SĄNARIO KREMZLĖS REGENERACIJOS TYRIMAI PANAUDOJANT ALOGENINIO KREMZLĖS IR KAULO KOMPLEKSO TRANSPLANTACIJĄ EKSPERIMENTINIAME MODELYJE

Transkriptas

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA Tomas Mickevičius SĄNARIO KREMZLĖS REGENERACIJOS TYRIMAI PANAUDOJANT ALOGENINIO KREMZLĖS IR KAULO KOMPLEKSO TRANSPLANTACIJĄ EKSPERIMENTINIAME MODELYJE Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai, medicina (06B) Kaunas, 2018

2 Disertacija rengta metais Lietuvos sveikatos mokslų universitete Medicinos akademijos Fiziologijos ir farmakologijos institute. Mokslinis vadovas doc. dr. Arvydas Ūsas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biomedicinos mokslai, medicina 06B). Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos medicinos mokslo krypties taryboje: Pirmininkė prof. dr. Ingrida Balnytė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biomedicinos mokslai, medicina 06B). Nariai: prof. dr. Alfredas Smailys (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biomedicinos mokslai, medicina 06B); prof. dr. Šarūnas Tarasevičius (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biomedicinos mokslai, medicina 06B); prof. dr. Valentinas Uvarovas (Vilniaus universitetas, biomedicinos mokslai, medicina 06B); dr. Volker Betz, (Ulmo universitetas (Vokietija), biomedicinos mokslai, medicina 06B). Disertacija ginama viešame medicinos mokslo krypties tarybos posėdyje 2018 m. rugpjūčio 30 d. 13 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų Didžiojoje auditorijoje. Adresas: Eivenių g. 2, Kaunas, LT-50161, Lietuva.

3 LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES MEDICAL ACADEMY Tomas Mickevičius REGENERATION OF ARTICULAR CARTILAGE AFTER ALOGENEIC OSTEOCHONDRAL TRANSPLANTATION IN EXPERIMENTAL ANIMAL MODEL Doctoral Dissertation Biomedical Sciences, Medicine (06B) Kaunas, 2018

4 Dissertation has been prepared at the Department of Physiology and Pharmacology of Medicine Academy of Lithuanian University of Health Sciences during the period of Scientific Supervisor Assoc. Prof. Dr. Arvydas Ūsas (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Medicine 06B). Dissertation is defended at the Medical Research Council of the Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences: Chairperson Prof. Dr. Ingrida Balnytė (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Medicine 06B). Members: Prof. Dr. Alfredas Smailys (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Medicine 06B); Prof. Dr. Šarūnas Tarasevičius (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Medicine 06B); Prof. Dr. Valentinas Uvarovas (Vilnius University, Biomedical Sciences, Medicine 06B); Dr. Volker Betz, (University of Ulm (Germany), Biomedical Sciences, Medicine 06B). Dissertation will be defended at the open session of the Medical Research Council of Lithuanian University of Health Sciences on the 30 th of August, 2018 at 1 p.m. at the Great Auditorium of the Hospital of Lithuanian University of Health Sciences Kauno klinikos. Address: Eivenių 2, LT Kaunas, Lithuania.

5 TURINYS SANTRUMPOS... 7 ĮVADAS DARBO TIKSLAS Tyrimo hipotezė Tyrimo tikslai ir uždaviniai DARBO NAUJUMAS LITERATŪROS APŽVALGA Bendra literatūros apžvalga METODIKA In vitro eksperimento etapas Naudota įranga Naudotos terpės Tyrimo eiga Elektromechaninių savybių vertinimas Chondrocitų gyvybingumo vertinimas Histologinis mėginių vertinimas Apoptozės vertinimas In vivo eksperimento etapas Naudota įranga Naudotos terpės In vivo etapo tyrimo eiga Trombocitais praturtintos plazmos paruošimas ir naudojimas Makroskopinis mėginių vertinimas Elektromechaninių savybių vertinimas Histologinis vertinimas Statistinė duomenų analizė REZULTATAI In vitro tyrimo rezultatai Elektromechaninės KKK savybės Chondrocitų gyvybingumas GAG pasiskirstymas KKK Histologinis KKK vertinimas Apoptozė KKK Koreliacijos tarp vertinimo kriterijų In vitro tyrimo rezultatų bendras aptarimas In vivo tyrimų rezultatai Makroskopinis vertinimas Transplantuotų KKK elektromechaninės savybės

6 Transplantuotų KKK histologinis vertinimas Transplantuotų KKK glikozaminoglikanų raiška Transplantuotų KKK vertinimo kriterijų koreliacijos DISKUSIJA In vitro rezultatų aptarimas In vivo rezultatų aptarimas IŠVADOS PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS DISERTACIJOS TEMA SUMMARY GYVENIMO APRAŠYMAS PADĖKA

7 SANTRUMPOS AA dgemri C DMEM DMMB DMSO ECM FBS GAG ICRS IGF-1 KKK LG MRT NMEM OA OAS OAT OATS OCA PBS PRP PSF QP RSI L-askorbininės rūgšties tirpalas (angl. ascorbic accid) kremzlės magnetinio rezonanso tyrimas, naudojant padidintą gadolinio koncentraciją mažos koncentracijos gliukozės tirpalas (angl. Low glucose Dulbecco's Modified Eagle s Medium) 1,9-dimetilmetileno mėlis dimetilsulfoksido tirpalas ekstraląstelinis tinklas jaučio embriono serumas (angl. Fetal bovine serum) glikozaminoglikanai tarptautinis kremzlės atsistatymo draugijos vertinimo balas (angl. International Cartilage Rrepair Society score) insulino augimo faktorius (angl. insulin growth factor-1) kremzlės kaulo kompleksas L-glutamino tirpalas magnetinio rezonanso tyrimas nepagrindinių amino rūgščių tirpalas (angl. Non-essential amino acids) osteoartritas Oswestry artroskopinė vertinimo skalė autologinė transplantacija KKK pernešimo sistema (angl. Osteochondral allograft transfer system) alogeninė transplantacija fosfatinis buferinis tirpalas (angl. Phosphate-buffered saline) trombocitais praturtinta plazma penicilino streptomicino fungizono tirpalas kiekybinis parametras raudonos spalvos intensyvumas 7

8 ĮVADAS Osteoartritas (toliau OA) labiausiai paplitusi degeneracinio pobūdžio liga, pažeidžianti sąnarius. Apžvalginėje 2013 m. apžvalginėje publikacijoje apibendrinti OA epidemiologiniai duomenys [65]. Jau 2005 m. buvo paskelbta, kad daugiau nei 26 milijonai žmonių Jungtinėse Amerikos Valstijose serga tam tikra OA forma. Nyderlandų gyventojų populiacijoje daugiau nei 20 procentų OA diagnozuojamas vyresniems nei 55 metų amžiaus vyrams bei vyresnėms nei 60 metų amžiaus moterims. OA sergančių moterų, vyresnių nei 50 metų, skaičius yra ženkliai didesnis nei vyrų. Masačiusetso universiteto tyrimų duomenimis, 240 iš asmenų per metus nustatoma kelio sąnario OA. Nyderlandų instituto duomenimis, OA paplitimas 1000 asmenų per metus siekia nuo 0,9 procentų tarp vyrų bei atitinkamai iki 1,6 procentų moterims. OA pasireiškia dėl įvairių priežasčių. Pirminio OA priežastys dažniausiai susijusios su organizmo amžiniais pokyčiais [65]. Antrinis OA dažniausiai pasireiškia iki 40 metų amžiaus. Jo pagrindinė priežastis yra trauma [80]. Dažniausiai įvairūs kremzlės pažeidimai yra nustatomi artroskopijų metu. Didelių kremzlės pažeidimų gydymas yra rimtas iššūkis ortopedui traumatologui [45, 72], kadangi gydymo taktikos parinkimas sąlygoja išeitis. Pavyzdžiui, atliekant artroskopines priekinio kryžminio raiščio rekonstrukcijos operacijas akivaizdūs kremzlės pakenkimai gali būti nematomi, o poperaciniai rezultatai visgi susiję su OA atsiradimu [56]. Tarp daugybės klinikinėje praktikoje taikomų gydymo būdų, autologinių kaulo kremzlės kompleksų (toliau KKK) transplantacija yra vienintelė, kuri gali anatomiškai ir funkciškai atstatyti pažeistą sąnario kremzlę. Autologinė KKK transplantacija yra vienas iš plačiausiai taikomų ir sėkmingiausių gydymo būdų. Šios operacijos turi tam tikrų apribojimų, t. y. sveikos kremzlės trūkumas sąnaryje bei po operacijos pasireiškiančia donorinės KKK vietos atrofija [47, 60]. Klinikinėje praktikoje taikoma autologinės KKK transplantacijos alternatyva alogeninė KKK transplantacijos operacijos. Šio tipo operacijos yra atliekamos, kai nėra galimybės atlikti autologinę KKK transplantacijos operaciją. Audinių bankai alogeninius KKK laiko skirtingomis sąlygomis. Pavyzdžiui, Lietuvoje praktikuojama alogeninius KKK šaldyti iki 80 C, kituose bankuose atsižvelgiama į individualius audinių banko protokolus. Literatūroje gausu informacijos apie autologinės kremzlės transplantatų prigijimo ir gerus integracijos į aplinkinį audinį rezultatus. Alogeninės transplantacijos atokieji rezultatai skelbiami literatūroje skiriasi. Potransplantaciniams atokiesiems rezultatams įtakos turi ir alogeninių KKK laikymo sąlygos ir trukmė, chondrocitų gyvybingumas, operacijos metu naudota 8

9 operacinė technika bei po operacijos skirtas gydymas. Potransplantacinius alogeninės ir autologinės KKK transplantacijos rezultatus galima palyginti tarpusavyje, kai yra žinoma defekto lokalizacija, traumos etiologija bei nustatyta kelio patologija [38, 107]. Alogeninių KKK laikymo sąlygos bei laikas turi tiesioginę įtaką KKK kokybei [17]. Audinių bankai ir ortopedai traumatologai taip pat susiduria su kita, ne ką mažesne, problema kaip tinkamai ir objektyviai nustatyti pradinius kremzlės pažeidimus, kurie objektyviai nėra matomi, simptomų nesukelia bei operacijos metu sunkiai arba visai nepastebimi [51, 99]. Net ir po chirurginiu požiūriu sėkmingai atliktų autologinių KKK transplantacijos operacijų, kurių metu naudojamos kokybiškos būklės KKK, praėjus 5 metams 37 procentams pacientų reikėjo operacijas pakartoti. Iš jų 87 procentai transplantuotų KKK buvo gyvybingi praėjus 5 metams po transplantacijos. Visgi 18 procentų pacientų autologinės KKK transplantacijos operacijos buvo nesėkmingos [34]. Sąnario kremzlė yra unikalus audinys, kuris atlaiko nuolatinį pasikartojantį mechaninį stresą. OA yra degeneracinio pobūdžio liga, susijusi su progresuojančiu kremzlės sudedamųjų dalių, dažniausiai glikozaminoglikanų (toliau GAG), netekimu. Chondrocitų metabolinio aktyvumo sumažėjimas ar apoptozė sąlygoja bei daro įtaką kremzlės audinio susidėvėjimui. Traumos ar didelių jėgų neteisingas pasiskirstymas sąnaryje lokaliai pažeidžia kremzlę, o tai vėliau sąlygoja vis didesnio pažeistos kremzlės ploto atsiradimą, kremzlės pažeidimą, o vėliau ir sąnario deformaciją. Kremzlę sudaro ne tik kremzlės ląstelės chondrocitai, tačiau ir chondrocitų formuojamas 3D tinklas, vadinamas ekstraląsteliniu matriksu (toliau ECM). ECM apykaitoje dalyvauja tiek chondrocitai, tiek biologiškai aktyvios medžiagos. Sugebėjimas pasipriešinti gniuždymo jėgai, slydimas bei elastingumas pagrindinės kremzlės savybės, kurios yra užtikrinamos ECM apykaitoje vykstančiais procesais. Neigiamą krūvį turinčios GAG molekulės pritraukia natrio jonus. Šie kremzlės audinyje sulaiko vandenį. Atsiradus kremzlės pažeidimams natrio jonai atsipalaiduoja nuo GAG ir tokiu būdu gali laisviau judėti ECM. Teigiamo ir neigiamo krūvio skirtumas lemia elektrinio potencialo atsiradimą. Makroskopinės vertinimo skalės negali tiksliai parodyti tik prasidedantį kremzlės pažeidimą, histologiniai tyrimai reikalauja ilgo laiko ir yra invazyvūs. Tobulėjant technologijoms atsirado naujų galimybių objektyviai įvertinti kremzlės būklę norimu metu. Viena iš tokių galimybių yra užregistruoti elektromechanines kremzlės savybes (toliau QP), kurios sąlygoja transliacijos potencialą (angl. streaming potential), gali būti registruojamos naujausiu aparatu Arthro-BST (Biomomentum Inc., Lavalas, Kvebekas, Kanada). Šis tyrimo būdas leidžia objektyviai ir nedestruktyviai įvertinti 9

10 sąnario kremzlės elektromechanines savybes bei nustatyti pažeidimą [99]. Operacijos metu svarbiausia greitai ir kokybiškai nustatyti beprasidedantį kremzlės pažeidimą, įvertinti jo plotą ar net pakartotinių operacijų metu stebėti kremzlės pažeidimo ar regeneracijos dinamiką. Šis tyrimo būdas gali būti taikomas taip pat ir audinių bankuose, siekiant įvertinti alogeninės KKK kokybę prieš transplantacijos operaciją. Dėl šios priežasties šiame moksliniame tyrime panaudotas naujausias Kanados mokslininkų grupės sukurtas aparatas siekiant įvertinti alogeninio KKK būklę išlaikius kremzlės kaulo kompleksus atitinkamomis sąlygomis bei po alogeninio KKK transplantacijos rezultatus, praėjus 3 ir 6 mėnesiams nuo transplantacijos operacijos. 10

11 1. DARBO TIKSLAS 1.1. Tyrimo hipotezė Mokslinėje literatūroje aprašytos kremzlės kaulo kompleksų laikymo sąlygos bei trukmė labai skiriasi. Transplantacijoms skirti alogeniniai kremzlės kaulo kompleksai laikomi skirtingų temperatūrų sąlygomis: nuo 80 C iki 4 C ir 37 C, skirtingos sudėties terpėse, skirtingą laiką (nuo 14 iki 56 dienų) [4, 17, 85]. Autoriai sutaria, kad kremzlės gyvybingumas yra svarbiausias rodiklis siekiant gerų potransplantacinių rezultatų. Mokslininkai nuolat ieško geresnių alogeninio kremzlės kaulo kompleksų išsaugojimo būdų ir priemonių gyvybingumui užtikrinti. Šio tyrimo hipotezė laikymo terpės sudėtis, temperatūra ir laikymo trukmė keičia alogeninio kremzlės kaulo komplekso savybes, kurios įtakoja atokiuosius alogeninės KKK transplantacijos rezultatus Tyrimo tikslai ir uždaviniai Šio tyrimo tikslas yra nustatyti optimalias alogeninio kremzlės kaulo komplekso laikymo sąlygas, kurioms esant kremzlės kaulo komplekso electromechaninės ir histologinės savybės, chondrocitų gyvybingumas, proteoglikanų raiška ir apoptotinių ląstelių kiekis būtų artimos autologiniam KKK ir užtikrintų geriausius alogeninės transplantacijos rezultatus.. Uždaviniai: 1. Išmatuoti ir palyginti kremzlės kaulo kompleksų eksplantų, laikytų skirtingomis sąlygomis ( 70 C, 4 C ir 37 C), skirtingos sudėties maitinamosiose (DMEM ir DMEM su IGF-1) terpėse skirtingą laiką (14 ir 28 dienas), elektromechanines savybes; 2. Nustatyti gyvybingų chondrocitų kiekį, morfologinius pokyčius, chondrocitų apoptozę, proteoglikanų raišką kremzlės kaulo kompleksų eksplantuose, laikytuose skirtingų temperatūrų ( 70 C, 4 C ir 37 C) sąlygomis, skirtingos sudėties maitinamosiose (DMEM ir DMEM su IGF-1) terpėse, skirtingą laiką (14 ir 28 dienas) bei palyginti gautus rezultatus tarp grupių; 3. Įvertinti ir palyginti alogeninio ir autologinio kremzlės kaulo komplekso transplantacijos rezultatus (elektromechanines savybes, makroskopinius bei histologinius pokyčius, proteoglikanų raišką) po 3 ir 6 mėnesių, panaudojus gyvybiškiausią optimaliomis sąlygomis laikytą alogeninį 11

12 kremzlės kaulo komplekso transplantatą, bei nustatyti koreliacijas tarp skirtingų KKK savybių vertinimo parametrų. 4. Išanalizuoti ir palyginti trombocitais praturtintos plazmos poveikį alogeninės ir autologinės KKK transplantacijos rezultatams. 12

13 2. DARBO NAUJUMAS Sąnario kremzlė yra unikalus audinys, kuris atlaiko nuolatinį pasikartojantį mechaninį stresą. Osteoartritas (OA) yra degeneracinio pobūdžio liga susijusi su progresuojančiu kremzlės sudedamųjų dalių, daugiausia proteoglikanų, netekimu. Chondrocitų metabolinio aktyvumo sumažėjimas ar apoptozė sąlygoja kremzlės audinio susidėvėjimą. Traumos ar didelių jėgų neteisingas pasiskirstymas sąnaryje lokaliai pažeidžia kremzlę, o tai vėliau lemia vis didesnio pažeisto kremzlės ploto atsiradimą ir sąnario deformaciją. Duomenų bazėse yra gausu informacijos apie laboratorinėmis sąlygomis laikomus chondrocitus, kremzles ar 3D konstruktus. Tyrimuose ypač pabrėžiama aplinkos temperatūros bei terpių sudedamųjų dalių kompozicijos svarba. Audinių bankai taip pat taiko moksliniais tyrimais įrodytas laikymo sąlygas: nuo 80 C iki 4 C ir 37 C, skirtingos sudėties terpėse, skirtingą laiką (nuo 14 iki 56 dienų) [4, 17, 85]. Tačiau pasigendama objektyvios potransplantacinių rezultatų analizės, kokį poveikį laikymo sąlygos daro transplantuotos KKK kokybei. Šiame moksliniame tyrime taikytos skirtingos KKK laikymo sąlygos, nuo 80 C iki 4 C ir 37 C, skirtingos sudėties terpėse, panaudojant IGF-1 arba be jo, skirtingą laiką 14 ir 28 dienas. Po operacijos bei praėjus vienam ir dviem mėnesiams po transplantacijos, į kairės užpakalinės kojos kelio sąnarį buvo leista autologinė PRP, siekiant stimuliuoti KKK integracijos procesą. Kremzlę sudaro ne tik kremzlės ląstelės chondrocitai, tačiau ir chondrocitų formuojamas 3D tinklas, ekstraląstelinis matriksas ECM. ECM apykaitoje dalyvauja tiek chondrocitai, tiek biologiškai aktyvios medžiagos. Sugebėjimas pasipriešinti gniuždymo jėgai, slydimas bei elastingumas pagrindinės kremzlės savybės, kurios yra užtikrinamos ECM apykaitoje vykstančiais procesais. Šiuolaikinės diagnostinės technologijos leidžia tiek tiesiogiai, tiek netiesiogiai įvertinti ECM būklę. Naujausiais gydymo metodais siekiama kremzlės audinį regeneruoti ląsteliniame lygmenyje, taip pat pasitelkus genų inžineriją ar slopinant kremzlėje vykstančius procesus užtikrinti kuo ilgesnį audinio gyvybingumą. ECM būklę galima įvertinti invaziniais ir neinvaziniais nedestrukciniais būdais. Viskas priklauso nuo tikslo, ką norima ištyrinėti. Nesant galimybių tyrimus atlikti laboratorinėmis sąlygomis galima stebėti šeimas, turinčias jungiamojo audinio patologiją (genetinis sutrikimas) [87] arba operacijų metu naudoti makroskopinio vertinimo skales (pvz., Oswestry arba vąšelio mėginį artroskopijos metu) [15]. Tiksliausias ir pats efektyviausias būdas nustatyti konkretų kremzlės pažeidimą ar pažeidimo mechanizmą yra įvairių histologinių ir imunohistocheminių tyrimų atlikimas. Tyrimuose labai svarbi dalis tenka pačių chondrocitų gyvybingumui ir apoptozei ar apoptozės mechanizmui nustatyti, 13

14 kadangi šios ląstelės ir gamina ECM struktūras. Negalima pamiršti ir imunofluorescensinių metodų, taikomų genų ekspresijos tyrimuose. Siekiant įvertinti paties ECM struktūrą, būtina kremzlėje pasitelkti ir kolageno raišką, kuri gali išryškinti pagrindinius audinio struktūros trūkumus. Proteoglikanų raiška įvertinama histologinio tyrimo metu (pvz., o-safranino, mėlynojo toluidino dažymas) bei vertinant įvairiomis histologinio vertinimo skalėmis (pvz., O Driscoll). Proteoglikanų netiesioginio kiekio tyrimams galima pasitelkti ir kompiuterines programas, kai matuojamas raudonos spalvos intensyvumas, kuris atvaizduoja proteoglikanų raišką [68] arba naudojant spektroskopinius metodus (pvz., DMMB). Praktikiniame darbe nustatant kremzlės pažeidimą kartais reikalingas daug greitesnis ir ne toks invazyvus kremzlės būklės vertinimas, apimantis ne tik chondrocitų gyvybingumą, tačiau ir ekstraląstelinio matrikso būklę. Elektromechaninių savybių įvertinimas čia ir dabar būtų privalumas, naudojant jį operacijų metu. Tokiu tikslu Kanados mokslininkų grupė sukūrė specialų prietaisą Arthro-BST, skirtą kremzlės elektromechaninės būklės įvertinimui. Kompresijos metu iš kremzlės intersticinis skystis stumia laisvus teigiamus jonus prie neigiamai įkrautų proteoglikanų, kurie yra kolageno tinkle. Tai ir formuoja tėkmės potencialą (angl. streaming potential), kurį ir išmatuoja prietaisas. Kuo aukštesnis QP, tuo labiau yra pažeistas kremzlės ekstraląstelinis matriksas, tuo labiau išreikšta artrozė [98]. Prietaisas apskaičiuoja kiekybinį elektrinio potencialo parametrą (QP), kai prietaiso matavimo daviklyje esantys mikroelektrodai liečiasi su kremzlės paviršiumi ir transliacijos potencialo suma pasiekia 100 mv. Be to, kremzlės ekstraląstelinio matrikso būklės blogėjimas yra tiesiogiai susijęs su chondrocitų gyvybingumu ir jų atliekama regeneracine funkcija. Dėl to QP iš dalies parodo ir chondrocitų būklę, jų galimybę regeneruoti sužalotą audinį. Be tradicinių metodų, naudojamų KKK kokybei nustatyti, šiame moksliniame tyrime buvo panaudotas naujas, klinikinėje praktikoje dar nenaudotas, kremzlės elektromechaninių savybių registracijos aparatas. Šio prietaiso pagalba nedestrukciniu būdu buvo įvertinta skirtingomis sąlygomis ir skirtingą laiką laikytų alogeninių KKK kokybė ne tik prieš transplantaciją, tačiau ir po jos [83]. In vitro tyrimo etape taip pat įvertintas gyvybingų chondrocitų kiekis, apoptozė, mėginių histologiniai vaizdai, proteoglikanų raiška. In vivo etapo metu vertinti makroskopiniai transplantuotų KKK vaizdai, tirtos elektromechaninės savybės, vertinti histologiniai pjūviai, įvertinta proteoglikanų raiška. Tyrimų gausa leido objektyviai įvertinti kremzlės būklę iki transplantacijos ir po jos, taip pat nustatyti ryšį tarp skirtingų KKK savybių vertinimo parametrų. 14

15 3. LITERATŪROS APŽVALGA 3.1. Bendra literatūros apžvalga Sąnario kremzlė dengia kaulų sąnarinius paviršius, neturi kraujagyslių ir nervų šaknelių tinklo. Pagrindinė sąnario kremzlės funkcija amortizuoti sąnariuose mechaninį krūvį. Kietas ir elastines kremzlės savybes užtiktina ląstelės chondrocitai. Jie gamina ECM, kuris sudarytas iš vandens, agrekanų ir daugiausia II tipo kolageno. Neigiamą krūvį turinčios GAG molekulės pritraukia natrio jonus. Šie kremzlės audinyje sulaiko vandenį. Dėl savitos sąnario struktūros, kremzlė yra priskiriama prie mažai imunogeniškų audinių grupės. Taip yra dėl to, kad kremzlėje nėra kraujagyslių tinklo. Dėl žemo imunogeniškumo sąnario kremzlė yra patraukli alogeninei transplanttacijai [31,74,91]. Autologinės KKK transplantacijos efektyvumas yra įrodytas [4, 8, 43, 46, 70, 78, 111]. Didesnė problema susijusi su alogenine transplantacija, kur audinių bankai KKK saugo įvairiausiomis sąlygomis: nuo šaldymo iki 80 C temperatūros iki laikymo įvairiose maitinamosiose terpėse skirtingų temperatūrų sąlygomis (4 C ir 37 C). Negana to, audinių bankai privalo tokio tipo transplantatus ištirti dėl įvairių infekcinių susirgimų, patikrinti jų sterilumą, dėl to mėginius laiko karantino sąlygomis pagal reglamentuotus protokolus [4, 85]. Kremzlės saugojimo trukmė bei aplinka sąlygoja kremzlės ląstelių chondrocitų gyvybingumą [31]. Chondrocitų gyvybingumas yra pats svarbiausias, norint kad implantuota kremzlė prigytų, o ir jos gyvavimo laikas būtų galimai ilgesnis. Chondrocitų gyvybingumo išsaugojimas yra nuolatinis tyrimų objektas [4, 66]. Tyrimai, kurių metu kremzlė buvo užšaldoma arba šaldoma kriogeniniu būdu, parodė, kad gyvų ląstelių kiekis kremzlėje ženkliai sumažėja [1, 18, 75], o jos laikymas hipotermijos sąlygomis 4 C temperatūroje gali išsaugoti chondrocitų gyvybingumą ir matrikso integraciją [84, 101, 110]. Yra tyrimų, kuriose kremzlė laikyta ir 37 C temperatūroje. Šių tyrimų rezultatai atskleidė, kad gyvybingų ląstelių kiekis buvo didesnis laikant kremzlę 37 C temperatūroje, nei šaldant [37, 75]. Chondrocitų gyvybingumas priklauso ir nuo terpės sudėties. Geri rezultatai stebėti tada, kai kremzlė buvo laikoma terpėje be serumo [8, 26, 37], terpėje su jaučio serumu [75, 79], deksametazonu [13], etanerceptu [64] ar trombocitais praturtinta plazma [81, 95, 114]. Kremzlės chondrocitų gyvybingumui turi įtakos ir hormoniniai priedai, pvz. insulino augimo faktorius (IGF-1). Jis naudojamas ir gydant kremzlės pažeidimą. Šis faktorius veikia chondrocitų proliferaciją, dėl ko stimuliuojama kremzlės matrikso gamyba [95, 103]. Literatūroje pavyko rasti tik kelias studijas, kur į maitinamąją 15

16 terpę buvo įdėtas 5 ng/ml IGF-1 [90], 5 ng/ml IL-1α [63] arba FGF-2 [41, 80]. IGF-1 taip pat veikia kaip kremzlę atstatantis preparatas. Tokio faktoriaus naudojimas studijose yra žinomas, tačiau jo dozuotė ir poveikis chondrocitų metabolizmui nėra iki galo išaiškintas. Atlikta nemažai tyrimų ir su ląstelių apoptoze arba programine chondrocitų žūtimi. Šių ląstelių žūtis kremzlėje yra susijusi su matrikso degeneracija ir OA pradžia [105, 106]. Buvo išanalizuotas tiesioginis ryšys tarp ląstelių apoptozės ir chondrocitų gyvybingumo, mėginius laikant hipotermijos sąlygomis [59]. Tyrimai parodė, kad apoptozę slopinant per signalinius apoptozės kelius, būtų užtikrintas chondrocitų gyvybingumas ir dėl to gerėtų atokieji transplantacijos rezultatai. Robertson as ir bendraautoriai analizavo apoptotinių genų ekspresiją ir nustatė, kad tokių genų daugėja kremzlę laikant ilgesnį laiką (iki 35 dienų) [88]. Nuo 2011 metų yra pasiūlytas naujas elektromechaninių kremzlės savybių tyrimo būdas, kuris parodo ir kremzlės kokybę. Kanados mokslininkų grupė sukūrė artroskopinį nedestrukcinį prietaisą Arthro-BST. Šio aparato veikimo principas yra susijęs su jonų judėjimo metu generuojamų potencialų registracija ir pavertimu skaitmenine išraiška. Labai tikėtina, kad tai gali būti ateityje naudojama technologija nustatant KKK kokybę prieš transplantaciją audinių bankuose ir operacijos metu. Iki šiol yra atlikti tyrimai tik in vitro su jaučio [22, 63, 90], arklio [20], šaldytais kadaverinių donorų žmogaus [2, 51, 98, 99] sąnario kremzlės mėginiais. Naujausiame 2016 metais Schagemann o ir bendraautorių atliktame tyrime naudotas kremzlės biodegraduojantis konstruktas, kurio metu dvisluoksnė chondrocitais pripildyta membrana buvo sodinama avims į kelio sąnarius [94]. Legare [63] ir Changoor [22] mėginius laikė 20 C temperatūroje. Sim [98] mėginius saugojo 70 C skirtingą laiką. Changoor [21,22] mėginius saugojo 4 C maitinamojoje terpėje, Legare [63] KKK laikė 37 C temperatūroje. Elektromechaninės kremzlės savybės buvo vertinamos skirtingais laiko intervalais: po 0 dienų [2, 63], 1 dienos [22, 63], 4 dienų [63], 5 dienų [21], 6 dienų [22], 7 dienų [22, 63], 11 dienų [63], 12 dienų [22], 14 dienų [63]. Schagemann studijoje vertintos kremzlės elektromechaninės savybės po 19 mėnesių nuo konstrukto su chondrocitais implantacijos avims [94]. Legare [63] nustatė, kad 20 C 2 savaites šaldytuose mėginiuose sukeltasis elektrinis potencialas labiau priklausė nuo paspaudimo ir amplitudės. Tai rodo netiesinę sukelto elektrinio potencialo priklausomybę nuo amplitudės. Be to, buvo nustatyta, kad IL-1α sumažino sukelto elektrinio potencialo amplitudę ir gradientą lyginant šviežios kremzlės rezultatus ir praėjus 11 dienų. 16

17 Changoor [22] nustatė pablogėjusias kremzlės elektromechanines savybes iki 20 C užšaldytuose mėginiuose tarp pirmos ir 12 laikymo dienos. Praėjus 6 dienoms nuo užšaldymo kremzlės elektromechaninės savybės buvo nepakitusios. Autorė taip pat nustatė, kad palaipsnis audinio nykimas (degradacija) atsirado tarp 6 ir 12 užšaldymo dienos. Vėlesni tyrimai parodė, kad QP įtaką daro struktūriniai kremzlės pokyčiai [20]. S. Sim [98] mėginius užšaldė iki 80 C, vėliau juos atšildė iki 4 C bei nustatė, kad aukštesnės QP reikšmės koreliavo su hidraulinio spaudimo sąlygotu pralaidumu. Tai patvirtino ir Abedian as [2], kuris nustatė silpną koreliaciją tarp hidraulinio spaudimo ir QP potencialo. Tų pačių tyrimu metu buvo stebėta proteoglikanų sumažėjimas mėginiuose, dažytuose safranino O dažais [22]. Naudojant indišką rašalą (angl. Indian ink) buvo nustatyti platūs paviršiaus įplyšimai ir maži plyšiai, besidriekiantys už paviršinės kremzlės zonos. Safranino O dažymo raiška buvo silpnesnė mėginius išlaikius 4 C temperatūroje 12 dienų [22]. Sim [98] nustatė elektromechaninių kremzlės savybių koreliaciją su histologiniu kremzlės įvertinimu. Abedian [2] patvirtino, kad Mankin o skalės vertinimo balai ir ICRS vertinimo skalės rezultatai taip pat koreliuoja su elektromechaninėmis kremzlės savybėmis. Proteoglikanų raiškai kremzlėje taip pat įtakos turi ne tik laikymo sąlygos [90], bet ir įvairūs uždegimą skatinantys faktoriai (IL-1α, IL-1ß, chondroitinazė ABC ir kiti) bei veiksniai [63]. Sim su bendraautoriais nustatė, kad elektromechaninės savybės koreliuoja su kremzlėje nustatytu proteoglikanų kiekiu [98], o Legare su bendraautoriais kad kolageno tinklas yra jautrus saugojimo trukmei [63]. Mokslininkai nustatė, kad elektromechaninės kremzlės savybės koreliuoja tiek su histologinio vertinimo rezultatais, tiek su biomechaniniais parametrais [98]. Kremzlės ir kaulo autologinė transplantacija yra gerai žinoma ir naudojama gydant kremzlės pažeidimus. Deja, donorinės vietos atrofija arba sveikos donorinės kremzlės stoka riboja tokio gydymo metodo taikymą. Tokių situacijų alternatyva alogeninė KKK transplantacija priklausomai nuo traumos, etiologijos ar nustatytos patologijos. Alogeninės transplanttacijos rezultatai yra tyrinėjami, tačiau tuo pačiu ir labai skiriasi [77, 96]. Atokiesiems rezultatams įtakos turi alograftų laikymo sąlygos, kuomet užšaldymas lemia chondrocitų mirtį [82]. Glen ir bendraautoriai [38] parodė, kad šviežias kremzlės ir kaulo kompleksas išlaiko savo histologines savybes tiek in vivo, tiek in vitro. Alogeninės kremzlės gyvybingumo išsaugojimas užtikrina KKK transplantato integraciją į aplinkinius audinius, o tai yra labai svarbu atokiesiems potransplantaciniams rezultatams. Kelios studijos parodė, kad transplantuoto KKK kaulas integruoja į aplinkinį kaulą geriau nei kremzlė, o kremzlė gali ir nesuaugti [30]. Kitų studijų rezultatai rodo, 17

18 kad kremzlės integracijai labai svarbus yra subchondrinio kaulo stabilumas po transplantacijos [16, 86]. KKK transplantato integraciją į sveiką audinį taip pat gali paskatinti po operacijos į kelio sąnarį leidžiama autologinė trombocitais praturtinta plazma [108]. Ikiklinikiniuose tyrimuose toks gydymo būdas atskleidė gerus rezultatus, tačiau klinikinių tyrimų rezultatai nebuvo vienareikšmiai [108]. Carneiro su bendraautoriais nustatė, kad injekuojant PRP į sąnarį su pažeista kremzle, fibrozinė kremzlė pasižymi geresnėmis histologinėmis savybėmis [19]. Görmeli su bendraautoriais atliko hialurono rūgšties ir PRP leidimo į sąnarį palyginamąjį tyrimą. Tyrimas parodė, kad PRP leidimas į sąnarį pradinėse OA stadijose teigiamai veikė sąnario regeneraciją, tuo tarpu vėlesnėse OA stadijose leisti abu preparatai gijimui įtakos neturėjo [42]. Altan ir bendraautoriai parodė, kad PRP leidimas į kelio sąnarį po OAT operacijos sąlygoja greitesnį gijimą ir geresnes histologines kremzlės savybes [5]. Apžvelgus literatūrą lieka neatsakyta į klausimą, ar PRP leidimas į sąnarį po OCA operacijos kremzlės regeneraciją veikia taip pat, kaip ir gydant OA ar po OAT operacijos. Pooperaciniu periodu įvertinti kremzlės būklę galima tik atlikus radiologinius tyrimus (pvz., magnetinio rezonanso) arba atliekant pakartotinę diagnostinę artroskopiją. Tikslesnis kremzlės pažeidimo įvertinimas būtų privalumas ypač ilgalaikiam pacientų stebėjimui. Idealiu vertinimo būdu būtų histologinis kremzlės tyrimas, tačiau jis yra invazyvus ir kremzlę žalojantis. Makroskopinio vertinimo skalės neužtikrina tinkamo kremzlės pažeidimo ploto ir gylio įvertinimo. Analizuojant literatūroje skelbiamus tyrimų rezultatus, pastebėta, kad išplėstinio alogeninio KKK tyrimo, kuris apimtų jo laikymo sąlygas ir sąlygų įtaką potransplantaciniame periode, nėra. Alogeninio KKK ir alogeninės transplantacijos rezultatai išlaikius mėginius atitinkamomis sąlygomis literatūroje dažniausiai analizuojami tik atskirais aspektais. Moksliniame tyrime atsižvelgta į literatūroje pateikiamas nagrinėtas KKK laikymo sąlygas, gautas išvadas, bei potransplantaciniame periode nustatytus rezultatus. 18

19 4. METODIKA Mokslinio tyrimo metu vykdyti eksperimentai atlikti vadovaujantis Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos leidimo atlikti bandymus su gyvūnais procedūrų projektu, išduotu 2014 m. kovo 5 d. Nr. 8, griežtai vykdant leidime nustatytus reikalavimus. Pagal keliamus reikalavimus buvo užtikrinta visapusiška ir nepriekaištinga eksperimentinių gyvūnų priežiūra bei gerovė iki eksperimento, jo vykdymo metu ir po eksperimento, taikytas tinkamas gyvūnų nuskausminimas. Tyrimas buvo atliktas dviem etapais. Pirmasis eksperimentinio tyrimo etapas vykdytas laboratorinėmis sąlygomis in vitro. Šio etapo eiga aprašyta skyriuje 4.1. In vitro eksperimento etapas. Antrasis tyrimo etapas atliktas in vivo, atsižvelgiant į pirmojo etapo metu gautus rezultatus. Šis etapas aprašytas skyriuje 4.2. In vivo eksperimento etapas. Pagal kiekvieno etapo aprašytas metodikas gauti eksperimentų duomenys ir rezultatai buvo registruojami, sisteminami, analizuojami ir aptariami, daromos išvados. Atliktų eksperimentų rezultatai aptarti skyriuje 5. Rezultatai ir pateiktos išvados skyriuje 7. Išvados Naudota įranga 4.1. In vitro eksperimento etapas Kremzlės kaulo kompleksai paimti steriliomis sąlygomis naudojant standartinius instrumentus (angl. osteochondral allograft transfer system (toliau OATS), Arthrex Inc, JAV). Viena mėginių grupė laikyta IL Shin šaldiklyje (ilshin Biobase Europe), šaldant juos iki 70 C temperatūros, antra inkubatoriuje 37 C su 5 proc. CO 2, trečia šaldytuve 4 C, atmosferiniame ore. Elektromechaninėms kremzlės savybėms tirti buvo naudotas prietaisas Arthro-BST (Biomomentum Inc., Lavalas, Kanada). Histologiniam gyvų chondrocitų nustatymui naudotas konfokalinis mikroskopas LSM 700 Axio Observer Z.1 (Carl Zeiss, Vokietija). Histologiniams vaizdams vertinti naudotas šviesinis mikroskopas Olympus BX63 ( Olympus, Japonija) su įmontuotu Olympus DP72 CCD fotoaparatu ir panaudojant CellSens Dimension vizualizavimo programą ( Olympus, Japonija). Šiuo mikroskopu nufotografuotose nuotraukose vertinta mėginių histologinė struktūra naudojant Mankin o skalę, chondrocitų apoptozė ir raudonos spalvos intensyvumas (proteoglikanų raiška). 19

20 Skaičiavimo programa Image J, versija 1.47q (Nacionalinis sveikatos institutas, JAV) naudota gyvų ir mirusių bei apoptotinių ląstelių kiekiui skaičiuoti ir GAG įvertinti Naudotos terpės Šviežiai paimti KKK mėginiai buvo transportuoti į laboratoriją fosfatiniame buferiniame tirpale (PBS, Sigma) su 100 U/mL penicilino, 100 μg/ml streptomicino ir 0,25 μg/ml fungizono (PSF, Sigma) priedais. Laboratorijoje mėginiai buvo laikomi 4 C ir 37 C temperatūros mažos koncentracijos gliukozės kiekio (DMEM, Sigma) tirpale, kuriame buvo pridėta 10 proc. jaučio embriono serumo (FBS, Sigma), 1 proc. PSF, 2 mm L-glutamino tirpalo (LG, Sigma), 25 μg/ml L-askorbininės rūgšties (AA, Sigma) ir 0,1 mm nepagrindinių amino rūgščių (NMEM, Sigma) su 100 ng/ml insulino augimo faktoriumi (angl. insulin growth factor, IGF-1, Sigma) arba be jo Tyrimo eiga Eksperimento schema pavaizduota paveiksle pav. In vitro eksperimento schema IGF-1 insulino augimo faktorius (angl. insulin growth factor-1); QP kiekybinis potencialas; GAG glikozaminoglikanai. 20

21 Iš 5 6 mėnesių amžiaus Saanen o veislės vyriškos lyties 6 ožiukų abiejų užpakalinių kojų kelio sąnarių vidinių šlaunikaulių krumplių steriliomis sąlygomis buvo paimti 5 mm diametro KKK, naudojant OATS. Visi paimti KKK buvo suskirstyti į dvi grupes pagal laikymo trukmę. Pirmoje grupėje KKK mėginiai buvo laikomi 14 dienų, o antrojoje 28 dienas. Kiekviena KKK grupė papildomai buvo suskirstyta į tris atskirus pogrupius, kuriuose mėginiai laikyti atitinkamai 70 C, 4 C ir 37 C temperatūrose. Straipsniuose [95, 103] analizuojama augimo faktorių įtaka kremzlės laikymui bei vertinimo rezultatams. Dėl teigiamo efekto chondrocitų išgyvenamumui buvo pasirinkta papildomai suformuoti tiriamas KKK grupes, į kurių terpę buvo įdėta 100 ng/ml IGF-1. Mėginių kiekis, laikymo sąlygos bei trukmė parodyti lentelėje lentelė. Mėginių kiekis, laikymo sąlygos bei trukmė grupėse DMEM be IGF-1 DMEM su IGF-1 Laikymo sąlygos / dienos 14 d. 28 d. 14 d. 28 d. 70 C n = 6 n = 6 n = 6 n = 6 4 C n = 6 n = 6 n = 6 n = 6 37 C n = 6 n = 6 n = 6 n = 6 DMEM mažos koncentracijos gliukozės tirpalas; IGF-1 insulino augimo faktorius. Šviežiai paimti KKK mėginiai buvo laikyti PBS su 100 U/mL penicilino, 100 μg/ml streptomicino ir 0,25 μg/ml fungizono (PSF) (Sigma) priedais. Laboratorijoje šie mėginiai suskirstyti po 6 KKK į keturias grupes: 1) kontrolinė ką tik paimta, 2) šaldyta 70 C ( 70 C), 3) atšaldyta iki 4 C su 100 proc. atmosferos oru (4 C), 4) laikyta inkubatoriuje 37 C su santykiniu 95 proc. oro drėgnumu bei 5 proc. CO 2 ) (37 C). 4 C ir 37 C grupių mėginiai buvo įdėti į 24 šulinėlių plokšteles, kurių šulinėliai užpildyti DMEM su 10 proc. FBS, 1 proc. PSF, 2 mm LG, 25 AA ir 0,1 mm NMEM su ar be 100 ng/ml IGF-1. Praėjus 14 ir 28 dienų nuo patalpinimo į atitinkamas sąlygas bei terpes, kiekvienos grupės KKK buvo įvertinti pagal nustatytą tvarką. Pirmiausiai buvo atliktas šių KKK elektromechaninių savybių vertinimas. Po elektromechaninių savybių vertinimo KKK perpjauti pusiau skalpeliu. Viena pusė panaudota chondrocitų gyvybingumo nustatymo tyrimams, dažant juos LIVE/DEAD dažais (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Kita pusė buvo naudojama įvertinti chondrocitų apoptozei, GAG pasiskirstymui ir mėginiams Mankin o histologinio vertinimo skale įvertinti. 21

22 Šviežiai surinktų mėginių (kontrolinė) grupė buvo analizuota ir įvertinta tą pačią mėginių paėmimo dieną pagal aukščiau minėtą metodiką Elektromechaninių savybių vertinimas Elektromechaninės kremzlės savybės kiekvienoje KKK mėginių grupėje buvo įvertintos Arthro-BST (Biomomentum Inc., Laval, QC, Kanada) prietaiso pagalba kaip pavaizduota paveiksle. A B pav. KKK elektromechaninių savybių vertinimas A naudojamos įrangos vaizdas; B vertinimo proceso momentas. Arthro-BST sąlyginai naujas medicininis įtaisas, kuris nedestrukciniu kontaktiniu būdu matuoja elektromechanines sąnario kremzlės savybes. Šio prietaiso veikimo principas toks: pusiau sferinis daviklis savo galvutėje turi 37 auksinius mikroelektrodus (5 mikroelektrodai/mm 2 ), kurie registruoja elektrinį kremzlės potencialą, atsirandantį švelniai paspaudus daviklį į kremzlės paviršių. Spaudimo metu teigiami kremzlės intersticinio audinio jonai atsipalaiduoja nuo neigiamai įkrautų proteoglikanų grandinių, taip sukurdami elektros srovę, kuri registruojama kaip kiekybinis parametras QP (angl. quantitative parameter). Jei kremzlė yra sveika, tokiu atveju sveikas kolageno tinklas neleidžia teigiamiems jonams judėti kremzlės tarpląsteliniame matrikse, dėl to sukuriama silpna srovė. Elektros srovė skaičiuojama tik tokiu atveju, kai ji pasiekia 100mV įtampą. Kompiuterinė programa automatiškai perskaičiuoja QP ir parodo rezultatą kompiuterio ekrane skaitmenine išraiška. Kuo didesnė QP rezultato skaitmeninė išraiška, tuo elektromechaninės kremzlės savybės blogesnės [98]. 22

23 Prieš KKK mėginių elektromechaninių savybių vertinimą mėginiai buvo palaikyti PBS tirpale 20 minučių. Prietaisu Arthro-BST kiekvienos grupės visų mėginių elektromechaninės kremzlės savybės buvo įvertintos po 5 kartus, kad būtų galima tiksliau nustatyti QP vidurkį Chondrocitų gyvybingumo vertinimas Po elektromechaninių savybių įvertinimo KKK skalpeliu buvo padalyti pusiau. Viena KKK pusė buvo panaudota chondrocitų gyvybingumui įvertinti. Mėginiai buvo nudažyti imunohistocheminiais LIVE/DEAD rinkinio dažais (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Rinkinys sudarytas iš 1 μm kalceino AM (angl. calcein AM) ir 2 μm etidium homodimero-1 (angl. Ethidium homodimer-1). Kalceinas AM jungdamasis prie ląstelės membranos atpalaiduoja žalią dažą, taip pažymėdamas gyvas ląsteles. Etidium homodimero-1 dažas jungiasi su endoplazminiu ląstelės tinklu ir taip negyvas ląsteles nudažo raudona spalva. Dažymas atliktas mėginius 40 min. laikant inkubatoriuje, 37 C temperatūroje. Po to KKK tris kartus po 10 min. buvo plauti PBS tirpale. Po dažymo etapo mėginiai buvo supjaustyti 200 μm storio sluoksniais. Konfokaliniu mikroskopu LSM 700 Axio Observer Z.1 atpjauti mėginių gabaliukai buvo apšviesti poliarizuota šviesa ir nufotografuoti. Konfokalinio mikroskopo giluminiai pjūviai tarp sluoksnių buvo 0,74 μm. Kiekvieno sluoksnio mikroskopinis vaizdas buvo fotografuojamas. Iš šių sluoksninių nuotraukų buvo sudaromos bendros (suminės) nuotraukos. Gyvybingų chondrocitų kiekis buvo apskaičiuojamas kiekvienoje nuotraukoje pasirenkant du μm kremzlės plotus. Gauti rezultatai skaičiuoti Image J versijos 1.47q programa. Chondrocitų gyvybingumas išreikštas procentais nuo visų kremzlėje rastų chondrocitų. Šviežiai paimtų kremzlės mėginių rezultatai buvo naudojami kaip kontroliniai pakitimams įvertinti Histologinis mėginių vertinimas Kita perpjautų KKK pusė buvo panaudota histologiniam kremzlės ištyrimui, vertinant chondrocitų apoptozę, GAG pasiskirstymą bei morfologinius pokyčius naudojant Mankino histologinio vertinimo skalę [67]. KKK buvo fiksuoti 10 proc. neutraliame buferiniame formalino tirpale. Dekalcifikacija atlikta naudojant Shandon TBD-2 Decalcifier (TBD; Thermo Scientific, JAV) tirpalą, mėginius laikant 3 savaites, vėliau juos fiksuojant parafino bloke. Paruošti 5 μm storio kremzlės pjūviai buvo nudažyti safranino O fast green dažais. Safranino O dažai nudažė hialininės kremzlės 23

24 matriksą raudonai taip išryškindami glikozaminoglikanus (GAG) [55]. Nudažyti mėginiai buvo nufotografuoti, naudojant šviesinį mikroskopą Olympus BX63 su įmontuotu Olympus DP72 CCD fotoaparatu bei naudojant CellSens Dimension vizualizavimo programą. Tyrimo mikroskopu metu visi KKK mėginių vaizdai padidinti 4 kartus. Norint įvertinti GAG raišką, nufotografuoti mėginiai išanalizuoti Image J programa, kaip yra apibūdinta moksliniame tyrime [68], vertintas kiekvienas mėginys, nustatant šviesos komponenčių santykį tarp raudonos, žalios ir mėlynos spalvos. Tyrimo metu gauti vaizdai naudojant programą buvo paversti į 256 baltos ir juodos spalvų paletę. Raudonos spalvos intensyvumas išreikštas procentais nuo visų spalvų komponenčių sumos. Mėginių histologinė struktūra taip pat papildomai buvo įvertinta Mankin o histologinio vertinimo skale [67], kurios kriterijai parodyti lentelėje lentelė. Mankin o vertinimo kriterijai Mankin o histologinio vertinimo skalė Struktūra Sveikas paviršius 0 Paviršiniai įtrūkimai 1 Įtrūkimai siekiantys kremzlės vidurį 2 Įtrūkimai siekiantys kaulą 3 Visiškas kremzlės nebuvimas 4 Ląstelės Normalios 0 Sugrupuotos/ besidauginančios 1 Pavienės padidinto skaičiaus ląstelių zonos 2 Zonos be ląstelių 3 Dažų pasiskirstymas mėginiuose, dažant hematoksilinu ir eozinu su Safranino O Normalus 0 Nedidelis sumažėjimas 1 Vidutinis sumažėjimas 2 Didelis sumažėjimas 3 Mėginys nenusidažė 4 Maksimalus balas 11 Pagal šią skalę sveika kremzlė vertinama 0 balų, o kremzlės pažeidimą rodo didesnis balų skaičius Apoptozės vertinimas KKK chondrocitų apoptozė buvo įvertinta, mėginius nudažius TUNEL rinkiniu (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit; Millipore, USA). Dažant mėginius buvo laikomasi gamintojo nurodymų. Deparafi- 24

25 nizuoti pjūviai laikyti 20 μg/ml Proteinazės K (Ambion) tirpale, kambario temperatūroje 15 min. Endogeninė chondrocitų peroksidazė inaktyvuota panaudojus 3 proc. vandenilio peroksido tirpalą, laikant mėginius 5 min. Po to visi mėginiai laikyti inkubatoriuje 60 min. 37 C temperatūroje. Vėliau histologiniai pjūviai laikyti 30 min. antidigoksigenino tirpale su antikūnais tam, kad peroksidazė prisijungtų laisvas molekules. Imunohistocheminiai antikūnai fiksuoti naudojant chromogeninį DAB substratą (Sigma) 10 min. Mėginiai dažyti metilo žaliojo (Sigma) tirpale 5 min., vėliau praplauti distiliuotu vandeniu, išdžiovinti alkoholio tirpale, išvalyti ir padengti dengiamuoju stikleliu. Histologinio vaizdo analizei mėginių vaizdas padidintas 200 kartų naudojant Olympus BX63 mikroskopą. Apoptotinių ląstelių kiekis (rudai juodų) ir gyvų (žalių) buvo suskaičiuotas μm plotuose kiekvieno KKK mėginio kiekviename pjūvyje. Gauti rezultatai rodo procentinį apoptotinių ląstelių kiekį matuotame plote nuo bendro ląstelių kiekio Naudota įranga 4.2. In vivo eksperimento etapas Kremzlės kaulo kompleksai transplantuoti steriliomis sąlygomis naudojant standartinius OATS instrumentus. Alogeniniai KKK laikyti šaldytuve 4 C, atmosferiniame ore, nes in vitro eksperimento etapo metu buvo išsiaiškinta, kad gyvybingiausia kremzlė išlieka KKK mėginius laikant DMEM terpėje be IGF-1 4 C temperatūroje ne ilgiau nei 14 dienų (žr In vitro tyrimų rezultatų bendras aptarimas ). Autologinės PRP paruošimui naudota centrifuga Rotofix, plazmai atskirti naudojant dvigubą Arthrex ABS švirkštą. Elektromechaninėms kremzlės savybėms tirti naudotas prietaisas Arthro- BST. Histologiniams vaizdams vertinti naudotas šviesinis mikroskopas Olympus BX63 su įmontuotu Olympus DP72 CCD fotoaparatu bei naudojant CellSens Dimension vizualizavimo programą. Šiuo mikroskopu nufotografuotų mėginių nuotraukose buvo vertintas GAG pasiskirstymas skaičiavimo programa Image J versija 1.47q. 25

26 Naudotos terpės Naudota maitinamoji terpė: DMEM tirpalas su 10 proc. FBS, 1 proc. PSF, 2 mm LG, 25 μg/ml AA ir 0,1 mm NMEM be IGF-1. (žr. skyrių Naudotos terpės ) In vivo etapo tyrimo eiga Eksperimentiniame tyrime panaudoti dvidešimt šeši 5 6 mėnesių vyriškos lyties Saaneno veislės ožiukai, sveriantys kg. In vivo eksperimento etapas buvo išskirtas į dvi dalis. In vivo tyrimo schema parodyta paveiksle pav. In vivo tyrimo schema QP kiekybinis potencialas; OAS Oswestry makroskopinio vertinimo skalė; GAG glikozaminoglikanai. Pirmame in vivo tyrimo etape iš keturių 5 6 mėnesių amžiaus Saaneno veislės vyriškos lyties ožiukų užpakalinių kojų kelio sąnarių vidinių šlaunikaulio krumplių atraminių paviršių buvo paimti 6 mm diametro 8 mm aukščio KKK (n = 13), naudojant OATS. Paimti mėginiai buvo laikomi 4 C temperatūroje DMEM terpėje be IGF-1 14 dienų (žr. skyrių Naudotos terpės ). Antrosios in vivo tyrimo etapo dalies metu likusiems dvidešimt dviem vyriškos lyties 5 6 mėnesių amžiaus Saaneno veislės ožiukams bendrinėje nejautroje buvo atliktos užpakalinių kojų abiejų (kairio ir dešinio) kelių 26

27 operacijos steriliomis sąlygomis, sąnarius atveriant vidiniu parapateliariniu pjūviu. Operacijų metu abiejų užpakalinių kojų kelio sąnarių vidinių šlaunikaulio krumplių atraminiuose paviršiuose padaryti defektai, naudojant OATS. Kontrolinėje ožiukų grupėje defektai buvo užpildyti autologiniu KKK transplantatu. Ši grupė pavadinta autologine OAT grupe (n = 9). Šioje grupėje kairės kojos kelio sąnario vidinio šlaunikaulio krumplio defektas buvo užpildytas iš to paties ožiuko dešinės kojos kelio sąnario išimtu autologiniu šviežiu KKK, o dešinės kojos kelio sąnario vidinio šlaunikaulio krumplio defektas buvo užpildytas iš to paties ožiuko kairės kojos kelio sąnario išimtu autologiniu šviežiu KKK. Tuoj po operacijos tik į kairės kojos kelio sąnarį buvo suleista autologinė PRP. Injekcijos kartotos praėjus 1 ir 2 mėnesiams po autologinės transplantacijos operacijos. Tiriamojoje ožiukų grupėje abiejų užpakalinių kojų (dešinės ir kairės) sukurti vidinių šlaunikaulio krumplių defektai buvo užpildyti alogeniniais KKK, kurie buvo laikyti in vitro etape nustatytomis sąlygomis DMEM terpėje be IGF-1, 4 C temperatūroje, 14 dienų. Ši grupė pavadinta alogenine OCA grupe (n = 13). Analogiškai po operacijos tik į kairės kojos kelio sąnarį buvo leista autologinė PRP, kurios injekcijos kartotos praėjus 1 ir 2 mėnesiams po alogeninės transplantacijos operacijos. Ožiukų dešinės užpakalinės kojos kelio sąnarys tiek OAT, tiek OCA grupėse buvo palikti gyti klinikinėje praktikoje taikomu įprastu būdu, neleidžiant PRP. Siekiant stimuliuoti alogeninio KKK regeneracijos ir integracijos procesą tiek OAT, tiek OCA grupėse į kairį ožiukų užpakalinės kojos kelio sąnarį buvo leista PRP tuojau pat po transplantacijos bei praėjus vienam ir dviem mėnesiams po jos. Operacijos žaizda buvo susiūta pasluoksniui, patikrinti kelio sąnario judesiai, girnelės stabilumas. Po operacijų ožiukams buvo skirti vaistai nuo skausmo ir antibiotikai, skirta judėjimo terapija. Ožiukai buvo stebimi atitinkamai 3 bei 6 mėnesius po transplantacijos operacijos. Praėjus 3 ir 6 mėnesiams po transplantacijos ožiukai buvo užmigdyti. Atvėrus operuotus kelio sąnarius, transplantuoti KKK buvo vertinti makroskopinio vertinimo OAS skale, išmatuoti transplantų QP. Pašalinus vidinius šlaunikaulio krumplius, įvertintos mėginių histologinės savybės naudojant O Driscoll skalę. Taip pat įvertinta ir GAG raiška. Šie metodai aptariami toliau esančiuose skyriuose Trombocitais praturtintos plazmos paruošimas ir naudojimas Autologinė PRP trombocitais praturtinta plazma buvo paruošiama iš ožiuko veninio kraujo. Procedūros metu naudojant dvigubą švirkštą (Arthrex 27

28 ABS-10010), iš jungo venos buvo paimta 10 ml veninio kraujo. Trombocitais praturtinta plazma atskirta dvigubą švirkštą su ožiuko krauju centrifuguojant 20 min. 2000G jėga Rotofix 32A centrifuga. Po centrifugavimo vidinio švirkšto pagalba, nusiurbta 2ml autologinės PRP, kuri buvo suleista į ožiuko kairės kojos kelio sąnarį tuoj po transplantacijos operacijos, praėjus 1 ir 2 mėnesiams po operacijos Makroskopinis mėginių vertinimas lentelė. Modifikuota Oswestry skalė Modifikuota Oswestry artroskopinio vertinimo skalė Transplantato lygis lyginant su aplinkine kremzle Tame pačiame lygyje 2 Pakilęs aukščiau 1 Nusileidęs žemiau 0 Integracija į aplinkinę kremzlę Visiška integracija 2 Maži plotai be integracijos (< 25 proc. ploto) 1 Dideli plotai be integracijos (_25 proc. ploto) 0 Paviršiaus išvaizda Lygus paviršius 2 Pavieniai netolygumai 1 Dauginiai netolygumai 0 Transplantato spalva Hialininė perlo spalva 2 Balta 1 Geltona, matomas kaulas 0 Maksimalus balas 8 Vertinimo kriterijai pavaizduoti lentelėje, kurioje transplantatų išvaizda buvo vertinta naudojant modifikuotą Oswestry artroskopinę vertinimo skalę (OAS) [15]. Lentelėje maksimali balų suma gali būti 8, kas rodo gerą kremzlės būklę. Ši skalė modifikuota, neįtraukiant vertinimo artroskopiniu kabliuku, kuris naudojamas norint įvertinti kremzlės kietumą. Šioje modifikuotoje OAS skalėje kremzlės kietumas nematuotas, kadangi šis kriterijus buvo įvertintas, išmatuojant QP Arthro-BST TM aparatu. 28

29 Elektromechaninių savybių vertinimas In vivo eksperimento etape praėjus 3 ir 6 mėnesiams po transplantacijos operacijos elektromechaninės KKK savybės buvo vertintos tokiu pat būdu kaip ir in vitro etape, naudojant aparatą Arthro-BST TM. Kiekvieno mėginio matavimas atliktas 5 kartus siekiant kuo tiksliau įvertinti QP vidurkį. Atsižvelgiant į transplantacijos pobūdį buvo sudarytos atitinkamos kontrolinės grupės. Mėginių, išlaikytų 4 C temperatūros DMEM terpėje be IGF-1 14 dienų, QP matavimo duomenys buvo laikomi kontroliniais tiriamosios OCA grupės matavimo rezultatams įvertinti praėjus 3 ir 6 mėnesiams po transplantacijos. Šviežiai paimtų autologinių KKK QP matavimo duomenys buvo kontroliniai OAT grupės rezultatams įvertinti praėjus 3 ir 6 mėnesiams po transplantacijos Histologinis vertinimas Makroskopiškai įvertinus vidinių šlaunikaulių krumplių, transplantuotų KKK būklę ir išmatavus QP po transplantacijos, šlaunikaulio vidiniai krumpliai buvo fiksuoti parafininiuose blokuose pagal tokią pačią metodiką kaip ir in vitro etape. Mėginiai perpjauti pusiau, atlikti 5 µm storio pjūviai nuo KKK centro ir nudažyti safraninu O fast green pagal tokią pat metodiką, kaip ir in vitro etapo metu. Histologinei struktūrai vertini buvo naudotas tas pats mikroskopas kaip ir in vitro etapo metu, nekeičiant sąlygų. Nuotraukos darytos taip pat su tokia pačia fotokamera kaip ir in vitro etapo metu. Histologiniams pjūviams vertinti buvo naudota O Driscoll skalė [73]. O Driscoll skalės vertinimo kriterijai parodyti lentelėje. Pagal šią skalę, kuo didesnis balų įvertinimas, tuo geresnės kremzlės histologinės savybės. Maksimali balų suma gali būti 24. GAG raiškos įvertinimas buvo atliktas kaip nurodyta metodikoje (žr Histologinis mėginių vertinimas ). 29

30 4.2.7 lentelė. O Driscoll histologinio vertinimo skalė O Driscoll histologinio vertinimo skalė 1. Ląstelių morfologija Hialininė kremzlė 4 Nepakankamai diferencijuotos mezenchiminės ląstelės 2 Fibrozinis audinys ar kaulas 0 2. Dažymas safraninu O Normalus ar beveik normalaus 3 Vidutinis 2 Silpnas 1 Nėra 0 3. Paviršiaus lygumas Lygus nepažeistas 3 Paviršinio sluoksnio sluoksniuotumas 2 Įtrūkimai nuo 25 iki 100 proc. storio 1 Gilūs įtrūkimai ar fibriliacijos 0 4. Integracija Normali 2 Pavieniai įtrūkimai, cistos 1 Gilūs įtrūkimai 0 5. Kremzlės storis 100 proc. normali kremzlė proc. nuo viso kremzlės storio proc. nuo viso kremzlės storio 0 6. Integracijos nebuvimas Abiejuose transplanto galuose 2 Viename pilnai, arba dalinai abiejuose 1 Nei viename 0 7. Ląstelių sumažėjimas Normalus kiekis ląstelių 3 Nedidelis sumažėjimas 2 Didelis sumažėjimas 1 Pavienės ląstelės 0 8. Chondrocitų sankaupos (klasteriai) Nėra sankaupų 2 < 25 proc. ląstelių proc. ląstelių 0 9. Aplinkinio audinio pakitimai Normalus ląstelių kiekis, be sankaupų, normalus nusidažymas 3 Normalus ląstelių kiekis, pavienės sankaupos, įvairus nusidažymas 2 Lengvas ar vidutinis ląstelių kiekio sumažėjimas, silpnas nusidažymas 1 Mažas ląstelių kiekis, blogas arba visiškas nenusidažymas 0 Maksimalus balas 24 30

31 4.3. Statistinė duomenų analizė Abiejų mokslinio tyrimo etapų duomenys analizuoti SPSS v.19 ( IBM ) programiniu paketu. Duomenys yra išreikšti kaip vidurkis ± standartinė deviacija. In vitro etape statistinė analizė tarp grupių atlikta naudojant vienakryptę pasikartojančių bandymų analizę (ANOVA), naudojant neparametrinį daugiafaktorinį Bonferoni post hoc kriterijų. Ryšys tarp QP, chondrocitų gyvybingumo, apoptotinių ląstelių kiekio, GAG pasiskirstymo bei histologinio vertinimo skalės rezultatų įvertintas neparametriniu Spearmano koreliacijos koeficientu. In vivo etapo metu atskirų kriterijų rezultatai vertinti neparametriniu Mann-Whitney aus-wilcoxon o kriterijumi. Skirtumas tarp eksperimentinių grupių vertintas, naudojant nepriklausomų imčių t-testą. Ryšys tarp QP, histologinio vertinimo skalės, makroskopinio įvertinimo bei raudonos spalvos intensyvumo nustatytas naudojant dvinarį Pearson o koreliacijos koeficientą. Imties galia apskaičiuota naudojant GPower 3.1 programa (Franz Faul universitetas, Kylis, Vokietija). Duomenys skyrėsi statistiškai reikšmingai, kai p < 0,05. 31

32 5. REZULTATAI Gautų rezultatų analizė šiame skyriuje aprašyta tokia pačia chronologine tvarka, kokia buvo vykdomas šis mokslinis tyrimas. Visų grupių jėga buvo > 0, In vitro tyrimo rezultatai Elektromechaninės KKK savybės In vitro eksperimentinio tyrimo etape iš ožiukų vidinių šlaunikaulių gumburų buvo paimti KKK mėginiai, kurie pagal tyrimo planą buvo laikomi skirtingose temperatūrose, skirtingose terpėse ir skirtingą laiką. Elektromechaninės kremzlės savybės buvo įvertintos Arthro-BST aparatu trimis etapais: 1) tuojau pat po operacijos; 2) po 14 dienų; 3) po 28 dienų. Atlikus matavimus šviežių KKK grupėje nustatytas kontrolinis QP vidurkis, kuris buvo lygus 4 ± 0,23. Mėginių, išlaikytų 14 dienų 70 C temperatūroje, vidutinis QP užregistruotas 5,6 ± 0,49. Mėginių, išlaikytų 14 dienų DMEM terpėje be IGF-1 4 C temperatūroje vidutinis QP buvo 4,43 ± 0,15, o 37 C temperatūroje 5,57 ± 0,43. Ženklus QP padidėjimas buvo stebėtas KKK mėginiuose, laikytuose 14 dienų 70 C temperatūroje bei 37 C temperatūros terpėje be IGF-1. Palyginus tarpusavyje gautus rezultatus, statistiškai reikšmingas QP skirtumas buvo tarp KKK mėginių, išlaikytų 14 dienų 70 C ir terpėje be IGF-1 4 C (p < 0,001). Toks pats QP vidurkių skirtumas nustatytas KKK, laikytuose terpėje be IGF-1 4 C ir 37 C (p < 0,001) temperatūrose. Tokiu būdu KKK mėginių, 14 dienų laikytų terpėje be IGF-1 4 C temperatūroje, išmatuotas QP vidurkis buvo mažiausias lyginant su 70 C ir terpėje be IGF-1 37 C temperatūroje laikytų mėginių QP vidurkiu (p < 0,001). Mėginių, laikytų 14 dienų terpėje su IGF-1, vidutinis QP 4 C temperatūroje buvo 4,53 ± 0,27, o 37 C temperatūroje 4,77 ± 0,32. Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp šių KKK QP vidurkių nestebėta. Lyginant rezultatus, tarp mėginių, laikytų 14 dienų terpėje su IGF-1 ir be IGF-1, statistiškai reikšmingas skirtumas rastas tik 37 C temperatūros (p < 0,005) KKK laikymo sąlygomis. Mėginių, išlaikytų 28 dienas 70 C temperatūroje, vidutinis QP užregistruotas 5,93 ± 0,33. Mėginių, išlaikytų 28 dienas terpėje be IGF-1, 4 C temperatūroje vidutinis QP buvo 5,17 ± 0,34, o 37 C temperatūroje 6,63 ± 0,34. Lyginant rezultatus, statistiškai reikšmingas QP vidurkių skirtumas buvo tarp KKK mėginių, išlaikytų 28 dienas terpėje be IGF-1 4 C ir 37 C temperatūrose (p < 0,001). 32

33 Naudojant neparametrinį daugiafaktorinį Bonferoni post hoc kriterijų reikšmingo skirtumo nestebėta lyginant rezultatus tarp 70 C ir 4 C temperatūrų mėginių grupių. Taip pat reikšmingo skirtumo nestebėta lyginant rezultatus tarp 70 C ir 37 C temperatūrų mėginių grupių (p > 0,05). Mėginių, laikytų 28 dienas terpėje su IGF-1, 4 C temperatūroje vidutinis QP buvo 5,23 ± 0,60, o 37 C 6,87 ± 0,53. Lyginant šiuos rezultatus, tarp mėginių laikytų 28 dienas terpėje su IGF-1, statistiškai reikšmingo skirtumo nestebėta. Arthro-BST aparatu nustatyti skirtingomis sąlygomis ir skirtingą laiką laikytų KKK elektromechaninių savybių rezultatai pateikti paveiksle. Šiame paveiksle grafiškai pavaizduota QP priklausomybė nuo mėginių laikymo sąlygų ir laikymo trukmės pav. Elektromechaninių KKK savybių matavimo rezultatai laikytų skirtingomis in vitro sąlygomis mėginių grupėse QP elektromechaninės kremzlės savybės. Reikšmingumo lygmuo tarp grupių: *p < 0,001; **p < 0,001; # p < 0,05. Visų grupių QP rezultatai skyrėsi nuo kontrolinės (šviežios) grupės QP rezultatų (*). Aukščiau išnagrinėti matavimų rezultatai akivaizdžiai parodė, kad išmatuoti QP vidurkiai statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo kontrolinių šviežios kremzlės duomenų (p < 0,001) visose KKK grupėse, nepriklausomai nuo to ar 14, ar 28 dienas jie buvo išlaikyti atitinkamose temperatūrų ir terpių sąlygose. 33

34 Gautų matavimų analizė parodė, kad šviežiai kremzlei artimiausios elektromechaninės savybės buvo nustatytos mėginiuose, laikytuose 14 dienų terpėje be IGF-1 4 C temperatūroje. Nors terpėje su IGF-1 QP 37 C temperatūroje po 14 dienų sumažėjo, tačiau skaitine išraiška vis tiek QP buvo didesnis nei KKK mėginių, laikytų 14 dienų terpėje be IGF-1 4 C temperatūroje Chondrocitų gyvybingumas LIVE/DEAD dažais nudažytų kremzlės pjūvių vaizdai parodyti paveiksle pav. Chondrocitų gyvybingumas skirtingose sąlygose laikytų mėginių grupėse (Live/Dead dažymas) Chondrocitų gyvybingumo matavimai atlikti kaip aprašyta metodikoje. Tuoj po operacijos buvo nustatytas šviežių KKK gyvybingų kremzlės chondrocitų skaičius, t.y. 83,3 ± 2,98 proc. Šie rezultatai buvo naudoti kaip kontroliniai duomenys pakitimams nustatyti. Po 14 dienų mažiausias gyvybingų chondrocitų kiekis buvo stebėtas KKK mėginiuose, laikytuose 70 C temperatūroje, kur gyvybingų ląstelių buvo 35,2 ± 6,9 proc. Mėginiuose laikytuose 14 dienų DMEM terpėje be IGF-1 4 C temperatūroje gyvybingų ląstelių buvo rasta 58,22 ± 4,07 proc., o 37 C temperatūroje gyvybingų chondrocitų buvo 44,87 ± 4,53 proc. Analizuojant gautus rezultatus tarp KKK mėginių grupių be IGF-1, išlaikytų 14 dienų, nustatyta, kad mažiausiai gyvybingų ląstelių buvo rasta KKK mėginiuose, laikant juos 70 C temperatūros sąlygomis. Šios grupės rezultatai statistiškai reikšmingai skyrėsi tik nuo KKK, laikytų 4 C temperatūros terpėje be IGF-1 (**p < 0,001). Daugiausiai gyvybingų ląstelių po 14 dienų rasta 4 C temperatūros DMEM terpėje be IGF-1, lyginant su 37 C 34

35 temperatūros terpėje be IGF-1 laikytais KKK, kur stebėtas statistiškai reikšmingas skirtumas (p = 0,003). Mėginių, laikytų 14 dienų 4 C temperatūros terpėje su IGF-1, gyvybingų chondrocitų kiekis buvo 53,89 ±6,48 proc., o 37 C su IGF-1 49,22 ± 7,35 proc. Lyginant gyvybingų chondrocitų kiekio rezultatus statistiškai reikšmingo skirtumo tarp KKK grupių, laikytų 14 dienų terpėje su IGF-1, nestebėta (p > 0,05). Pažymėtina, kad po 14 dienų IGF-1 įtakojo KKK gyvybingų chondrocitų kiekio padidėjimą tik 37 C grupėje, tačiau lyginant su 37 C be IGF-1 grupės rezultatais, statistiškai reikšmingo skirtumo nestebėta. Po 28 dienų 70 C temperatūroje laikytuose KKK, gyvybingi chondrocitai sudarė tik 35,46 ± 4,36 proc. Mėginių laikytų DMEM terpėje be IGF-1 4 C temperatūroje gyvybingų chondrocitų išliko 57,80 ± 2,71 proc., o 37 C 52,02 ± 5,97 proc.. Palyginus šių grupių rezultatus, statistiškai reikšmingo skirtumo tarp jų nerasta. KKK, laikytų 28 dienas terpėje su IGF-1 4 C temperatūroje, gyvybingų chondrocitų buvo 53,81 ± 4,90 proc., o 37 C temperatūroje- 49,93 ± 4,96 proc. Lyginant KKK išlaikytų 28 dienas terpėse su IGF-1 rezultatus tarp 4 C ir 37 C temperatūrų grupių, reikšmingo gyvybingų chondrocitų kiekio skirtumo nestebėta (p > 0,05). KKK mėginius, laikant 70 C temperatūros sąlygomis 28 dienas ir lyginant su kitomis grupėmis, išlaikytomis tiek pat laiko, gyvybingų ląstelių kiekis buvo mažiausias ir rezultatas statistiškai reikšmingai skyrėsi (p 0,001). Apibendrinti gyvybingų chondrocitų rezultatai parodyti paveiksle pagal kiekvieną KKK grupę. Duomenys pateikiami procentine išraiška. Pažymėtina, kad po 14 ir 28 dienų visose KKK tiriamosiose grupėse chondrocitų kiekis sumažėjo. Apibendrinant gautus rezultatus, gyvybingų chondrocitų kiekio vidurkis statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo kontrolinių duomenų tiek po 14, tiek po 28 dienų laikymo skirtingų temperatūrų sąlygomis visose grupėse (p 0,001). Apskaičiuotas gyvybingų chondrocitų kiekis parodė, kad gyvybingiausia kremzlė išliko KKK mėginius laikant DMEM terpėje, 4 C temperatūros, 14 dienų, lyginant juos su šaldytų mėginių grupe ir mėginiais, kurie laikyti terpėje, inkubuojant juos 37 C temperatūroje. Nors terpėje su IGF-1 gyvybingų chondrocitų kiekis 37 C temperatūroje po 14 dienų padidėjo, tačiau skaitine išraiška vis tiek buvo mažesnis nei KKK mėginiuose, laikytuose terpėje be IGF-1 4 C temperatūroje po 14 dienų. 35

36 pav. Gyvybingų chondrocitų kiekis procentais skirtingomis sąlygomis laikytų mėginių grupėse Reikšmingumo lygmuo tarp grupių: *p 0,001; **p < 0,001; ***p < 0,003; # p 0,001. Visų grupių rezultatai skyrėsi nuo kontrolinės (šviežios) grupės rezultatų (*). Po 28 dienų 70 C grupės rezultatai skyrėsi nuo visų grupių rezultatų po 28 dienų (#) GAG pasiskirstymas KKK Mėginius nudažius safranino O fast green dažais buvo padarytos nuotraukos, kaip nurodyta metodikoje. Kremzlėje GAG pasiskirstymas parodytas paveiksle pagal grupes ir laikymo trukmę pav. Histologiniai pjūviai nudažyti safraninu O skirtingomis sąlygomis laikytų mėginių grupės 36

37 Vertintas dažų pasiskirstymas mėginiuose pagal grupes, kaip numatyta metodikoje. Šviežių KKK raudonos spalvos intensyvumas (RSI) buvo 72,95 ± 1,06 proc. Šis rezultatas buvo naudojamas kaip kontrolinis toilmesnei duomenų analizei. Po 14 dienų KKK, laikytų 70 C temperatūroje, RSI buvo sumažėjęs iki 61,50 ± 9,60 proc. Mėginiuose, laikytuose 14 dienų terpėje be IGF-1 4 C temperatūroje, RSI buvo 71,48 ± 5,61 proc., o 37 C 54,4 ± 1,76 proc. Visose mėginių grupėse RSI pablogėjo po 14 dienų. Statistiškai reikšmingas skirtumas stebėtas tik tarp mėginių, kurie buvo laikyti 14 dienų terpėje be IGF-1 4 C ir 37 C temperatūrų sąlygose (p 0,001). Po 14 dienų KKK mėginių, laikytų terpėje su IGF-1 4 C temperatūroje, RSI buvo 62,58 ± 9,57 proc., 37 C 63,98 ± 9,35 proc. RSI rezultatai buvo blogesni ir KKK laikytų 4 C temperatūros DMEM terpėje su IGF-1, lyginant su 37 C temperatūroje laikytų mėginių rezultatais, tačiau statistiškai reikšmingo RSI skirtumo nestebėta. Po 28 dienų RSI matavimų rezultatai dar labiau pablogėjo 70 C temperatūroje laikytų mėginių RSI sumažėjo iki 57,89 ± 2,31 proc. Mėginių laikytų terpėje be IGF-1 4 C temperatūroje RSI vidurkis buvo 59,02 ± 5,46 proc., o 37 C 48,58 ± 3,43 proc. Analizuojant rezultatus, statistiškai reikšmingo skirtumo tarp šių grupių nestebėta. Po 28 dienų 4 C temperatūros terpėje su IGF-1 RSI vidurkis buvo 54,12 ± 7,27 proc., o 37 C 45,91 ± 4,1 proc. Per šį laikotarpį IGF-1 priedas terpėje neįtakojo RSI, mėginius laikant tiek 4 C, tiek 37 C temperatūrose, statistiškai reikšmingo skirtumo nestebėta. Apibendrinti gauti tyrimo rezultatai parodyti paveiksle. Rezultatas parodo raudonos spalvos komponentės procentinį kiekį nuo žalios, mėlynos ir raudonos komponenčių sumos. Apibendrinant rezultatus, RSI vidurkis statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo kontrolinės grupės rezultatų tiek po 14, tiek po 28 dienų visose grupėse (p < 0,002). Apskaičiuotas RSI parodo, kad didžiausia glikozaminoglikanų koncentracija yra kremzlėje, laikant mėginius DMEM terpėje 4 C temperatūroje 14 dienų, lyginant su šaldytų mėginių grupe ir mėginiais (p > 0,05), kurie laikyti terpėje inkubuojant juos 37 C temperatūroje (p 0,001). Po 14 dienų terpė su IGF-1 teigiamai įtakojo RSI įvertį mėginių, laikytų 37 C temperatūroje, tačiau efektas statistiškai nebuvo reikšmingas, lyginant su mėginiais laikytais terpėje be IGF-1. 37

38 pav. Raudonos spalvos intensyvumas (procentais) skirtingomis sąlygomis laikytų mėginių grupėse Reikšmingumo lygmuo tarp grupių: *p < 0,002; **p < 0,002; ***p 0,001. Visų grupių rezultatai skyrėsi nuo kontrolinės (šviežios) grupės rezultatų (*) Histologinis KKK vertinimas Norint įvertinti mėginių histologinę būklę buvo pasinaudota Mankin pasiūlyta histologinio vertinimo skale. Nors ši metodika labiau yra pritaikyta įvertinti žmogaus OA pažeistos kremzlės histologinę būklę, tačiau ji yra plačiai naudojama kaip analogas vertinant histologinius kremzlės pažeidimus ir studijose su gyvūnais. Visų KKK mėginių, išlaikytų 14 dienų atitinkamomis sąlygomis, vertinimo rezultatai buvo prastesni lyginant su sveika šviežiai paimta kremzle, kuri buvo įvertinta 0 balų. Po 14 dienų KKK laikyti 70 C buvo įvertinti 1,83 ± 0,75. Mėginiai laikyti terpėje be IGF-1 4 C temperatūroje įvertinti 1,40 ± 0,89, o 37 C temperatūroje 3,20 ± 0,84. Mėginiuose, laikytuose 70 C ir 4 C temperatūrose, buvo mažesnė safranino O dažų raiška kremzlėje, o paviršiniame KKK kremzlės sluoksnyje buvo rastas padidintas ląstelių kiekis. KKK, išlaikytų 37 C temperatūros grupėje buvo struktūriniai kremzlės pakitimai, sumažėjęs ląstelių kiekis ir ląstelių išsidėstymas kolonomis. Šiuos rezultatus papildė ir GAG raiška kremzlėje, kur paviršiniame ir viduriniame kremzlės sluoksniuose jis buvo šiek tiek sumažėjęs. 38

39 Apibendrinus 14 dienų rezultatus, histologinių pjūvių įvertis balais buvo mažesnis 4 C mėginių grupėje, lyginant su 37 C grupe, mėginius laikant terpėje be IGF-1. Skirtumas buvo statistiškai reikšmingas (p = 0,019). Po 14 dienų mėginių laikytų terpėje su IGF-1 4 C temperatūroje histologinis KKK įvertinimas buvo 2,20 ± 0,45, 37 C temperatūroje 2,83 ± 0,98 balų. Terpės papildymas IGF-1 tiek 4 C, tiek 37 C temperatūrų grupėse teigiamos įtakos histologinei KKK struktūrai neturėjo. Lyginant rezultatus, tarp mėginių, laikytų 14 dienų terpėje su IGF-1 ir be IGF-1, statistiškai reikšmingo skirtumo histologinei kremzlės būklei nenustatyta tiek 4 C, tiek 37 C temperatūrų grupėse (p > 0,05). Nors terpėje su IGF-1 histologinė mėginių būklė 37 C temperatūroje po 14 dienų pagerėjo palyginus su mėginiais laikytais be IGF-1, tačiau skaitine išraiška įvertis vis tiek buvo didesnis nei KKK mėginių, laikytų 14 dienų terpėje be IGF-1 4 C temperatūroje. Po 28 dienų kremzlės mėginių būklė dar pablogėjo. KKK laikyti 70 C buvo įvertinti 2,00 ± 0,82. Mėginiai laikyti terpėje be IGF-1 4 C temperatūroje įvertinti 2,50 ± 0,55, o 37 C 4,33 ± 0,82. Histologiniuose pjūviuose buvo padidėjęs išsibarsčiusių ląstelių kiekis bei ryškiai sumažėjęs safranino O pasiskirstymas. Statistiškai reikšmingas skirtumas po 28 dienų buvo stebėtas tarp KKK grupių, laikytų 70 C ir terpėje be IGF-1 37 C temperatūroje (#p = 0,005). Toks pats skirtumas rastas tarp KKK mėginių laikytų terpėse be IGF-1 faktoriaus 4 C bei 37 C temperatūrose (p=0,005). Terpėje su IGF-1 po 28 dienų laikymo 4 C temperatūroje, mėginių įvertis buvo 3,17 ± 0,75, o 37 C- 5,00 ± 0,63. Terpė su IGF-1 histologinės kremzlės būklės neįtakojo mėginius laikant 28 dienas tiek 4 C, tiek 37 C temperatūrose. Didžiausias balų įvertis buvo, KKK mėginius laikant terpėje su IGF-1 37 C temperatūroje, dėl padidėjusių difuzinių ląstelių sankaupų. Paviršiaus struktūra taip pat buvo netolygi, kaip ir safranino O pasiskirstymas kremzlėje. Po 28 dienų statistiškai reikšmingas skirtumas stebėtas tarp KKK mėginių, laikytų terpėje su IGF-1 4 C ir 37 C temperatūrose (p = 0,005). Histologinis įvertinimas atliktas kaip aprašyta metodikoje (žr. sk ). Rezultatai pavaizduoti paveiksle. Apibendrinant rezultatus, geriausia histologinė kremzlės būklė buvo nustatyta KKK mėginiuose, laikytuose DMEM terpėje be IGF-1 4 C temperatūroje 14 dienų. Po 14 dienų 37 C temperatūros terpėje su IGF-1 histologinė kremzlės būklė pagerėjo, tačiau skaitine reikšme įvertis buvo didesnis nei mėginių laikytų DMEM terpėje be IGF-1 4 C temperatūroje 14 dienų. Statistiškai reikšmingo skirtumo nestebėta (p > 0,05). 39

40 pav. Histologinis kremzlės įvertinimas pagal Mankin o skalę skirtingomis sąlygomis laikytų mėginių grupėse Reikšmingumo lygmuo tarp grupių: #p = 0,005; ##p < 0,02. Kontrolinė (šviežia) grupė įvertinta 0 balų Apoptozė KKK Apoptotinių ląstelių kiekiui nustatyti histologiniai pjūviai buvo dažomi TUNEL metodu, kaip nurodyta metodikoje. Apoptotinių ląstelių pasiskirstymas pagal grupes parodytas paveiksle pav. Apoptotinių ląstelių pasiskirstymas skirtingomis sąlygomis laikytų mėginių grupėse 40

41 Apoptotinių ląstelių pasiskirstymas skirtingomis sąlygomis laikytų mėginių grupėse buvo nevienodas. Apoptotinės ląstelės nusidažo ruda spalva. Šviežios kremzlės pjūviuose apoptotinių chondrocitų skaičius buvo 54,55 ± 8,87 proc. Šis rezultatas buvo naudojamas kaip kontrolinis įvertis tolimesnei rezultatų analizei. Mėginius išlaikius 14 dienų apoptotinių ląstelių kiekis padidėjo visose grupėse lyginant su kontroline grupe. KKK mėginiuose apoptotinių ląstelių rasta atitinkamai 70 C temperatūroje 85,82 ± 8,72 proc., 4 C temperatūros terpėje be IGF-1 74,98 ± 8,67 proc., o 37 C temperatūroje 93,91 ± 1,1 proc. Statistiškai reikšmingas skirtumas stebėtas tik tarp mėginių laikytų 4 C ir 37 C temperatūros terpėje be IGF-1 grupių (p = 0,021). Mėginiuose laikytuose 14 dienų terpėse su IGF-1 apoptotinių ląstelių kiekis 4 C temperatūroje buvo 86,97 ± 4,71 proc., o 37 C 94,72 ± 0,95 proc. Terpė su IGF-1 po 14 dienų tiek 4 C temperatūroje, tiek 37 C temperatūroje apoptozės nesumažino. Šių mėginių grupių apoptotinių ląstelių kiekis buvo netgi didesnis, lyginant su mėginiais laikytais atitinkamomis temperatūros sąlygomis terpėje be IGF-1. Po 28 dienų apoptotinių ląstelių kiekis mėginiuose laikytuose 70 C temperatūroje buvo 86,19 ± 6,87 proc., terpėje be IGF-1 4 C temperatūroje 74,39 ± 3,60 proc., o 37 C temperatūroje 94,32 ± 1,90 proc. Po 28 dienų išlaikymo terpėje be IGF-1 pastebėtas statistiškai reikšmingas skirtumas tik tarp 4 C temperatūros ir 37 C temperatūros grupių (p = 0,008). Po 28 dienų apoptotinių ląstelių kiekis mėginiuose laikytuose terpėje su IGF-1 4 C temperatūroje buvo 83,81 ± 3,48 proc., o 37 C 93,90 ± 1,20 proc. DMEM terpė su IGF-1 įtakos chondrocitų apoptozei neturėjo tiek 4 C, tiek 37 C temperatūros grupėse, kur statistiškai reikšmingo skirtumo nestebėta (p > 0,05). Kremzlės apoptotinių ląstelių kiekiai procentine išraiška pagal grupes parodyti paveiksle. Apibendrinat gautus rezultatus, chondrocitų apoptozė visose KKK grupėse statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo kontrolinės grupės (p < 0,001). Mažiausias apoptotinių ląstelių kiekis nustatytas KKK mėginiuose laikytuose DMEM terpėje be IGF-1, 4 C temperatūroje, 14 ir 28 dienas. Statistiškai reikšmingas skirtumas stebėtas tarp mėginių grupių, laikytų DMEM terpėje be IGF-1 4 C ir 37 C temperatūrose tiek po 14, tiek po 28 dienų (p < 0,05). 41

42 pav. Apoptotinių chondrocitų kiekis procentais skirtingomis sąlygomis laikytų mėginių grupėse Reikšmingumo lygmuo tarp grupių: *p < 0,001; #p < 0,05; **p = 0,008. Visų grupių rezultatai skyrėsi nuo kontrolinės (šviežios) grupės rezultatų (*), išskyrus 4 C po 14 ir 28 dienų (#) Koreliacijos tarp vertinimo kriterijų Įvertinus visus turimus duomenis buvo atlikta ir koreliacijos ryšio analizė. Rastas tiesioginis ryšys tarp QP ir histologinio vertinimo (r = 0,673, p < 0,001) bei apoptotinių chondrocitų kiekio (r = 0,416, p = 0,018). Rasta atvirkštinė koreliacija tarp chondrocitų gyvybingumo (r = 0,654, p < 0,001). Koreliacijos stebėtos ir tarp kitų parametrų. Apoptozė tiesiogiai koreliavo su histologinio vertinimo rezultatais (r = 0,493, p = 0,006) bei atvirkščiai koreliavo su GAG pasiskirstymu, atvaizduotu RSI (r = 0,644, p < 0,001). Išanalizavus duomenis, nustatytos koreliacijos pavaizduotos paveiksle

43 pav. Koreliacijos tarp skirtingų KKK kokybės vertinimo parametrų QP kiekybinis parametras In vitro tyrimo rezultatų bendras aptarimas Apibendrinant visų KKK grupių in vitro tyrimo metu gautus rezultatus, nustatyta, kad geriausios elektromechaninės kremzlės savybės ir didžiausias gyvybingų chondrocitų kiekis buvo KKK laikytuose DMEM terpėje be IGF-1, 4 C temperatūroje, 14 dienų. Šioje mėginių grupėje raudonos spalvos intensyvumas buvo didžiausias, o histologinis Mankin o vertinimo balas ir apoptotinių ląstelių kiekis buvo mažiausi. Taigi šios grupės histologinė 43

44 kremzlės būklė buvo geriausia, lyginant su kitomis ištirtomis KKK grupėmis. Šie rezultatai rodo, kad KKK išlaikius DMEM terpėje be IGF-1, 4 C temperatūroje, 14 dienų, šios KKK grupės savybės yra artimiausios šviežių KKK kremzlių savybėms Makroskopinis vertinimas 5.2. In vivo tyrimų rezultatai Vidiniai šlaunikaulių krumpliai tyrimams paimti praėjus atitinkamai 3 ir 6 mėnesiams po transplantacijos. Jų išorinis vaizdas įvertintas modifikuota Oswestry skale kaip nurodyta metodikoje, (žr ). Modifikuotos OAS skalės maksimalus vertinimo balas 8 buvo laikomas kontroliniu. Makroskopiniai vaizdai tiriamosiose grupėse po operacijos parodyti paveiksle pav. Makroskopiniai šlaunikaulio vidinių krumplių vaizdai skirtingose mėginių grupėse skirtinguose laiko intervaluose A vaizdas po operacijos praėjus 3 mėnesiams po transplantacijos grupėse ir B praėjus 6 mėnesiams. OCA alogeninė transplantacija, OAT autologinė transplantacija, PRP trombocitais praturtinta plazma. 44

45 Rezultatai praėjus 3 mėnesiams po transplantacijos Po 3 mėnesių OCA grupės dešinės kojos kelio sąnario OAS įvertis buvo 5,00 ± 1,79, kairės 5,17 ± 0,98, o OAT grupės dešinės kojos kelio sąnario įvertis buvo 6,25 ± 2,06, kairės 5,25 ± 2,06. Įverčiai OCA ir OAT grupėse buvo mažesni tiek dešinės, tiek kairės kojų kelio sąnariuose lyginant su kontroliniu įverčiu (p = 0,059). Trombocitais praturtintos plazmos suleidimas į kairės kojos kelio sąnarį OCA ir OAT grupėse praėjus 3 mėnesiams po transplantacijos makroskopinio vaizdo nepagerino, lyginant su atitinkamos grupės dešinės kojos kelio sąnario makroskopiniu vaizdu, statistiškai reikšmingo skirtumo nestebėta (p > 0,05). Lyginant OCA ir OAT grupių dešinės kojos kelio sąnario OAS rezultatus, praėjus 3 mėnesiams po operacijos, statistiškai reikšmingo skirtumo įverčiuose nestebėta (p > 0,05). Taip pat statistiškai reikšmingo skirtumo tarp grupių OAS įverčių nestebėta ir lyginant kairės kojos kelio sąnario makroskopinius vaizdus. (p > 0,05) Rezultatai praėjus 6 mėnesiams po transplantacijos Praėjus 6 mėnesiams po operacijos OCA grupės dešinės kojos kelio sąnario įvertis buvo 3,57 ± 1,62, kairės 2,86 ± 1,21, o OAT grupės dešinės kojos kelio sąnario įvertis buvo 5,25 ± 1,26, kairės 6,00 ± 1,83. Įverčiai OCA ir OAT grupėse buvo mažesni abiejų kojų kelio sąnariuose lyginant su kontroliniu įverčiu (p < 0,05). Trombocitais praturtintos plazmos leidimas į kairės kojos kelio sąnarį OCA ir OAT grupėse praėjus 6 mėnesiams po transplantacijos makroskopinio vaizdo nepagerino, lyginant su atitinkamos grupės dešinės kojos kelio sąnario makroskopiniu vaizdu, statistiškai reikšmingo skirtumo nestebėta (p > 0,05). Lyginant OCA ir OAT transplantacijų rezultatus, praėjus 6 mėnesiams po operacijos, dešinės kojos kelio sąnario makroskopinis vaizdas OCA grupėje buvo žymiai blogesnis nei OAT grupėje, o OAS balų suma statistiškai reikšmingai skyrėsi (p = 0,01). Kairės kojos kelio sąnario išorinis vaizdas OCA grupėje buvo blogesnis, t. y. OAS balas daugiau nei du kartus mažesnis, lyginant su OAT grupe ir statistiškai reikšmingai skyrėsi (p < 0,001). 45

46 Transplantacijos rezultatų po 3 ir 6 mėnesių palyginimas Lyginant OCA grupės 3 ir 6 mėnesių rezultatus, paaiškėjo, kad dešinės kojos kelio sąnario vaizdas po 6 mėnesių buvo žymiai blogesnis nei 3 mėnesių OAS rezultatas ( ## p = 0,004). Tokia pati tendencija stebėta OCA grupės kairės kojos kelio sąnaryje (*p < 0,001), kur PRP leidimas į sąnarį kremzlės makroskopinio vaizdo nepagerino. Lyginant OAT grupės 3 ir 6 mėnesių rezultatus tarp dešinės kojos kelio sąnarių statistiškai reikšmingo skirtumo nestebėta (p > 0,05). Priešingas makroskopinio vaizdo pokytis stebėtas OAT grupės kairės kojos kelio sąnaryje po 6 mėnesių, kur kairės kojos kelio sąnario OAS įvertis buvo statistiškai reikšmingai didesnis nei 3 mėnesių OAS rezultatas ( # p = 0,016). Į kairės kojos kelio sąnarį OAT grupėje suleidus PRP, makroskopinis vaizdas pagerėjo praėjus 6 mėnesiams po transplantacijos Makroskopinio vertinimo rezultatų apibendrinimas Modifikuotos Oswestry skalės maksimalus vertinimo balas yra 8. Šis įvertis yra kontrolinis skaičius, norint įvertinti makroskopinius pakitimus kremzlėje po transplantacijos. Didesnis balas rodo geresnę transplantato būklę. Alogeninės ir autologinės transplantacijų OAS vertinimo rezultatai, praėjus 3 ir 6 mėnesiams po operacijos, pavaizduoti paveiksle. Apibendrinant makroskopinio vertinimo rezultatus nustatyta, kad praėjus 3 mėnesiams po operacijos makroskopinis vaizdas alogeninės transplanttacijos grupėje nesiskyrė nuo autologinės transplantacijos grupės vaizdo. Po 6 mėnesių makroskopinis vaizdas buvo blogesnis, t. y. vertinimo balų suma buvo mažesnė OCA grupėje, lyginant su kontroline OAT grupe abiejų kojų kelio sąnariuose. Autologinės trombocitais praturtintos plazmos leidimas į kairės kojos kelio sąnarį makroskopinio vaizdo rezultatų nei vienoje grupėje nepagerino praėjus 3 ir 6 mėnesiams po transplantacijos. 46

47 pav. Makroskopinio vertinimo naudojant OAS skalę rezultatai skirtingose mėginių grupėse skirtinguose laiko intervaluose OCA 14 diena (X) alotransplantato (OCA) implantacijos diena, kontroliniai duomenys OCA grupei, OAT 0 diena (XX) autologinio transplantato (OAT) tyrimo rezultatas implantacijos dieną. OCA alogeninis transplantatas OAT autologinis transplantatas. PRP trombocitais praturtinta plazma. 3 3 mėnesiai po transplantacijos, 6 6 mėnesiai. Reikšmingumo lygmuo tarp grupių: #p = 0,016, ##p = 0,004, *p < 0,001, **p = 0, Transplantuotų KKK elektromechaninės savybės Elektromechaninės KKK transplanto savybės OCA ir OAT grupėse vertintos operacijos dieną bei praėjus 3 ir 6 mėnesiams po transplantacijos. QP įvertintas kaip aprašyta metodikoje (žr ). Didesnis QP įvertis reiškia prastesnę kremzlės būklę. Operacijos metu užregistruoti pradiniai QP duomenys, siekiant įvertinti potransplantacinius elektromechaninių savybių pakitimus OCA ir OAT grupėse. KKK, išlaikytų 14 dienų 4 C temperatūros DMEM terpėje be IGF-1, rezultatas (4,43 ± 0,15) buvo kontrolinis OCA grupei, o šviežių KKK electromechaniniai duomenys (4,00 ± 0,23) buvo naudojami kaip kontrolė OAT grupei Rezultatai praėjus 3 mėnesiams po transplantacijos Praėjus 3 mėnesiams po transplantacijos operacijų OCA grupės dešinės kojos kelio sąnario QP buvo 5,37 ± 0,96, kairės kojos kelio sąnario QP 6,21 ± 0,71. OAT grupės dešinės kojos kelio sąnario QP buvo 6,29 ± 1,99, 47

48 kairės kojos kelio sąnario QP 6,13 ± 0,81. Abiejų kojų kelio sąnarių transplantatų elektromechaninės savybės OCA ir OAT grupėse statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo atitinkamos grupės operacijos dieną užregistruotų kontrolinių QP (p < 0,001). Trombocitais praturtintos plazmos leidimas į kairės kojos kelio sąnarį OCA ir OAT grupėse praėjus 3 mėnesiams po transplantacijos, elektromechaninių kremzlės savybių nepagerino, lyginant su atitinkamos grupės dešinės kojos kelio sąnario QP, statistiškai reikšmingo skirtumo nestebėta (p > 0,05). Lyginant OCA ir OAT grupių dešinės ir kairės kojų kelių sąnarių electromechaninių kremzlės savybių rezultatus, praėjus 3 mėnesiams po operacijos, statistiškai reikšmingo skirtumo nestebėta (p > 0,05) Rezultatai praėjus 6 mėnesiams po transplantacijos Praėjus 6 mėnesiams po operacijos OCA grupės dešinės kojos kelio sąnario QP buvo 9,41 ± 2,17, kairiojo 9,29 ± 2,69, o OAT grupės dešiniojo kelio sąnario QP buvo 5,81 ± 1,97, kairiojo 5,07 ± 0,96. Abiejų kojų kelio sąnarių transplantatų elektromechaninės savybės OCA ir OAT grupėse statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo atitinkamos grupės operacijos dieną užregistruotų kontrolinių QP (p < 0,001). QP įvertis po 6 mėnesių OCA grupės abiejų kojų kelio sąnariuose padidėjo daugiau nei du kartus, lyginant su operacijos dienos kontroliniais duomenimis. Tai rodo ženklų elektromechaninių savybių pablogėjimą OCA grupėje abiejų kojų kelio sąnariuose. Trombocitais praturtintos plazmos leidimas į kairės kojos kelio sąnarį OCA ir OAT grupėse praėjus 6 mėnesiams po transplantacijos elektromechaninių kremzlės savybių nepagerino, lyginant su atitinkamos grupės dešinės kojos kelio sąnario elektromechaninėmis savybėmis, statistiškai reikšmingo skirtumo nestebėta (p > 0,05). Lyginant OCA ir OAT transplantacijų rezultatus, praėjus 6 mėnesiams po operacijos, abiejų kojų kelio sąnarių elektromechaninės kremzlės savybės OCA grupėje buvo žymiai blogesnės nei atitinkamo kelio sąnario OAT grupėje ir QP rezultatas statistiškai reikšmingai skyrėsi tiek dešinės, tiek kairės kojų kelio sąnariuose (p < 0,01) Transplantacijos rezultatų po 3 ir 6 mėnesių palyginimas Lyginant OCA grupės 3 ir 6 mėnesių QP rezultatus, paaiškėjo, kad dešinės kojos elektromechaninės savybės po 6 mėnesių buvo žymiai blogesnės nei po 3 mėnesių (p < 0,001). Tokia pati tendencija stebėta OCA grupės 48

49 kairės kojos kelio sąnaryje (p < 0,001), kur PRP leidimas į sąnarį kremzlės QP nepagerino. Lyginant kontrolinės OAT grupės 3 ir 6 mėnesių elektromechaninių savybių rezultatus nustatyta, kad dešinės kojos kelio sąnario QP rezultatai statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p > 0,05). OAT grupėje po 6 mėnesių kairės kojos kelio sąnaryje, lyginant su 3 mėnesių QP rezultatu, PRP leidimas statistiškai reikšmingai elektromechanines savybes pagerino (p = 0,002) Elektromechaninių savybių vertinimo rezultatų apibendrinimas Elektromechaninių kremzlės savybių registracijos rezultatai pagal grupes pateikiami paveiksle pav. Elektromechaninių kremzlės savybių rezultatai skirtingose mėginių grupėse skirtinguose laiko intervaluose OCA 14 diena alotransplantato (OCA) implantacijos diena, kontroliniai duomenys OCA grupei, OAT 0 diena autologinio transplantato (OAT) tyrimo rezultatas implantacijos dieną. PRP trombocitais praturtinta plazma. 3 3 mėnesiai po transplantacijos, 6 6 mėnesiai. Reikšmingumo lygmuo tarp grupių: #p = 0,002, *p < 0,001, **p = 0,

50 Apibendrinant rezultatus, nustatyta, kad praėjus 3 mėnesiams po operacijos elektromechaninės savybės alogeninės transplantacijos grupėje nesiskyrė nuo autologinės transplantacijos grupės. Po 6 mėnesių elektromechaninės savybės buvo blogesnės OCA grupėje, lyginant su kontroline OAT grupe abiejų kojų kelio sąnariuose. Alogeninės ir autologinės transplanttacijos grupėse trombocitais praturtintos plazmos leidimas į kairės kojos kelio sąnarį elektromechaninių savybių nepagerino praėjus 3 ir 6 mėnesiams po operacijos Transplantuotų KKK histologinis vertinimas Histologiniai mėginių pjūviai vertinti O Driscoll skale (žr ). In vivo eksperimento vertinimas atliktas OCA ir OAT grupėse praėjus 3 bei 6 mėnesiams po operacijos. Maksimalus įvertis 24 balai buvo naudojamas kaip kontrolinis skaičius vertinant histologinius pokyčius transplantuotoje kremzlėje. Histologiniai kremzlės vaizdai parodyti paveiksle pav. Histologinis kremzlės vaizdas rezultatai skirtingose mėginių grupėse skirtinguose laiko intervaluose A vaizdas po operacijos praėjus 3 mėnesiams po transplantacijos grupėse ir B praėjus 6 mėnesiams. OCA alogeninė transplantacija, OAT autologinė transplantacija, PRP trombocitais praturtinta plazma. 50

51 Rezultatai praėjus 3 mėnesiams po transplantacijos Praėjus 3 mėnesiams po operacijos OCA ir OAT grupėse transplantatų O Driscoll vertinimo balai buvo mažesni lyginant su kontroliniu balu. OCA grupėje dešinės kojos kelio sąnario įvertis buvo 18,33 ± 1,66, o kairės 18,09 ± 1,64. OAT grupės dešinės kojos kelio sąnario rezultatų įvertis buvo 19,73 ± 1,85, kairės 19,83 ± 1,40. Po 3 mėnesių OCA ir OAT grupėse O Driscoll įvertis buvo mažesnis ir statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo kontrolinio balo abiejų kojų kelių sąnariuose (p < 0,05). Trombocitais praturtinta plazma OCA transplantacijos grupės kairės kojos kelio sąnaryje histologinės kremzlės struktūros nepagerino, lyginant su įprastu būdu gydytu dešinės kojos kelio sąnariu. Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp dešinės ir kairės kojų kelio sąnarių O Driscoll balų įverčio OCA grupėje nestebėta (p > 0,05). Kairės kojos kelio sąnario histologinė struktūra OAT grupėje mažai pakito, lyginant su OAT grupės dešinės kojos kelio sąnario histologiniu vaizdu, statistiškai reikšmingo skirtumo nestebėta (p > 0,05). Lyginant OCA ir OAT transplantacijų rezultatus, praėjus 3 mėnesiams po operacijos, abiejų kojų kelio sąnarių O Driscoll įvertis OCA grupėje buvo mažesnis nei OAT grupėje ir statistiškai reikšmingai skyrėsi tiek dešinės (p = 0,017), tiek kairės (p < 0,001) kojų kelio sąnariuose Rezultatai praėjus 6 mėnesiams po transplantacijos Praėjus 6 mėnesiams po operacijos OCA grupės rezultatai pablogėjo: dešinės kojos kelio sąnario įvertis buvo 14,00 ± 3,29, o kairės 14,42 ± 2,81. Priešingai, OAT grupės dešinės kojos kelio sąnario įvertis buvo 19,67 ± 1,87, kairiojo 20,11 ± 1,27. Po 6 mėnesių OCA ir OAT grupių O Driscoll įvertis buvo mažesnis ir statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo kontrolinio balo abiejų kojų kelio sąnariuose (p < 0,05). Trombocitais praturtintos plazmos leidimas į kairės kojos kelio sąnarį OCA ir OAT grupėse praėjus 6 mėnesiams po transplantacijos histologinio O Driscoll įverčio nepagerino, lyginant su atitinkamos grupės dešinės kojos kelio sąnario O Driscoll įverčio, statistiškai reikšmingo skirtumo nestebėta (p > 0,05). Lyginant OCA ir OAT transplantacijų rezultatus, praėjus 6 mėnesiams po operacijos, abiejų kojų kelio sąnarių O Driscoll įvertis balų vidurkis OCA grupėje buvo mažesnis nei OAT grupės atitinkamos kojos kelio sąnario O Driscoll įvertis ir statistiškai reikšmingai skyrėsi abiejų kojų kelio sąnariuose (p < 0,001). 51

52 Transplantacijos rezultatų po 3 ir 6 mėnesių palyginimas Lyginant OCA grupės 3 ir 6 mėnesių histologinio vertinimo rezultatus, paaiškėjo, kad abiejų kojų kelio sąnarių O.Driscoll įvertis mažėjo 6 mėnesių laikotarpyje ir statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo 3 mėnesių įverčio abiejų kojų kelio sąnariuose (p < 0,001). Lyginant kontrolinės OAT grupės 3 ir 6 mėnesių abiejų kojų kelio sąnarių rezultatus, statistiškai reikšmingo skirtumo nerasta (p > 0,05) Histologinio vertinimo rezultatų apibendrinimas Histologinio vertinimo pagal O Driscoll skalę rezultatai pagal grupes parodyti paveiksle pav. Histologinio vertinimas pagal O Driscoll skalę rezultatai skirtingose mėginių grupėse skirtinguose laiko intervaluose OCA 14 diena (X) alotransplantato (OCA) implantacijos diena, kontroliniai duomenys OCA grupei, OAT 0 diena (XX) autologinio transplantato (OAT) tyrimo rezultatas implantacijos dieną. OCA alogeninis transplantatas, OAT autologinis transplantatas. PRP trombocitais praturtinta plazma. 3 3 mėnesiai po transplantacijos, 6 6 mėnesiai. Reikšmingumo lygmuo tarp grupių: #p = 0,017, *p < 0,

53 Apibendrinant gautus histologinio vertinimo O Driscoll skale rezultatus, nustatyta, kad OCA grupėje histologinis įvertis, praėjus 3 ir 6 mėnesiams po operacijos, buvo blogesnis lyginant su OAT grupės rezultatais. Trombocitais praturtintos plazmos leidimas į kairės kojos kelio sąnarį OCA ir OAT grupėse histologinės kremzlės struktūros nepagerino praėjus 3 ir 6 mėnesiams po transplantacijos Transplantuotų KKK glikozaminoglikanų raiška RSI įvertintas operacijos dieną bei praėjus 3 ir 6 mėnesiams po operacijos OCA ir OAT grupėse. Duomenys nustatyti operacijos dieną yra kontroliniai. OCA grupei kontroliniai duomenys buvo mėginių, išlaikytų 14 dienų 4 C temperatūros terpėje be IGF-1 (71,48 ± 5,61), o OAT kontrolinę grupę sudarė operacijos metu transplantuotų šviežių KKK duomenys (72,95 ± 1,06) Rezultatai praėjus 3 mėnesiams po transplantacijos Praėjus 3 mėnesiams po transplantacijos OCA ir OAT grupėse RSI įvertinimas buvo mažesnis lyginant su operacijos dieną apskaičiuotais kontroliniais rezultatais. OCA grupės dešinės kojos kelio sąnario RSI įvertis buvo 66,93 ± 5,69, kairės 66,54 ± 3,43. OAT grupės dešinės kojos kelio sąnario RSI įvertis buvo 70,93 ± 2,8, kairės 71,86 ± 2,44. OCA grupėje skirtumas stebėtas tik kairiame kelio sąnaryje lyginant su operacijos dieną apskaičiuotu kontroliniu RSI (p = 0,021), tuo tarpu OAT grupėje po 3 mėnesių RSI įvertis statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo kontrolinio įverčio abiejų kojų kelio sąnariuose (p = 0,043). Trombocitais praturtinta plazma OCA ir OAT transplantacijos grupių kairės kojos kelio sąnariuose RSI nepadidino, lyginant su įprastu būdu gydytais dešinės kojos kelio sąnariais ir statistiškai reikšmingo skirtumo nestebėta (p > 0,05). Lyginant OCA ir OAT transplantacijų rezultatus, praėjus 3 mėnesiams po operacijos, abiejų kojų kelio sąnarių RSI įvertis OCA grupėje buvo mažesnis nei OAT grupės atitinkamo kelio sąnario RSI įvertis ir statistiškai reikšmingas skirtumas stebėtas tarp kairės kojos kelio sąnarių (p = 0,021). 53

54 Rezultatai praėjus 6 mėnesiams po transplantacijos Praėjus 6 mėnesiams po operacijos RSI rezultatai pablogėjo OCA grupėje. Dešinės kojos kelio sąnario RSI įvertis buvo 53,34 ± 11,15, kairės 55,95 ± 7,9. OAT grupės dešinės kojos kelio sąnario įvertis buvo 75,55 ± 0,27, kairio 73,19 ± 6,51. OCA grupėje po 6 mėnesių RSI įvertis ženkliai pablogėjo bei statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo kontrolinio įvertinimo operacijos dieną abiejų kojų kelio sąnariuose (p = 0,001), tuo tarpu OAT grupėje skyrėsi tik kairės kojos kelio sąnaryje (p = 0,002). Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp dešinės ir kairės kojų kelio sąnarių RSI įverčių OCA ir OAT grupėse nestebėta (p > 0,05), trombocitais praturtintos plazmos leidimas į kairės kojos kelio sąnarį po 6 mėnesių RSI įverčio nepagerino. Lyginant OCA ir OAT transplantacijų rezultatus, praėjus 6 mėnesiams po operacijos, abiejų kojų kelio sąnarių RSI įvertis OCA grupėje buvo mažesnis nei OAT grupės atitinkamo kelio sąnario RSI įvertis ir statistiškai reikšmingai skyrėsi tiek dešinės, tiek kairės kojų kelio sąnariuose (p < 0,001) Transplantacijos rezultatų po 3 ir 6 mėnesių palyginimas Lyginant tiriamosios OCA grupės 3 ir 6 mėnesių RSI rezultatus, paaiškėjo, kad abiejų kojų kelio sąnarių RSI įvertis mažėjo 6 mėnesių laikotarpyje ir statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo 3 mėnesių įverčio abiejų kojų kelio sąnariuose (p = 0,002). Lyginant OAT grupės 3 ir 6 mėnesių rezultatus nustatyta, kad abiejų kojų kelio sąnarių RSI įverčiai po 6 mėnesių buvo didesni nei 3 mėnesių ir statistiškai reikšmingai skyrėsi abiejuose kelio sąnariuose (p = 0,001) RSI vertinimo rezultatų apibendrinimas Apibendrinant gautus proteoglikanų raiškos (raudonos spalvos intensyvumo) rezultatus, nustatyta, kad alogeninio KKK transplantato OCA grupėje RSI įvertis, praėjus tiek 3, tiek 6 mėnesiams po operacijos, buvo blogesnis lyginant su OAT grupės rezultatais. Trombocitais praturtintos plazmos leidimas į kairės kojos kelio sąnarį OCA ir OAT grupėse RSI nepagerino praėjus 3 ir 6 mėnesiams po transplantacijos. Raudonos spalvos intensyvumas kremzlės histologiniuose pjūviuose pateikiamas paveiksle. 54

55 pav. Raudonos spalvos intensyvumas procentais skirtinguose mėginių grupėse skirtinguose laiko intervaluose OCA 14 diena alotransplantato (OCA) implantacijos diena, kontroliniai duomenys OCA grupei, OAT 0 diena autologinio transplantato (OAT) tyrimo rezultatas implantacijos dieną. OCA alogeninis transplantatas, OAT autologinis transplantatas, PRP trombocitais praturtinta plazma, 3 3 mėnesiai po transplantacijos, 6 6 mėnesiai. Reikšmingumo lygmuo tarp grupių: *p = 0,001, ** p = 0,021, # p = 0,002, ## p = 0, Transplantuotų KKK vertinimo kriterijų koreliacijos Statistinė analizė parodė, kad elektromechaninės kremzlės savybės QP atvirkščiai koreliuoja su histologinio vertinimo rezultatais (r = 0,596, p < 0,001), OAS vertinimu (r = 0,641, p< 0,001) bei glikozaminoglikanų pasiskirstymu kremzlėje (r = 0,506, p = 0,001). Taip pat histologinio vertinimo ir makroskopinio vertinimo rezultatų koreliacija tiesinė (r = 0,620, p < 0,001), GAG pasiskirstymas koreliuoja su O Driscoll įvertinimu (r = 0,533, p< 0,001) bei OAS balais (r = 0,623, p< 0,001). Siekiant išsiaiškinti tirtų parametrų tarpusavio ryšį, buvo atlikta nepriklausomų imčių analizė naudojant koreliacijos kreives, kurios parodytos paveiksle. 55

56 pav. Koreliacijos tarp skirtingų parametrų A QP koreliacija su O Driscol vertinimu; B QP su makroskopiniu vertinimu OAS; C QP ir raudonos spalvos intensyvumo ryšys. QP kiekybinis parametras. 56

57 6. DISKUSIJA 6.1. In vitro rezultatų aptarimas Alogeninė kremzlės transplantacija yra vienas iš galimų sąnario kremzlės gydymo būdų, pakeičianti autologinę kremzlės transplantaciją. Mokslininkai nuolatos tobulina chondrocitų gyvybingumo išsaugojimo metodikas ir ieško optimalių alogeninės kremzlės laikymo sąlygų, kurios užtikrintų gerus potransplantacinius atokiuosius rezultatus [25]. Šio tyrimo metu taip pat nustatyta, kad sąnario kremzlės chondrocitų gyvybingumui turi įtakos laikymo sąlygos, t. y. laikymo temperatūra, laikymo trukmė ir laikymo terpės sudėtis. Daugiausia gyvybingų chondrocitų buvo rasta mėginiuose, kurie buvo išlaikyti DMEM terpėje be IGF-1, 4 C temperatūroje, 14 dienų. Šie rezultatai priešingi Pallante su bendraautoriais paskelbtiems rezultatams, kurie nustatė, kad gyvų chondrocitų kiekis 4 C temperatūroje yra mažesnis, nei mėginius laikant 37 C temperatūroje, tačiau skirtumas nebuvo statistiškai reikšmingas ypač po 28 dienų [75]. Tuo tarpu Francesca de Caro ir bendraautoriai konstatuoja, kad 70 C temperatūroje gyvybingų chondrocitų kiekis ženkliai sumažėja, palyginus su 4 C ir 37 C laikymo temperatūra [30]. Gyvybingų chondrocitų kiekio ženklus sumažėjimas nustatytas ir šio tyrimo metu, kuomet mėginiai buvo šaldyti iki 70 C temperatūros 14 ir 28 dienas. Gauti rezultatai patvirtino ankščiau literatūroje paskelbtus duomenis. Pažymėtina, kad praktiniame audinių bankų darbe yra naudojamas ir kriogeninis kremzlės šaldymas, panaudojant dimetilsulfoksido (DMSO) tirpalą, tačiau šio tyrimo metu, nesant techninių galimybių, laikymas DMSO nebuvo taikytas. Vadovaujantis audinių bankų protokolais, prieš atliekant alogeninę transplantaciją būtina patikrinti transplantą dėl užkrečiamų ligų bei bakterinių infekcijų sukėlėjų. Minimalus patikrinimui skirtas laikas yra 7 dienos, tačiau praktiškai gautų rezultatų patvirtinimas užtrunka dienų [26]. Šio mokslinio tyrimo metu pasirinktas 14 ir 28 dienų KKK in vitro laikymo intervalas yra susijęs su minimaliai reikalaujamu laiku tyrimų atsakymams gauti ir dažniausiai skelbiamuose moksliniuose tyrimuose naudojamu 28 dienų laiko intervalu. Ilgesnis nei 28 dienų KKK laikymo intervalas 4 C ir 37 C temperatūroje ženkliai sumažina gyvybingų chondrocitų kiekį kremzlėje [25]. In vitro eksperimento metu KKK mėginiai buvo laikyti DMEM terpėje, praturtintoje 10 proc. FBS, priešingai nei Garitty atlikto tyrimo metu, kur buvo naudojama terpė be serumo [37]. Moksliniuose straipsniuose minima, kad KKK laikant terpėje su FBS 4 C temperatūroje chondrocitų gyvybin- 57

58 gumas yra ženkliai didesnis [79, 103, 110]. Palante mėginius inkubavo 10 proc. FBS praturtintoje terpėje laikant juos 4 C temperatūros 5 proc. CO 2 aplinkoje, tuo tarpu šio tyrimo metu KKK buvo patalpinti 24 šulinėlių plokštelėje atmosferos ore, maitinamąją terpę kečiant tris kartus per savaitę [75]. Ankstesnės studijos taip pat rekomendavo terpę keisti reguliariai, nes dėl to padidėja chondrocitų gyvybingumas hipoterminėmis sąlygomis [110, 113]. Pažymėtina, kad gyvybingų chondrocitų kiekis išliko didžiausias, mėginius laikant DMEM terpėje be IGF-1 4 C temperatūroje 14 dienų, ter pę keičiant kas 2 dienas. Yra žinoma, kad IGF-1 skatina chondrocitų proliferaciją [95]. Atlikti vos keli tyrimai, kuriuose buvo nagrinėta IGF-1 faktoriaus įtaka chondrocitų gyvybingumui. Teng ir bendraautoriai [103] tyrimuose naudojo terpę be serumo ir pastebėjo, kad po 3 savaičių DMEM terpėje, praturtintoje IGF-1, chondrocitų kiekis buvo didesnis nei terpėje be IGF-1. Po 4 savaičių tyrėjai pastebėjo ženklų chondrocitų kiekio sumažėjimą DMEM terpėje su IGF-1. In vitro tyrimo etape nustatyta, kad IGF-1 faktorius DMEM terpėje 4 C temperatūroje nedavė laukiamo chondrocitų gyvybingumą didinančio efekto nei po 14, nei po 28 dienų. Pažymėtina, kad IGF-1 37 C temperatūroje po 14 dienų turėjo teigiamą efektą chondrocitų gyvybingumui. Tokį pat efektą gavo ir Chen as su bendraautoriais [23]. Minėtame darbe buvo naudoti chondrocitai išskirti iš žandikaulio sąnario kremzlės ir kultivuojami atskirai lėkštelėje. Sąnario kremzlės chondrocitai yra atsakingi už ECM gamybą ir homeostazės palaikymą kremzlėje [105]. Histologinę kremzlės būklę galima įvertinti naudojantis histologinio vertinimo skalėmis. Tyrimo metu buvo pasirinkta Mankin o histologinio vertinimo skalė, kuri yra tinkamiausia in vitro tyrimuose ir naudojama klinikinėje praktikoje [67]. Mankino balų įverčiai pagal grupes atvirkščiai atkartojo chondrocitų gyvybingumo rezultatus, mėginius laikant terpėse tiek 4 C, tiek 37 C temperatūroje 14 ir 28 dienas. Šio tyrimo metu nustatyta, kad mažiausią Mankin o balų skaičių, t. y. Geriausias histologines kremzlės savybes, turėjo mėginiai laikyti DMEM terpėje be IGF-1 4 C temperatūroje 14 dienų. Mėginius laikant 70 C temperatūroje 28 dienas Mankin o balų įvertis buvo mažesnis, lyginant su įverčiu mėginių, laikytų 4 C temperatūroje DMEM terpėje be IGF-1 28 dienas. Šiame tyrime nustatyta koreliacija tarp gyvybingų chondrocitų kiekio ir įverčio pagal Mankin o vertinimo skalę. IGF-1 buvimas terpėje 37 C temperatūroje 14 dienų teigiamai įtakojo Mankin o įvertį. Pažymėtina, kad tokio pobūdžio rezultatų mokslinėje literatūroje nėra paskelbta. ECM yra sudarytas iš kolageno tinklo ir GAG molekulių, kurias gamina chondrocitai. Auksinis GAG koncentracijos nustatymo standartas yra dažymas 1,9- dimetilmetileno mėliu (DMMB) [71]. Šiame moksliniame 58

59 tyrime buvo naudotas netiesioginis GAG kiekio įvertinimas, skaičiuojant raudonos spalvos komponentės kiekį nuo raudonos, žalios ir mėlynos spalvos kiekio sumos [68]. Šis metodas buvo pasirinktas dėl to, kad negalima buvo pritaikyti antrajame in vivo tyrimo etape DMMB tyrimo. Didžiausias raudonos spalvos intensyvumas, prilygstantis kontrolinei grupei, buvo nustatytas mėginius laikant DMEM terpėje be IGF-1 4 C temperatūroje 14 dienų. RSI rezultatai pagal grupes yra charakteringi gyvybingų chondrocitų kiekio pokyčiams, išskyrus 70 C temperatūroje laikytus 14 ir 28 dienas. Darytina prielaida, kad mėginiuose 70 C temperatūroje nevyksta metaboliniai procesai, dėl ko nedegraduoja proteoglikanų tinklas. Garrity su bendraautoriais nustatė [37], kad GAG koncentracija buvo palaikoma didesnė kaip ir gyvybingų chondrocitų kiekis buvo didžiausias, mėginius laikant 37 C temperatūros terpėje be serumo 56 dienas, lyginant su 4 C temperatūros terpėje be serumo laikytais mėginių rezultatais. In vitro tyrimo rezultatai prieštarauja minėto autoriaus skelbiamiems rezultatams. Pažymėtina, kad IGF-1 buvimas 37 C temperatūros terpėje 14 dienų RSI intensyvumą pagerino. Toks pats rezultatų pakitimas yra atvirkščiai charakteringas Mankin o įverčių rezultatams. Ding as su bendraautoriais nustatė, kad apoptotinių ląstelių kiekis didėja mėginius laikant terpėje ilgą laiką [32]. Apoptotinių genų ekspresija taip pat didėja priklausomai nuo laikymo sąlygų ir trukmės [88]. Thomas ir bendraautorių tyrime analizuota chondrocitų apoptozė glaudžiai susijusi su kremzlės matrikso pažeidimu, sąlygotu osteoartrito atsiradimu [106]. Traumuotuose sąnariuose buvo nustatytas sumažėjusių gyvybingų ląstelių ir padidėjusių apoptotinių ląstelių skaičius [53]. In vitro rezultatų analizė parodė, kad apoptotinių chondrocitų kiekis kremzlėje yra atvirkščiai proporcingas gyvybingų chondrocitų kiekiui, nors koreliacija tarp apoptozės ir gyvybingų chondrocitų skaičiaus statistiškai buvo silpnai reikšminga (p = 0,051), tikėtina, kad dėl mažo mėginių skaičiaus grupėse. Be to, nustatytas tiesioginis atvirkštinis ryšys tarp apoptozės ir Mankin o balų įverčio, kur didėjant apoptotinių ląstelių kiekiui, kremzlė įvertinama didesniu balų kiekiu, kas pagal Mankin o vertinimo skalę parodo prastesnę kremzlės būklę. Atvirkščiai proporcingas ryšys tarp GAG pasiskirstymo ir apoptotinių chondrocitų kiekio šiame tyrime taip pat buvo nustatytas, kai didėjant apoptotinių chondrocitų kiekiui RSI mažėjo. Tai parodo blogėjančią kremzlės būklę. Šie rezultatai patvirtino prieš tai buvusių kitų autorių tyrimų rezultatus, kur nustatytas tiesioginis ryšys tarp histopatologinių skalių ir chondrocitų apoptozės [58, 69, 105]. ECM būklės vertinimui galima panaudoti Arthro-BST aparatą, kuris registruoja elektrinį kremzlės potencialą [21, 22, 98]. Atkreiptinas dėmesys, kad nuoseklios priklausomybės palyginimo tarp temperatūros, terpės su- 59

60 dėties bei laikymo sąlygų ir trukmės įtakos elektromechaninėms kremzlės savybėms iki šiol nebuvo. Šio tyrimo metu nustatyta, kad geriausios elektromechaninės savybės buvo KKK laikytuose DMEM terpėje be IGF-1 4 C temperatūros 14 dienų ir buvo artimos šviežiai kremzlei. Kitose KKK grupėse QP vidurkis buvo didesnis bei atvirkščiai proporcingas gyvybingų chondrocitų kiekiui. In vitro etape mėginius šaldant iki 70 C temperatūros gyvybingų chondrocitų kiekis ženkliai sumažėjo, kaip ir pablogėjo elektromechaninės kremzlės savybės lyginant su mėginiais išlaikytais 4 C temperatūroje. Tai patvirtina anksčiau literatūroje skelbiamus rezultatus, kadangi šaldymas sumažina gyvų chondrocitų kiekį, ko pasėkoje blogėja elektromechaninės kremzlės savybės [75]. Šio tyrimo rezultatai prieštarauja kitų mokslininkų skelbtiems rezultatams, kad 80 C temperatūroje laikytų mėginių elektromechaninės savybės nepakinta [8, 57, 102, 113]. Nors biomechaninės kremzlės savybės tiek in vitro tiek in vivo etape ir netyrinėtos, tačiau naujausios studijos rodo koreliaciją tarp elektromechaninių ir biomechaninių kremzlės savybių [16, 88]. Pažymėtina, kad po 14 dienų terpėje su IGF-1 37 C temperatūroje KKK elektromechaninės savybės pagerėjo lyginant su KKK laikytais 37 C temperatūros terpe be IGF-1, tačiau rezultatas buvo prastesnis nei KKK išlaikius 14 dienų 4 C temperatūros DMEM terpėje be IGF-1. Šio tyrimo metu buvo naudota nedidelė mėginių imtis, tačiau net ir tokios imties analizė parodė, kad histologinio vertinimo skalė ir keturi kiekybiniai parametrai yra susiję su elektromechaninėmis kremzlės savybėmis. Kiekvienu tyrimo laiko momentu atliktoje analizėje rasta panaši koreliacija tarp rezultatų po 14 ir 28 dienų. Šio tyrimo metu buvo naudojami ožiuko KKK, o Sim ir bendraautoriai [98] naudojo žmogaus KKK. Sim ir bendraautoriai savo studijoje nerado koreliacijos tarp elektromechaninių savybių ir žmogaus kremzlės storio dėl galimo Arhtro-BST TM daviklio geometrijos, nepritaikytos plonai kremzlei. Nors ožiuko kremzlė gerokai plonesnė nei žmogaus [35], tačiau Arhtro-BST TM aparatu elektromechaninės kremzlės savybės buvo įvertintos sėkmingai. Sveikos ožiuko kremzlės QP vidurkis buvo 4. Mokslinio tyrimo metu įvertinta maitinamosios terpės, laikymo sąlygų ir laikymo trukmės įtaka elektromechaninėms kremzlės savybėms, nustatant ryšį tarp QP ir chondrocitų gyvybingumo, histologinių kremzlės savybių, GAG pasiskirstymo bei chondrocitų apoptozės. Tyrimo metu nustatytas atvirkščias ryšys tarp mažėjančio gyvybingų chondrocitų kiekio ir didėjančios QP skaitinės reikšmės, kas patvirtina blogėjančias elektromechaninės kremzlės savybes. 60

61 6.2. In vivo rezultatų aptarimas In vivo studijos dalyje buvo panaudotas gyvybiškiausias alogeninis KKK bei analizuojami OCA transplantacijos rezultatai praėjus 3 ir 6 mėnesiams po operacijos. Gauti rezultatai lyginti su OAT transplantacija, kuri yra naudojama klinikinėje praktikoje kaip vienas iš efektyviausių gydymo būdų. Nedestrukcinės kremzlės kokybės įvertinimo technikos buvo naudojamos ir praeityje, įskaitant magnetinio rezonanso tyrimą (MRT) ir T2 kremzlės koordinavimą. dgemric iki klinikiniuose tyrimuose buvo naudojamas plačiai dėl įrodytos koreliacijos tarp GAG ir kremzlės storio. Be to, T2 koordinavimas gali atgaminti kolageno kiekį netipiniu T2 atsipalaidavimo momentu. Nepaisant priimto patvirtinto kiekybinio kremzlės storio ir biocheminės sudėties vertinimo metodo nedestrukciniu būdu naudojant dgemric ir T2 koordinavimą, Aroen nerado morfologinių skirtumų tarp pakenktos ir sveikos kremzlės tiriant kremzlę magnetiniu rezonansu [6]. Naujausiame Goebel io ir bendraautorių tyrime alternatyva OAS vertinimui yra pasiūlytas didelio stiprumo magnetinio rezonanso tyrimas (9,4 T), kuris atitinka makroskopinio vertinimo vaizdą ir gali pakeisti invazyvų makroskopinį vertinimą skalėmis [40]. Šio mokslinio tyrimo metu nebuvo galimybės naudoti magnetinio rezonanso, dėl to mėginiai praėjus 3 ir 6 mėnesiams po transplantacijos buvo įvertinti OAS skale. Makroskopinis transplantato vaizdas po 3 mėnesių OCA grupėje Pablogėjo abiejų kojų kelio sąnariuose, o palyginus vaizdus praėjus 6 mėnesiams po transplantacijos OCA grupės vaizdas abiejuose kelio sąnariuose dar labiau pablogėjo. Autologinės PRP leidimas į kairį kelio sąnarį neturėjo teigiamos įtakos makroskopiniam vaizdui nei po 3 nei po 6 mėnesių OCA grupėje. OCA grupės rezultatai statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo OAT grupės rezultatų po 6 mėnesių De Caro nustatė, kad KKK kaulas integruoja į aplinkinį kaulą geriau nei kremzlė, o kremzlė gali ir nesuaugti [30]. Kitų autorių darbai rodo, kad kremzlės integracijai labai svarbus yra subchondrinio kaulo stabilumas po transplantacijos [16,86]. Šiuos rezultatus patvirtina ir Bhattacharje su bendraautoriais, tačiau tik autologinės transplanttacijos atveju [12]. KKK transplantato integraciją į sveiką audinį taip pat gali paskatinti po operacijos į kelio sąnarį leidžiama trombocitais praturtinta plazma [108]. Ikiklinikinėse studijose toks gydymo būdas duoda gerus rezultatus [9], tačiau klinikinėse studijose skelbiami rezultatai skiriasi [108]. Elektromechaninės transplantatų savybės taip pat buvo vertintos needstrukciniu būdu naudojant Arthro-BST. Analizuojant PubMed publickacijų duomenų bazę nustatyta, kad šio tyrimo metu pirmą kartą elektromechaninės kremzlės savybės buvo ištirtos po OAT ir OCA transplanttacijos. 61

62 Praėjus 3 mėnesiams po OCA transplantacijos QP vidurkis lyginant su kontroliniais duomenimis padidėjo, kas reiškia, kad kremzlės elektromechaninės savybės pablogėjo. PRP leidimas į OCA grupės kairės kojos kelio sąnarį elektromechaninių kremzlės savybių nepagerino. Po 6 mėnesių QP vidurkis ženkliai pablogėjo abiejų kojų kelio sąnariuose, o PRP injekcijos QP rezultatų nepagerino, statistiškai reikšmingo skirtumo nestebėta. OAT grupėje QP rezultatai po 3 mėnesių buvo blogesni, lyginant su 6 mėnesių rezultatais. PRP leidimas į kairės kojos kelio sąnarius OAT rezultatų nepagerino. Statistiškai reikšmingo skirtumo nestebėta. Šio tyrimo metu nustatytas ryšys tarp transplantatų makroskopinio vaizdo, juos vertinant OAS, ir elektromechaninių transplantatų savybių. Ryšys tarp ICRS ir išmatuoto QP buvo nustatytas ir Becher [10] bei Sim [99] darbuose, tačiau juose matavimai atlikti tik pažeistos kremzlės įvertinimui. Van den Borne nustatė, kad kremzlę vertinant ICRS ir OAS skalėmis vertinimo rezultatai yra vienodi [15]. Histologinis transplantato vaizdas OCA grupėje po 3 mėnesių pablogėjo abiejų kojų kelio sąnariuose, o palyginus vaizdus praėjus 6 mėnesiams po transplantacijos OCA grupės vaizdas abiejų kojų kelio sąnariuose buvo blogiausias, ką rodo mažiausias O Driscoll balų įvertis. Kremzlės ir kaulo autologinė transplantacija yra gerai žinoma ir naudojama gydant kremzlės pažeidimus. Alogeninės transplantacijos rezultatai yra nepakankami [68, 86]. Atokiesiems rezultatams įtakos turi alograftų laikymo sąlygos, kur užšaldymas lemia chondrocitų mirtį. Glen ir bendraautoriai [38] parodė, kad šaldytas kremzlės ir kaulo kompleksas gali palaikyti savo savybes tiek in vivo, tiek in vitro. Alogeninės kremzlės gyvybingumo išsaugojimas užtikrina KKK transplantato integraciją į aplinkinius audinius, o tai yra labai svarbu atokiesiems potransplantaciniams rezultatams. De Caro su bendraautoriais nustatė, kad transplantuoto KKK kaulas integruoja į aplinkinį kaulą, tačiau kremzlė gali ir nesuaugti [30]. Šio tyrimo rezultatai parodė, kad po 3 mėnesių tiek OCA tiek OAT grupėse transplantato kremzlės integracijos į aplinkinį audinį nebuvo. Praėjus 6 mėnesiams nuo transplanttacijos OCA grupės kremzlė nesiintegravo ir priešingai OAT integravosi. In vitro studijos metu elektromechaninių savybių ryšys su histologiniais pokyčiais jau buvo aprašytas ankstesniuose tyrimuose [10, 98]. In vivo tyrime buvo nustatytas ryšys tarp elektromechaninių savybių ir histologinių KKK pokyčių vertinamų pagal O Driscoll skalę. In vivo tyrime buvo naudotas netiesioginis GAG kiekio nustatymas tokiu pat būdu kaip ir in vitro dalyje [68]. Taip pat GAG pasiskirstymas atsižvelgiant į RSI atvirkščiai koreliuoja su elektromechaninėmis kremzlės savybėmis, t. y. didėjant RSI, mažėja QP. Praėjus 3 mėnesiams po transplanttacijos OCA grupėje GAG sumažėjo nežymiai, tačiau po 6 mėnesių stebėtas 62

63 GAG sumažėjimas abiejų kojų kelio sąnariuose. Rezultatas yra priešingas OAT grupės rezultatams, kur GAG kiekis net padidėjo. Zhou ir bendraautoriai ištyrė GAG koncentraciją šviežiai persodintuose transplantatuose po 3 mėnesių [115] ir nenustatė skirtumo tarp jų. Tokius pat duomenis patvirtino ir šiame moksliniame darbe nustatyti rezultatai OAT grupėje. GAG rezultatų aptarimui po alogeninės transplantacijos mokslinių straipsnių PubMed duomenų bazėje neaptikta. Klinikinių tyrimų apie autologinės trombocitais praturtintos plazmos panaudojimą po alogeninės ir autologinės transplantacijų nėra daug. Mažai yra tyrimų, kuriuose būtų nagrinėjami gerų išeičių rezultatai po PRP injekcijų ypatingai susijusių su OCA transplantacija. Altan ir bendraautoriai [5] nustatė, kad PRP naudojimas po OAT transplantacijų davė gerą efektą ir pagerino histologinio vertinimo rezultatus po 3 savaičių lyginant su OAT grupe, kurioje PRP buvo nenaudota. Praėjus 6 savaitėms po operacijų statistiškai reikšmingo skirtumo tarp grupių nebuvo. Guney ir bendraautoriai [50] ištyrė šokikaulio kremzlės pažeidimo gydymo metodus gydant juos mikrolūžiais, mikrolūžiais su autologine PRP ir mozaikine plastika. Autoriai nustatė geresnius pooperacinius rezultatus. Sanchez [93] su bendraautoriais nustatė, kad PRP leidimas į sąnarį gydant kremzlės pažeidimus teigiamai veikia kremzlės gijimo procesą. Vannini ir bendraautoriai [108] yra paskelbę rezultatus, kuriuose stebimas teigiamas PRP efektas KKK transplantato prigijimo procesui. Wei su bendraautoriais nustatė, kad rezultatai atliekant OCA transplantaciją su PRP ir lyginat juos su OAT po 72 mėnesių buvo identiški [109]. Šiame moksliniame tyrime nustatyta, kad autologinės PRP injekcijos, panaudotos po OCA ir OAT transplantacijų, ženkliai nepagerino kremzlės elektromechaninių savybių, OAS skalės balų, histologinio įverčio ir proteoglikanų raiškos nei vienoje transplantacijos grupėje. Ląstelių gyvybingumas yra vienas svarbiausių veiksnių, nulemiantis transplantacijos sėkmę ir padidinantis KKK išgyvenamumą [76]. Williams ir bendraautoriai [113] rodė, kad netgi esant daugiau 80 proc. gyvybingų ląstelių KKK neapsaugo nuo pooperacinės nesėkmės. Negana to, techniniai tokio gydymo aspektai yra susiję su KKK surinkimui, apdorojimu ir saugojimu, atraumatiniu implantavimu ir fiksavimu. Visa tai turi įtakos atokiesiems potransplantaciniams rezultatams. In vitro studijos metu elektromechaninių savybių ryšys su histologiniais pokyčiais jau buvo aprašytas ankstesniuose tyrimuose [98]. Abiejuose tyrimo etapuose buvo nustatytas ryšys tarp elektromechaninių savybių ir histologinių KKK pokyčių, GAG kiekio. Elektromechaninės savybės netiesiogiai atvaizduoja šių vertinimo kriterijų pokyčius. 63

64 Pisanu su bendraautoriais apžvalginiame darbe nustatė, kad maksimalus OCA išgyvenamumas buvo 15 metų bei siekė 76 procentus atvejų. Pažymėta, kad 22 procentai pakartotinų operacijų buvo vidutiniškai po 21,8 metų [82]. Pisanu su bendraautoriais darbe apžvelgė straipsnius, kuriuose naudojo 6 8 cm diametro OCA KKK blokus, o šiame tyrime KKK buvo naudoti 5 mm diametro KKK. Kremzlės plotas elektromechaninių savybių neįtakoja kaip ir kremzlės storis. Atkreiptinas dėmesys į tai, kad ožiuko imuninė sistema agresyviau reaguoja į alogeninį audinį nei žmogaus. Pagal internete siūlomas skaičiuokles vieni ožiuko gyvenimo metai prilyginami 18-ai žmogaus gyvenimo metų. Šio tyrimo rezultatai parodė, kad potransplantacinis periodas ožiukams buvo 3 ir 6 mėnesiai, kas atitiktų žmogaus 4,5 ir 9 metus. Dėl to šių mokslinio tyrimo rezultatų interpretacija klinikinėje praktikoje turėtų būti atsargi. 64

65 7. IŠVADOS 1. Geriausios elektromechaninės savybės nustatytos kremzlės kaulo kompleksuose, laikytuose DMEM terpėje be IGF-1, 4 C temperatūroje, 14 dienų. 2. Didžiausias gyvybingų chondrocitų kiekis, mažiausi morfologiniai pokyčiai, didžiausia proteoglikanų raiška ir mažiausias apoptotinių ląstelių skaičius yra kremzlės kaulo kompleksuose, laikytuose DMEM terpėje be IGF-1, 4 C temperatūroje, 14 dienų. 3. Po trijų mėnesių elektromechaninės kremzlės savybės ir makroskopinis įvertis alogeninės transplantacijos grupėje, naudojant nustatytomis geriausiomis sąlygomis (DMEM terpėje be IGF-1, 4 C temperatūroje, 14 dienų), laikytą transplantatą, nesiskyrė nuo autologinės transplantacijos grupės rezultatų, o histologinis kremzlės įvertis ir proteoglikanų raiška (raudonos spalvos intensyvumas) buvo blogesni. Praėjus šešiems mėnesiams po transplantacijos visi kremzlės kokybės vertinimo parametrai alogeninės transplantacijos grupėje buvo blogesni nei autologinės transplantacijos grupėje. Nustatyta atvirkščiai proporcinga priklausomybė tarp kremzlės elektromechaninių savybių ir histologinio, makroskopinio bei proteoglikanų raiškos įverčių. 4. Autologinė trombocitais praturtinta plazma nei vienoje transplantacijos grupėje rezultatų ženkliai nepagerino. 65

66 8. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS Praktinės KKK saugojimo rekomendacijos Įvertinus šio eksperimentinio tyrimo metu gautus rezultatus, rekomenduotina audinių bankams saugant alogeninius KKK atsižvelgti į tai, kad geriausiomis savybėmis pasižymėjo alogeniniai KKK, saugoti hipotermijos sąlygomis DMEM terpėje be IGF-1, 4 C temperatūroje, 14 dienų. Nedestrukcinio KKK ir transplantato būklės įvertinimo rekomendacijos Šiame moksliniame tyrime naudotas naujas Kanados mokslininkų grupės išrastas elektrinį kremzlės potencialą registruojantis aparatas Arthro-BST (Biomomentum Inc., Laval, QC, Kanada). Šio aparato panaudojimas audinių bankuose leistų nustatyti kremzlės elektromechanines savybes tokiu pat nedestrukciniu būdu kaip šiame eksperimentiniame tyrime. Tai leistų greitai įvertinti kremzlės būklę prieš transplantaciją bei transplantacijos metu. 66

67 BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS [1] Abazari A, Jomha NM, Elliott JAW, McGann LE. Cryopreservation of articular cartilage. Cryobiology 2013;66: [2] Abedian R, Willbold E, Becher C, Hurschler C. In vitro electromechanical characterization of human knee articular cartilage of different degeneration levels: a comparison with ICRS and Mankin scores. J. Biomech. 2013;46: [3] Aigner T, Cook JL, Gerwin N, Glasson SS, Laverty S, Little CB, McIlwraith W, Kraus VB. Histopathology atlas of animal model systems - overview of guiding principles. Osteoarthr. Cartil. OARS Osteoarthr. Res. Soc. 2010;18 Suppl 3:S2-6. [4] Allen RT, Robertson CM, Pennock AT, Bugbee WD, Harwood FL, Wong VW, Chen AC, Sah RL, Amiel D. Analysis of stored osteochondral allografts at the time of surgical implantation. Am. J. Sports Med. 2005;33: [5] Altan E, Aydin K, Erkocak O, Senaran H, Ugras S. The effect of platelet-rich plasma on osteochondral defects treated with mosaicplasty. Int. Orthop. 2014;38: [6] Årøen A, Brøgger H, Røtterud JH, Sivertsen EA, Engebretsen L, Risberg MA. Evaluation of focal cartilage lesions of the knee using MRI T2 mapping and delayed Gadolinium Enhanced MRI of Cartilage (dgemric). BMC Musculoskelet. Disord. 2016;17:73. [7] Bae JY, Han D-W, Wakitani S, Nawata M, Hyon SH. Biological and biomechanical evaluations of osteochondral allografts preserved in cold storage solution containing epigallocatechin gallate. Cell Transplant. 2010;19: [8] Ball ST, Amiel D, Williams SK, Tontz W, Chen AC, Sah RL, Bugbee WD. The effects of storage on fresh human osteochondral allografts. Clin. Orthop. 2004;418: [9] Bardos T, Farkas B, Mezes B, Vancsodi J, Kvell K, Czompoly T, Nemeth P, Bellyei A, Illes T. Osteochondral integration of multiply incised pure cartilage allograft: repair method of focal chondral defects in a porcine model. Am. J. Sports Med. 2009;37 Suppl 1:50S- 57S. [10] Becher C, Ricklefs M, Willbold E, Hurschler C, Abedian R. Electromechanical Assessment of Human Knee Articular Cartilage with Compression-Induced Streaming Potentials. Cartilage 2016;7: [11] Bedi A, Feeley BT, Williams RJ. Management of articular cartilage defects of the knee. J. Bone Joint Surg. Am. 2010;92:

68 [12] Bhattacharjee A, McCarthy HS, Tins B, Roberts S, Kuiper JH, Harrison PE, Richardson JB. Autologous Bone Plug Supplemented With Autologous Chondrocyte Implantation in Osteochondral Defects of the Knee. Am. J. Sports Med. 2016;44: [13] Bian L, Stoker AM, Marberry KM, Ateshian GA, Cook JL, Hung CT. Effects of dexamethasone on the functional properties of cartilage explants during long-term culture. Am. J. Sports Med. 2010;38: [14] Bonasia DE, Marmotti A, Massa ADF, Ferro A, Blonna D, Castoldi F, Rossi R. Intra- and inter-observer reliability of ten major histological scoring systems used for the evaluation of in vivo cartilage repair. Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. Off. J. ESSKA 2015; 23: [15] van den Borne MPJ, Raijmakers NJH, Vanlauwe J, Victor J, de Jong SN, Bellemans J, Saris DBF, International Cartilage Repair Society. International Cartilage Repair Society (ICRS) and Oswestry macroscopic cartilage evaluation scores validated for use in Autologous Chondrocyte Implantation (ACI) and microfracture. Osteoarthr. Cartil. OARS Osteoarthr. Res. Soc. 2007;15: [16] Brown D, Shirzad K, Lavigne SA, Crawford DC. Osseous Integration after Fresh Osteochondral Allograft Transplantation to the Distal Femur: A Prospective Evaluation Using Computed Tomography. Cartilage 2011;2: [17] Bugbee WD, Pallante-Kichura AL, Görtz S, Amiel D, Sah R. Osteochondral allograft transplantation in cartilage repair: Graft storage paradigm, translational models, and clinical applications. J. Orthop. Res. Off. Publ. Orthop. Res. Soc. 2016;34: [18] Capeci CM, Turchiano M, Strauss EJ, Youm T. Osteochondral allografts: applications in treating articular cartilage defects in the knee. Bull. Hosp. Jt. Dis ;71: [19] Carneiro M de O, Barbieri CH, Barbieri Neto J. Platelet-rich plasma gel promotes regeneration of articular cartilage in knees of sheeps. Acta Ortop. Bras. 2013;21: [20] Changoor A, Coutu JP, Garon M, Quenneville E, Hurtig MB, Buschmann MD. Streaming potential-based arthroscopic device is sensitive to cartilage changes immediately post-impact in an equine cartilage injury model. J. Biomech. Eng. 2011;133: [21] Changoor A, Coutu JP, Garon M, Quenneville E, Hurtig MB, Buschmann MD. Streaming potential-based arthroscopic device is sensitive to cartilage changes immediately post-impact in an equine cartilage injury model. J. Biomech. Eng. 2011;133:

69 [22] Changoor A, Fereydoonzad L, Yaroshinsky A, Buschmann MD. Effects of refrigeration and freezing on the electromechanical and biomechanical properties of articular cartilage. J. Biomech. Eng. 2010;132: [23] Chen Y, Ke J, Long X, Meng Q, Deng M, Fang W, Li J, Cai H, Chen S. Insulin-like growth factor-1 boosts the developing process of condylar hyperplasia by stimulating chondrocytes proliferation. Osteoarthritis Cartilage 2012;20: [24] Chui K, Jeys L, Snow M. Knee salvage procedures: The indications, techniques and outcomes of large osteochondral allografts. World J. Orthop. 2015;6: [25] Cook JL, Stannard JP, Stoker AM, Bozynski CC, Kuroki K, Cook CR, Pfeiffer FM. Importance of Donor Chondrocyte Viability for Osteochondral Allografts. Am. J. Sports Med. 2016;44: [26] Cook JL, Stoker AM, Stannard JP, Kuroki K, Cook CR, Pfeiffer FM, Bozynski C, Hung CT. A novel system improves preservation of osteochondral allografts. Clin. Orthop. 2014;472: [27] Crema MD, Hunter DJ, Burstein D, Roemer FW, Li L, Eckstein F, Krishnan N, Hellio Le-Graverand M-P, Guermazi A. Association of changes in delayed gadolinium-enhanced MRI of cartilage (dgemric) with changes in cartilage thickness in the medial tibiofemoral compartment of the knee: a 2 year follow-up study using 3.0 T MRI. Ann. Rheum. Dis. 2014;73: [28] Curl WW, Krome J, Gordon ES, Rushing J, Smith BP, Poehling GG. Cartilage injuries: a review of 31,516 knee arthroscopies. Arthrosc. J. Arthrosc. Relat. Surg. Off. Publ. Arthrosc. Assoc. N. Am. Int. Arthrosc. Assoc. 1997;13: [29] Czitrom AA, Keating S, Gross AE. The viability of articular cartilage in fresh osteochondral allografts after clinical transplantation. J. Bone Joint Surg. Am. 1990;72: [30] De Caro F, Bisicchia S, Amendola A, Ding L. Large Fresh Osteochondral Allografts of the Knee: A Systematic Clinical and Basic Science Review of the Literature. Arthrosc. J. Arthrosc. Relat. Surg. Off. Publ. Arthrosc. Assoc. N. Am. Int. Arthrosc. Assoc [31] Demange M, Gomoll AH. The use of osteochondral allografts in the management of cartilage defects. Curr. Rev. Musculoskelet. Med. 2012;5: [32] Ding L, Zampogna B, Vasta S, Jang KW, De Caro F, Martin JA, Amendola A. Why Do Osteochondral Allografts Survive? Comparative Analysis of Cartilage Biochemical Properties Unveils a 69

70 Molecular Basis for Durability. Am. J. Sports Med. 2015;43: [33] Endo J, Watanabe A, Sasho T, Yamaguchi S, Saito M, Akagi R, Muramatsu Y, Mukoyama S, Katsuragi J, Akatsu Y, Fukawa T, Okubo T, Osone F, Takahashi K. Utility of T2 mapping and dgemric for evaluation of cartilage repair after allograft chondrocyte implantation in a rabbit model. Osteoarthr. Cartil. OARS Osteoarthr. Res. Soc. 2015; 23: [34] Frank RM, Lee S, Levy D, Poland S, Smith M, Scalise N, Cvetanovich GL, Cole BJ. Osteochondral Allograft Transplantation of the Knee: Analysis of Failures at 5 Years. Am. J. Sports Med. 2017;45: [35] Frisbie DD, Cross MW, McIlwraith CW. A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee. Vet. Comp. Orthop. Traumatol. VCOT 2006;19: [36] Fritz J, Janssen P, Gaissmaier C, Schewe B, Weise K. Articular cartilage defects in the knee--basics, therapies and results. Injury 2008;39 Suppl 1:S [37] Garrity JT, Stoker AM, Sims HJ, Cook JL. Improved osteochondral allograft preservation using serum-free media at body temperature. Am. J. Sports Med. 2012;40: [38] Glenn RE, McCarty EC, Potter HG, Juliao SF, Gordon JD, Spindler KP. Comparison of fresh osteochondral autografts and allografts: a canine model. Am. J. Sports Med. 2006;34: [39] Glenn RE, McCarty EC, Potter HG, Juliao SF, Gordon JD, Spindler KP. Comparison of fresh osteochondral autografts and allografts: a canine model. Am. J. Sports Med. 2006;34: [40] Goebel L, Orth P, Müller A, Zurakowski D, Bücker A, Cucchiarini M, Pape D, Madry H. Experimental scoring systems for macroscopic articular cartilage repair correlate with the MOCART score assessed by a high-field MRI at 9.4 T--comparative evaluation of five macroscopic scoring systems in a large animal cartilage defect model. Osteoarthr. Cartil. OARS Osteoarthr. Res. Soc. 2012;20: [41] Gomoll AH, Farr J, Gillogly SD, Kercher J, Minas T. Surgical management of articular cartilage defects of the knee. J. Bone Joint Surg. Am. 2010;92: [42] Görmeli G, Görmeli CA, Ataoglu B, Çolak C, Aslantürk O, Ertem K. Multiple PRP injections are more effective than single injections and hyaluronic acid in knees with early osteoarthritis: a randomized, 70

71 double-blind, placebo-controlled trial. Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. Off. J. ESSKA [43] Görtz S, Bugbee WD. Fresh osteochondral allografts: graft processing and clinical applications. J. Knee Surg. 2006;19: [44] Gracitelli GC, Meric G, Briggs DT, Pulido PA, McCauley JC, Belloti JC, Bugbee WD. Fresh osteochondral allografts in the knee: comparison of primary transplantation versus transplantation after failure of previous subchondral marrow stimulation. Am. J. Sports Med. 2015;43: [45] Gracitelli GC, Meric G, Pulido PA, Görtz S, De Young AJ, Bugbee WD. Fresh Osteochondral Allograft Transplantation for Isolated Patellar Cartilage Injury. Am. J. Sports Med [46] Gross AE, Kim W, Las Heras F, Backstein D, Safir O, Pritzker KPH. Fresh osteochondral allografts for posttraumatic knee defects: longterm followup. Clin. Orthop. 2008;466: [47] Gudas R, Gudaitė A, Mickevičius T, Masiulis N, Simonaitytė R, Cekanauskas E, Skurvydas A. Comparison of osteochondral autologous transplantation, microfracture, or debridement techniques in articular cartilage lesions associated with anterior cruciate ligament injury: a prospective study with a 3-year follow-up. Arthrosc. J. Arthrosc. Relat. Surg. Off. Publ. Arthrosc. Assoc. N. Am. Int. Arthrosc. Assoc. 2013;29: [48] Gudas R, Gudaite A, Pocius A, Gudiene A, Cekanauskas E, Monastyreckiene E, Basevicius A. Ten-year follow-up of a prospective, randomized clinical study of mosaic osteochondral autologous transplantation versus microfracture for the treatment of osteochondral defects in the knee joint of athletes. Am. J. Sports Med. 2012; 40: [49] Gudas R, Kalesinskas RJ, Kimtys V, Stankevicius E, Toliusis V, Bernotavicius G, Smailys A. A prospective randomized clinical study of mosaic osteochondral autologous transplantation versus microfracture for the treatment of osteochondral defects in the knee joint in young athletes. Arthrosc. J. Arthrosc. Relat. Surg. Off. Publ. Arthrosc. Assoc. N. Am. Int. Arthrosc. Assoc. 2005;21: [50] Guney A, Yurdakul E, Karaman I, Bilal O, Kafadar IH, Oner M. Medium-term outcomes of mosaicplasty versus arthroscopic microfracture with or without platelet-rich plasma in the treatment of osteochondral lesions of the talus. Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. Off. J. ESSKA 2016;24: [51] Hadjab I, Sim S, Karhula SS, Kauppinen S, Garon M, Quenneville E, Lavigne P, Lehenkari PP, Saarakkala S, Buschmann MD. Electro- 71

72 mechanical properties of human osteoarthritic and asymptomatic articular cartilage are sensitive and early detectors of degeneration. Osteoarthritis Cartilage 2018;26: [52] Hangody L, Vásárhelyi G, Hangody LR, Sükösd Z, Tibay G, Bartha L, Bodó G. Autologous osteochondral grafting--technique and longterm results. Injury 2008;39 Suppl 1:S [53] Hembree WC, Ward BD, Furman BD, Zura RD, Nichols LA, Guilak F, Olson SA. Viability and apoptosis of human chondrocytes in osteochondral fragments following joint trauma. J. Bone Joint Surg. Br. 2007;89: [54] Hjelle K, Solheim E, Strand T, Muri R, Brittberg M. Articular cartilage defects in 1,000 knee arthroscopies. Arthrosc. J. Arthrosc. Relat. Surg. Off. Publ. Arthrosc. Assoc. N. Am. Int. Arthrosc. Assoc. 2002;18: [55] Hoemann C, Kandel R, Roberts S, Saris DBF, Creemers L, Mainil- Varlet P, Méthot S, Hollander AP, Buschmann MD. International Cartilage Repair Society (ICRS) Recommended Guidelines for Histological Endpoints for Cartilage Repair Studies in Animal Models and Clinical Trials. Cartilage 2011;2: [56] Karikis I, Åhlén M, Sernert N, Ejerhed L, Rostgård-Christensen L, Kartus J. The Long-Term Outcome After Early and Late Anterior Cruciate Ligament Reconstruction. Arthrosc. J. Arthrosc. Relat. Surg. Off. Publ. Arthrosc. Assoc. N. Am. Int. Arthrosc. Assoc [57] Kiefer GN, Sundby K, McAllister D, Shrive NG, Frank CB, Lam T, Schachar NS. The effect of cryopreservation on the biomechanical behavior of bovine articular cartilage. J. Orthop. Res. Off. Publ. Orthop. Res. Soc. 1989;7: [58] Kim DY, Taylor HW, Moore RM, Paulsen DB, Cho D-Y. Articular chondrocyte apoptosis in equine osteoarthritis. Vet. J. Lond. Engl ;166: [59] Kim HT, Teng MS, Dang AC. Chondrocyte apoptosis: implications for osteochondral allograft transplantation. Clin. Orthop. 2008;466: [60] Krych AJ, Harnly HW, Rodeo SA, Williams RJ. Activity levels are higher after osteochondral autograft transfer mosaicplasty than after microfracture for articular cartilage defects of the knee: a retrospective comparative study. J. Bone Joint Surg. Am. 2012;94: [61] LaPrade RF, Botker JC. Donor-site morbidity after osteochondral autograft transfer procedures. Arthrosc. J. Arthrosc. Relat. Surg. Off. Publ. Arthrosc. Assoc. N. Am. Int. Arthrosc. Assoc. 2004;20:e

73 [62] Lattermann C, Romine SE. Osteochondral allografts: state of the art. Clin. Sports Med. 2009;28: , ix. [63] Légaré A, Garon M, Guardo R, Savard P, Poole AR, Buschmann MD. Detection and analysis of cartilage degeneration by spatially resolved streaming potentials. J. Orthop. Res. Off. Publ. Orthop. Res. Soc. 2002;20: [64] Linn MS, Chase DC, Healey RM, Harwood FL, Bugbee WD, Amiel D. Etanercept enhances preservation of osteochondral allograft viability. Am. J. Sports Med. 2011;39: [65] Litwic A, Edwards MH, Dennison EM, Cooper C. Epidemiology and burden of osteoarthritis. Br. Med. Bull. 2013;105: [66] Malinin T, Temple HT, Buck BE. Transplantation of osteochondral allografts after cold storage. J. Bone Joint Surg. Am. 2006;88: [67] Mankin HJ, Dorfman H, Lippiello L, Zarins A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. J. Bone Joint Surg. Am. 1971;53: [68] Martin I, Obradovic B, Freed LE, Vunjak-Novakovic G. Method for quantitative analysis of glycosaminoglycan distribution in cultured natural and engineered cartilage. Ann. Biomed. Eng. 1999;27: [69] Matsuo M, Nishida K, Yoshida A, Murakami T, Inoue H. Expression of caspase-3 and -9 relevant to cartilage destruction and chondrocyte apoptosis in human osteoarthritic cartilage. Acta Med. Okayama 2001;55: [70] McCulloch PC, Kang RW, Sobhy MH, Hayden JK, Cole BJ. Prospective evaluation of prolonged fresh osteochondral allograft transplantation of the femoral condyle: minimum 2-year follow-up. Am. J. Sports Med. 2007;35: [71] Mort JS, Roughley PJ. Measurement of glycosaminoglycan release from cartilage explants. Methods Mol. Med. 2007;135: [72] Mundi R, Bedi A, Chow L, Crouch S, Simunovic N, Sibilsky Enselman E, Ayeni OR. Cartilage Restoration of the Knee: A Systematic Review and Meta-Analysis of Level 1 Studies. Am. J. Sports Med [73] O Driscoll SW, Keeley FW, Salter RB. Durability of regenerated articular cartilage produced by free autogenous periosteal grafts in major full-thickness defects in joint surfaces under the influence of continuous passive motion. A follow-up report at one year. J. Bone Joint Surg. Am. 1988;70:

74 [74] Ouzzine M, Venkatesan N, Fournel-Gigleux S. Proteoglycans and cartilage repair. Methods Mol. Biol. Clifton NJ 2012;836: [75] Pallante AL, Bae WC, Chen AC, Görtz S, Bugbee WD, Sah RL. Chondrocyte viability is higher after prolonged storage at 37 degrees C than at 4 degrees C for osteochondral grafts. Am. J. Sports Med. 2009;37 Suppl 1:24S-32S. [76] Pallante AL, Chen AC, Ball ST, Amiel D, Masuda K, Sah RL, Bugbee WD. The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity. Am. J. Sports Med. 2012;40: [77] Pallante-Kichura AL, Cory E, Bugbee WD, Sah RL. Bone cysts after osteochondral allograft repair of cartilage defects in goats suggest abnormal interaction between subchondral bone and overlying synovial joint tissues. Bone 2013;57: [78] Pearsall AW, Tucker JA, Hester RB, Heitman RJ. Chondrocyte viability in refrigerated osteochondral allografts used for transplantation within the knee. Am. J. Sports Med. 2004;32: [79] Pennock AT, Wagner F, Robertson CM, Harwood FL, Bugbee WD, Amiel D. Prolonged storage of osteochondral allografts: does the addition of fetal bovine serum improve chondrocyte viability? J. Knee Surg. 2006;19: [80] Pereira D, Ramos E, Branco J. Osteoarthritis. Acta Med. Port. 2015; 28: [81] Petrera M, De Croos JNA, Iu J, Hurtig M, Kandel RA, Theodoropoulos JS. Supplementation with platelet-rich plasma improves the in vitro formation of tissue-engineered cartilage with enhanced mechanical properties. Arthrosc. J. Arthrosc. Relat. Surg. Off. Publ. Arthrosc. Assoc. N. Am. Int. Arthrosc. Assoc. 2013;29: [82] Pisanu G, Cottino U, Rosso F, Blonna D, Marmotti AG, Bertolo C, Rossi R, Bonasia DE. Large Osteochondral Allografts of the Knee: Surgical Technique and Indications. Joints 2018;6: [83] Préville A-M, Lavigne P, Buschmann MD, Hardin J, Han Q, Djerroud L, Savard P. Electroarthrography: a novel method to assess articular cartilage and diagnose osteoarthritis by non-invasive measurement of load-induced electrical potentials at the surface of the knee. Osteoarthr. Cartil. OARS Osteoarthr. Res. Soc. 2013;21: [84] Ranawat AS, Vidal AF, Chen CT, Zelken JA, Turner AS, Williams RJ. Material properties of fresh cold-stored allografts for osteochondral defects at 1 year. Clin. Orthop. 2008;466:

75 [85] Raz G, Safir OA, Backstein DJ, Lee PTH, Gross AE. Distal Femoral Fresh Osteochondral Allografts: Follow-up at a Mean of Twenty-two Years. J. Bone Joint Surg. Am. 2014;96: [86] von Rechenberg B, Akens MK, Nadler D, Bittmann P, Zlinszky K, Kutter A, Poole AR, Auer JA. Changes in subchondral bone in cartilage resurfacing--an experimental study in sheep using different types of osteochondral grafts. Osteoarthr. Cartil. OARS Osteoarthr. Res. Soc. 2003;11: [87] Reginato AM, Olsen BR. The role of structural genes in the pathogenesis of osteoarthritic disorders. Arthritis Res. 2002;4: [88] Robertson CM, Allen RT, Pennock AT, Bugbee WD, Amiel D. Upregulation of apoptotic and matrix-related gene expression during fresh osteochondral allograft storage. Clin. Orthop. 2006;442: [89] Rosa SC, Gonçalves J, Judas F, Lopes C, Mendes AF. Assessment of strategies to increase chondrocyte viability in cryopreserved human osteochondral allografts: evaluation of the glycosylated hydroquinone, arbutin. Osteoarthr. Cartil. OARS Osteoarthr. Res. Soc. 2009; 17: [90] Sah RL, Trippel SB, Grodzinsky AJ. Differential effects of serum, insulin-like growth factor-i, and fibroblast growth factor-2 on the maintenance of cartilage physical properties during long-term culture. J. Orthop. Res. Off. Publ. Orthop. Res. Soc. 1996;14: [91] Sakata R, Iwakura T, Reddi AH. Articular Cartilage Regeneration: Challenges and Opportunities. Tissue Eng. Part B Rev [92] Sakata R, Iwakura T, Reddi AH. Regeneration of Articular Cartilage Surface: Morphogens, Cells, and Extracellular Matrix Scaffolds. Tissue Eng. Part B Rev. 2015;21: [93] Sánchez M, Delgado D, Sánchez P, Fiz N, Azofra J, Orive G, Anitua E, Padilla S. Platelet rich plasma and knee surgery. BioMed Res. Int. 2014;2014: [94] Schagemann JC, Rudert N, Taylor ME, Sim S, Quenneville E, Garon M, Klinger M, Buschmann MD, Mittelstaedt H. Bilayer Implants: Electromechanical Assessment of Regenerated Articular Cartilage in a Sheep Model. Cartilage 2016;7: [95] Schmidt MB, Chen EH, Lynch SE. A review of the effects of insulinlike growth factor and platelet derived growth factor on in vivo cartilage healing and repair. Osteoarthr. Cartil. OARS Osteoarthr. Res. Soc. 2006;14:

76 [96] Shaha JS, Cook JB, Rowles DJ, Bottoni CR, Shaha SH, Tokish JM. Return to an athletic lifestyle after osteochondral allograft transplantation of the knee. Am. J. Sports Med. 2013;41: [97] Shasha N, Aubin PP, Cheah HK, Davis AM, Agnidis Z, Gross AE. Long-term clinical experience with fresh osteochondral allografts for articular knee defects in high demand patients. Cell Tissue Bank. 2002;3: [98] Sim S, Chevrier A, Garon M, Quenneville E, Yaroshinsky A, Hoemann CD, Buschmann MD. Non-destructive electromechanical assessment (Arthro-BST) of human articular cartilage correlates with histological scores and biomechanical properties. Osteoarthr. Cartil. OARS Osteoarthr. Res. Soc. 2014;22: [99] Sim S, Hadjab I, Garon M, Quenneville E, Lavigne P, Buschmann MD. Development of an Electromechanical Grade to Assess Human Knee Articular Cartilage Quality. Ann. Biomed. Eng. 2017;45: [100] Smyth NA, Haleem AM, Murawski CD, Do HT, Deland JT, Kennedy JG. The effect of platelet-rich plasma on autologous osteochondral transplantation: an in vivo rabbit model. J. Bone Joint Surg. Am. 2013;95: [101] de Sousa EB, Aguiar DP, Barcelos JFM, Duarte MEL, Olej B. Approaches to preserve human osteochondral allografts. Cell Tissue Bank [102] Szarko M, Muldrew K, Bertram JE. Freeze-thaw treatment effects on the dynamic mechanical properties of articular cartilage. BMC Musculoskelet. Disord. 2010;11:231. [103] Teng MS, Yuen AS, Kim HT. Enhancing osteochondral allograft viability: effects of storage media composition. Clin. Orthop. 2008; 466: [104] Tetteh ES, Bajaj S, Ghodadra NS. Basic science and surgical treatment options for articular cartilage injuries of the knee. J. Orthop. Sports Phys. Ther. 2012;42: [105] Thomas CM, Fuller CJ, Whittles CE, Sharif M. Chondrocyte death by apoptosis is associated with cartilage matrix degradation. Osteoarthr. Cartil. OARS Osteoarthr. Res. Soc. 2007;15: [106] Thomas CM, Fuller CJ, Whittles CE, Sharif M. Chondrocyte death by apoptosis is associated with the initiation and severity of articular cartilage degradation. Int. J. Rheum. Dis. 2011;14: [107] Torrie AM, Kesler WW, Elkin J, Gallo RA. Osteochondral allograft. Curr. Rev. Musculoskelet. Med. 2015;8:

77 [108] Vannini F, Di Matteo B, Filardo G. Platelet-rich plasma to treat ankle cartilage pathology - from translational potential to clinical evidence: a systematic review. J. Exp. Orthop. 2015;2:2. [109] Wei L-C, Lei G-H, Sheng P, Gao S-G, Xu M, Jiang W, Song Y, Luo W. Efficacy of platelet-rich plasma combined with allograft bone in the management of displaced intra-articular calcaneal fractures: a prospective cohort study. J. Orthop. Res. Off. Publ. Orthop. Res. Soc. 2012;30: [110] Williams RJ, Dreese JC, Chen C-T. Chondrocyte survival and material properties of hypothermically stored cartilage: an evaluation of tissue used for osteochondral allograft transplantation. Am. J. Sports Med. 2004;32: [111] Williams RJ, Ranawat AS, Potter HG, Carter T, Warren RF. Fresh stored allografts for the treatment of osteochondral defects of the knee. J. Bone Joint Surg. Am. 2007;89: [112] Williams SK, Amiel D, Ball ST, Allen RT, Tontz WL, Emmerson BC, Badlani NM, Emery SC, Haghighi P, Bugbee WD. Analysis of cartilage tissue on a cellular level in fresh osteochondral allograft retrievals. Am. J. Sports Med. 2007;35: [113] Williams SK, Amiel D, Ball ST, Allen RT, Wong VW, Chen AC, Sah RL, Bugbee WD. Prolonged storage effects on the articular cartilage of fresh human osteochondral allografts. J. Bone Joint Surg. Am. 2003;85-A: [114] Xie X, Ulici V, Alexander PG, Jiang Y, Zhang C, Tuan RS. Platelet- Rich Plasma Inhibits Mechanically Induced Injury in Chondrocytes. Arthrosc. J. Arthrosc. Relat. Surg. Off. Publ. Arthrosc. Assoc. N. Am. Int. Arthrosc. Assoc. 2015;31: [115] Zhou Y, Liu Y-J, Hou S-X. [Experimental study on fresh meniscal allografts combined with osteochondral allografts transplantation]. Zhongguo Gu Shang China J. Orthop. Traumatol. 2012;25:

78 PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS DISERTACIJOS TEMA 1. Mickevicius T, Pockevicius A, Kucinskas A, Gudas R, Maciulaitis J, A, Usas A. Non-destructive Assessment of Articular Cartilage Electromechanical Properties after Osteochondral Autologous and Allogeneic Transplantation in a Goat Model.// Cartilage. ISSN: SSN , Jul 1; doi: / PubMed PMID: Mickevicius T, Pockevicius A, Kucinskas A, Gudas R, Maciulaitis J, Noreikaite, A, Usas A. Impact of storage conditions on electromechanical, histological and histochemical properties of osteochondral allografts. BMC Musculoskelet Disord Oct 23;16:314. doi: /s y. PubMed PMID: ; PubMedCentral PMCID: PMC Tyrimo duomenys skelbti konferencijose 1. Alogeninio sąnarinės kremzlės kaulo komplekso laikymo sąlygų poveikis chondrocitų gyvybingumui. Tomas Mickevičius, Rimtautas Gudas, Arvydas Ūsas, Audrius Kučinskas, Alius Pockevičius, Sergej Sosunkevič. 12tasis Lietuvos ortopedų traumatologų draugijos suvažiavimas "Skubi pagalba ortopedijoje traumatologijoje. Gydymo taktika" : tezių rinkinys : 2014 balandžio 2526 d., Kaunas / Lietuvos ortopedų traumatologų draugija. Kaunas, Lietuvos ortopedų traumatologų draugija, ISBN UDK: Experimental study of evaluation of articular cartilage chondrocyte vieability in vitro. Tomas Mickevičius, Arvydas Ūsas, Alius Pockevičius, Sergej Sosunkevič, Rimtautas Gudas. International conference Move for health, Kaunas, Lietuva, Sąnarinės kremzlės laikymo sąlygų poveikis chondrocitų gyvybingumui, apoptozei ir biomechaninėms savybėms. Tomas Mickevičius, Rimtautas Gudas, Alius Pockevičius, Sergėj Sosunkevič, Arvydas Ūsas. VIII nacionalinė doktorantų mokslinė konferencija Mokslas sveikatai : konferencijos pranešimų tezės [skirta] Pasaulinei sveikatos dienai paminėti, kuri minima balandžio 7-ąją. Lietuvos sveikatos mokslų universitetas. Kaunas: Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Leidybos namai, ISBN ( ). UDK: Electromechanical properties of articular cartilage: A reliable method for assessing allograft permormance in vivo. R. Gudas, T. Mickevicius, J. 78

79 Maciulaitis, A. Pockevicius, A. Kucinskas, A. Usas. Osteoarthritis and Cartilage, OARS. Abstracts from the 2016 OARSI World Congress on Osteoarthritis: Promoting Clinical and Basic Research in Osteoarthritis : 31 March April 2016, Amsterdam, The Netherlands. ISSN , vol. 24, suppl. 1, April, p. S172S172, no. 288 : pav. 5. Electromechanical properties of articular cartilage: a reliable method to assess allograft quality and performace in vivo. Mickevicius T, Pockevicius A, Kucinskas A, Gudas R, Maciulaitis J, Usas A. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy : Abstracts of the 17th ESSKA Congress : 47 May 2016, Barcelona, Spain. ISSN , iss. 1, suppl. 1, May, p. S386S386, no. P [Indėlis: 0.167] 6. Storage conditions affect electromechanical, histological and histochemical properties of osteochondral allografts. Arvydas Ūsas, Tomas Mickevičius, Alius Pockevičius, Rimtautas Gudas, Justinas Mačiulaitis. Acta Physiologica [elektroninis išteklius] : Special Issue: Abstracts from the Joint Meeting of the Federation of European Physiological Societies and the Baltic Physiological Societies : Kaunas, Lithuania, August 2015: abstracts. ISSN , vol. 215, suppl. S705, p. 4243, no. S10O3. 7. Assessment of allograft performance in vivo using electromechanical properties of articular cartilage. Arvydas Usas, Tomas Mickevicius, Alius Pockevičius, Audrius Kucinskas, Justinas Mačiulaitis, Rimtautas Gudas. 13th World congress of International Cartilage Repair society & 5th ICCRA congress on foot & ankle on Sept September, Italy, Sorento. P95, P

80 80

81 81

82 82

83 83

84 84

85 85

86 86

87 87

88 88

89 89

90 90

91 91

92 92

93 93

94 94

95 95

96 96

97 97

98 98

99 99

100 100

101 101

102 SUMMARY INTRODUCTION Osteochondral allograft transplantation has a good clinical outcome; however, there is still debate on the optimization of allograft storage protocol. Storage temperature and nutrient medium composition are the most critical factors for sustained biological activity of grafts before implantation. In this study, a time dependent in vitro experiment was performed in order to investigate the effect of various storage conditions on the electromechanical, histological and histochemical properties of articular cartilage. Also, the applicability of a minimally invasive diagnostic device to evaluate the quality of articular cartilage following autologous (OAT) and allogeneic (OCA) osteochondral graft transplantation in goat model was determined. During the knee arthroscopic surgery, an articular cartilage injury is a frequent incidental finding [28, 54]. Among numerous treatment options currently available in clinical practice, osteochondral transplantation is the only biological technique that can anatomically and functionally restore the hyaline cartilage [11, 24, 31, 41, 43, 62, 97]. Good or excellent clinical outcomes are demonstrated after OCA [48, 49, 52, 104], however, the usage is limited due to the lack of healthy cartilage or donor site morbidity [36, 61]. Avascularity, aneurality of the articular cartilage, makes osteochondral graft attractive for the OAT, thus it is a relatively immunoprivileged tissue populated with chondrocytes residing within the extracellular matrix [74, 92]. OCA efficacy has already been previously established [4, 8, 29, 43, 46, 70, 78]; however, its application is limited by the need for infectious disease screening, which requires extended allograft storage [85, 112]. The presservation of cell viability during long-term in vitro maintenance of osteochondral allograft tissue poses a very big challenge. The graft survivor is mostly influenced by the chondrocyte viability which is a major determinant of graft performance in vivo. The implantation of viable chondrocytes can assure prolonged maintenance of the extracellular matrix and integrity of the articular cartilage after transplantation. Despite numerous studies on allograft preparation, storage conditions and already approved protocols used by tissue banks, research on how to maintain viable cells is still ongoing [4, 66]. It has been found that deep freezing and cryopreservation leads to plummeted chondrocyte viability [1, 18, 75]. Hypothermic storage at 4 C, currently used by most tissue banks, has been shown capable of maintaining chondrocyte viability and matrix integrity [84, 101, 110]. New research has shown that storage at 37 C is increasing the results in comparison with the refrigeration as mentioned above [37, 75]. During allograft 102

103 storage the compositions of different storage media have been used to improve chondrocyte survival. Serum free medium [8, 26, 37], fetal bovine serum (FBS) supplemented medium [75, 79], dexamethasone [13], etanercept [64] and plateletrich plasma [81, 95, 114] have been used with varying success in the studies. Insulinlike growth factor 1 (IGF1) is also considered to be a viable treatment option for osteochondral injuries. IGF1 stimulates the chondrocyte proliferation and the synthesis of the extracellular matrix, and is chondroreparative [95, 103]. These studies suggest a potential role of different biological regulators in cartilage repair, however, their appropriate dosing and impact on chondrocyte metabolic activity is unknown. Research has shown that apoptosis is crucial for maintaining the appropriate number of cells and tissue organization. Chondrocyte death by apoptosis has been linked with cartilage matrix degradation and initiation of osteoarthritic lesions [105, 106]. A substantial relationship between the inhibition of chondrocyte apoptosis and the improved chondrocyte viability during cold storage of osteochondral grafts has been demonstrated [59]. Researchers found that the apoptotic process could be manipulated to enhance chondrocyte survival and improve the results of osteochondral allograft transplantation. Robertson et al. have studied apoptotic gene expression in stored osteochondral allografts and found many apoptotic genes with prolonged storage [88]. Recently, a new technology has been employed to assess functional properties of the cartilage. ArthroBST, an arthroscopic device, enables the measurement of cartilage streaming potentials, which have been emphasized as an important parameter of cell and matrix viability [22]. Streaming potentials reflect cartilage composition and function, and are sensitive to degradative changes. It has been shown that the electromechanical measurements obtained with the ArthroBST correlate with the histological scores and biomechanical parameters, and provide a rapid and reliable assessment of articular cartilage damage [98]. Progress in tissue transplantation, increased availability of fresh donor tissue, and greater demand, especially in athletic and aging population, may explain the growing need for the allograft transplantation procedures, which speed up recovery and help return to sports, or postpone arthroplasty for the elderly. However, the lack of clinical evidence on the best preservation conditions for OCA requires more investigation on retaining chondrocyte viability and cartilage matrix integrity during allograft screening. Different storage conditions have to be reevaluated and an optimal allograft tissue storage protocol must then be proposed. The purpose of this study was to assess the electromechanical, histological and histochemical properties of the articular cartilage after allograft storage for 14 and 28 days at 70 C, 4 C and 37 C, and to investigate the effect of IGF1 supplementation at 4 C and 37 C. 103

104 Secondly, it was aimed at examining the relationship between cartilage streaming potentials, measured by ArthroBST device, and chondrocyte viability, apoptosis and histological evaluation. Traumatic osteochondral defects are a burden to active people and a challenge to orthopaedic surgeons [44, 72]. It is critical to restore articular cartilage to prevent subsequent development of osteoarthritis. Osteochondral autograft transplantation (OAT) is a well described surgical procedure for cartilage surface restoration, unfortunately, donor site morbidity and scarcity of autologous tissue generally limits its application [47,60]. Treatment outcome of osteochondral allograft transplantation (OCA) and OAT is comparable, when osteochondral defect location, trauma etiology, and concomitant knee pathology are addressed [39, 107]. Despite the favourable clinical outcome after OCA transplantation there is a number of studies reporting inconsistent efficacy, especially in active patients [77,96]. Recently, fresh allografts alone or in combination with autografts have been suggested as a better approach to treat large osteochondral defects, because of the larger pool of viable cells compared to cold stored or frozen OCA. It has been shown that allograft freezing is associated with chondrocyte death; however, preclinical results are still acceptable and biomechanical properties of cold stored or frozen grafts could be maintained even in acellular tissue [7, 76, 89]. Glenn et al. [39] showed that refrigerated osteochondral allografts can maintain their functionality in vitro and in vivo. Assessing the viability and integration of the transplanted OCA into surrounding tissue is crucial to clinical outcome. It has been shown, that bone to bone integration is usually achieved, but cartilage integration is scant [30]. Several studies have demonstrated that subchondral bone is critical for mechanical stability of the graft and plays an essential role in cartilage layer integrity and viability after osteochondral transplantation [16, 86]. Unfortunately, there are limitations in measuring the rate of success after these surgical procedures. Methods routinely used to evaluate the treatment outcome after the osteochondral transplantation procedures include functional, arthroscopic and diagnostic imaging. Therefore, there is a great need for more precise and objective diagnostic methods to assess the efficacy of the osteochondral transplantation in a long-term follow-up. Recently, the evaluation of cartilage electromechanical properties with ArthroBST device has been proposed as a new method to assess osteochondral graft quality. It has been indicated that electromechanical quantitative parameter (QP) measurements correlate with histological scores and biomechanical parameters [98]. In addition, allograft storage conditions may influence the electromechanical properties of the cartilage. Nevertheless, the 104

105 electromechanical properties have not been thoroughly investigated after OAT and OCA transplantation and there is no clear evidence regarding the usefulness of this technique for the evaluation of transplantation efficacy. Platelet rich plasma (PRP) has also been a subject of interest because of its potential to enhance osteochondral tissue regeneration after different cartilage repair procedures [108]. Preclinical studies supported the use of PRP; however clinical reports indicated mixed outcomes after PRP application [108]. In fact, only a few studies focused on the injective PRP treatment as an adjunct to the surgical management of osteochondral lesions, and the results are controversial [5, 100]. The objective of this study was to evaluate the electromechanical, macroscopic and histological properties of the transplanted autologous and cold stored allogeneic osteochondral grafts in goat knees at 3 and 6 months postoperatively. The effect of autologous PRP application on osteochondral graft healing has also been investigated. The hypothesis of the research The osteochondral allograft transplantation is closely related with the preservation conditions of osteochondral plugs in a tissue bank. The biggest challenge of preserving liveliness of osteochondral allograft is related to temperature and duration of storage. The grafts are preserved from 14 to 56 days in 80 C, 4 C and 37 C temperatures, using different composition of storage media [4, 17, 85]. Good results after the transplantation of the allograft are closely related with its liveliness according to many researchers. The hypothesis of this research is that the medium and time of preservation, as well as the temperature, changes the properties of the osteochondral graft which are closely related to the outcomes after the graft transplantation operation. The aim of the research To investigate the most suitable osteochondral allograft preservation conditions which could ensure equal electromechanical and histological properties, chondrocyte viability, the expression of glycosaminoglycans and the number of apoptotic chondrocytes of the allograft compared to the autograft and the best outcomes after the allograft transplantation. 105

106 Research objectives: 1. To measure and compare the electromechanical properties of the osteochondral grafts which were preserved in different storage medium (DMEM and DMEM with IGF-1), different temperature conditions ( 70 C, 4 C and 37 C) and different time periods (14 and 28 days). 2. To determine the number of viable chondrocytes, the histological changes, the apoptosis of chondrocytes and the distribution of glycosaminoglycans in the osteochondral grafts which were kept in different medium (DMEM and DMEM with IGF-1), different temperature conditions ( 70 C, 4 C and 37 C) and different time periods (14 and 28 days) and to compare the results between the groups. 3. To assess and compare the results of the allogeneic and autologous osteochondral transplantation (electromechanical, macroscopic and histological properties and the expression of glycosaminoglycans of the graft) after 3 and 6 months after the transplantation when the most viable osteochondral allograft was used, and to determine the correlations between the measured parameters. 4. To evaluate and compare the impact of the platelet rich plasma injections on outcome of allogeneic and autologous osteochondral transplantation. In vitro part of the experiment MATERIALS AND METHODS All the experiments were approved by the Animal Health and Welfare Department, State Food and Veterinary Service. The osteochondral plugs, consisting of an articular cartilage and a subchondral bone (5 mm in diameter), were harvested from medial femoral condyles of six 5 to 6 month old male Saanen goats using standard OATS technique (Arthrex Inc, USA) under sterile conditions. The samples were rinsed with phosphatebuffered saline (PBS; Sigma) supplemented with 100 U/mL penicillin, 100 μg/ml streptomicin and 0.25 μg/ml fungizone (PSF) (Sigma), and randomly allocated to the following groups (n=6 in each group): freshly harvested control (Fresh), frozen at 70 C ( 70 C), refrigerated at 4 C in 100% atmospheric air (4 C), and incubated at 37 C (95 % humidity, 5% CO 2 ) (37 C). The samples from 4 C and 37 C groups were placed in 24 well plates containing low glucose Dulbecco s Modified Eagle's Medium (DMEM) (Sigma), supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) (Sigma), 1% of PSF), 2 mm Lglutamine (Sigma), 25 μg/ml Lascorbic acid (Sigma), and 0.1 mm MEM nonessential amino acids solution (Sigma) with or without 100 ng/ml of IGF1(Sigma). The samples were stored for 14 or 106

107 28 days. At the end of storage period, the osteochondral plugs were first analyzed for electromechanical properties, and then cut in half and subjected to further processing for the evaluation of chondrocyte viability, apoptosis, glycosaminoglycan expression and histological scoring. The freshly harvested control samples were analyzed on the same day after their collection (Fig. 1). A B C Fig. 1. The sketch of experimental setup. (A) The design of experimental setting showing different allograft storage conditions and evaluation time points. (B, C) The testing the electromechanical properties with ARTHROBST in vitro. 107

108 The electromechanical properties of the samples stored at different temperatures and nutritive medium conditions were evaluated with the ArthroBST (Biomomentum Inc., Laval, QC, Canada). The ArthroBST is a relatively new medical device for the non-destructive evaluation of articular cartilage electromechanical properties. The handheld hemispherical indenter containing an array of 37 gold microelectrodes (5 microelectrodes/mm 2 ) records streaming potentials in the articular cartilage generated during gentle compression. During the compression of cartilage positive mobile ions in the interstitial fluid are displaced relatively to the fixed negatively charged proteoglycan molecules, which are entrapped in the collagen network creating normal streaming potentials. In the degenerated cartilage the network of collagen and proteoglycans is degraded leading to very low streaming potentials. A quantitative parameter (QP, arbitrary units), calculated by the computer software, corresponds to the number of microelectrodes in contact with the cartilage when the sum of streaming potentials reaches 100 mv. High QP indicates high compliance and, therefore, weak electromechanical properties reflecting poor loadbearing capacity of the cartilage. On the contrary, low QP indicates strong electromechanical properties and high loadbearing capacity. Prior to testing, the osteochondral grafts were immersed in PBS solution for 20 min. and the QP of each graft was recorded 5 times in order to obtain median values. The detection of the chondrocyte viability Chondrocyte viability was analyzed using LIVE/DEAD assay (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) staining and confocal microscopy. The samples were washed in PBS and then labelled with 1 μm calcein AM (to detect live cells) and 2 μm ethidium homodimer1 (to detect dead cells). Thereafter, the samples were incubated for 40 min at 37 C, washed 3 times in PBS for 10 min and processed for imaging. 200 μm thick slices were imaged along the vertical profile with inverted confocal microscope LSM 700 Axio Observer Z.1 (Carl Zeiss, Germany). Image stacks, consisting of 8 slices each at 0.74 μm interval were obtained at 20 magnification. Live and dead cells were counted in 2 random areas ( μm) in each tissue section using Image J version 1.47q (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Chondrocyte viability was calculated as a percentage of live cells relative to the total cell number. 108

109 The histological evaluation The samples were fixed in 10% neutral buffered formalin, decalcified in Shandon TBD2 Decalcifier (TBD; Thermo Scientific, Kalamazoo, MI, USA) and embedded in paraffin. Cartilage sections (5 μm thick) were stained with safranin O fast green using an established protocol [55] to detect the glycosaminoglycan (GAG) positive matrix that is typical for the hyaline cartilage and normally stains red. Light microscopy images were taken at 4 magnification with Olympus BX63 microscope (Olympus, Japan) equipped with Olympus DP72 CCD camera using CellSens Dimension imaging software (Olympus, Japan). The images were analysed using Image J software. The previously described image processing protocol was adapted to quantify the amount of GAG distribution in each section [68]. Briefly, red colour intensity (RCI) was calculated in the entire cross-sectional slice area by obtaining red, green, and blue (RGB) image planes in a scale of 256 values (black =0). The fraction of red (RF) was defined as the ratio of the R component to the sum of the R, G, and B components: RF = R/(R + G + B) and expressed as a percentage. The sections were additionally evaluated by 3 blinded observers using histological histochemical grading system proposed by Mankin et al. [67]. Fresh articular cartilage received the score of 0, whereas higher score indicated a more deteriorated cartilage. The TUNEL assay for chondrocyte the apoptosis The apoptosis was evaluated with the TUNEL assay kit (ApopTag Peroxidase in situ Apoptosis Detection Kit; Millipore, USA) using the protocol provided by the manufacturer. Briefly, deparaffinised tissue sections were incubated in 20 μg/ml Proteinase K (Ambion) for 15 min. at room temperature. After endogenous peroxidase had been quenched by incubation in 3% hydrogen peroxide for 5 min, the ends of fragmented DNA in the tissue were labelled with terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) enzyme in the presence of digoxigeninconjugated nucleotides and unlabelled nucleotides for 60 min in humidified chamber at 37 C. The slides were then incubated for 30 min with the antidigoxigenin antibodies conjugated to a peroxidase reporter molecule. Immunohistochemical detection of these antibodies was carried out by the exposure to a chromogenic DAB substrate (Sigma) for 10 min. The slides were counterstained with Methyl Green (Sigma) solution for 5 min, rinsed in distilled water, dehydrated in alcohol, cleared in xylenes, and mounted with cytosol under a coverglass. High magnification images (200 ) were obtained with Olympus BX63 microscope. The number of apoptotic (brown black) and viable (green) cells 109

110 was counted in 3 random areas ( μm) selected in two tissue sections from each sample. The percentage of apoptotic cells was then calculated. The in vivo part of the experiment All the experiments were approved by the Animal Health and Welfare Department, State Food and Veterinary Service. The experiment was carried out in two stages (Fig. 2). Fig. 2. The design of experimental setting. Twenty six 5 to 6 month old male Saanen goats weighing kg were used in the study. Lateral femoral condyles (LFC) of four donor goats were used to harvest osteochondral plugs (6 mm diameter 8 mm height) in a sterile fashion using Osteochondral Autograft Transfer System (OATS, Arthrex Inc, Naples, Fla, USA). These grafts were assigned to OCA group and were cold stored in DMEM medium without IGF-1 of 4 C temperature for 14 days as previously described in in vitro part. Twenty two goats underwent bilateral knee mini arthrotomies by medial parapatellar approach, in the second stage of the study. In the experimental OAS (n=9) group the created inner defects of femoral condyle of both hind legs (right and left) were filled with allogeneic grafts which were stored in DMEM medium without IGF-1, at the temperature of 4 C for 14 days. This group was named allogeneic OCA group (n=13). Similarly, after the surgery 110

111 an autologous injection of PRP was injected into the left knee joint, which was repeatedly made 1 and 2 months after the allogeneic transplant surgery. (Fig. 2) The goats right hing leg knee joint of both OAT an OCA groups were left to heal as is usual in general clinical practice without the PRP injections. In order to stimulate the process of regeneration and integration of the allogeneic grafts in both OAT and OCA groups the PRP injections into the left hind knee joints were made immediately after the surgery and repeated after one and two months after the transplantation. The surgical incision was closed layer by layer and the knee was moved through a full range of motion to ensure normal patellar tracking. 10 ml of venous blood was drawn from the jugular vein into double syringe (Arthrex ABS10010) and centrifuged for 20 minutes at 2000 G (Rotofix 32A centrifuge, Hettich, Beverly, MS, USA) to obtain PRP. The amount of 2 ml of PRP was injected in to the left knee of each goat postoperatively and repeatedly at 1 and 2 months after surgery. Animals received antibiotics for five days after the operation, were provided with food and water ad libitum, and were allowed to move freely. The macroscopic evaluation and grading Two independent researchers performed macroscopic evaluation and grading according to a modified Oswestry Arthroscopy score (OAS) at 3 and 6 months after the implantation. According to this scoring system graft level, integration with surrounding cartilage, appearance of the surface and colour of the graft is assessed. Stiffness on probing was excluded from the original scoring system in the study, because cartilage electromechanical properties were evaluated using ArthroBST. The maximum score of 8 represents normal cartilage repair. The electromechanical evaluation Electromechanical properties of cartilage were evaluated with ArthroBST TM (Biomomentum Inc., Laval, QC, Canada) at 3 and 6 months after the transplantation, as described previously [21]. QP measurements in each transplantation site were recorded 5 times to obtain median values. The measurements made on the day of the surgery (OAT day 0 and OCA day 14) were used as a control reference. 111

112 The histological evaluation and grading After macroscopic and QP examination, distal femurs were dissected, fixed in 10% neutral buffered formalin, decalcified and embedded in paraffin. 5 µm thick sagittal sections were stained with Safranin O Fast Green, as described previously. Light microscopy images were taken at 4x magnification with Olympus BX61 microscope equipped with Olympus DP72 CCD camera using CellSens Dimension imaging software. The quality of the repaired cartilage was blindly evaluated by two investigators using histological grading score, as described by O Driscoll et al. [73]. Higher score indicates superior cartilage repair (maximum score is 24). The images were analysed using Image J software. The amount of GAG distribution as represented by red colour intensity of Safranin O staining was quantified as described previously. The statistical analysis The data were analyzed using the SPSS v.19. All results are presented as the mean ± standard deviation. Statistical differences between the sample groups were assessed using one-way repeated measures analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc multiple comparison test. p < 0.05 was considered statistically significant. Statistical differences between the experimental groups at different time points were assessed using nonparametric MannWhitneyWilcoxon test. Statistical difference between different experimental groups was assessed using independent sample t test. The relationship between the QP, chondrocyte viability, apoptosis, GAG distribution and histological grading scores was assessed by using nonparametric correlation analysis. A post hoc power analysis revealed value greater than 0.9 for all statistically significant comparisons. RESULTS The results of in vitro part of experiment The electromechanical properties of osteochondral grafts The QP of the freshly harvested samples on average was 4±0.23. Significantly increased QP after 14 days for the samples stored at 70 C or incubated in DMEM at 37 C (5.6 ± 0.49 and 5.57 ± 0.43, respectively; p<0.001) was observed. For the samples stored in DMEM at 4 C, a slightly increased QP (4.43±0.15) was detected; however, QP was significantly 112

113 lower compared to both aforementioned groups (p<0.001). When the culture medium was supplemented with IGF1, there was a slight increase of QP for the grafts stored at 4 C (4.53±0.27); however, a considerable decrease of QP was detected for the grafts stored at 37 C (4.77±0.32; p=0.043). After 28 days of storage, the electromechanical properties of the samples got worse. For the samples stored at 70 C, only a slight increase of QP (5.93 ± 0.33) was detected. For the grafts incubated in DMEM at 37 C, a significant increase of QP (6.63±0.34; p=0.001) when compared to 14day storage period was observed. Although there was a diminutive increase of QP in the refrigeration group (5.17±0.34), it was significantly lower compared to the incubation at 37 C group (p<0.001). The addition of IGF1 to the culture medium at this time had no significant effect on QP at 4 C and 37 C. These findings clearly indicate that allograft refrigeration has a greater capacity of preserving electromechanical properties of the osteochondral grafts compared to freezing or incubation at 37 C and could prevent rapid deterioration of the cartilage. The chondrocyte viability Chondrocyte viability for the freshly harvested articular cartilage was approximately 83.3±2.98%. A significant decrease of chondrocyte viability in all the storage groups after 14 and 28 days (p<0.001) compared to fresh cartilage samples was detected. The samples stored at 70 C contained the smallest amount of viable chondrocytes compared to any other storage group. After 14 days, the 70 C samples contained only 35.2±6.9% of viable chondrocytes, whereas samples stored in DMEM medium at 37 C contained 44.87±4.53% of viable chondrocytes. No significant difference was detected between these two groups. For the samples stored in DMEM at 4 C, viability was 58.22±4.07% and it was significantly higher compared with the 70 C and 37 C storage groups (p<0.001 and p<0.003, respecttively). When IGF1 was added to the medium, the chondrocyte viability decreased in the 4 C storage group (53.89±6.48%) and increased in the 37 C storage group (49.22±7.35%), but this change was not significant. After 28 days, the samples stored at 70 C contained significantly less viable chondrocytes (35.46±4.36%) compared to any other storage group (p 0.001). There was no significant difference in chondrocyte viability between the samples stored at 37 C and 4 C (52.02±5.97% and 57.80± 2.71%, respectively). When IGF1supplemented medium was used, chondrocyte viability slightly decreased in the 4 C and 37 C groups (53.81±4.90% and 49.93±4.96%, respectively). These results suggest that storage at 70 C is unable to maintain the chondrocyte viability. Storage at 4 C is capable of 113

114 maintaining significantly higher chondrocyte viability than storage at 37 C, but this effect lasts for only 2 weeks. The IGF1 supplementation increased the chondrocyte viability at 37 C during the 14 day storage, but did not reveal a profound effect at any time at 4 C and 37 C after28 days. The GAG quantification by safranin O staining The cartilage sections from all sample groups were stained with safranin O fast green and evaluated for the GAG distribution. Red colour intensity (RCI) of the freshly extracted normal articular cartilage was 72.95±1.06%. A significant reduction of RCI after storage at 70 C for 14 days (61.50± 9.60%; p=0.018) was observed. The RCI of the samples stored in DMEM at 4 C remained very close to a fresh cartilage level 71.48±5.61%. When IGF1 was added to the medium at 4 C RCI decreased to 62.58±9.57%, but this change was not significant. For the samples stored in DMEM at 37 C, a significant reduction of RCI compared to the fresh and refrigerated samples (54.4±1.76%; p 0.001) was observed. When IGF 1 was added to the medium at 37 C, the RCI increased to 63.98±9.35%, but this increase was not significant. After 28 days, the RCI for all the samples was significantly lower compared to the fresh samples and constituted 57.89±2.31%, 59.02± 5.46% and 48.58±3.43%, for 70 C, 4 C and 37 C storage groups, respectively (p<0.002). A significant reduction of RCI compared to a 14 day storage period was detected in the samples stored in DMEM at 4 C (p=0.078). When the IGF1 was added to the storage medium at 4 C and 37 C, RCI decreased to 54.12±7.27% and 45.91±4.1%, respectively. There was no statistically significant difference between the groups after 28 days. These results indicate that allograft storage at 4 C maintains the GAG distribution near the normal levels for 14 days and is superior compared to storage at 37 C. The IGF1 supplementation did not help to maintain the GAG distribution at 4 C, but facilitated these properties at 37 C. However, during the extended storage, the GAG distribution decreased and there was no significant difference between the groups. The histological grading It was also analyzed whether different storage conditions had effect on the histopathology. The histological-histochemical grading system proposed by Mankin et al. [67] was used. Even though this method is intended to be used for the grading of the human osteoarthritic cartilage, it has also been used in animal studies [3, 14]. After 14 days, the samples stored at 70 C and 4 C exhibited a slightly reduced safranin O staining with a diffuse 114

115 hypercellularity at the superficial cartilage layer and received the scores of 1.83±0.75 and 1.4±0.89, respectively. In contrast, the samples stored at 37 C received a score of 3.2±0.84 because of structural irregularities, hypocellularity and clonal cells, which were accompanied by a slight reduction in safranin O staining throughout the superficial and middle layer of the cartilage. In addition, the histological score in the 37 C group was significantly higher (p=0.019) compared to the 4 C group, indicating a more rapid cartilage deterioration. The histological scores after 28 days increased in each group. The samples stored at 37 C received significantly higher scores compared to the 70 C and 4 C groups (4.33±0.82 versus 2.0±0.82 and 2.5±0.55, respectively; p=0.005), as was evident by a more diffuse hypercellularity and markedly reduced safranin O staining throughout the samples. The IGF1 addition to the medium at 4 C and 37 C had no profound effect on the histological scores compared with the DMEM alone after 14 days of storage, although a slight improvement was detected at 37 C. Higher histological scores were observed after 28 days, but a significant increase compared to the 14day period was detected only in the 37 C group (p<0.001) after the IGF1 supplementation. An increased diffuse hypercellularity was evident in both IGF1 supplemented groups after a prolonged storage. In addition, inferior surface structure, moderate to severe reduction in safranin O staining and clonal cellularity with hypocellular areas were notable throughout the 37 C samples after 28 days of storage. The chondrocyte apoptosis The extent of chondrocyte apoptosis varied among different storage groups. The freshly harvested samples contained on average 54.55±8.87% of TUNEL positive chondrocytes. After 14 days, a significant increase in apoptotic chondrocyte number was observed at 70 C and 37 C (85.82± 8.72% and 93.91±1.1 %, respectively; p<0.001). Albeit it was a significant increase in the 4 C group (74.98±8.67%; p=0.021), this group contained considerably less (p=0.015) apoptotic chondrocytes compared to the 37 C storage group. The IGF1 supplementation had no profound effect on the apoptosis at 4 C and 37 C. After 28 days, the percentage of apoptotic chondrocytes in each group did not change significantly when compared to the 14 day storage. Yet again, significantly less apoptotic chondrocytes in the refrigeration group compared to the 37 C storage group (74.39±3.60% and 94.32±1.90%, respectively; p=0.008) was detected. The IGF1 addition at this time also did not altered the apoptosis at 4 C and 37 C. These findings indicate that the allograft storage at 4 C is associated with a lesser 115

116 extent of the apoptosis than storage at 37 C. The IGF1 had no impact on the chondrocyte apoptosis in any group at any time. The correlations between different quantitative parameters The statistical analysis revealed that the electromechanical QP correlated directly with the histological grading score (r=0.673, p<0.001), apoptotic chondrocytes (r=0.416, p=0.018), and inversely with the chondrocyte viability (r= 0.654, p<0.001). In addition, the extent of the apoptosis correlated directly with the histological grading score (r=0.493, p=0.006) and inversely with the GAG distribution manifested by the RCI measurement (r= 0.644, p<0.001). The results of in vivo part of the experiment The macroscopic evaluation The OAS scores revealed that the macroscopic appearance of the transplanted cartilage in the OAT group was similar to the preoperative normal cartilage up to 6 months (P=0.059). However, cartilage deterioration was noted in the OCA group after 3 and 6 months, as represented by the impaired transplant integration to the surrounding cartilage and fine fronds on the surface. The OAS score did not reveal differences amongst experimental groups at 3 months postoperatively (P=0.087); however, it was inferior in OCA group when compared to the OAT group at 6 months postoperatively (P<0.05). The PRP injections resulted in higher OAS score at 6 months postoperatively, when compared to 3 months in the OAT graft group (P<0.05). This was mainly influenced by the superior graft integration to the surrounding cartilage, a smooth and white appearance of the surface with isolated fronds on the graft. The PRP administration had no positive effect on OAS scores in OCA group at 6 months. The electromechanical evaluation Electromechanical properties were similar in both OAT and OCA transplantation groups after 3 months (P=0.089), but significantly inferior compared to the preoperative measurements, as assessed by the increased QP values (P<0.05). Cartilage quality was retained in OAT group after 6 months (P=0.498), whereas it worsened in the OCA group (P<0.05) and was 116

117 lower than that of the OAT group (P<0.05), thus indicating subsequent deterioration of collagen and proteoglycans network. The PRP injections improved the QP parameter in the OAT group at 6 months, when compared to 3 months (P<0.05), however such treatment did not influence cartilage electromechanical properties in the OCA group at any time. The histological evaluation The histological properties of the OAT and OCA groups were inferior at 3 months, compared to the preoperative cartilage structure, as assessed by O Driscoll score. However, osteochondral grafts were partially bonded to the adjacent cartilage and subchondral bone, and little clustering was detected at the border of the native cartilage, thus showing active integration with the adjacent cartilage. All grafts exhibited hyaline cartilage morphology that was manifested by normal Safranin O staining. The histological scores were retained in the OAT group up to 6 months (P=0.897); however, they decreased in the OCA group (P<0.05). This was represented by the increased hypocellularity, clustering and reduced extracellular matrix deposition in the transplanted cartilage. O Driscoll score was lower in the OCA group at 3 months (P<0.05) and was even lower at 6 months after the transplantation (P<0.05), when compared to the OAT group of a respective endpoint, thus indicating the deterioration of the cartilage histological structure in the OCA group at least up to 6 months. The PRP injections had no positive effect on the histological structure in any of the groups at any time postoperatively. The glycosaminoglycan distribution A decreased intensity of red colour was noted in both OAT and OCA transplantation groups after 3 months compared to the preoperative measurement. The intensity of red colour significantly decreased in the OCA group, whereas it increased in the OAT group after 6 months. In addition, the PRP injection slightly increased the GAG staining intensity in the OAT group at 3 months and in the OCA group at 6 months. The correlations The statistical analysis revealed that the electromechanical QP correlated inversely with the histological grading score (r=0.596, p<0.001), the OAS score (r=0.641, p<0.001), and the GAG distribution (r=0.506, p=0.001). In 117

118 addition, histological grading score correlated directly with the OAS score (r=0.620, p<0.001), the GAG distribution correlated with the O Driscoll score (r=0.533, p<0.001) and the OAS score (r=0.623, p<0.001). THE DISCUSSION The results demonstrate that the cartilage samples stored at 4 C possessed higher chondrocyte viability and GAG distribution, lower apoptosis and nearly normal electromechanical properties compared with the samples stored at 37 C. These improvements were apparent throughout 28 days. However, there was no significant difference in chondrocyte viability and GAG expression between two groups after 28 days. The results did not support previous studies which indicate that allograft storage at 37 C is superior to storage at 4 C. Garrity et al. found that osteochondral allograft viability, matrix content, composition and biomechanical properties were maintained at fresh levels through 56 days of storage in the standard medium at 37 C, but allografts stored at 4 C were unable to maintain viability or matrix integrity through 28 days of storage [35]. In distinction to the latter study, which used a serum-free medium, 10% FBS-supplemented medium was used. Numerous studies have demonstrated that addition of FBS to the nutrient media can signifycantly increase chondrocyte survival during storage at 4 C [32, 37, 43]. Pallante et al. reported that chondrocyte viability was higher after storage at 37 C, instead of 4 C, while cartilage thickness, GAG and collagen content were maintained at both temperatures [29]. In that study 4 C samples were stored in 10% FBS-supplemented medium preequilibrated to 5% CO2 and tightly sealed. By contrast, in this study the specimens were stored in 24- well plates exposed to 100% atmospheric air with medium change three times per week. Prior studies have also suggested that replenishment of nutrients by regular changes of the medium may enhance chondrocyte survival in hypothermically stored cartilage specimens [32, 55]. It was detected that storage at 70 C was associated with significant decline in chondrocyte viability and worse electromechanical properties compared to storage at 4 C. These results support previous findings that deep freezing leads to dramatic loss of viable chondrocytes [29]. In fact, the results conflict previous findings that storage at 80 C does not change the mechanical properties of articular cartilage [19, 55 57]. Even though biomechanical properties of the grafts was not assessed, recent studies demonstrated significant correlation between electromechanical and biomechanical parameters [49, 58]. There is a limited number of studies that have investigated the IGF-1 effect on chondrocyte viability during allograft storage. Teng et al. [43] used a serum- 118

119 free medium at 4 C and reported that viability after 3 weeks was significantly higher in DMEM+ IGF-1 group compared with DMEM alone group. However, after 4 weeks researchers observed near a 10-fold decrease in the DMEM+ IGF-1 group compared with a 2-fold decrease in the DMEM alone group. Several reports have indicated that IGF-1 can decrease chondrocyte apoptosis induced by traumatic compression or collagenases treatment [59, 60]. In this study the addition of IGF-1 to DMEM at 4 C did not produce a favourable effect on chondrocyte viability, apoptosis and GAG distribution, but the electromechanical properties in both groups were quite similar and remained near normal levels after 14 and 28 days. Interestingly, it was found that IGF-1 supplementation at 37 C had a positive effect on chondrocyte viability, GAG distribution and significantly improved the electromechanical QP. However, these improvements lasted only for 14 days and eventually, after 28 days, all the parameters became worse compared with the samples stored in DMEM without IGF-1. Non-destructive evaluation of electromechanical properties by Arthro-BST is a relatively new technique in cartilage research and it has already been shown very useful for quantitative assessment of functional properties in cartilage repair studies [48, 49, 58]. It has been reported that electromechanical measurements reflect cartilage material properties and are even more sensitive to the changes than biomechanical testing [58]. Although the correlation between electromechanical QP and GAG distribution (p = 0.059) was not detect, the findings are consistent with other studies demonstrating that the electromechanical QP correlated directly with the Mankin score [49, 61]. Cartilage cellular impairment and subsequent reduction of safranin-o staining was reflected by increased QP values. In addition, it was observed that the electromechanical properties correlated with the chondrocyte viability and apoptosis as reflected by relationship between higher QP, reduced viability and increased apoptosis. This is the first report when electromechanical properties of the articular cartilage were linked with these biological parameters. It has been reported that chondrocyte death by apoptosis is closely associated with cartilage matrix degradation which is crucial for osteoarthritis development [44]. Decreased cell viability and increased apoptosis was also detected after a traumatic joint injury [62]. Although correlation between viability and apoptosis (p=0.051) was not observed, but it was found that apoptosis correlated directly with Mankin score and inversely with proteoglycan distribution as assessed by safranin-o staining. These findings are consistent with previous reports indicating significant linear relationship between the histopathological grade of cartilage and chondrocyte apoptosis [44, 63, 64]. One limitation of this study could be relatively small number of samples per experimental group. However, only 119

120 one subjective parameter of histological grading and four quantitative evaluation parameters used in this study confirm reliability of the obtained data. In fact, the correlation analyses performed at each designated time point revealed similar relationship between aforementioned parameters after 14 and 28 days. To further investigate correlations between different storage groups more samples would be required. Another limitation related to this study was previously described by Sim et al. [49]. Although this study found no correlation between electromechanical QP and human cartilage thickness, authors indicated that it could be difficult to distinguish high electromechanical properties of the cartilage for low QP (<4) due to the geometry of Arthro-BST indenter and its limitations for thin cartilage. Regardless the fact that the goat knee articular cartilage is substantially thinner compared to human [65], like in their study, this limitation caused no problem for us since the lowest average QP was 4. The in vivo study electromechanical properties of articular cartilage after OAT and OCA transplantation were evaluated in goat knee osteochondral defect model at 6 months follow-up. The Arthro-BST enables accurate assessment of an articular cartilage properties and thus could be used intraoperatively to evaluate surface of the joint and the quality of the repair tissue. This is the first time that electromechanical properties have been adapted for the assessment of osteochondral transplantation efficacy. Evaluation of the electromechanical properties is a promising, new technique in cartilage research, which has already been shown to adequately reflect cartilage material properties. [98] Schagemann et al evaluated cartilage regeneration after bilayer scaffold implantation. [94] Using Arthro-BST they were able to detect early signs of degeneration of the cartilage bordering the repair site, that was supported by histological findings. It has been reported that electromechanical measurement of cartilage composition and structure is even more sensitive to changes than biomechanical testing. In addition, electromechanical QP has been shown to correlate directly with the Mankin histological score, apoptosis and inversely with chondrocyte viability. [98] Similarly, it was also observed a correlation between electromechanical QP, histological O Driscoll score and GAG expression, which demonstrated that intrinsic properties of cartilage repair can be reflected by electromechanical changes. Thus, the demonstrated QP correlation with cartilage histological, biomechanical parameters and cell viability, in conjunction with macroscopic analysis, can give basis for the decision on subsequent treatment approach. Despite the valuable and quantifiable electromechanical results, recent studies have acknowledged limitations regarding the scatter of obtained data. A study by Sim et al have shown, that electromechanical properties are 120

121 not patient-specific, even though it did not include important characteristics like participation in sport activities. Moreover, QP values are diverse and depend on the location of measurement throughout the cartilage surface, with significant differences even amongst knee cartilage compartments.[99] Cartilage thinning can generate very low streaming potentials, resembling that of a healthy cartilage, but nevertheless is mainly due to the closely underlying bone. In addition, Becher et al noted a significant learning curve and a need for training to employ electromechanical measurement routinely. [10] This proves, that lack of specificity of the resultant cartilage quality value as expressed by a false-positive and false-negative data and additional cartilage evaluation, such as electromechanical grading, macroscopic scoring and arthroscopic hook probing must be considered, to improve cartilage assessment, specify the lesion more accurately and employ electromechanical measurement as a routine diagnostic procedure. Non-invasive techniques for cartilage quality evaluation have been employed in the past, including delayed gadolinium-enhanced MRI (dgemric) and T2 mapping of cartilage. dgemric has been largely used in preclinical and clinical studies, because of the proven correlation to cartilage glycolsaminoglycan content and cartilage thickness[27]. In addition, T2 mapping is reported to reproducibly measure collagen content in the cartilage by the aberrant T2 relaxation times. Histological evaluation has shown a high correlation to T2 and ΔR1 values after allograft chondrocyte implantation in a rabbit model [33]. However, despite the currently applied quantitative valuation of cartilage thickness, biochemical and histological composition methods by non-invasive dgemric and T2 mapping techniques, a study by Aroen et al. did not find a morphological difference between affected and healthy cartilage regions of interest[6]. In addition, biomechanical parameters of cartilage, such as fibril, matrix modulus and permeability have been shown to correlate to the QP potential, as well. Electromechanical assessment might be a valuable addition to currently employed diagnostic methods, due to its effectiveness in detecting minor cartilage defects, especially in the absence of macroscopical changes, otherwise not seen during standard diagnostic procedures, such as MRI. Because of the scarce availability of cartilage donor tissue, allografts have been widely used for the treatment of large osteochondral defects. Cell viability has long been considered as a significant predictor towards clinical success and increased osteochondral graft survival in previous studies [76]. It requires an established protocol that should facilitate rapid processing of allografts for immediate implantation or prolonged storage. Protocols are varying, but this has been shown to be most effectively done at 4 C with subsequent graft deterioration past 14 days [76]. However, Williams et al 121

122 have argued that chondrocyte viability exceeding even 80% was not able to protect from allograft failure [114]. Therefore, other technical points related to allograft storage and implantation, such as timely harvesting, brief period of ex vivo handling, atraumatic implantation and fixation are vital for a successful treatment outcome. There is a lack of clinical data regarding the usefulness of autologous PRP on the outcome of OAT and OCA transplantation. Recently Altan et al. [5] demonstrated that use of PRP concomitantly with OAT resulted in a better healing response and improved histological scores at 3 weeks postoperatively compared with the OAT-alone procedure. However, no significant difference was observed between the groups after 6 weeks. Guney et al. [50] demonstrated similar improvements in clinical outcome after 42 months in patients treated with microfracture, microfracture plus PRP and mosaicplasty. Sanchez et al. [94] debated a possible need for different formulations of PRP that could be tailored for each specific clinical situation. The PRP injections significantly improved QP parameter, OAS score and GAG expression after 6 months compared to 3 months in OAT group, whereas it had no positive effect on any parameter in OCA group. Different techniques used for PRP preparation, such as single or double centrifugation, length of centrifugation and different methods of application, impede quality comparison amongst studies that reported superior clinical outcome [19,42]. Custom formulation and preparation methods may be required to achieve clinical efficacy using allografts. CONCLUSIONS 1. The results indicate that the electromechanical properties of the allograft are better preserved at 4 C storage temperature, in DMEM without IGF-1 for 14 days. 2. The best chondrocyte survival, the lowest changes in the histology of the cartilage and the lowest number of the apoptotic chondrocytes with the biggest expression of the glycosaminoglycans was detected in the allograft preserved in the DMEM without the IGF-1 at 4 C storage temperature for 14 days. 3. There was no difference in the electromechanical properties of the osteochondral allograft after 3 months post operatively compared to the autograft transplantation group when the allografts were preserved in the DMEM without the IGF-1 medium at 4 C storage temperature for 14 days. The histological grades and the expression of glycosaminoglycans in the allograft transplantation group after 3 months was diminished. After six months all quality parameters in the allograft transplantation 122

123 group were lower compared to the autograft transplantation group. A reverse correlation was detected between the electromechanical properties and the histological grading scores, and the macroscopic scores and the glycosaminoglycan expression of the transplants. 4. The platelet rich plasma had no significant positive effect in all the transplant groups at any time. 123

124 CURRICULUM VITAE Name, Surename: Tomas Mickevicius Address: E-mai: Department of Orthopaedics and traumatology, Medical Academy, Lithuanian University of Health Sciences, Eivenių 2, LT-50161, Kaunas, Lithuania Education: Doctoral studies at the Institute of Physiology and Pharmacology of Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences Residency in Orthopaedics and Traumatology at the department of Orthopaedics and Traumatology of Lithuanian University of Health Sciences Studies Biolaw at the University of Mykolas Romeris Primary Internship at Alytus S. Kudirkos hospital Studies at the Faculty of Medicine, Medical Academy, Lithuanian University of Health Sciences (former Kaunas University of Medicine) Work experience 2018 till now a researcher jr. in the European Social Fund under the Global Grant Target scientific research in the field of intelligent specialization No LMTK718 Innovative advanced therapy construct for cartilage regeneration (ICAR) at the University of Lithuanian Health Sciences Junior Researcher in the European Social Fund under the Global Grant Support to Research Activities of Scientists and Other Researcher (Global Grant) No VP13.1SMM07K03078 The effect of osteochondral all transplantation on articular cartilage regeneration in experimental model of cartilage damage (CHONDRO) at the University of Lithuanian Health Sciences. 124

125 Junior Researcher at the Institute of biomedicine research of University of Lithuanian Health Sciences (former Kaunas University of Medicine) 2012 till now an orthopaedic and traumatologist at the Hospital of Lithuanian University of Health Sciences Kaunas Clinics 2012 till now the Head of Musculoskeletal Sector of the Tissue Bank at Hospital of the University of Lithuanian Health Sciences Kaunas Clinics Qualifications: 2016 trainee in Tutor of articular ultrasound diagnostics at Lithuanian University of Health Sciences 2016 trainee in ESSKA cadaver-lab Pre-Course- Knee, ESSKA, Barcelona, Spain 2014 trainee in Tissue banking and advanced therapies at the University of Barcelona, Spain 2013 trainee International on-line course in tissue banking, cell therapy and regenerative medicine ar the University of Barcelona, Spain 2013 trainee in Transplantation of organs and tissues at Lithuanian University of Health Sciences Memberships: Member of AO foundation 125

126 PADĖKA Nuoširdžiai dėkoju šio mokslinio darbo vadovui doc. Arvydui Ūsui už vadovavimą bei patarimus, o taip pat nuolatinį skatinimą siekti geriausių rezultatų. Dėkoju Lietuvos mokslo tarybai už galimybę studijuoti Lietuvos mokslo tarybos finansuojamoje doktorantūroje. Ypatingai dėkoju Veterinarijos akademijos Veterinarinės patobiologijos katedros prof. Aliui Pockevičiui bei Biologinių tyrimų centro veterinarijos gydytojui Audriui Kučinskui bei jų bendradarbiams, kurie padėjo įgyvendinti šio mokslinio tyrimo idėją. Dėkoju visam Fiziologijos ir farmakologijos instituto kolektyvui už palaikymą ir patarimus rengiant šį mokslinį darbą. Nuoširdžiai dėkoju Europos sąjungos struktūriniams fondams, kurių finansavimas leido įgyvendinti šio mokslinio tyrimo idėją. Projekto Alogeninio kremzlės ir kaulo komplekso transplantacijos poveikis sąnario kremzlės regeneracijai eksperimentiniame kremzlės pažeidimo modelyje (CHONDRO) (Nr. VP13.1ŠMM07K03078), pradžia 2013 m. gegužės 1 d., planuojama pabaiga 2015 m. gegužės 29 d. 100 proc. tinkamų finansuoti išlaidų finansuojama iš Europos socialinio fondo pagal visuotinės dotacijos III kvietimo priemonę. 126