčiai dauginasi, lengvai kolonizuoja uždegimišką bei seborėjišką odą (12). Dažniausiai pastebima eritema ir kailio išplikimai, taip pat jaučiamas nemalonus odos kvapas (15). Piodermija tradiciškai klasifikuojama pagal bakterinės infekcijos gylį į paviršiaus, paviršinę ir giliąją. Paviršiaus ir paviršinė piodermija yra ribojama epidermio ir nesiskverbia gilyn pro pamatinę membraną. Gyvūnai jaučia niežulį, matomos papulės, pustulės bei šašai, susidariusios šlapiuojančios žaizdos. Tuo tarpu gilioji piodermija prasiskverbia pro pamatinę membraną į dermą ir gilesnius audinius (1). Pažeidimai būna labai skausmingi, odoje atsiveria opos, matomos hemoragiškos žaizdos, tačiau niežėjimas yra retesnis (15). Tokia piodermijos klasifikacija vyravo anksčiau ir ji yra naudinga nustatant ligos prognozę bei numatomą gydymo trukmę, tačiau diagnozuojant ligą ir sukėlėją nėra labai tikslinga. Pasiūlyta probleminė klasifikacija, remiantis klinikiniais požymiais: Seborėjinė piodermija, kuriai būdinga odos eksudacija ir eritema; Papulės, pustulės, židininė alopecija ir odos pleiskanojimas; Erozijos ir opos; Opos ir šlapiuojančios žaizdos; Mazgeliai ir regioninis patinimas (16) Seborėjinė piodermija Seborėjinei piodermijai priskiriama bakterinis peraugimo sindromas bei odos raukšlės piodermija (16). Bakteriniui peraugimo sindromui būdinga eritema, hiperpigmentacija bei glitni keratoseborėjinė eksudacija (17). Šis sindromas pasireiškia tik suaugusiems šunims, gali būti idiopatinės kilmės ar kilti kaip antrinė liga dėl alerginio dermatito. Pagrindinis ligos sukėlėjas yra S. pseudintermedius (12). Nuo šia liga sergančių šunų dažniausiai sklinda nemalonus kvapas, gyvūnai nuolatos kasosi ir laižosi. Daugiausia pažeidimų matoma ant pilvo, ausų kaušelių ir tarpupirščių (17). Odos raukšlės, dar kitaip vadinama paviršiaus piodermija yra odos raukšlių infekcija, kurią sukelia nuolatinis dirginimas, prasta odos raukšlių ventiliacija bei nuolatinė drėgmė. Dažniausiai 15

16 identifikuojami ligos sukėlėjai Staphylococcus pseudintermedius ir Pseudomonas spp. bakterijos (5). Susirgimas būdingas brachicefalinių veislių šunims snukio srityje (4 pav.), buldogams ties uodegos odos raukšle, nutukusioms patelėms vulvos srityje, o tuo tarpu šarpėjams, dėl didelio kūno raukšlėtumo, pažeista gali būti bet kuri odos vieta (16). Nuolatinis akių ašarojimas, tekančios seilės ar šlapimo nelaikymas taip pat gali turėti įtakos ligos pasireiškimui (12). Pažeista oda yra drėgna, riebi ir paraudusi, pastebimas balkšvas, dvokiantis eksudatas (16). 4 pav. Odos raukšlės piodermija (5) Papulės, pustulės, židininė alopecija ir odos pleiskanojimas Papulės, pustulės, odos pleiskanojimas ir židininė alopecija dažniausiai matomos esant Impetigo sindromui, bakteriniui folikulitui bei paviršinei plintančiai piodermijai (16). Šuniukų piodermija arba kitaip juvenilinis Impetigo tai pustulinė neužkrečiama epidermio raginio sluoksnio liga, pasireiškianti 2 9 mėnesių amžiaus šuniukams dėl prasto šėrimo, esant bakterinei infekcijai ar dėl parazitų invazijos (15). Pustulės lokalizuojasi tose kūno vietose, kur mažesnis plaukuotumas ant pilvo, pažastyse ir kirkšnyse, dažniausiai matoma geltoni šašai, galimas odos niežulys (12). Iš pažeistų odos vietų dažniausiai išskiriama Staphylococcus spp. bakterijos (5). Senesni, imunosupresiški šunys taip pat gali turėti panašių pažeidimų su didelėmis suglebusiomis ar įtemptomis pustulėmis (pūslinis Impetigo) (16). Bene dažniausia šunų piodermijos forma yra bakterinis folikulitas. Labiausiai linkę sirgti trumpaplaukiai šunys, pastebimos mažos, su plaukų folikulais susijusios paraudusios odos sritys, žiedinė alopecija, susivėlęs ir nutriušęs kailis, medaus spalvos šašai (18). Šios infekcijos pasireiškimui turi įtakos hiperjautrumas, endokrinopatijos bei ektoparazitai. Esant bent vienam iš išvardintų predisponuojančių veiksnių, gali pasikeisti odos mikrobiota ir pradėti daugintis patogeniniai stafilokokai. Dažniausiai nustatomi patogenai: S. pseudintermedius, S. schleiferi coagulans, S. schleiferi schleiferi, žymiai rečiau S. aureus. (19). Vyraujantis patogenas, sukeliantis paviršinę 16

17 piodermiją, yra S. pseudintermedius (18). Rečiau pasitaikantys mikroorganizmai, bet taip pat galintys sukelti bakterinį folikulitą, yra Streptococcus canis, Pseudomonas aeruginosa ir kitos gramneigiamos bakterijos (19). Paviršinė plintanti piodermija pasižymi dideliais, plintančiais ir besijungiančiais epidermio kolaretais (apvalūs odos pažeidimai su besilupančiu kraštu), eritema ir pleiskanojimu, galimos šlapiuojančios žaizdos (5 pav.). Šie pažeidimai būdingi ventralinėje kūno dalyje (16). 5 pav. Paviršinė plintanti piodermija (16) Odos erozijos ir opos Kiti, rečiau pastebimi klinikiniai požymiai erozijos ir opos. Jos matomos esant piotrauminiui dermatitui, gleivinių pakraščių piodermijai, o sunkiais atvejais ir odos raukšlės piodermijai (16). Piotrauminis dermatitas yra greitai besivystantis, paviršutiniškas, drėgnas, eksudacinis dermatitas, kurį paprastai sukelia patirta trauma. Esant lengvai ligos formai matomos drėgnos kailio vietos su nežymia odos paviršiaus erozija. Šie pažeidimai nėra labai ūmūs ar pavojingi gyvybei, tačiau dėl pažeistose vietoje esančios bakterinės infekcijos jaučiamas stiprus niežulys (20). Ilgainiui tai gali išsivystyti į paviršinį folikulitą arba giliąją furunkuliozę su alopecija, eritema, papulėmis, erozija ir galiausiai opomis. Pažeista oda sustorėja, tampa labai skausminga. Kartais būna sunku atskirti paviršinę formą nuo gilios, tad geriausia atlikti histologinį tyrimą (21). Kitas, ganėtinai dažnas susirgimas yra odos gleivinės jungties piodermija. Šis bakterinis odos susirgimas pasireiškia tose kūno vietose, kur oda pereina į gleivinę: burnos srityje, ant lūpų (6 pav.), prie išangės, apyvarpės ar vulvos. Matoma eritema, odos patinimas bei šašai, po to seka fistulių, erozijų ir opų formavimasis, žaizdos kraštai su balkšvais kraštais (22). Etiologija nėra aiški, bet manoma, kad predisponuojantys veiksniai yra hipersensibilizacija bei endokrininės ligos, taip atveriamas kelias antrinei bakterinei infekcijai (15). Ši piodermijos forma gali būti kliniškai ir histopatologiškai labai panaši į imuninės sistemos sukeltas ar neoplastines ligas, tad dažnai būna nustatoma klaidinga diagnozė. Tačiau pritaikius tinkamą antibiotikų kursą ir tinkamą 17

18 antimikrobinę medžiagą, pasiekiamas visiškas pasveikimas, kas ir leidžia diferencijuoti susirgimą nuo kitų anksčiau minėtų ligų (16). 6 pav. Gleivinės pakraščių piodermija (16) Opos ir šlapiuojančios žaizdos Opos ir šlapiuojančios žaizdos pasireiškia sergant giliajai piodermijai/ furunkuliozei. Tai dermos bakterinė infekcija, kuomet yra pažeidžiami plauko folikulai (furunkuliozė) ir patogenas lengvai pereina per odos apsauginius barjerus į gilesnius odos sluoksnius (15). Gilioji piodermija yra daug rečiau pasireiškianti liga nei paviršinė piodermija. Šią piodermiją sukeliantis patogenas yra Staphylococcus spp., tačiau uždegiminiame procese dalyvauja ir kitos gramneigiamos bakterijos (23), tokios kaip Pasteurella multocida ir Bacteroides spp. (5). Predisponuojantys veiksniai: demodekozė, hipotiroidizmas, blusų sukeltas hiperjautrumas, veislė, hiperadenokorticizmas, nutukimas, nuolatinis šuns savęs laižymas. Esant giliajai piodermijai matomos hemoraginės pūslės, fistulės, šašai bei susiformavę randai. Eksudatas gali būti pūlingas ar su kraujo priemaiša, oda patinusi, esant lėtinei formai oda sustorėjusi (15). Kai kurios giliosios piodermijos formos yra apribotos tam tikroje kūno vietoje, tad yra išskiriami specifiniai sindromai: nuospaudų piodermija, tarpupirščių furunkuliozė, snukio furunkuliozė ar dar kitaip vadinama šunų aknė (7 pav.) (15). Aknė dažniausiai diagnozuojama jaunesnio amžiaus šunims, taip pat nustatyta ir veislės predisponacija: anglų buldogai, bokseriai, mastifai serga dažniau (5). Kitos giliosios piodermijos formos yra išplitusios ir gali sukelti sisteminę ligą (16) 18

19 7 pav. Snukio furunkuliozė (5) Išskirtinai vokiečių aviganiams pasireiškia tam tikra giliosios piodermijos forma, kuomet pažeidimai matomi lateralinėse kojų srityse, ant šonų bei kirkšnyse. Sergantys šunys paprastai būna iki 5 metų amžiaus. Manoma, kad šią specifinę piodermiją predisponuoja daugelis veiksnių, tokių kaip alergijos, ektoparazitai, endokrinopatijos ir aišku genetinis polinkis (1). Kita, retai diagnozuojama piodermijos forma yra Pseudomonas spp. furunkuliozė, kuomet pastebimos skausmingos, paraudusios odos sritys, papulės, pustulės, hemoraginės pūslės, opos ir šašai ant nugaros bei šonų. Manoma, kad šiam susirgimui turi įtakos dažnas gyvūno maudymas ir grumingavimas (24) Mazgeliai arba regioninis patinimas Įvairūs mazgeliai ir regioninis patinimas matomas esant celiulitui bei abscesui. Abscesas apribotas pūlingas darinys, dažniausiai susiformuojantis poodyje ar dermoje, celiulitas labiau išplitęs ir pasiskirstęs tarp odos sluoksnių. Šunims abscesai susiformuoja po peštynių, susikandžiojimų, tokiu atveju bene visada išskiriami sukėlėjai yra S. pseudintermedius ir Escherichia coli bakterijos. O tuo tarpu celiulitas dažniausiai būna kaip antrinis susirgimas po demodekozės ar absceso. Pažeidimai pastebimi ant snukio, galūnių ar uodegos, rečiau ant nugaros ir pilvo (12, 13). Celiulito atveju oda paprastai būna nepažeista, tačiau gali būti beatsiveriančių žaizdų, iš kurių teka kraujingas serozinis, sunkesniais atvejais pūlingas eksudatas (8 pav.) (25). 19

20 8 pav. Celiulitas po demodekozės susirgimo (12) Yra išskiriami du pagrindiniai celiulito sukėlėjai S. aureus, kuomet pastebimi karbunkulai, furunkulai, poodiniai abscesai, bei Staphylococcus pyogenes, pastarosios forma būna labiau išplitusi, nepastebima pūlingo eksudato (12). Tokios pažeistos odos sritys labai skausmingos. Nekrozinis fascijitas (raumens ar organo fascijos uždegimas) yra reta, bet sunki celiulito forma, susijusi su bakterijų išskiriamais toksinais ir pastarųjų pasiskirstymu organizme. Ši forma greitai progresuoja, pradžioje matomas odos tynis ir nekrozė, vėliau prasideda gilesnių audinių infekcija ir septicemija, kuri būna mirtina (25) Bakterijų identifikavimas Norint nustatyti ligos diagnozę ir tinkamai parinkti gydymą labai svarbu tiksliai identifikuoti ligos sukėlėją. Tam naudojami tiek klasikiniai, kiek molekuliniai tyrimai. Dauguma bakterijų izoliatų yra greitai ir tiksliai identifikuojami pasitelkiant tradicinius metodus: bakterijos priskiriamos tam tikrai genčiai vertinant morfologinius požymius (kolonijos dydį ir spalvą), mikroskopuojant nudažytą pagal Gramą tepinėlį ar atliekant greitus biocheminius tyrimus katalazės ir (arba) oksidazės aktyvumui nustatyti (26). Dažniausiai bakterijas galima identifikuoti greičiau nei per 24 valandas, po to kai konkreti kolonija yra persėta į tam tikras pasirinktas terpes. Kadangi tradicinis metodas yra sąlyginai nebrangus ir nesudėtingas, tai nėra didelio poreikio naudoti sudėtingesnius tyrimo metodus, tokius kaip molekuliniai tyrimai. Tačiau pasitaiko atvejų, kuomet modernūs tyrimai padeda sutaupyti laiko ir tiksliai identifikuoti bakteriją iki rūšies (26, 27). Šiuo metu pasiūloje yra įvairių bakterijų identifikavimo testų, kurių pagrindas yra hibridizacijos reakcija. Šie testai padeda greitai identifikuoti sukėlėjus, tačiau tik tuo atveju, kai mikroorganizmų rūšis yra nuspėjama (27). Kuomet bakterijų neįmanoma identifikuoti tradiciniais metodais ar kitais greitaisiais biocheminiais testais, kai išskirtos bakterijos yra nežinomos ir norima identifikuoti jų rūšį, 20

21 atliekamas molekulinis identifikavimo būdas bakterijų identifikavimas sekvenuojant 16S rrnr genų seką, kuri yra randama visose bakterijose. 16S rrnr geno seka yra apie 1550 bp ilgio, tad šis genas yra gana didelis ir turintis pakankamai tarpspecifinių 16S rrnr geno polimorfizmų, kad būtų galima atskirti statistiškai pagrįstus matavimus (28). Deja, 16S rrnr genų sekos nustatymas nėra idealus identifikavimo būdas visoms bakterijoms. Šis metodas nėra tinkamas norint atskirti skirtingas bakterijų gentis, tokias kaip Escherichia coli ir Shigella spp., kurių 16S rrnr genų sekos panašumas siekia daugiau nei 99 proc. (29) Bakterijų kultivavimas ir jautrumas antibiotikams Antibiotikų naudojimas smulkiųjų gyvūnų veterinarinėje praktikoje tapo svarbiu ir prieštaringai vertinamu klausimu. Yra žinoma, kad odos ligos sudaro nuo 20 iki 25 proc. neteisingai nustatytų diagnozių ir paskirtų gydymų, tad tikėtina, kad tai sudaro didžiąją neteisingai naudojamų antimikrobinių medžiagų dalį (16). Ligos diagnozė turi būti patvirtinta naudojant citologiją, bakterijų kultivavimą bei jautrumo antibiotikams tyrimus. Antimikrobiniai vaistai neturėtų būti naudojami spekuliatyviai tik remiantis klinikiniais požymiais (18). Atliekant citologinį tyrimą, galima aptikti peraugusių bakterijų kolonijas, kurioms būdingas didelis skaičius bakterijų, dažnai kelių skirtingų formų. Dažniausiai matomi stafilokokai, pastarieji yra palyginti dideli kokai, kurie dažnai sudaro dviejų ar aštuonių organizmų išsidėstymą. Streptokokai yra mažesni ir sudaro grandines, mikrokokai ir enterokokai taip pat yra maži, tačiau sudaro netaisyklingas grupes. Lazdelinės bakterijos lengvai atsiskiria nuo kokų; bene labiausiai paplitusios rūšys yra Pseudomonas spp. ir Proteus spp. (16). Tokios bakterijos kaip stafilokokai turi gana lengvai nuspėjamą antimikrobinio jautrumo modelį, o empirinis gydymas dažnai būna sėkmingas. Tačiau esant gyvybei pavojingoms infekcijoms, kuomet bakterijų jautrumas antibiotikams nėra nuspėjamas, patartina atlikti išsamesnius tyrimus bakterijų kultivavimą ir nustatyti jautrumą antimikrobinėms medžiagoms (30). Dažniausiai atliekamas disko difuzijos testas, tam naudojami antibiotikais impregnuoti popieriniai diskai. Jei bakterijos yra jautrios antibiotikams, aplink diską (slopinimo zona) matoma skaidri zona, kurioje bakterijos negali augti. Slopinimo zona lyginama su apibrėžtais standartais (EUCAST, CLSI) ir nustatoma ar bakterijos yra jautrios, vidutiniškai jautrios ar atsparios tam tikram antibiotikui (31) Dažniausiai naudojamos antimikrobinės medžiagos gydant bakterines odos ligas Bene dažniausi bakterinės odos infekcijos sukėlėjai yra koaguliazei teigiami stafilokokai, o Staphylococcus pseudintermedius (SIG) yra pagrindinis šunų piodermijos sukėlėjas. Buvo atlikta 21

22 daugybė tyrimų, apibūdinančių SIG izoliatų jautrumą antibiotikams, iš kurių matyti, kad jautrumas antibiotikams skiriasi (32). Laikui bėgant padidėjo bakterijų izoliatų skaičius, kurie atsparūs vienai antimikrobinei medžiagai ar atsparūs daugeliui vaistų, tad prieš paskiriant gydymą visada rekomenduojama nustatyti jautrumą antimikrobinėms medžiagoms (31,32). Šunų piodermijai gydyti antibiotikai turėtų būti parenkami atsižvelgiant į jų gebėjimą įsiskverbti į odą ir į jautrumo antibiotikams duomenis (23). Sisteminiai antibiotikai turi būti skiriami esant išplitusiai, giliajai ar atsinaujinančiai piodermijai, vaistus rekomenduotina skirti mažiausiai dvejoms savaitėms, o po klinikinių požymių išnykimo gydymą reiktų pratęsti dar dvejoms savaitėms (18, 32). Nustatyta, kad cefovecinas veiksmingiausias gydant paviršinę piodermiją, o amoksicilinas su klavulato rūgštimi veiksmingas esant giliajai piodermijai. Taip pat paviršinei piodermijai gydyti efektyvūs ir klindamicinas, cefadroksilas, trimetoprimas su sulfametoksazolu, sulfadimetoksinas su ormetoprimu, o giliajai piodermijai gydyti tinka cefadroksilas, cefovecinas. Atsižvelgiant į gydymo efektyvumo ir jautrumo duomenis galima sėkmingai parinkti tinkamiausią antimikrobinę medžiagą (33, 34). Aišku reiktų nepamiršti, kad oda yra didžiausias kūno organas, o kraujo tiekimas yra palyginti prastas, tad gydant piodermiją, antibiotikai turėtų būti skiriami viršutinėje jų dozių diapazono dalyje. Be abejo, būtina rinktis žemiausios pirmos kartos antibiotikus, norint išvengti antimikrobinio atsparumo(32). Vis daugiau kalbama apie piodermijos gydymo efektyvumą vietiškai naudojant šampūnus. Taikant kartu ir vietinę terapiją greičiau atsistato pažeistos odos vietos, sutrumpėja antimikrobinių medžiagų skyrimo laikas (35) bei mechaniškai pašalinama pažeista odos pluta, kurioje gausu patogeninių bakterijų (18). Yra pateikta daug duomenų, įrodančių, kad vien tik vietinės terapijos taikymas yra efektyvus gydymo būdas esant lokalizuotiems pažeidimams, ankstyvai generalizuotai piodermijos stadijai ar kai pažeidimai yra lengvi (35). 22

23 2. DARBO METODIKA 2.1. Tyrimų vieta ir objektai Eksperimentiniai tyrimai atlikti LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos institute metais. Medžiaga tyrimams pristatyta iš įvairių veterinarijos gydyklų Kauno, Vilniaus, Klaipėdos ir kitų rajonų, didžiausias mėginių skaičius gautas iš dr. Leono Kriaučeliūno smulkiųjų gyvūnų klinikos. Medžiagą tyrimams pristatė veterinarijos specialistai transportinėse terpėse su lydraščiais. Tyrimams naudoti mėginiai iš šunų klinikinės medžiagos, esant įvairioms odos infekcijoms. Surinkus mėginius jie buvo sugrupuoti pagal šuns veislę, kailio plauko ilgį, amžių ir lytį Tiriamųjų bakterijų išskyrimas Gauti mėginiai iškart po pristatymo buvo įsėti į standžias mitybines terpes. Tiesiai ant mitybinių terpių paviršiaus tamponėliu buvo išvedžiojama apie 1/3 lėkštelės ploto. Tuomet atlikti sėjimai naudojant sterilią bakteriologinę kilpelę, išvedžiojama štrichais, kad gauti atskiras mikroorganizmų kolonijas, įvertinti kultūrų augimo gausumą ir vienalytiškumą. Tyrimams buvo naudojama universali mitybinės terpė Columbia agar su 5 proc. avino krauju (Biolife, Italija) (9 pav.), bei keletas selektyvių terpių Cetrimide Agar (Liofilchem, Italija), Slanetz- Bartley Agar (Liofilchem, Italija), Mannitol Salt Agar (Liofilchem, Italija), Endo Agar (Thermo Fisher, Jungtinė Karalystė). Bakterijos buvo kultivuotos termostate +35 ºC temperatūroje (10 pav.), kasdien peržiūrint bakterijų augimą ant terpių. 9 pav. Bakterijų augimas mitybinėje terpėje (autoriaus nuotrauka) Išaugusios bakterijų kolonijos buvo vertinamos pagal jų kiekį universalios terpės paviršiuje (įvertinta, ar mėginyje yra reikiamas kiekis bakterijų ar tai tik kontaminacija imant mėginį), taip pat 23

24 vertintas kolonijų vienalytiškumas, buvo atrinktos atskiros bakterijų kolonijos tolimesniam pagausinimui ir identifikavimui. 10 pav. Termostatas bakterijų kultivavimui (autoriaus nuotrauka) 2.2. Išskirtų bakterijų identifikacija Bakterijų identifikacija klasikinės mikrobiologijos metodais Bakterijų identifikavimas buvo atliekamas klasikiniais metodais, naudojant komercines identifikacijos sistemas Microbact (Thermo Fisher, JAV) (11 pav.) bei nustatant biochemines jų savybes standartiniuose stikliniuose mėgintuvėliuose su angliavandeniais. Rezultatai interpretuoti naudojant kompiuterinę programą Microbact Bakterijų identifikacijai atlikti grynos kultūros buvo įsėjamos į komercines sistemas ar mėgintuvėlius, prieš tai paruošus 0,5 McFarland vieneto drumstumo bakterijų suspensiją. 11 pav. Komercinė identifikacijos sistema Microbact (autoriaus nuotrauka) 24

25 Vertinant rezultatus komercinėse sistemose, laikyta, kad rūšis identifikuota, jei identifikavimo tikslumas buvo ne mažiau kaip 90 proc. Esant bakterijų gentims, kurioms nėra skirtų biocheminių testų arba kurios yra biochemiškai neaktyvios, taip pat nustačius mažesnį identifikavimo patikimumo procentą, identifikacija buvo atlikta naudojant molekulinius metodus Bakterijų identifikacija molekulinės biologijos metodais Atliekant bakterijų identifikaciją molekulinės mikrobiologijos metodais prieš tai buvo išskirta bakterijų DNR. Keletas bakterijų kolonijų, augančių standžioje terpėje, buvo suspenduojama 200 μl vandens, be DNAzių. Suspensija virinama 5 min. kratyklėje su kaitinimo funkcija (BioSan, Latvija), tada greitai atšaldoma ir centrifuguojama g greičiu. Supernatantas su DNR nusiurbiamas ir iki tyrimų laikomas šaldiklyje. Bakterijų identifikacijai naudota 16S rrnr sekoskaita. Norint ją atlikti, pirmiausiai turi būti atliekamas PGR panaudojant bakterijoms universalų pradmenį 515R. Reakcijai atlikti naudotas komercinis rinkinys,,draem Taq Green PCR Master Mix (Thermo Fisher, JAV) su polimeraze, tiriamųjų bakterijų DNR ir pradmuo. Reakcija vykdyta termocikleryje (BOECO, Vokietija) (12 pav.). DNR sintezė buvo vykdoma 30-čia ciklų, kuriuos sudaro: DNR denatūracija (94 C, 30s), pradmenų prilipinimas (55 C, 1 min), DNR sintezė (72 C, 30s). 12 pav. Termocikleris (autoriaus nuotrauka) Gelyje DNR fragmentai išfrakcionuoti elektroforezės aparatu (Cleaver, Jungtinė Karalystė), o jiems išryškinti panaudota gelių dokumentavimo sistema,,geldoc (Ultraviolet Products, Vokietija) (13 pav.). 25

26 13 pav. Gelių dokumentavimo sistema,,geldoc (autoriaus nuotrauka) Gavus PGR produktą, buvo atliktas jo valymas ir koncentravimas. Tuo tikslu naudotas Zymo Research (USA) komercinis rinkinis,,dna Clean & Concentrator (15 pav.) Išgryninti produktai išsiųsti sekoskaitai atlikti į,,baseclear kompanijos laboratoriją (Nyderlandai). Naudojant kompiuterinę programą,,molecular Evolutionary Genetic Analysis software (MEGA, version 6) buvo išanalizuotos gautos sekos. Pasitelkiant bazinių lokalių išsidėstymų įrankį (BLAST) sekos buvo palygintos su sekomis, esančiomis nacionalinio biotechnologijos informacijos centro (NCBI, JAV) duomenų bazėse registruotomis DNR sekomis. Gauti duomenys išanalizuoti ir pagal tai sudarytas identifikuotų bakterijų rūšių filogenetinis medis. 15 pav. Komercinis rinkinys,, DNA Clean & Concentrator (autoriaus nuotrauka) 2.3 Bakterijų jautrumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimas Atliekant bakterijų jautrumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimą grynos kultūro buvo sėjamos ant Mueller Hinton agaro (Thermo Fisher, Jungtinė Karalystė). Gaminant terpę buvo nustatomas ir 26

27 esant reikalui koreguojamas jos ph, tam naudotas natrio šarmo tirpalas. Laminarinėje traukos spintoje į Petri lėkšteles 4 mm storiu buvo išpilstomos terpės, jų ph svyravo tarp 7,2 iki 7,6. Atliekant jautrumo tyrimą steriliame fiziologiniame tirpale buvo pagaminama 0,5 McFarland standarto tankio bakterijų suspensija, kuria buvo suvilgomas sterilus vatos tamponėlis ir juo išvedžiojamas visas terpės paviršius. Vienalytei suspensijai gauti naudota purtyklė, o bakterijų tankis matuotas optiniu tankio matuokliu (BioSan, Latvija) (16 pav). 16 pav. Optinio tankio matuoklis (autoriaus nuotrauka) Keletą minučių padžiovinus terpes ant jų specialiu dispenseriu (Oxoid, Jungtinė Karalystė) buvo uždedami antibiotikų diskai (17 pav.). Šiuose diskuose esančios antimikrobinių medžiagų koncentracijos parinktos pagal EUCAST (Europos) standartą. Tyrimų rezultatai vertinti matuojant milimetrine liniuote sterilios zonos diametrą. Zona, kurioje bakterijų padermė neaugo, buvo laikoma sterilia zona. 17 pav. Terpė su antibiotikų diskais (autoriaus nuotrauka) 27

28 Gauti rezultatai interpretuoti remiantis EUCAST klinikiniais lūžio taškais. t.y. buvo įvertintas kiekvienos medžiagos efektyvumas kiekvienai tirtajai bakterijų rūšiai, kuriai šiuo metu yra sukurti galiojantys standartai (2, 3 lentelės). Jei EUCAST standarte nebuvo interpretacijos atskiriems antibiotikams, jie vertinti remiantis CLSI standartu. 2 lentelė. Klinikiniai lūžio taškai stafilokokams, mm Interpretacija Antibiotikas Jautru Vidutiniškai Atsparu jautru Penicilinas Cefoksitinas 22 (25 S. epidermidis) 21 (24 S. epidermidis) Gentamicinas 22 (18 S. aureus) 21 (17 S. aureus) Enrofloksacinas Trimeto-sulfa Eritromicinas Tetraciklinas lentelė. Klinikiniai lūžio taškai enterobakterijoms, mm Antibiotikas Interpretacija Jautru Vidutiniškai Atsparu jautru Cefaleksinas Gentamicinas Enrofloksacinas Trimeto-sulfa Amoksicilinas Amoxi/clav Ampicilinas Bakterijų padermės, kurios buvo atsparios ne mažiau kaip trims skirtingų antibiotikų klasių antimikrobinėms medžiagoms, naudojamoms gydymui, buvo laikytos daugiaatspariomis. 2.4 Statistinė duomenų analizė Statistinė duomenų analizė atlikta naudojantis kompiuterinėmis programomis: Microsoft Excel 2007 ir SPSS. Diagramos apdorotos naudojant Microsoft Excel 2007 programa, Chi kvadrato kriterijus skaičiuotas naudojant SPSS programą. Gauti rezultatai laikomi statistiškai reikšmingais, kuomet p<0,05, p<0,01, p<0,001; statistiškai nereikšmingi kuomet p>0,05. 28

29 Atvejų skaičius 3. REZULTATAI 3.1 Rizikos veiksniai, predisponuojantys šunų bakterines odos ligas Veislė Tyrimo metu buvo ištirta 50 šunų, iš jų 6 buvo mišrūnai, kiti grynaveisliai šunys (17 skirtingų veislių). Iš pateiktos diagramos matyti (18 pav.), kad daugiausia bakterinėmis odos ligomis sirgo vokiečių aviganiai (14 proc.), mišrūnai ( 12 proc.), taip pat Jorkšyro terjerai bei Vakarų Škotijos baltieji terjerai (po 10 proc.). Tačiau atlikus statistinę duomenų analizę nustatyta, kad skirtumas tarp šunų veislių, sergančių bakterinėmis odos ligomis, nėra statistiškai reikšmingas (p>0,05) Šunų veislės 18 pav. Skirtingų veislių šunų (n=50) sergamumas bakterinės kilmės odos ligomis Tiriamieji veisliniai šunys taip pat buvo suskirstyti į dvi grupes pagal plauko ilgį: trumpaplaukiai ir ilgaplaukiai. Iš pateiktos diagramos matyti (19 pav.), kad ilgaplaukiai šunys (25 atvejai) nežymiai dažniau sirgo bakterinėmis odos ligomis nei trumpaplaukiai šunys (19 atvejų). Atlikus statistinę duomenų analizę nustatyta, kad skirtumas tarp tiriamųjų grupių nėra statistiškai reikšmingas, šunų plauko ilgis neturi įtakos ligos pasireiškimui (p>0,05). 29

30 43,18% 56,82% Trumpaplaukiai Ilgaplaukiai 19 pav. Sergamumas bakterinėmis odos infekcijomis priklausomai nuo šunų (n=44) plauko ilgio Amžius Tiriamieji gyvūnai buvo suskirstyti pagal amžių į tris amžiaus grupes: šunys iki vienerių metų amžiaus, šunys nuo vienerių iki penkerių metų amžiaus ir šunys, vyresni nei penkeri metai. Daugiausia sergančių (60 proc.) šunų buvo nuo 1 iki 5 metų amžiaus (30 atvejų), taip pat didelę dalį sudarė vyresni nei 5 metų šunys (14 atvejų) (20 pav.). Mažiausiai segančių šunų buvo pirmoje amžiaus grupėje (6 atvejai). Vidutinis sergančiųjų šunų amžius siekė 4,2 ± 0,46 metus. 28,0% 12,0% 60,0% <1 m. 1-5 m. >5 m. 20 pav. Skirtingų amžiaus grupių šunų (n=50) sergamumas bakterinėmis odos ligomis Atlikus statistinę duomenų analizę nustatyta, kad šunų amžius turi įtakos bakterinės odos infekcijos pasireiškimui, šunų sergamumas 1 5 metų amžiaus grupėje yra 2 kartus dažnesnis (p<0,001) už vyresnių nei 5 metų amžiaus grupės šunų sergamumą ir 5 kartus dažnesnis (p<0,001) už iki 1 metų amžiaus grupės šunų sergamumą. 30

31 Atvejų skaičius Lytis Tiriamieji šunys buvo sugrupuoti pagal lytį. Iš pateiktų duomenų matyti (21 pav.), kad patelės bakterinėmis odos ligomis sirgo neženkliai dažniau (28 atvejai) nei patinai (22 atvejai) Atlikus statistinę duomenų analizę nustatyta, kad gyvūno lytis neturi įtakos bakterinės odos ligos pasireiškimui, skirtumas tarp tiriamųjų grupių nėra statistiškai reikšmingas (p>0,05). 44,0% 56,0% Patinas Patelė 21 pav. Skirtingos lyties šunų (n=50) sergamumas bakterinėmis odos ligomis Susisteminus duomenis matyti (22 pav.), kad iki vienerių metų amžiaus grupėje patelių ir patinų sergamumas buvo vienodas (po 6 proc.). Nuo 1 iki 5 metų amžiaus grupėje patelės sirgo nežymiai dažniau (32 proc.) nei patinai (28 proc.). Vyresnių nei 5 metų amžiaus grupėje taip pat dažniau sirgo patelės (18 proc.) nei patinai (10 proc.) <1 m. 1-5 m. >5 m. Amžiaus grupės, m. Patinas Patelė 22 pav. Skirtingų amžiaus grupių patelių ir patinų (n=50) sergamumas bakterinėmis odos ligomis 31

32 3.2. Odos ligų sukėlėjų genčių įvairovė Tyrimo metu buvo ištirta 50 šunų, sergančių bakterinėmis odos ligomis, paimti mėginiai ir išskirti bei identifikuoti bakterinių ligų sukelėjai (23 pav.). Daugiau nei pusė (55,56 proc.) išskirtų ligos sukelėjų sudarė Staphyloccocus genties bakterijos (45 atvejai). Taip pat ganėtinai didelis kiekis išskirta Enterococcus spp. (8 atvejai) bei Bacillus spp. (5 atvejai). Kitos bakterijų rūšys: Corynebacterium spp. (4 atvejai), Proteus spp. (4 atvejai) sudarė po 4,94 proc. iš visų išskirtų mikroorganizmų. Po keletą atvejų išskirta Micrococcus spp. (3 atvejai), Pseudomonas spp., Actinomyces spp. ir Weisella spp. (po 2 atvejus). Likusią dalį (7,41 proc.) sudarė mikroorganizmai, išskirti po 1 kartą: Streptococcus sp., Escherichia sp., Acinetobacter sp., Pasteurella sp., Klebsiella sp., Macrococcus sp. Staphylococcus spp. Enterococcus spp. 4,94% 2,47% 6,17% 2,47% 4,94% 9,88% 3,70% 2,47% 7,41% 55,56% 1,23% 1,23% 1,23% 1,23% 1,23% 1,23% Corynebacterium spp. Pseudomonas spp. Bacillus spp. Actinomyces spp. Proteus spp. Micrococcus spp. Weissella sp. Escherichia sp. Acinetobacter spp. Pasteurella sp. Klebsiella sp. Macrococcus sp. Streptococcus sp. 23 pav. Bakterinių odos ligų sukelėjai, išskirti iš odos ligomis sirgusių šunų (n=50) Atlikus statistinę duomenų analizę nustatyta, kad išskirtų bakterijų pasiskirstymas skiriasi statistiškai reikšmingai: Staphylococcus spp. bakterijos išskirtos 6 kartus dažniau (p<0,001) nei Enteroccocus spp., 9 kartus dažniau (p<0,001) nei Bacillus spp. ir 11 kartų dažniau (p<0,001) nei Corynebacterium spp. ar Proteus spp. bakterijos. Bakteriologinių tyrimų metu iš skirtingų mėginių buvo išskirta po vieną ar kelias bakterijų rūšis. Pagal tai mėginiai buvo suskirstyti į dvi grupes (24 pav.). Pirmąją grupę sudarė mėginiai, iš kurių 32

33 išskirta vienos rūšies bakterijos (31 mėginys), antrąją grupę sudarė mėginiai, iš kurios išskirta mišri mikrobiota (19 mėginių). 38,0% 62,0% Gryna bakterijų kultūra Mišri bakterijų kultūra 24 pav. Bakterinių odos ligų sukelėjų grupės Susisteminti duomenys, kai iš mėginių išaugo tik vienas aiškus numatomas odos ligos sukėlėjas, pateikti diagramoje (25 pav.). Iš pateiktų duomenų matyti, kad dažniausiai nustatomas sukelėjas yra Staphylococcus spp. (24 atvejai), pastarasis išskirtas 12 kartų dažniau (p<0,001) nei Weissella spp. (2 atvejai). Kitos bakterijos, tokios kaip Corynebacterium sp., Acinetobacter sp., Actinomyces sp., Proteus sp. ir Micrococcus sp. buvo identifikuotos tik po 1 kartą: 3,23% 3,23% 3,23% 4,0% 3,% 3,23% Staphylococcus spp. Corynebacterium sp. Weissella spp. Acinetobacter sp. Actinomyces sp. 82,0% Proteus sp. Micrococcus sp. 25 pav. Vienos rūšies bakterijų padermės (n=31), išskirtos iš bakteriologinių ėminių 33

34 Iš viso buvo išskirta 45 stafilokokų padermės (26 pav), daugiau nei pusė (26 atvejai) stafilokokų nebuvo fenotipiškai identifikuota iki rūšies. Aiškiai vyraujantis bakterinių odos ligų sukelėjas yra Staphylococcus pseudintermedius (10 atvejų), kuris identifikuotas 5 kartus dažniau (p<0,05) nei Staphylococcus hyicus ar Staphylococcus saprophyticus (po 2 atvejus). Kitos rūšys, kaip, kad Staphylococcus aureus, Staphylococcus delphini, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus epidermidis ir Staphylococcus haemolyticus, išskirtos tik po 1 kartą. Staphylococcus spp. Staphylococcus pseudintermedius 20,0% Staphylococcus hyicus 4,44% 4,44% 2,22% Staphylococcus saprophyticus 11,11% 2,22% 2,22% Staphylococcus delphini 60,0% 2,22% 2,22% Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis 26 pav. Odos ligas sukeliančių stafilokokų rūšinis pasiskirstymas (n=45) 3.3. Išskirtų bakterijų jautrumas antimikrobinėms medžiagoms Nustatytas Staphylococcus spp. jautrumas antimikrobinėms medžiagoms (27 pav.). Iš pateiktų duomenų matyti, kad didžiausias jautrumas buvo cefoksitinui (38 atvejai iš 39) bei cefaleksinui (43 atvejai iš 44), jiems jautrumas atitinkamai siekė 97,44 ir 95,56 proc. Be to, efektyviai veikė ir enrofloksacinas (40 atvejai iš 45), kiek mažiau efektyvi buvo sulfametoksazolo ir trimetoprimo kombinacija (31 atvejis iš 43), kur jautrumas siekė 72,09 proc. Makrolidų klasės antibiotikai taip pat dažnai buvo efektyvūs: 57,89 proc. bakterijų padermių buvo jautrios eritromicinui (22 atvejai iš 38). Mažesnis nei 50 proc. jautrumas nustatytas tetraciklinui ir gentamicinui (po 21 atvejį iš 44) bei penicilinui (17 atvejų iš 40). 34

35 Antimikrobinės medžiagos Cefaleksinas 95,56 2,22 2,22 Amoksicilinas su klavulano r. 84,44 15,56 Tetraciklinas 47,73 6,82 45,45 Eritromicinas 57,89 5,26 36,84 Sulfametoksazolis/trimetoprimas 72,09 11,63 16,28 Enrofloksacinas 88,89 8,89 Gentamicinas 48,84 51,16 Cefoksitinas 97,44 2,56 Penicilinas 42,50 57,50 0% 20% 40% 60% 80% 100% Mėginių skaičius, proc. jautru vidutiniškai jautru atsparu 27 pav. Staphylococcus spp. padermių jautrumas antibakterinėms medžiagoms Atlikus statistinę duomenų analizę nustatyta, kad bakterijų jautrumas cefaleksinui buvo 2 kartus didesnis (p<0,05) nei gentamicinui, taip pat bakterijų jautrumas amoksicilinui su klavulano rūgštimi ir penicilinui skiriasi statistiškai reikšmingai (p<0,05). Tuo tarpu stafilokokų padermių jautrumas tetraciklinui bei eritromicinui (p>0,05) ar gentamicinui ir penicilinui (p>0,05) nesiskiria statistiškai reikšmingai. Taip pat palyginta kitos grupės bakterijų Enterobacteriaceae šeimos jautrumas antimikrobinėms medžiagoms. Iš pateiktos diagramos matyti (28 pav.), kad didžiausias jautrumas yra sulfametoksazolo ir trimetoprimo kombinacijai bei enrofloksacinui (po 5 atvejus iš 6), taip pat daugiau nei pusė tirtų bakterijų buvo jautrios gentamicinui (4 atvejai iš 6). Tuo tarpu bakterijų jautrumas amoksicilinui, amoksicilinui su klavulano rūgštimi ir cefaleksinui tesiekia 50 proc. (po 3 atvejus iš 6). Atlikus statistinę duomenų analizę nustatyta, kad Enterobacteriaceae šeimos padermių jautrumas cefaleksinui ir gentamicinui, sulfametoksazolo ir trimetoprimo kombinacijai bei enrofloksacinui, amoksicilinui su klavulano rūgštimi ir gentamicinui nesiskiria statistiškai reikšmingai (p>0,05). 35

36 Antimikrobinės medžiagos Amoksicilinas 50,0 50,0 Amoksicilinas su klavulano r. 50,00 50,0 Cefaleksinas 50,0 50,0 Enrofloksacinas 83,33 16,67 Gentamicinas 66,67 33,33 Sulfametoksazolis-trimetoprimas 83,33 16,67 0% 20% 40% 60% 80% 100% Mėginių skaičius, proc. jautru vidutiniškai jautru atsparu 28 pav. Enterobacteriaceae šeimos padermių jautrumas antibakterinėms medžiagoms 3.4 Iš odos išskirtų bakterijų identifikacija molekulinės biologijos metodais Mėginiai, kurių nepavyko identifikuoti fenotipiškai, naudojant biocheminius ir kitus įprastus mikrobiologinius testus buvo identifikuoti sekoskaitos metodu, tiriant 16S rrnr subvieneto išskirtų bakterijų izoliatų sekas. Sekoskaita atlikta nepriklausomoje komercinėje tyrimų kompanijoje. Viso buvo paruošta 12 DNR mėginių sekoskaitai. Atlikus sekų analizę identifikuotos šios bakterijos: Macrococcus spp., Corynebacterium mucifaciens, Weissella cunfusa, Acinetobacter lwoffii, Bacillus pseudomycoides, Corynebacterium sp., Actinomyces coleocanis, Pasteurella canis, Staphylococcus epidermidis ir Corynebacterium ammoniagenes. Išanalizavus gautus duomenis buvo sudarytas bakterijų rūšių filogenetinis medis. (29 pav). 29 pav. Identifikuotų bakterijų rūšių filogenetinis medis 36

37 4. REZULTATŲ APTARIMAS Atlikus eksperimentinius tyrimus LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos institute metais ir ištyrus medžiagą iš įvairių veterinarijos gydyklų Kauno, Vilniaus, Klaipėdos ir kitų rajonų, nustatyta, kad labiausiai bakterinėmis odos ligomis sirgo vokiečių aviganiai (14 proc.), Jorkšyro terjerai (10 proc.), Vakarų Škotijos baltieji terjerai (10 proc.), taip pat nemažą dalį sudarė mišrūnai (12 proc.). Panašius tyrimo rezultatus pateikia V. H. Shyma ir K. Vijayakumar, kurie teigia, kad didžiausias ligos pasireiškimas buvo nustatytas vokiečių aviganiams (26 proc.) bei labradoro retriveriams (19 proc.) (36). Tuo tarpu J. F. Summers ir kt. atlikto tyrimo duomenimis, nustatyta, kad daugiausia bakterinių odos susirgimų nustatyta labradoro retriveriams (61,9 proc.), Vakarų Škotijos baltiesies terjerams (54,8 proc.) ir Stafordšyro butlerjerams (50,7 proc.), o sirgusių vokiečių aviganių buvo mažiau (38,6 proc.) (37). Iš pateiktų duomenų matyti, kad vokiečių aviganiai labiausiai yra linkę sirgti bakterinėmis odos ligomis. Kitos dekoratyvinės šunų veislės, tokios kaip Jorkšyro terjerai ar Vakarų Škotijos baltieji terjerai taip pat dažnai serga odos ligomis, tai gali lemti hiperjautrumas pašarui ar dažnas gyvūno maudymas, šukavimas ar trimingavimas, procedūros, kurių metų pažeidžiamas odos paviršinis sluoksnis. Palyginus gyvūnus pagal kailio plauko ilgį, nustatyta, kad ilgaplaukiai šunys (56,82 proc.) sirgo nežymiai dažniau nei trumpaplaukiai šunys (43,18 proc.). Tam gali turėti įtakos prastesnė kailio priežiūra, nepakankamas kailio išdžiūvimas po maudynių, ar esant didesnei aplinkos drėgmei. Tačiau šis skirtumas nebuvo labai ryškus, atlikus statistinę duomenų analizę, matoma, kad skirtumas nebuvo statistiškai reikšmingas, tad šunų kailio plauko ilgis neturėjo įtakos ligos pasireiškimui (p>0,05). Tiriant gyvūnus pagal amžių, nustatyta, kad daugiausia sergančių šunų buvo nuo 1 iki 5 metų amžiaus (60,0 proc.) taip pat didelę dalį sudarė vyrensi nei 5 metų šunys (28,0 proc.). Vidutinis sergančių šunų amžius 4,2 metai. Matoma, kad šunų amžius turi įtakos bakterinių odos ligų pasireiškimui (p<0,001). Pasak V. H. Shyma ir K. Vijayakumar, didžiausias sergamumas nustatytas 1 3 metų amžiaus grupėje (42,85 proc.) (36), o J. F. Summers ir kt. teigia, kad vidutinis sergančių šunų amžius yra 5 metai (39). Daroma išvada, kad didžiausia dalis sergačiųjų šunų buvo 1 5 metų amžiaus. Atlikus tyrimus ir palyginus gyvūnų sergamumą pagal lytį, nustatyta, kad 56,0 proc. sergančių odos bakterinėmis ligomis buvo patelės ir 44,0 proc. patinai. Skirtumas nėra statistiškai reikšmingas, tad šunų lytis neturi įtakos bakterinių odos ligų pasireiškimui (p>0,05). Labai panašūs rezultatai pateikiami ir V. H. Shyma ir K. Vijayakumar, kur teigiama, kad sergančių bakterinėmis odos ligomis 57,14 proc. buvo patelės ir 42,86 proc. patinai (36). Be to, M. L. Meneses ir kt. pateikti tyrimų rezultatai beveik identiški: 56 proc. sergančiųjų buvo patelės ir 44 proc. patinai (tik tiriamoji grupė 37

38 mažesnė, n=39) (38). Tai patvirtina ir A. P. Foster ir kt. teiginį, kad šunims, sergantiems odos bakterinėmis ligomis, nėra nustatyta lyties predisponacijos (13). Tyrimo metu iš sergančių bakterinėmis odos ligomis šunų paimti mėginiai ir išskirti bei identifikuoti bakterinių ligų sukelėjai. Nustatyta, kad 55,56 proc. išskirtų ligos sukelėjų yra Staphyloccocus genties bakterijos. 60 proc. stafilokokų nebuvo identifikuota fenotipiškai iki rūšies, 20 proc. sudarė S. pseudintermedius, kitos rūšys buvo išskirtos tik po keletą kartų (S. hyicus, S.aureus, ir kitos). Taip pat ganėtinai didelis kiekis išskirta Enterococcus spp. bei Bacillus spp., mažiau išskirta kitų mikroorganizmų, tokių kaip Micrococcus spp., Pseudomonas spp., Streptococcus sp., Escherichia sp. ir kitų. J. F. Summers ir kt. atlikto tyrimo duomenimis, dažniausiai išskiriami odos ligų sukelėjai yra koaguliazei teigiami stafilokokai, tokie kaip Staphylococcus pseudintermedius, taip pat dažnai išskiriami ir kiti stafilokokai: S. aureus, S. schleiferi, bei kitos bakterijos, tokios kaip: E.coli, Proteus mirabilis, Corynebacterium spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp. (37). Pasak M. L. Meneses ir kt. S. pseudintermedius sudaro 15 proc. visų išskirtų stafilokokų atvejų (38). Tad galima daryti išvadą, kad šunų bakterines odos ligas dažniausiai sukelia S. pseudintermedius padermės (p<0,05). Taip pat buvo nustatytas išskirtų Staphylococcus spp. bakterijų jautrumas antimikrobinėms medžiagoms. 97,44 proc. bakterijų buvo jautrios cefoksitinui. Efektyviai veikė ir cefaleksinas, jautrumas siekia 95,56 proc., bei enrofloksacinas jautrumas 88,89 proc. Kiek mažiau efektyvūs buvo amoksicilinas su klavulano rūgštimi ir sulfametoksazolio/trimetoprimo kombinacija, kur bakterijų jautrumas atitinkamai siekė 84,44 ir 72,09 proc. Makrolidų klasės antibiotikai taip pat dažnai buvo efektyvūs: 57,89 proc. padermių buvo jautrios eritromicinui. Tuo tarpu tetraciklinui, penicilinui ir gentamicinui nustatytas mažesnis nei 50 proc. Staphylococcus spp. bakterijų jautrumas. Pasak F. Ghidini, antibiotikai, tokie kaip cefadroksilas, cefaleksinas, chloramfenikolis, doksiciklinas, rifampicinas ir vankomicinas buvo veiksmingi daugiau nei prieš 50 proc. stafilokokų izoliatų, o tuo tarpu atlikti tyrimai Italijoje parodė, kad jautrumas yra dar didesnis (39). Pasak M. Vanni ir kt., visos S. intermedius padermės buvo visiškai jautrios amoksicilinui su klavulano rūgštimi, cefaleksinui, cefoperazonui, fuzidino rūgščiai, rifampicinui ir trovafloksacinui, proc. jautrumas nustatytas enrofloksacinui, gentamicinui, marbofloksacinui. (40). Iš šių rezultatų matoma, kad bakterijų izoliatų jautrumas antibiotikams skiriasi. Laikui bėgant padidėjo bakterijų padermių, atsparių daugeliui vaistų (t.y. atsparių trijų ar daugiau klasių antimikrobiniams vaistams) ir meticilinui atsparių bakterijų izoliatų skaičius. Be to, antimikrobinio jautrumo modeliai įvairiose šalyse skiriasi, todėl gydytojai turėtų remtis savo vietovės duomenimis. Šiame darbe buvo nustatytas Enterobacteriaceae šeimos bakterijų jautrumas antimikrobinėms medžiagoms. Atlikus tyrimus nustatyta, kad didžiausias jautrumas yra sulfametoksazolo ir 38

39 trimetoprimo kombinacijai ir enrofloksacinui, jautrumas siekia 83,33 proc., taip pat 66,67 proc. tirtų bakterijų buvo jautrios gentamicinui. Tuo tarpu bakterijų jautrumas amoksicilinui, amoksicilinui su klavulano rūgštimi ir cefaleksinui tesiekia 50 proc. Remiantis C. Ludwig ir kt. tyrimo duomenimis, iš sergančių šunų išskirtos E. coli atsparumas fluorochinolonams ir chloramfenikoliui buvo nuo 3,7 iki 4,6 proc., tuo tarpu visi izoliatai buvo visiškai jautrūs gentamicinui. Be to, beta laktaminiams antibiotikams buvo didelis atsparumas. Proteus mirabilis 3 proc. atsparumas nustatytas amoksicilinui su klavulano rūgštimi, marbofoksacinui ir chloramfenikoliui, o gentamicinui ir enrofloksacinui atsparumas svyravo nuo 12,8 iki 15,6 proc. (41). Vėlgi matomas skirtingas bakterijų jautrumas antimikrobinėms medžiagoms, tad prieš paskiriant gydymą būtina nustatyti išskirtų bakterijų jautrumą antibiotikams. Atsižvelgus į bakterijų jautrumą tam tikrai antimikrobinei medžiagai galima tinkamai parinkti gydymą. Pirmiausia rekomenduojama naudoti pirmos eilės antibiotikus, jie gerai toleruojami siauro ar plataus veikimo spektro, pasižymintis antistafilokokiniu aktyvumu. Tinkamai parinkti jie yra ne ką mažiau efektyvūs nei aukštesnės pakopos vaistai ir yra tinkami nekomplikuotos šunų piodermijos empiriniam gydymui. Pirmos eilės vaistams priskiriami cefadroksilas, cefaleksinas, amoksicilinas su klavulano rūgštimi, klindamicinas ir linkomicinas (32). Pagal J. F. Summers ir kt., gydant Staphylococcus spp. infekciją dažniausiai pasirenkami šie antibiotikai: amoksicilinas su klavulano rūgštimi (55,7 proc.), cefaleksinas (43,9 proc.) ir klindamicinas (10 proc.) (37). Pasak M.L. Meneses ir kt., dažniausiai gydymui pasirenkamas cefaleksinas (51 proc.) (38). Molekuliniais biologiniais tyrimais identifikuota 12 mėginių ir išskirtos bakterijos, tokios kaip Macrococcus sp. gramteigiama bakterija, prikausanti Staphylococcaceae šeimai. Šios bakterijos buvo išskirtos iš įvairių gyvūnų odos, taip pat buvo rasta mėsoje ir piene (42). Du kartus išskirta Weissella confusa gramteigiama bakterija, dažniausiai randama fermentuotuose maisto produktuose ir yra naudojama kaip probiotikas, tačiau ši bakterija taip pat gali sukelti sepsį ir kitas rimtas žmonių bei gyvūnų infekcijas (43). Taip pat išskirtos kitos patogeninės bakterijos, tokios kaip Pseudomonas sp. ir Staphylococcus epidermidis. Pastaroji yra gramteigiama koagulezei neigiama kokobakterija, anksčiau buvo laikoma kaip nepatogeninė komensalinė bakterija, dabar vis dažniau priskiriama potencialiai ar obligatiškai patogeniškiems mikroorganizmams (44). Pseudomonas sp. gramneigiama lazdelės formos bakterija, dažniausiai sukelia lėtinį išorinės ar vidurinės ausies uždegimą, tačiau retai išskiriamas iš odos. Bakterija gali būti išskirta iš šunų odos, sergančių lėtine gilia piodermija, kartu su kitais patogenais, tokiais kaip S. pseudintermedius ir E. coli (45). Kelios išskitos ir identifikuotos bakterijos randamos kaip organizmo natūrali mikrobiota Acinetobacter lwoffii ir Pasteurella canis, pastaroji maža gramneigiama kokobacila, priklausanti 39

40 Pasteurellaceae šeimai, ji yra normali sveikų naminių gyvūnų, ypač šunų, mikrobiotos dalis, bet gali tapti patogeninė kituose minkštuosiuose audiniuose (46). Acinetobacter lwoffii nefermentuojanti aerobinė gramneigiama bacila, kuri randama kaip burnos ryklės ir odos natūrali mikrobiota. Dėl savo unikalios prigimties, bakterija gali tapti patogenine ir sukelti septicemją, pneumoniją, odos ir žaizdų infekcijas (47). Kitos retai identifikuojamos bakterijų rūšys Corynebacterium mucifaciens ir Corynebacterium ammoniagenes. Pirmoji daugiausia buvo išskirta iš odos, kraujo ir kitų sterilių kūno skysčių (48). C. ammoniagenes pirma karta išskirta iš išmatų, dažniausiai sukelia odos bėrimus. Anksčiau buvo klasifikuojama kaip brevibakterija (Brevibacterium ammoniagenes), ji gramteigiama, netaisyklingos lazdelės ar ''V'' formos bakterija, dėstosi pavieniui ar grupėmis (49). Mažai pateikta duomenų apie Bacillus pseudomycoides ir Actinomyces coleocanis. Pastaroji mažai aprašyta patogeninė bakterija, pirmą kartą išskirta 2002 m. iš kalės makšties gleivinės (50). Bacillus pseudomycoides gramteigiama bacila, dėstosi pavieniui ar po kelis grandinėle, fenotipiškai labai panaši į Bacillus mycoides, tad šios bakterijos atskiriamos tik pagal DNR giminingumą (51). Prieduose pateikiama molekuliniais biologiniais tyrimais identifikuotų ir aprašytų bakterijų augimas mitybinėje terpėje bei būdinga morfologija (4 lentelė). 40

41 IŠVADOS 1. Sergamumą bakterinėmis odos ligomis predisponuoja šuns amžius (p<0,001), tuo tarpu, gyvūno veislė, kailio plauko ilgis ir lytis ligos pasireiškimui įtakos neturėjo (p>0,05). 2. Iš sergančių bakterinėmis odos ligomis šunų dažniausiai išskiriamos Staphylococcus genties bakterijos (55,56 proc.), o dažniausiai išskiriama rūšis S. pseudintermedius (p<0,05). 3. Staphylococcus genties bakterijos, sukeliančios šunų odos ligas, išlieka jautrios amoksicilinui su beta laktamazės slopikliu (klavulano rūgštimi) (84,44 proc.), pirmos ir antros kartos cefalosporinams (95,56 proc. ir 97,4 proc.) ir fluorochinolonams (88,89 proc.). 4. Enterobacteriaceae šeimos bakterijos dažniausiai buvo jautrios sulfametoksazolo ir trimetoprimo kombinacijai ir fluorochinolonams (83,3 proc.) S rrnr sekoskaita leidžia identifikuoti biocheminiais testais neidentifikuojamas bakterijas. Naudojant šią sekoskaitą, nustatyti tokie mikroorganizmai, kaip Corynebacterium mucifaciens, Weissella confusa, Bacillus pseudomycoides, Actinomyces coleocanis, Pasteurella canis, Corynebacterium ammoniagenes ir kiti, apie kuriuos duomenų kol kas yra labai nedaug, jie dar nėra plačiai aprašyti ar žinomi kaip galimi šunų infekcinių odos ligų sukėlėjai. 41

42 LITERATŪROS SĄRAŠAS 1. Jackson H, Marsella R. BSAVA Manual of Canine and Feline Dermatology. 3rd edition. Gloucester: British Small Animal Veterinary Association; p , Grice EA, Segre JA.The skin microbiome. Nature Reviews Microbiology 2013;9(4): Chiller K, Selkin AB, Murakawa GJ. Skin Microflora and Bacterial Infections of the Skin. Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings 2001;6(3): Chen YE, Tsao H. The skin microbiome: current perspectives and future challenges. Journal of the American Academy of Dermatology 2013;69(1): Paterson S. Manual of Skin Diseases of the Dog and Cat. 2nd edition. West Sussex: Wiley- Blackwell; p Miller WH, Griffin CE, Campbell K. Muller and Kirk s Small Animal Dermatology. 7th edition. Missouri: Saunders; p Harvey RG, Lloyd DH. The Distribution of Bacteria (Other Than Staphylococci and Propionibacterium Acnes) on the Hair, at the Skin Surface and within the Hair-Follicles of Dogs. Veterinary Dermatology 1995;6(2): Torres S, Clayton JB, Danzeisen JL, Ward T, Huang H, Knights D, Johnson TJ. Diverse bacterial communities exist on canine skin and are impacted by cohabitation and time. PeerJ [Internet]. 2017;5:3075 [cited 2019 Oct 05]. Available from: 9. Fazakerley J, Nuttall T, Sales D, Schmidt V, Carter SD, Hart CA, McEwan NA. Staphylococcal colonization of mucosal and lesional skin sites in atopic and healthy dogs. Veterinary Dermatology 2009;20(3): Cuscó A, Sánchez A, Altet L, Ferrer L, Francino O. Individual Signatures Define Canine Skin Microbiota Composition and Variability. Frontiers in Veterinary Science 2017;4: Hoffmann1 AR, Patterson AP, Diese A, Lawhon SD, Ly HJ, Stephenson CE, Mansel J, Steiner JM, Dowd SE, Olivry T, Suchodolski JS. The Skin Microbiome in Healthy and Allergic Dogs. Public Library of Science 2014;9(1): Jasmin P. Clinical Handbook on Canine Dermatology. 3rd edition. France: Virbac S.A.; p Foster AP, Foil CS. BSAVA Manual of Small Animal Dermatology. 2nd edition. Barcelona; British small animal veterinary association: p

43 14. Jaeger K, Linek M, Power HT, Bettenay SV, Zabel S, Rosychuk RAW, Mueller RS. Breed and site predispositions of dogs with atopicdermatitis: a comparison of five locations in threecontinents. Veterinary dermatology 2010;21(1): Schaer M, Gaschen FP. Clinical Medicine of the Dog and Cat. 3rd edition. Florida; CRC Press: p Beco L, Guaguère E, Lorente Mèndez C, Noli C, Nuttall T, Vroom M. Suggested guidelines for using systemic antimicrobials in bacterial skin infection: diagnosis based on clinical presentation cytology and culture. Veterinary Record 2013;172(3): Pin D, Carlotti DN, Jasmin P, DeBoer DJ, Prélaud P. Prospective study of bacterial overgrowth syndrome in eight dogs. Veterinary Record 2006;158(13): Bajwa J. Canine superficial pyoderma and therapeutic considerations. Canadian Veterinary Journal 2016;57(2): Morris DO, Rook KA, Shofer FS, Rankin SC. Screening of Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius, and Staphylococcus schleiferi isolates obtained from small companion animals for antimicrobial resistance: a retrospective review of 749 isolates ( ). Veterinary Dermatology 2006;17(5): Palmer L.E. Picture This: Management of Canine Pyotraumatic Dermatitis. Journal of Special Operations Medicine 2018;18(2): Holm BR., Rest JR., Seewald W. A prospective study of the clinical findings, treatment and histopathology of 44 cases of pyotraumatic dermatitis. Veterinary Dermatology 2014;15(6): Olivry T, Rossi MA, Banovic F, Linder KE. Mucocutaneous lupus erythematosus in dogs. BMC Veterinary Research 2015;26(4): Reddy BS, Sivajothi S. Therapeutic Management of Deep Pyoderma - A Clinical Study of Nine Dogs. International Journal of Science, Environment and Technology 2015;16(2): Hillier A, Alcorn JR, Cole LK, Kowalski JJ. Pyoderma caused by Pseudomonas aeruginosa infection in dogs. Veterinary Dermatology 2006;17(6): Naidoo SL, Campbell DL, Miller LM, Nicastro A. Necrotizing fasciitis: a review. Journal of the American Animal Hospital Association 2005;41(2): Váradi L, Luo JL, Hibbs DE, Perry JD, Anderson RJ, Orenga S, Methods PW. Methods for the detection and identification of pathogenic bacteria: past, present, and future. Chemical Society Reviews 2017;46(16):

44 27. Nascimento C, Albuquerque RF, Monesi N, Candido-Silva JA. Alternative Method for Direct DNA Probe Labeling and Detection Using the Checkerboard Hybridization Format. Journal of Clinical Microbiology 2010;48(8): Jensen KH, Dargis R, Christensen JJ, Kemp M. Ribosomal PCR and DNA sequencing for detection and identification of bacteria: Experience from 6 years of routine analyses of patient samples. AMPIS Journal of pathology, microbiology and immunology 2013;122(3): Ragupathi D, Sethuvel M, Inbanathan FY, Veeraraghavan B. Accurate differentiation of Escherichia coli and Shigella serogroups: challenges and strategies. New Microbes New Infect 2017;21: Guardabassi L, Fondati A. Prudent and rational use of antibiotics for treatment of canine and feline pyoderma. Veterinaria (Cremona) 2009;23(3): Schwarz S, Silley P, Simjee S, Woodford N, Duijkeren E, Johnson AP, Gaastra W. Assessing the antimicrobial susceptibility of bacteria obtained from animals. Veterinary Microbiology 2010;65(4): Beco L, Guaguère E, Méndez CL, Noli C, Nuttall T, Vroom M. Suggested guidelines for using systemic antimicrobials in bacterial skin infections (part 2): antimicrobial choice, treatment regimens and compliance. Veterinary Record 2013;172(6): Summers JF, Brodbelt DC, Forsythe P, Loeffler A, Hendricks A. The effectiveness of systemic antimicrobial treatment in canine superficial and deep pyoderma: a systematic review. Veterinary Dermatology 2012;23(4): Vlaenderen IV, Nautrup BP, Gasperc SM. Estimation of the clinical and economic consequences of non-compliance with antimicrobial treatment of canine skin infections. Preventive Veterinary Medicine 2011;99(2-4): Hillier A, Lloyd DH, J. Weese S, Blondeau JM, Boothe D, Breitschwerdt E, Guardabassi L, Papich MG, Rankin S, Turnidge JD, Sykes JE. Guidelines for the diagnosis and antimicrobial therapy of canine superficial bacterial folliculitis (Antimicrobial Guidelines Working Group of the International Society for Companion Animal Infectious Diseases). Veterinary Dermatology 2014;25(3): Shyma VH, Vijayakumar K. Epidemiolgical studines on bacterial skin infectios in dogs. J. Veterinary and Animal Science 2012;43: Summers JF, Hendricks A, Brodbelt D. Prescribing practices of primary care veterinary practitioners in dogs diagnosed with bacterial pyoderma. BMC veterinary research 2014;10(240):

45 38. Meneses ML, Martin PL, Manzuc P, Arauz MS, Pardo AG. Staphylococcus sp. antimicrobial treatment and resistance in canine superficial bacterial pyoderma. Revue de Medecine Veterinaire 2018;29(3): Ghidini F, Piancastelli C, Taddei S, Gandolfo E, Cavirani S, Cabassi CS. Antibiotic sensitivity of bacterial isolates from cases of canine dermatitis. New Microbiology 2011;34: Vanni M, Tognetti R, Pretti C, Crema F, Soldani G, Meucci V, Intorre L. Antimicrobial susceptibility of Staphylococcus intermedius and Staphylococcus schleiferi isolated from dogs. Research in Veterinary Science 2009;87(2): Ludwig C, Jong A, Moyaert H, Garch F, Janes R, Klein U, Morrissey I, Thiry J, Youala M. Antimicrobial susceptibility monitoring of dermatological bacterial pathogens isolated from diseased dogs and catsacross Europe (ComPath results). Journal of Applied Microbiology 2016;121(5): Brawand SG, Cotting K, Sanz EG, Collaud A, Thomann A, Brodard I, Campos SR, Strauss C, Perreten V. Macrococcus canis sp. nov., a skin bacterium associated with infections in dogs. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2017;67(3): Bernard KA, Wiebe D, Burdz T, Reimer A, Betty NG, Singh C., Schindle S, Pacheco AL. Assignment of Brevibacterium stationis (ZoBell and Upham 1944) Breed 1953 to the genus Corynebacterium, as Corynebacterium stationis comb. nov., and emended description of the genus Corynebacterium to include isolates that can alkalinize citrate. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2009;60(4): Rupp ME, Fey PD. Staphylococcus epidermidis and Other Coagulase-Negative Staphylococci. Part 3. Elsevier 2010;2: Hillier A, Alcorn JR, Cole LK, Kowalski JJ. Pyoderma caused by Pseudomonas aeruginosa infection in dogs: 20 cases. Veterinary dermatology 2006;17(6): Bongyoung K, Hyunjoo P, Kwang-hyun L, Yangsoon L. Identification of Pasteurella canis in a Soft Tissue Infection Caused by a Dog Bite: The First Report in Korea. Annals of Laboratory Medicine 2016;36(6): Regalado NG, Martin G, Antony SJ. Acinetobacter lwoffii, Bacteremia associated with acute gastroenteritis. Travel Medicine and Infectious Disease 2009;7(5): Djossou F, Bézian MC, Moynet D, Le Flèche-Matéos A, Malvy D. Corynebacterium mucifaciens in an immunocompetent patient with cavitary pneumonia. BMC Infectious Diseases 2010;10(1):

46 49. Bernard KA, Wiebe D, Burdz T, Reimer A, Betty NG, Singh C., Schindle S, Pacheco AL. Assignment of Brevibacterium stationis (ZoBell and Upham 1944) Breed 1953 to the genus Corynebacterium, as Corynebacterium stationis comb. nov., and emended description of the genus Corynebacterium to include isolates that can alkalinize citrate. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2009;60(4): Hoyles L, Falsen E, Foster G, Collins MD. Actinomyces coleocanis sp. nov., from the vagina of a dog. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2002;52(4): Luna VA, King DS, Gulledge J, Cannons AC, Amuso PT, Cattani J. Susceptibility of Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides and Bacillus thuringiensis to 24 antimicrobials using Sensititre automated microbroth dilution and Etest agar gradient diffusion methods. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2007;60(3):

47 PRIEDAI 4 lentelė. Kai kurių identifikuotų bakterijų augimo ir morfologinės savybės Bakterija Augimas mitybinėje terpėje Vaizdas tepinėlyje Macrococcus sp. Weissella confusa Corynebacterium mucifaciens 47

48 Acinetobacter lwoffii Pseudomonas sp. Bacillus pseudomycoides 48

49 Actinomyces coleocanis Pasteurella canis Staphylococcus epidermidis 49