PELKINIŲ NOTRŲ (Stachys palustris L.) AUGALINIŲ ŽALIAVŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS

Transkriptas

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS DAIVA DABRICKYTĖ PELKINIŲ NOTRŲ (Stachys palustris L.) AUGALINIŲ ŽALIAVŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS Magistro baigiamasis darbas Vientisųjų studijų programa Farmacija, valstybinis kodas 6011GX003 Studijų kryptis Farmacija Darbo vadovas Doc. dr. Raimondas Benetis KAUNAS, 2021

2 2 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA TVIRTINU: Farmacijos fakulteto dekanas Ramunė Morkūnienė, parašas Data PELKINIŲ NOTRŲ (Stachys palustris L.) AUGALINIŲ ŽALIAVŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas Doc. dr. Raimondas Benetis Data Darbą atliko Magistrantė Daiva Dabrickytė Data Recenzentas Vardas, pavardė, parašas Data KAUNAS, 2021

3 3 TURINYS SANTRAUKA... 5 SUMMARY... 6 SANTRUMPOS... 7 ĮVADAS... 8 DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI LITERATŪROS APŽVALGA Oksidacinis stresas Antioksidantai Fenoliniai junginiai Pelkinių notrų (Stachys palustris L.) morfologija ir paplitimas Pelkinių notrų (Stachys palustris L.) panaudojimų sritys Pelkinių notrų (Stachys palustris L.) fitocheminė sudėtis Fenolinių junginių nustatymo metodai Antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai TYRIMO METODAI IR METODIKA Tyrimų objektas Medžiagos ir reagentai Naudota aparatūra tyrimų metodai Tiriamųjų S. palustris žaliavų ekstraktų paruošimas Reagentų paruošimas Pelkinių notrų (S. palustris) žaliavos ekstraktų spektrofotometrinė analizė Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas Bendrojo fenolio rūgščių kiekio nustatymas Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu Fe2+ jonų sujungimo metodu... 25

4 Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu DPPH radikalų sujungimo metodu Antioksidantinio aktyvumo įvertinimas naudojant ABTS + radikalų sujungimo metodą Redukcinio aktyvumo įvertinimas FRAP metodu Duomenų analizė REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS Ekstrakcijos sąlygų parinkimas Ekstrahento poliškumo įvertinimas Ekstrakcijos ultragarsu trukmės parinkimas Ekstrakcijos ultragarsu temperatūros nustatymas Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas S. palustris žaliavose Bendrojo fenolio rūgščių kiekio nustatymas Stachys palustris L. žaliavose Bendro flavonoidų kiekio nustatymas S. palustris žaliavose Chelatinio aktyvumo nustatymas Fe 2+ jonų sujungimo metodu S. palustris ekstraktuose Antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH laisvųjų radikalų sujungimo metodu pelkinių notrų (S. palustris) žaliavos ekstraktuose Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS sujungimo metodu S. palustris ekstraktuose Antioksidacinio aktyvumo nustatymas FRAP redukciniu metodu S. palustris ekstraktuose Koreliacinių ryšių įvertinimas tarp bendrojo flavonoidų, fenolio rūgščių ir fenolio junginių kiekio S. palustris žaliavose bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo IŠVADOS PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS NAUDOTA LITERATŪRA PRIEDAI... 60

5 5 SANTRAUKA D. Dabrickytės magistro baigiamasis darbas,,pelkinių notrų (Stachys palustris L.) augalinių žaliavų fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas. Mokslinio darbo vadovas doc. dr. Raimondas Benetis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra, Kaunas, Tikslas - Nustatyti iš įvairių Lietuvos vietovių surinktų, natūraliai augančių pelkinių notrų (Stachys palustris L.) augalinių žaliavų bendrąjį fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekį bei jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą. Uždaviniai: 1. Parinkti fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygas iš pelkinių notrų (S. palustris) žaliavų. 2. Spektrofotometrijos metodu įvertinti iš skirtingų Lietuvos cenopopuliacijų surinktų pelkinių notrų (S. palustris) augalinių žaliavų fenolinių junginių, fenolio rūgščių, flavonoidų kiekį ir nustatyti jų rodmenų kitimus, skirtingais vegetacijos tarpsniais. 3. Įvertinti pelkinių notrų (S. palustris) augalinių ekstraktų antiradikalinį aktyvumą DPPH ir ABTS metodais bei nustatyti jų redukcines savybes taikant FRAP metodą. 4. Taikant fotometrinį dvivalentės geležies jonų sujungimo (FIC) metodą, įvertinti pelkinių notrų (S. palustris) augalinių ekstraktų chelatines savybes. 5. Nustatyti koreliacinius ryšius tarp fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekių pelkinių notrų žaliavose bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo. Tyrimo metodika. Tyrimui atlikti naudotos augalinės pelkinių notrų žaliavos, surinktos iš 29 skirtingų Lietuvos augaviečių. Bandinių ekstrakcija vykdyta ultragarsu, ekstrahentu naudojant 70% (V/V) etanolį, ekstrakcijos trukmė - 15 min, o temperatūra - 40 C. Bendram fenolinių junginių kiekybiniam nustatymui taikytas spektrofotometrinis Folin-Ciocalteu metodas. Bendro flavonoidų kiekio nustatymui taikyta reakcija su AlCl3. Bendram fenolio rūgščių kiekybiniam nustatymui naudotas Arnow reagentas. Etanolinių ekstraktų antioksidacinės savybės tirtos naudojant DPPH, ABTS, FIC ir FRAP spektrofotometrines metodikas. Rezultatai ir išvados. S. palustris augalinėms žaliavoms būdingas fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekybinių sudėčių kintamumas. Jų pasiskirstymas tiesiogiai priklauso nuo augalo morfologinės dalies, cenopopuliacijos ir vegetacijos tarpsnio. Didžiausi kiekiai šių biologiškai aktyvių medžiagų nustatyti pelkinių notrų lapuose ir vegetacijos pradžioje surinktose žaliavose. Stipriausiu antioksidaciniu aktyvumu tirtose sistemose (DPPH, ABTS, FIC ir FRAP) pasižymėjo vegetacijos pradžioje surinktų žaliavų ekstraktai. Stipriausias antiradikalinis, chelatinis ir redukcinis aktyvumai nustatyti S. palustris lapų ekstraktuose. Gautų rezultatų statistinė analizė parodė statistiškai reikšmingus (p < 0,05) koreliacinius ryšius tarp bendrojo fenolinių junginių, flavonoidų ir fenolio rūgščių kiekių pelkinių notrų žaliavose ir jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo.

6 6 SUMMARY D. Dabrickytė master thesis The investigation of phenolic compounds and antioxidant activity of Marsh woundwort (Stachys palustris L.) plants. Supervisor dr. Raimondas Benetis, Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of pharmacy, Department of Drug Chemistry, Kaunas, The aim: Investigate the quantitative composition of Marsh woundwort (Stachys palustris L.) from naturally growing in Lithuania different cenopopulations raw materials phenolic compounds, flavonoids and phenolic acids and evaluate the antioxidant activity of their extracts. The objectives of the study: 1. To optimize extraction conditions of phenolic compounds from Marsh woundwort (S. palustris) raw materials; 2. To quantitative composition of total phenolic, flavonoids and phenolic acids in Marsh woundwort raw materials collected from naturally growing in Lithuania different cenopopulations and to analyze their variation patterns depending on morphology of the plants; 3. To evaluate the antiradical activity of Marsh woundwort (S. palustris): by DPPH, ABTS methods and to determine their reductive activity by FRAP method. 4. To evaluate the chelation properties of marsh woundwort extracts (S. palustris) using FIC method. 5. To determine correlation between phenolic compounds, phenolic acid and flavonoid contents in S. palustris plant material and the antioxidant activity of their extracts. Research methodology: The samples of the research was raw materials of Marsh woundwort plants collected from 29 different cenopopulations naturally growing in Lithuania. The method of extraction - ultrasound agitation, solvent 70 proc. (V/V) ethanol, extraction time -15 min, extraction temperature 40 ºC. Spectrophotometric Folin-Ciocalteu method was used to determine the total content of phenolic compounds. Reaction with AlCl3 was used to determine the total content of flavonoids. Arnow reagent was used to determine the total content of phenolic acids. DPPH, ABTS, FIC and FRAP spectrophotometric assays were used to find out the antioxidant properties of plant extracts. Results and conclusions: Plant materials of S. palustris are characterized by phenolic compounds, phenolic acids, and flavonoids. Their distribution depends on the morphological part of the plant, the cenopopulation and the stage of vegetation. The highest levels of these biologically active substances were found in the leaves which were collected at the beginning of vegetation. Extracts of raw materials collected at the beginning of vegetation had the strongest antioxidant activity in the studied systems (DPPH, ABTS, FIC and FRAP). The strongest antiradical, chelating and reducing activities were found in S. palustris leaf extracts. Statistical analysis showed statistically significant (p <0.05) correlations between the total content of phenolic compounds, flavonoids and phenolic acids in the raw materials of S. palustris and the antioxidant activity of their extracts.

7 7 SANTRUMPOS V/V tūrio procentai BAM biologiškai aktyvios medžiagos FIC geležies (II) jonų sujungimo metodas DPPH 2,2-difenil-1-pikrikhidrazilo laisvasis radikalas ABTS 2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono) rūgšties radikalas. FRAP geležies redukcijos antioksidacinė galia TPTZ 2,4,6-tripiridil-s-triazinas GRE galo rūgšties ekvivalentai TE trolokso ekvivalentai RE rutino ekvivalentai UV ultravioletinė spinduliuotė BHA butilintas hidroksianizolis BHT butilintas hidroksitoluenas EDTA etilendiamintetraacto rūgštis

8 8 ĮVADAS Šiandien visame pasaulyje žmonės patiria įvairius sveikatos sutrikimus: serga širdies ir kraujagyslių ligomis, hipertenzija, cukriniu diabetu, įvairiomis vėžio formomis ir skundžiasi kitais negalavimais [9,28,33]. Mokslininkų atlikti tyrimai rodo, kad tinkamas mitybos pasirinkimas gali būti svarbi priemonė, kuri gali prisidėti prie šių lėtinių ligų kontrolės. Nustatyta, kad maisto racionas, kuriame gausu vaisių ir daržovių, sumažina susirgimo riziką įvairiomis ligomis, ypač širdies ir kraujagyslių ligomis bei vėžiu. Manoma, kad vieni svarbiausių komponentų augalinės kilmės maiste reikšmingai prisidedančiu prie anksčiau minėtų efektų yra antioksidantai [21]. Remiantis moksline literatūra nustatyta, kad vartojant maisto produktus, turinčių antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčiu junginių, gali sumažinti riziką išsivystyti tokiomis ligomis kaip vėžys, aterosklerozė, artritas, cukrinis diabetas taip pat apsaugo ląsteles nuo senėjimo [11,14,40]. Fenoliniai junginiai yra natūralūs antioksidantai, kurie yra plačiai paplitę augalų karalystėje [40]. Augalinės kilmės fenoliniams junginiams priskiriami: flavonoidai (antocianinai, flavanoliai, flavonoliai, flavanonai) ir kelios neflavonoidų klasės (fenolio rūgštys, stilbenai ir iš jų gaunamos sudėtingos molekulės) [16]. Notreliniai (Lamiaceae) yra viena didžiausių ir plačiausiai naudojamų augalų šeima, susidedanti iš 250 genčių ir daugiau nei 7000 rūšių. Didžiausios Lamiaceae šeimos gentys yra šios: Stachys, Salvija, Scutellaria, Plectranthus, Hyptis, Teucrium, Thymus, Vitex, Nepeta ir kt. Notrelinių šeimos augalai vertinami dėl jų kaupiamų eterinių aliejų, kurie pasižymi antioksidacinėmis, priešuždegiminėmis, antimikrobinėmis, antivirusinėmis ir priešvėžinėmis savybėmis [6]. Apie 300 augalinių eterinių aliejų komerciniais tikslais yra naudojami maisto konservavimui, aromaterapijoje ir farmakologiniais tikslais [7]. Eteriniai aliejai turi antrinių metabolitų, kurie apsaugo augalus nuo bakterijų, virusų, grybelių ir kitų kenkėjų. Vaistiniai augalai, priklausantys Lamiaceae šeimai, yra žinomi dėl savo aromatinio kvapo; juos sudaro daugybė plačiai naudojamų kulinarinių žolelių, įskaitant rozmariną, baziliką ir mairūną, kuriems būdingas didelis eterinių aliejų kiekis [6,7]. Per amžius Stachys L. rūšių augalinės žaliavos buvo naudojamos tradicinėje medicinoje įvairiais tikslais, įskaitant uždegiminių ligų, opų, sklerozės, lytinių organų navikų, žaizdų, kosulio, viduriavimo, karščiavimo, gerklės skausmo, kepenų sutrikimų, širdies ligų gydymui, silpnumui, vidiniam kraujavimui stabdyti, galvos skausmams, migrenai ir neuralgijoms gydyti [5,7]. Buvo nustatyta, kad fenoliniai junginiai pasižymi antibakterinėmis, antimutageninėmis, antikancerogeninėmis, antitrombozinėmis ir kraujagysles plečiančiomis savybėmis [15,16]. Dauguma naudingų fenolinių junginių savybių buvo siejama su jų antioksidaciniu aktyvumu [15].

9 9 Darbo naujumas. Lietuvoje dar nebuvo atlikta jokių išsamių tyrimų su pelkinių notrų (S. palustris) antžeminėmis dalimis. Todėl tikslinga įvertinti pelkinių notrų fitocheminę sudėtį bei jų ekstraktų antioksidacines savybes. Šio tyrimo metu pirmą kartą Lietuvoje įvertinti pelkinių notrų bendrieji fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekiai bei jų įvairavimas skirtingose augalo morfologinėse dalyse (lapuose, žieduose, stiebuose) skirtingose gamtinėse cenopopuliacijose, skirtingais vegetacijos tarpsniais. Taip pat buvo įvertintas pelkinių notrų ekstraktų, paruoštų iš skirtingų Lietuvos augaviečių ir skirtingais augalo vegetacijos tarpsniais surinktų pelkinių notrų žaliavų, antioksidacinis potencialas, vertinant antiradikalines, redukcines ir chelatines ekstraktų savybes spektrofotometriniais metodais. Darbo tikslas - Nustatyti iš įvairių Lietuvos vietovių surinktų, natūraliai gamtoje augančių pelkinių notrų (Stachys palustris L.) augalinių žaliavų bendrąjį fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekį bei jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.

10 10 DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI Tikslas - Nustatyti iš įvairių Lietuvos vietovių surinktų, natūraliai gamtoje augančių pelkinių notrų (Stachys palustris L.) augalinių žaliavų bendrąjį fenolių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekį bei jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą. Uždaviniai: 1. Parinkti fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygas iš pelkinių notrų (S. palustris) žaliavų. 2. Spektrofotometrijos metodu įvertinti iš skirtingų Lietuvos vietovių surinktų pelkinių notrų (S. palustris) augalinių žaliavų fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekį ir nustatyti jų rodmenų kitimus, skirtingais vegetacijos tarpsniais. 3. Įvertinti pelkinių notrų (S. palustris ) augalinių ekstraktų antiradikalinį aktyvumą DPPH ir ABTS metodais bei nustatyti jų redukcines savybes taikant FRAP metodą. 4. Taikant fotometrinį dvivalentės geležies jonų sujungimo (FIC) metodą, įvertinti pelkinių notrų (S. palustris) augalinių ekstraktų chelatines savybes. 5. Nustatyti koreliacinius ryšius tarp fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekių pelkinių notrų žaliavose bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo.

11 11 1. LITERATŪROS APŽVALGA 1.1. Oksidacinis stresas Oksidacinis stresas yra normalus organizmo reiškinys, būdingas visiems gyviesiems organizmams. Oksidacinį stresą gali sukelti bet koks dirgiklis, nesvarbu, socialinis, fiziologinis ar fizinis, kurį organizmas suvokia kaip grėsmingą ar pavojingą, ir gali būti,,pažymėtas kaip stresorius [20]. Sintezėje, atsižvelgiant į glaudų ryšį tarp oksidacinio streso, uždegimo ir senėjimo, buvo pasiūlyta senėjimo-oksidacijos-uždegimo teorija. Pagal šią teoriją senėjimas yra apibūdinamas kaip homeostazės praradimas dėl lėtinio oksidacinio streso, kuris veikia įvairias sistemas, tokias kaip nervų, endokrininę ir imuninę. Suaktyvėjusi imuninė sistema sukelia uždegiminę būseną, kuri sukuria tarsi užburtą ratą, kuriame lėtinis oksidacinis stresas ir uždegimas,,maitina vienas kitą, taigi taip padidinamas su amžiumi susijęs sergamumas ir mirtingumas [19]. Greitėjant gyvenimo ritmui patiriama vis daugiau streso, apie kurio žalą rašoma ne viename moksliniame straipsnyje. Mokslininkai vis ieško naujų būdų kaip sumažinti oksidacinį stresą bei bando atrasti naujų alternatyvų jau žinomiems vaistiniams augalams, kurie pasižymėtų geromis ar net geresnėmis antioksidacinėmis savybėmis už jau vartojamus augalinius preparatus Antioksidantai Žmones ir gyvūnus nuolatos veikia ne tik daugybė biologinių faktorių, bet ir įvairūs aplinkos veiksniai, tokie kaip klimato pokyčiai, mitybos įpročiai, įvairūs stresoriai ir kt. Žmogaus ir gyvūno gebėjimas susitvarkyti su šiais veiksniais yra labai svarbus palaikant jų sveikatą ir produktyvumą taip pat apsaugant ląsteles nuo oksidacinio streso [20]. Laisvieji radikalai yra reaktyvios cheminės medžiagos, turinčios nesuporuotą elektroną. Laisvieji radikalai yra molekulės, atomai ar kitos cheminių medžiagų grupės, kurios apima vandenilio peroksidą, hidroksilo radikalą, azoto oksidą, peroksinitritą, pavienį deguonį, peroksilo radikalą ir superoksido anijoną. Pernelyg didelė šių reaktyvių rūšių gamyba sukelia oksidacinį stresą, atsirandantį dėl organizmo antioksidantų gynybos sistemos disbalanso ir laisvųjų radikalų susidarymo. Įrodyta, kad oksidacinis stresas yra vienas iš mechanizmų, koreliuojančių su laisvųjų radikalų sukeliama oksidacine žala, kuri sukelia lėtines ligas, tokias kaip vėžys, koronarinės širdies ligos, diabetas, neurodegeneracinės ligos ir netgi senėjimas [11,16,21]. Taigi epidemiologiniai tyrimai parodė, kad maisto produktų, kuriuose yra antioksidantų, vartojimas gali apsaugoti žmogaus organizmą nuo

12 12 reaktyviųjų deguonies rūšių pažeidimų ir padėti išvengti arba nutolinti ankščiau minėtų ligų atsiradimą [11,21]. Nustatyta, kad antioksidantai iš natūralių šaltinių padidina antioksidacinį pajėgumą ir taip sumažina daugelio ligų riziką. Didelis antioksidantų suvartojimas kartu su maistu gali padėti palaikyti ribinę antioksidantų koncentraciją ir skatinti normalų fiziologinių sistemų funkcionavimą [40]. Antioksidantai tai junginiai, kurie gali sulėtinti arba slopinti lipidų ar kitų molekulių oksidaciją, slopindami oksidacinių grandininių reakcijų pradžią ar plitimą ir tokiu būdu galėdami neutralizuoti žalingą oksidacijos poveikį gyvūnų audiniams [11]. Antioksidaciniai junginiai atlieka gyvybiškai svarbų vaidmenį organizmo gynybos sistemoje, saugant nuo reaktyviųjų deguonies rūšių, kurie yra kenksmingi šalutiniai produktai, atsirandantys aerobinio ląstelių kvėpavimo metu [40]. Nors sintetiniai antioksidantai butilintas hidroksianizolis (BHA) ir butilintas hidroksitoluenas (BHT) plačiausiai naudojami kaip alternatyvūs konservantai, siekiant užkirsti kelią nepageidaujamam maisto produktų sugedimui, tačiau jie nėra tinkamiausias pasirinkimas. Nustatyta, kad ilgainiui juos vartojant gali pasireikšti toksiškas poveikis, o vienas iš šalutinių reiškinių kancerogeninis poveikis [40,41]. Taigi, reikia mažiau toksiškų, ekonomiškai efektyvių ir stiprių antioksidantų. Įrodyta, kad augaluose yra įvairių natūralių antioksidantų; tai fenolio rūgštys, flavonoidai / bioflavonoidai, tanino rūgštys (taninai) ir lignanai ir stilbenai, kurie kartu vadinami polifenoliais (fenoliai). Jų daugiausia randama vaistinių augalų dalyse, tokiose kaip vaisiai, lapai ir daržovės [40]. Norint, kad antioksidantų terapija būtų veiksminga, reikia įvykdyti tris sąlygas: (1) antioksidantas turi sugebėti pašalinti teisingus radikalus, (2) radikalų šalinimas turi būti nukreiptas į ląsteles per tam tikrą laiką, (3) Antioksidantas turi išlikti aktyvus ir nedegraduoti tam tikrą laiką [22] Fenoliniai junginiai Fenoliniai junginiai yra didelė antrinių metabolitų klasė. Jie randami augaluose, įvairiuose augaliniuose maisto produktuose, vaisiuose, daržovėse [11]. Šios medžiagos sintetinamos įprastai vystantis augalui, taip pat sintetinami iš dalies kaip atsakas į ekologinį ir fiziologinį spaudimą, pvz., patogenų ir vabzdžių puolimą, UV spinduliuotę, įvairius sužeidimus, reaguojant į stresą [10,21]. Pagrindinis fenolio junginių struktūrinis bruožas yra aromatinis žiedas, turintis vieną ar kelias hidroksilo grupes. Augalinės kilmės fenolio junginiai klasifikuojami kaip paprasti fenoliai arba polifenoliai, atsižvelgiant į fenolio vienetų skaičių molekulėje. Taigi augalinės kilmės fenolius sudaro paprastieji fenoliai, kumarinai, ligninai, lignanai, kondensuoti ir hidrolizuoti taninai, fenolio rūgštys ir flavonoidai [3,10]. Fenoliniai junginiai pasižymi didele struktūrų įvairove, įskaitant gana paprastas

13 13 molekules (pvz., vaniliną, galo rūgštį, kofeino rūgštį) ir polifenolius, tokius kaip flavonoidus ir iš šių įvairių grupių gautus polimerus. Fenoliniai junginiai gali būti klasifikuojami į vandenyje tirpius junginius (fenolio rūgštys, fenilpropanoidai, flavonoidai ir chinonai) ir vandenyje netirpius junginius (kondensuoti taninai, ligninai ir hidroksicinamų rūgštys) [21,44]. Nors terminas polifenolis dažnai naudojamas kaip fenolio junginio sinonimas, jis turėtų būti vartojamas tik molekulėms, turinčioms bent du fenolio žiedus. Polifenolius pirmiausia apibrėžė Bate-Smith ir Swain (1962 m.) kaip vandenyje tirpius fenolinius junginius, kurių molekulinis svoris yra nuo 500 iki 3000 (Da), be to, jie turi ne tik įprastas fenolines savybes, bet ir ypatingas, tokias kaip gebėjimą nusodinti alkaloidus, želatiną ir kitus baltymus iš tirpalo. Fenoliniai junginiai yra svarbūs augalinio maisto kokybei: jie yra atsakingi už raudonųjų vaisių, sulčių ir vyno spalvą bei skonio savybes [44]. Manoma, kad fenoliniai junginiai, kurių gausu įvairiuose vaisiuose ir daržovėse, prisideda prie naudos sveikatai, taip pat padeda užkirsti kelią širdies ligoms, mažinta uždegimą, vėžinius susirgimus bei mutagenezės greitį žmogaus ląstelėse. Pavyzdžiui, ligninai ir hidroksicinaminės rūgštys vaidina svarbų vaidmenį ląstelės sienelėje augalų augimo metu, nes apsaugo nuo įvairių stresorių, infekcijų, sužeidimų ir UV spindulių, o taninai (hidrolizuoti taninai ir kondensuoti taninai) turi didelį potencialą sudaryti oksidacinius ryšius su kitomis augalų molekulėmis [10]. Kai kurie fenoliniai junginiai yra labai paplitę, o kiti yra būdingi tik tam tikroms augalų šeimoms arba yra randami tik tam tikruose augalų organuose arba tam tikruose augalo vystymosi etapuose. Struktūrų įvairovė yra susijusi su įvairiomis savybėmis, susijusiomis su konkrečiais vaidmenimis augaluose, taigi ir jų specifiniu pasiskirstymu. Pavyzdžiui, antocianinai yra daugumos raudonųjų ir mėlynųjų augalų organų pigmentai. Jie randami žieduose ir prinokusiuose vaisiuose ir atlieka svarbų vaidmenį pritraukiant apdulkintojus ir platinant sėklas. Jie taip pat yra dažnai aptinkami jaunuose lapuose siekiant atgrasyti nuo žolėdžių vabzdžių. Flavonoliai apsaugo augalų audinius nuo UV spindulių poveikio, o proantocianidinai (dar vadinami kondensuotais taninais) ir hidrolizuojami taninai gali dalyvauti augalų gynyboje nuo žolėdžių, grybelių ir virusų, greičiausiai dėl savo rauginių savybių, ir yra randami daugumoje augalų audinių ankstyvuosiuose vystymosi stadijose [45]. Fenolio junginiai, aptinkami augaluose, pasižymėjo stipriu antioksidaciniu aktyvumu, daugiausia dėl jų redukcinių savybių, leidžiančių jiems veikti kaip reduktoriams. Įrodyta, kad flavonoidai turi platų biocheminį ir farmakologinį poveikį, pavyzdžiui, antikancerogeninį, antivirusinį, antimikrobinį, antitrombozinį, priešuždegiminį ir antimutageninį poveikį. Be to, flavonoidai gali veikti kaip laisvųjų radikalų šalintojai ir nutraukti grandinines reakcijas, vykstančias trigliceridų oksidacijos metu [3,11]. Taip pat mokslinėje literatūroje pranešama, kad ekstraktų antioksidacinis aktyvumas ir redukcinės savybės yra stipriai priklausomos nuo žaliavose esančių fenolinių junginių kiekių [39].

14 1.4. Pelkinių notrų (Stachys palustris L.) morfologija ir paplitimas 14 Iš viso visame pasaulyje suskaičiuojama maždaug 300 Stachys rūšių ir yra laikoma viena didžiausių Lamiaceae genčių, paplitusia beveik visame pasaulyje [24]. Stachys gentį sudaro maždaug 58 rūšys, kurios aptinkamos Europoje, tai S. annua, S. alpina, S. byzanthina, S. germanica, S. officinalis, S. palustris, S. recta ir S. Sylvatica, o kai kurios yra auginamos kaip dekoratyviniai augalai arba randamos botanikos soduose (pvz., S. grandiflora ir S. Macrantha) [13]. Pelkinės notros (Stachys palustris L.) tai notrelinių (Lamiaceae) šeimos augalai, priklausantys notrų (Stachys) genčiai [24]. Genties pavadinimas, kilęs iš graikų kalbos žodžio (Stachys- στάχυς), nurodantis žiedyno tipą, kuris apibūdinamas kaip kukurūzų burbuolės ir yra panašūs į Triticum L. (Gramineae) genties rūšių žiedynus [34]. Pelkinės notros tai beveik bekvapiai, daugiamečiai žoliniai augalai, turintys ilgus, šliaužiančius požeminius šakniastiebius. Priskiriami nuodingiesiems augalams, piktžolėms. 1 pav. vaizduojamos pelkinių notrų (S. palustris) antžeminės dalys. 1 pav. (Stachys palustris L.) antžeminės dalys Stiebai būna iki cm ilgio, stačiakampiai, šviesiai žalios spalvos, padengti negausiais tankiais plaukeliais, dažniausiai be liaukų, nežymiai išsišakoję viršuje, žiedai dažnai skaisčiai rausvai violetinės spalvos. Jie išdėstyti verpstėmis, kiekvienas žiedas susideda iš penkių sujungtų žiedlapių, vainikėlis susideda iš dviejų dalių, viršutinė dalis švelniai gaubta, o apatinė plokščia, susidedanti iš trijų skiautelių. [4,5,24,34]. Lapai priešingi, lancentiški, dantyti, apatiniai lapai trumpai pjaustyti, viršutiniai ir viduriniai stiebo lapai nejudrūs, siauri, pailgai ovalūs, nusmailėjantys viršūnėje. Taurelė 6 8 mm. Kuokeliai 4, išoriniai 2 ilgi ir vidiniai 2 trumpi [5,24]. Vaisiai 2,0 2,5 mm, elipsės formos,

15 15 suapvalėjantys viršūnėje, sausi [4,24]. Buvo pranešta, kad vidutinė vienos sėklos masė yra 0,78 2,00 mg ± 0,2 mg. Pelkinės notros yra vertingos kaip nektaro šaltinis vabzdžiams, ypač kamanėms. Jos turi antispazminių, antiseptinių ir sutraukiančių savybių, o pavadinimas Woundwort kilęs iš jos tradicinio naudojimo siekiant užkirsti kelią kraujavimui ir gydant žaizdas [26]. Auga drėgnuose laukuose, krūmuose, krantuose, grioviuose, drėgnose pievose, paupiuose [2,4,32]. Paprastai randamas periodiškai užliejamuose ir blogai nusausintuose dirvožemiuose, kurie yra silpnai rūgštūs arba silpnai šarminiai ir labai derlingi [26]. S. palustris yra paplitusi vakarų Europoje į šiaurę nuo Viduržemio jūros pakrančių regionų ir per rytinę Europą iki Vidurinės Azijos ir šiaurės vakarų Kinijos [4,5]. Lietuvoje šio augalo paplitimas yra gana dažnas. Žydi liepą-rugsėjį [2] Pelkinių notrų (Stachys palustris L.) panaudojimų sritys S. palustris yra žinomas kaip valgomasis augalas. Jauni ūgliai gali būti vartojami virti ir naudojami kaip šparagų pakaitalas, o jų šakniagumbiai gali būti vartojami žali arba virti [24]. Taip pat, gumbai naudojami sriubai ir alkoholiniams gėrimams, tokiems kaip degtinė, pagardinti [5,34. Be to, džiovinti S. palustris milteliai Europoje naudojami kaip duonos priedas, todėl jie vadinami gegužės mėnesio miltais [5]. Yra duomenų, kad lapai ir sėklos taip pat galėjo būti vartojami kaip maistas. Remiantis istoriniais duomenis S. palustris buvo naudojamas kaip maistinis augalas Europoje iki XIX - XX a.. Yra duomenų, kad šis augalas buvo kaip savotiškas užkandis po Antrojo pasaulinio karo, net iki ųjų. Augalas daugiausiai buvo vartojamas esant maisto trūkumui pavasarį [34]. Yra žinoma, kad pelkinės notros buvo vartojamos kaip žolelių arbata dėl savo lakiųjų komponentų ir fenolinių rūšių [5]. Tradicinėje medicinoje S. palustris buvo vartojamas kaip antiseptiniai, antispazminiai, vėmimą skatinantys, atsikosėjimą lengvinantys, kraujavimą stabdantys, nervus raminantys ir tonizuojantys vaistai bei žaizdų gydymui. Pažymėtina, kad augalas veiksmingai veikia vidines ir išorines hemoragijas, taip pat yra veiksmingas podagros, mėšlungio ir sąnarių skausmų gydymui [7,14]. Termiškai apdoroti, išvirti S. palustris šakniagumbiai yra šiek tiek saldoki, nes jose yra daug ir lengvai virškinamų angliavandenių, todėl jie buvo vartojami segant cukriniu diabetu [5,7]. Pranešama, kad Stachys žolelių ekstraktai pasižymi ne tik įvairiomis medicininėmis savybėmis (priešuždegiminėmis, antitoksikacinėmis, antimikrobinėmis ir antioksidantinėmis), bet yra

16 16 veiksmingi ir kaip natūralūs konservantai, kurie plačiai tyrinėjami maisto chemijoje [8]. Stachys rūšių, įskaitant S. palustris, eterinių aliejų komponentai yra plačiai naudojami farmacijos, kosmetikos ir kvepalų pramonėje [4,45]. Nepaisant to, kad S. palustris buvo vartojamas šimtmečius kaip maistinis augalas, plačiai vartotas ir tradicinėje medicinoje, vis dėlto yra mažai žinoma apie jo cheminę sudėtį, o ypač apie polines sudedamąsias dalis [24] Pelkinių notrų (Stachys palustris L.) fitocheminė sudėtis Tarptautinėje literatūroje Stachys rūšys buvo plačiai ištirtos atliekant kelis fitocheminius ir farmakologinius tyrimus, pagrindžiant jų etnofarmakologinius panaudojimo būdus. Ypatingas dėmesys yra skiriamas priešuždegimiam, antioksidaciniam, analgetiniam, renoprotekciniam, anksiolitiniam ir antidepresiniam aktyvumui. Todėl daug dėmesio buvo skirta Stachys genties biologiškai aktyvių antrinių metabolitų identifikavimui iš skirtingų augalų dalių. Apskritai iš šios genties buvo išskirta daugiau nei 200 junginių, priklausančių šioms svarbioms cheminėms grupėms: terpenai (pvz., triterpenai, diterpenai, iridoidai), polifenoliai (pvz., flavono dariniai, feniletanoidiniai glikozidai, lignanai), fenolio rūgštys ir eteriniai aliejai [34]. Pagrindiniai S. palustris poliniai antriniai metabolitai yra feniletoidiniai gliukozidai ir izoskutelareino dariniai. Nustatyta, kad S. palustris pasižymi ypač dideliu polifenolinių junginių kiekiu. Šie metabolitai pasižymi tam tikru biologiniu aktyvumu ir gali pateisinti kai kuriuos tradicinius augalų naudojimo būdus, taip pat naudą sveikatai, susijusia su šio augalo vartojimu. Jų buvimas etanoliniuose ekstraktuose lėmė didelį bendrą fenolio kiekį bei gerą radikalų šalinimo aktyvumą [24]. Nustatyta, kad didelius fenolinių junginių kiekius lėmė būtent feniletanoidinių glikozidų ir izoskutelareino darnių gausa. Vienas iš feniletanoidinių glikozidų buvo varbaskozidas, kuris yra pakankamai gerai žinomas Stachys genties komponentas. Įrodyta, kad šis junginys yra geras antioksidantas, apsaugantis nuo oksidacinio streso, bei veikia priešuždegimiškai ir pasižymi prieš vėžinėmis savybėmis [24]. Izoskutelareino dariniai buvo identifikuoti keliose Lamiaceae šeimos gentyse (taip pat ir S. palustris) taip patvirtinant jų pačių chemotaksonominę svarbą. Įrodyta, kad jie yra stiprūs antioksidaciniai junginiai ir suteikia neuroprotekcinį poveikį sergant Alzheimerio liga [24,34]. Tirtuose mėginiuose labiausiai paplitęs fenolio junginys buvo chlorogeninė rūgštis, diterpenai - anuanonas, stahilonas ir stahonas, iridoidai - harpagidas ir aukubinas [1,23,24]. Chlorogeno rūgštis

17 17 (3-O-kofeilchinino rūgštis) yra labai dažna fenolio rūgštis, kuri jau buvo aptikta tiek gentyje, tiek šioje rūšyje. Šis junginys pasižymi antioksidacinėmis savybėmis ir sulėtina gliukozės išsiskyrimą į kraują po valgio, todėl gali būti vartojamas kaip natūralus antidiabetikas [24]. Taip pat buvo identifikuotos ir kitos fenolio rūgštys pelkinių notrų žaliavose, tokios kaip kavos rūgštis, galo rūgštis, rozmarino rūgštis [23,24] ir kt. Stachys gentis yra turtinga flavonoidais. Atliekant tyrimus buvo pranešta apie kelis flavonoidų tipus, pasitaikančius Stachys spp., įskaitant flavonus, polimetilintus flavonus, flavonolius, flavanonus ir biflavonoidus. S. palustris lapuose buvo nustatyti šie junginiai: 5-(glikurogliukozil)-7 metoksibaicaleinas (palustrinas), 5- (gliukuronosil) -7-metoksibaicaleinas (palustrinosidas), viceninas- 2, apigeninas 7-O-p-kumaroil-β-D-gliukopiranozidas [23,34]. Iridoidai yra vieni iš pagrindinių cheminių junginių, randamų Stachys gentyje. Pasak mokslininkų, iridoidai laikomi gerais šios genties chemotaksonominiais žymenimis. Atliekant fitocheminius tyrimus nustatyta įvairių rūšių iridoidų [12]. Pelkinių notrų mėginiuose identifikuoti šie junginiai: ajugosidas, harpagidas, acetilharpagidas, harpagozidas, katalipolis ir aukubinas [1,3,7,23,34]. Be to, naujausiuose S. palustris veikliųjų medžiagų tyrimuose nustatyta ne tik iridoidų harpagido ir 8-O-acetil-harpagido, bet ir monomelitozido, kuris buvo pirmasis šio junginio identifikavimas S. palustris rūšyse [10]. Kaip ir daugelis kitų Lamiaceae šeimos atstovų, Stachys rūšys gamina eterinį aliejų. Tačiau nepaisant didelio Stachys genties dydžio, lakiųjų junginių sudėtis žinoma tik nedaugeliui rūšių [8]. Pagrindiniai eterinio aliejaus komponentai randami Stachys gentyje yra šie: germacrenas D, kariofilenas, kadinenas, spathulenolis [5]. Diterpenoidai yra svarbus Stachys rūšių eterinio aliejaus komponentas. Įrodyta, kad šie diterpenoidai turi antibakterinį, priešgrybelinį, antimikobakterinį ir anti- Alzheimerio poveikį. Kitas gerai žinomas eterinio aliejaus komponentas, žinomas alkaloidas, yra stahidrinas. Jis buvo aptinkamas tokiose Stachys rūšyse kaip S. baicalensis, S. palustris, S. recta, S. betoniciflora ir S. sylvatica kartu su betainu, cholinu ir alantoninu. Stachys rūšių eterinio aliejaus sudėtį daugiausia sudaro seskviterpenai, fenilpropanoidų ir jų deguonies junginių mišiniai [1,5,7] Fenolinių junginių nustatymo metodai Paprastai fenoliniai komponentai iš vaistinių augalų žaliavų išgaunami įvairiomis būdais. Pagrindiniai fenolio komponentų ekstrahavimo procedūros yra maceravimas, ekstrahavimas ultragarsu, ekstrahavimas esant aukštam slėgiui ir kt., naudojant skirtingus ekstrahentus. Vertinant vaistinių

18 18 augalinių žaliavų farmakologinį aktyvumą būtina nustatyti fenolinių junginių koncentraciją. Tam naudojami įvairūs chromatografijos ir spektrofotometriniai metodai [10,42]. Pagrindinės metodikos, naudojamos kiekybiškai įvertinti bioaktyvius junginius yra Folin- Ciocalteu kolorimetrinis metodas, kuriuo įvertinamas bendras polifenolių kiekis, aliuminio chlorido kolorimetrinis tyrimas, kuriuo nustatomas bendras flavonoidų kiekis ir bendrasis antocianinų kiekis, apskaičiuotas ph diferencialo metodu, kuris pagrįstas antocianinų chromoforo struktūriniu pokyčiu tarp ph reikšmių 1,0 4,5 [22]. Fenolio junginių kiekybinis nustatymas daugiausia atliekamas naudojant spektrofotometrinę analizę. Dažniausiai ir plačiausiai paplitusi metodika, naudojama kiekybiškai įvertinti fenolio junginius, atsirado iš metodikos, kurią 1927 m. Sukūrė Otto Folin ir Vintila Ciocalteu tirozinui matuoti. Ši metodika pagrįsta cheminiu redukavimu volframo ir molibdeno oksidų mišiniu. Sureagavus su fenoliais, susidaro mėlyna spalva, kuri sugeria šviesą prie 765 nm. Šviesos absorbcijos intensyvumas šiame bangos ilgyje yra proporcingas fenolių koncentracijai. Vidutinė šio bandymo trukmė yra 2 valandos; tačiau šia trukmę galima sutrumpinti kaitinant mėginį [22,43]. Bendras flavonoidų kiekis daugiausia apskaičiuojamas naudojant kolorimetrinį metodą su aliuminio chloridu. Pagal šią metodiką ekstraktas pridedamas prie nustatytos koncentracijos aliuminio chlorido metanolio tirpale [22]. Aliuminio jonas reaguoja su ekstrakte esančiais flavonoidais ir suformuoja stabilų, geltonos spalvos kompleksą, kurio spalvos intensyvumas yra tiesiogiai proporcingas flavonoidų koncentracijai [43]. Mėginio absorbcija palyginama su flavonoidų etalonu (katechinu, kvercetinu ar rutinu). Šios metodikos trūkumas yra tas, kad joje pateikiamas tik viso flavonoidų kiekio įvertinimas. Nepaisant to, tai yra paprasta ir veiksminga metodika apskaičiuoti bendrą flavonoidų kiekį [22] Antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai Siekiant įvertinti antioksidacinį aktyvumą naudojami įvairūs metodai in vitro ir in vivo. Šiame darbe naudoti spektrofotometriniai metodai in vitro pagrysti spalvoto oksidatoriaus redukcija. Antioksidacinis aktyvumas neturėtų būti vertinamas remiantis vienu tyrimo modeliu. Praktiškai atliekamos kelios in vitro tyrimų procedūros, skirtos įvertinti antioksidacinį aktyvumą su dominančiais mėginiais. Kitas aspektas yra tas, kad antioksidaciniai metodai skiriasi įvairiais aspektais. Todėl sunku visiškai palyginti vieną metodą su kitu [35]. Šiame tyrime antioksidacinis aktyvumas įvertintas keliais metodais: DPPH, ABTS, FRAP ir FIC.

19 19 Vienas populiariausių ir plačiausiai naudojamų metodų yra DPPH. Tai laisvųjų radikalų šalinimo metodas, kuris yra ne tik greitas ir paprastas (t.y. nereikia atlikti daugybės žingsnių ir nereikia naudoti skirtingų reagentų), bet ir nebrangus, palyginti su kitais metodais. 1,1-difenil-2-pikrilhidrazilo molekulė (α,α-difenil-β-pikrilhidrazilas; DPPH) yra stabilus laisvasis radikalas, todėl molekulė nedimerizuoja, kaip būtų daugumos kitų laisvųjų radikalų atveju. Elektronų delokalizacija taip pat suteikia tirpalui violetinę spalvą, kuriai būdinga stipri absorbcija esant 517 nm bangos ilgiui. Kai DPPH tirpalas sumaišomas su substratu, galinčiu atiduoti vandenilio atomą, tirpalas praranda šią violetinę spalvą. Norint įvertinti antioksidacinį potencialą tiriant laisvuosius radikalus, stebimas DPPH radikalų optinio tankio pokytis. Šis metodas gali būti naudojamas kietiems ar skystiems mėginiams ir yra būdingas ne tik konkrečiam antioksidantui, bet ir bendram mėginio antioksidaciniam pajėgumui įvertinti [36,37,38]. Kitas metodas siekiant įvertinti antioksidacinį aktyvumą yra ABTS. Metodas pagrįstas ABTS katijonų radikalų absorbcijos sumažėjimu. Šis metodas yra pagrįstas mėlynai žalio ABTS radikalo redukcija antioksidantais, kai antioksidantas pridedamas prie mėlynai žalios spalvos chromoforo ABTS + (2,2-azino-bis (3-etilbenziaziazolino-6-sulfonrūgšties)). Antioksidantas sumažina ABTS + iki ABTS ir įgauna spalvą. ABTS + yra stabilus radikalas, kurio žmogaus organizme nėra [36]. ABTS tyrimas mėgstamas dėl savo privalumų: sumažina darbo laiką, medžiagų sąnaudas ir mėginių kiekį. [37,38]. Geležies redukcinės antioksidacinės galios (FRAP) tyrimas tai dar vienas metodas antioksidacinio aktyvumo nustatymui. Šis metodas matuoja antioksidantų gebėjimą redukuoti geležį. Jis pagrįstas trivalentės geležies Fe3+ ir 2,3,5-trifenil-1,3,4-triaza-2-azoniaciklopenta-1,4-dieno chlorido (TPTZ) komplekso redukavimu iki dvivalentės Fe2+ formos esant žemam ph. Šis sumažėjimas stebimas matuojant absorbcijos pokytį ties 593 nm, naudojant spektrofotometrą. Kadangi antioksidacines ir antiradikalines savybes daugiausia lemia fenolio junginių buvimas, tikimasi, kad frakcijos efektyvumas bus proporcingas jo fenolio koncentracijai [36,37] FIC tai dar vienas metodas skirtas antioksidacinio aktyvumo įvertinimui. Ferozinas gali sudaryti raudonos spalvos kompleksą, formuodamas chelatus su Fe2+ jonais. Ši reakcija yra slopinama esant kitiems chelatiniams agentams, kompleksas nebesusidaro ir dėl to pakinta mišinio spalva. Spalvos sumažėjimo matavimas lemia chelatų aktyvumą konkuruoti su ferozinu dėl geležies jonų, o spalvos pakitimas leidžia įvertinti antioksidantų chelatų sudarymo efektyvumą [36,37,38]. Absorbcija matuojama ties 562 nm. EDTA arba citrinos rūgštis gali būti naudojama kaip teigiama kontrolė [36].

20 Tyrimų objektas 2. TYRIMO METODAI IR METODIKA Tiriamasis objektas natūraliai gamtoje augančios S. palustris žaliavos. Žaliavos surinktos masinio žydėjimo metu liepos rugpjūčio mėnesiais 2019 ir 2020 metais (3 priedas). Iš skirtingų cenopopuliacijų surinkti augalinių žaliavų mėginiai buvo suskirstyti į žiedus, lapus ir stiebus, o tada susmulkinti. Tokiu būdu buvo paruošti augalo morfologinių dalių analitiniai pavyzdžiai. Visos žaliavos surinktos paupiuose, paežerėse, esant toliau nuo važiuojamųjų kelių ir pramoninių objektų. Buvo išdžiovintos vietoje, apsaugotoje nuo tiesioginių saulės spindulių ir drėgmės bei buvo laikomos popieriniuose maišeliuose, kuriuose buvo sudarytos sąlygos orui cirkuliuoti. Antžeminės S. palustris augalų dalys, surinktos skirtingais vegetacijos tarpsniais: masinio augimo, butonizacijos, masinio žydėjimo ir sėklų brandinimo. 2.2 Medžiagos ir reagentai Tyrimai atlikti naudojant analitinio švarumo tirpiklius ir reagentus: išgrynintą vandenį (Ph.Eur. 01/2009:0008), maistinį rektifikuotą 96% etilo alkoholį (UAB Stumbras, Kaunas, Lietuva), fenolinį 2M Folin-Ciocalteu reagentą (,,Sigma Aldrich, Šveicarija), 99,5-100,5% natrio karbonatą (,,Sigma Aldrich, Prancūzija), 98% galo rūgšties monohidratą (,,Sigma Aldrich, Kinija), 100% acto rūgštį (,,Carl Roth, Vokietija), 95% aliuminio chlorido heksahidratą (,,Carl Roth, Vokietija), 94% rutino hidratą (,,Sigma Aldrich, Vokietija), 99,5% metenaminą (,,Sigma Aldrich, Rusija), 97% feroziną (,,Sigma Aldrich, JAV), 99,5% bevandenis geležies (II) chloridas (,,Alfa Aesar, Vokietija), 95% DPPH (2,2-difenil-1- pikrilhidrazilas) (,,Alfa Aesar, Vokietija), ABTS (2,2 - azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfono) rūgštis) (,,Sigma-Aldrich, Kanada), kalio persulfatą (,,SIAL, Kanada), troloksą (,,Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Danija), analitinio švarumo natrio nitritą (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), natrio molibdatą ( 99%) (SigmaAldrich Chemie GmbH, Vokietija), vandenilio chlorido rūgštį (37%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), natrio hidroksidą (99%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), natrio acetatą ( 99,9 %) (CHEMPUR, Lenkija), geležies (III) chloridą ( Scharlau, Ispanija), TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazinas) (,,Alfa Aesar, Vokietija).

21 Naudota aparatūra Mėginiams paruošti buvo naudota ultragarso vonelė ElmaSonic S40H (U=230V) (gamintojas Elma Schmidbauer, Vokietija), orbitalinė purtyklė IKA KS 130 Basic (gamintojas IKA-WERKE, Vokietija). Naudoti spektrofotometrai Genesys 2 (Thermo Spectronic, JAV) ir Agilent Technologies (Cary 60, JAV) tyrimų metodai Tiriamųjų S. palustris žaliavų ekstraktų paruošimas Analitinėmis svarstyklėmis atsveriama po 0,05 g S. palustris žaliavos (lapai, žiedai, stiebai). Kiekvienas mėginys užpilamas po 10 ml 70% etanoliu (V/V) ir veikiamas ultragarsu ultragarso vonelėje esant 40 C temperatūrai. Pagaminti etanoliniai ekstraktai filtruojami pro popierinius filtrus į matavimo cilindrus. Žaliavos likutis ant filtro praplaunamas 70% (V/V) etanoliu ir pripilama etanolio iki 10 ml. Pagaminti ekstraktai buvo laikomi uždaroje, tamsaus stiklo taroje ir laikomi vietoje, apsaugotoje nuo tiesioginių saulės spindulių. Iš kiekvienos augalo dalies (stiebų, žiedų ir lapų) buvo paruošta po 2 mėginius. Iš viso paruošti 174 ekstraktai iš įvairių Lietuvos augaviečių S. palustris žaliavų ir 56 ekstraktai skirtingais augalo vegetacijos tarpsniais. Iš viso paruošta 230 ekstraktų su pelkinių notrų žaliavomis Reagentų paruošimas 70 proc. (V/V) etanolio išgryninto vandens mišinys ruošiamas remiantis alkoholimetrine lentele. 1 litrui pagaminti reikia 665 ml 96 proc. (V/V) etanolio ir 335 ml išgryninto vandens. 0,2 N Folin-Ciocalteu reagentas ruošiamas 100 ml matavimo kolboje. 10 ml 2M Folin- Ciocalteu fenolinio reagento praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 100 ml. 7,5 proc. (W/V) natrio karbonato (Na2CO3) tirpalas ruošiamas 100 ml matavimo kolboje. 7,5g bevandenio natrio karbonato tirpinama 100 ml išgryninto vandens. 5 proc. metenamino tirpalas gaminamas 2,5 g metenamino tirpinant 50 ml išgryninto vandens. 33 proc. acto rūgšties tirpalas ruošiamas 100 ml matavimo kolboje. 33 ml 99,8 proc. ledinės acto rūgšties skiedžiama išgrynintu vandeniu iki 100 ml žymos.

22 22 10 proc. aliuminio chlorido (AlCl3) tirpalas ruošiamas stiklinėje kolboje 5,0 g aliuminio chlorido ištirpinant 50 ml išgryninto vandens. Rutino etanolinis tirpalas gaminamas 0,025 g (tikslus svėrinys) 99 proc. grynumo rutino tirpinant 25 ml 70 proc. (V/V) etanolio. 2 mm geležies (II) chlorido (FeCl2) tirpalas ruošiamas 0,0063g (tikslus svėrinys) bevandenio FeCl2 tirpinant 25 ml išgryninto vandens. Kiekvieną kartą ruošiamas naujas tirpalas. 5 mm ferozino tirpalas gaminamas 0,0616 g ferozino (tikslus svėrinys) tirpinant 25 ml išgryninto vandens M DPPH (2,2-difenil-1-pikrikhidrazilas) tirpalas gaminamas ir laikomas tamsaus stiklo buteliuke, apsaugančiame nuo šviesos. 0,00118g (tikslus svėrinys) DPPH reagento ištirpinama 50 ml 96 %. (V/V) etanolyje. DPPH tirpalas kiekvieną tyrimo dieną ruošiamas naujas. ABTS tirpalas ruošiamas tamsaus stiklo buteliuke. 0,0548 g (tikslus svėrinys) ABTS miltelių tirpinama 50 ml išgryninto vandens, pridedama 70 mm kalio persulfato tirpalo. Mišinys val. laikomas tamsioje vietoje kambario temperatūroje. Motininis ABTS tirpalas skiedžiamas išgrynintu vandeniu, kad pagaminti darbinį ABTS + tirpalą. 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties tirpalas gaminamas atmatuojant 42 ml 37 proc. vandenilio chlorido rūgšties ir ją maišant su išgrynintu vandeniu iki 1 litro. Praskiestas natrio šarmo tirpalas gaminamas pasveriant tikslų 8,500 g natrio šarmo kiekį, kuris ištirpinamas išgrynintame vandenyje ir praskiedžiamas iki 100 ml. Arnow reagentas gaminamas pasveriant tikslų 10,000 g natrio molibdato kiekį, ištirpinant jį ml išgryninto vandens. Pasveriamas tikslus 10,000 g natrio nitrito kiekis, kuris ištirpinamas gautame tirpale ir praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 100 ml. 300 mm acetatinis buferis gaminamas atsveriant 3,1 g natrio acetato ir užpilant 16 ml ledine acto rūgštimi. Skiedžiama išgrynintu vandeniu iki 1000 ml (ph 3,6). 10 mm TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazino) reagentas gaminamas ištirpinant 0,1562 g TPTZ miltelių 50 ml išgryninto vandens. 20 nm geležies (III) chlorido heksahidrido tirpalas ruošiamas 0,2703 g geležies (III) chlorido heksahidrido ištirpinant 50 ml išgryninto vandens.

23 Absorbcijos dydis analizė 2.5 Pelkinių notrų (S. palustris) žaliavos ekstraktų spektrofotometrinė Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas Bendrajam fenolinių junginių kiekiui etanoliniuose S. palustris bandiniuose nustatyti atlikta spektrofotometrinė analizė naudojant Folin-Ciocalteu reagentą. Bandinys ruošiamas imant 1 ml tiriamojo ekstrakto ir sumaišoma su 5 ml 0,2 N Folin-Ciocalteu reagentu. Po 4 min įpilama 4 ml 7,5 % (V/V) natrio karbonato tirpalo ir gerai sumaišoma. Pagamintas tirpalas paliekamas 60 min. stovėti tamsoje vietoje. Gauto tirpalo optinis tankis matuojamas esant 765 nm šviesos bangos ilgiui, o kaip palyginamasis tirpalas naudojamas išgrynintas vanduo. Iš kiekvieno bandinio buvo gaminama po du analizės mėginius. Bendrasis fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentu (GRE), remiantis galo rūgšties kalibracine kreive 2 pav., ir naudojant formulę: GRE (mg/g) = c x V / m, kur c galo rūgšties koncentracija (mg/ml); V pagaminto ekstrakto tūris (ml); m atsvertas žaliavos kiekis (g). 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 y = 5,3973x - 0,0713 R² = 0, ,02 0,04 0,06 0,08 0,1 Galo rūgšties koncentracija mg/ml 2 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė. (n=2)

24 Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas Bendras flavonoidų kiekis S. palustris augaliniuose ekstraktuose buvo nustatytas bandinius veikiant aliuminio chlorido (AlCl3) ir metenamino tirpalais, parūgštinus acto rūgštimi. Iš kiekvieno ekstrakto buvo gaminama po 2 analizės bandinius. Kiekvienam iš jų buvo ruošiama po du tirpalus 25 ml kolbutėse: palyginamasis ir tiriamasis. Tiriamasis tirpalas ruošiamas imant 1 ml tiriamojo ekstrakto, įpilant 10 ml 96% etanolio, 0,05 ml 33% acto rūgšties, 1,5 ml 10% aliuminio chlorido ir 2 ml 5% metenamino tirpalų. Gautas tirpalas skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 25 ml žymės ir gerai sumaišoma. Palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat, tik nepridedama aliuminio chlorido ir metenamino tirpalų. Imama 1 ml tiriamojo ekstrakto, įpilama 10 ml 96 % etanolio ir 0,05 ml 33 % acto rūgšties. Pagaminti bandiniai paliekami stovėti tamsioje vietoje 30 min. Praėjus 30 min, bandinių optinis tankis matuojamas esant 475 nm šviesos bangos ilgiui. Matuojama po 2 kartus. Kaip palyginamasis tirpalas naudojami aukščiau aprašyti palyginamieji tirpalai. Bendrasis flavonoidų kiekis nustatomas palyginant gauto tiriamojo ir etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydžius. Rutino etaloninis ir palyginamasis tirpalai ruošiami imant 1 ml etaloninio rutino tirpalo vietoj 1 ml tiriamojo ekstrakto. Bendras flavonoidų kiekis išreiškiamas rutino ekvivalentais (RE) mg rutino/ml ekstrakto, naudojant formulę: x(mg/g)= mr A V m Ar Vr 1000 mr rutino masė, kuri buvo sunaudota etaloninio rutino tirpalo paruošimui (g); A tiriamojo augalinio ekstrakto tirpalo absorbcijos dydis; V augalinio ekstrakto tūris (ml); m atsvertas augalinės žaliavos kiekis, sunaudotas ekstraktui paruošti (g); Ar etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydis; Vr etaloninio rutino tirpalo tūris (ml); Bendrojo fenolio rūgščių kiekio nustatymas Bendrojo fenolio rūgščių nustatymui S. palustris žaliavose iš kiekvieno etanolinio ekstrakto gaminamas tiriamasis ir palyginamasis tirpalai. Tiriamasis tirpalas gaminamas įpilant 1 ml tiriamojo S.

25 palustris ekstrakto, 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido (HCl) rūgšties, dedant 2 ml Arnow reagento ir 2 ml praskiesto šarmo. Viskas gerai sumaišoma kolbutėje ir praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki 10 ml. Palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat kaip tiriamasis, tik nededama Arnow reagento; imamas 1 ml tiriamojo ekstrakto, 2 ml 0,5 HCl rūgšties, 2ml praskiesto natrio šarmo. Gerai sumaišoma ir praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki 10 ml. Kiekvienas bandinys tiriamas po 2 kartus. Gauto tirpalo optinis tankis matuojamas esant 525 nm bangos ilgiui. 25 Bendras fenolio rūgščių kiekis procentais ekstrakte išreiškiamas chlorogeno rūgštimi remiantis formule: X(%)= A 5,3 m A tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis; m atsvertas žaliavos kiekis, g Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu Fe2+ jonų sujungimo metodu Fenolinių junginių chelatinį aktyvumą galima nustatyti naudojant spektrofotometrinį Fe2+ jonų sujungimo metodą. Šis metodas pagrįstas komplekso, kurį sudaro Fe (II) ir ferozinas, absorbcijos sumažėjimu esant 562 nm šviesos bangos ilgiui [36,37]. Tiriamasis tirpalas paruošiamas imant 1 ml tiriamojo ekstrakto, 50 μl 2 mm geležies (II) chlorido tirpalo. Reakcija inicijuojama 0,2 ml 5 mm ferozino tirpalu. Gautas tirpalas gerai sumaišomas ir paliekamas stovėti tamsioje vietoje 10 min kambario temperatūroje. Tuščias bandinys ruošiamas imant 1 ml 70% (V/V) etanolio ir sumaišant su 50 μl 2 mm geležies (II) chlorido ir 0,2 ml 5 mm ferozino tirpalais. Kiekvienam ekstraktui ruošiama po 2 mėginius. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas 70% (V/V) etanolis. Ekstrakto gebėjimas sujungti Fe²+ jonus išreiškiamas procentais ir yra apskaičiuojamas pagal formulę: Fe²+ sujungimas = [ Ab Aa ] 100% Ab Aa bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis; Ab tuščio bandinio absorbcijos dydis.

26 Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu DPPH radikalų sujungimo metodu 26 Tiriamųjų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo įvertinimui atliekamas elektronų perdavimo reakcijomis pagrįstas DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) radikalų sujungimo metodas [36,37]. Kiekvienam ekstraktui ruošiama po 2 bandinius. Tiriamasis tirpalas ruošiamas kvarcinėje kiuvetėje 50 μl tiriamojo etanolinio ekstrakto sumaišant su 2 ml M DPPH tirpalo. Tuščias bandinys ruošiamas vietoj tiriamojo etanolinio ekstrakto, naudojant 50 μl 70 proc. (V/V) etanolio išgryninto vandens mišinį ir sumaišant su 2 ml M DPPH tirpalo. Gautų bandinių absorbcijos dydžio mažėjimas matuojamas spektrofotometru, kai šviesos bangos ilgis 515 nm, kol pasiekiama absorbcijos pusiausvyra (po 30min). Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas 70 % (V/V) etanolis. Antiradikalinis ekstraktų aktyvumas išreiškiamas sujungto DPPH procentais ir apskaičiuojamas pagal formulę: DPPH sujungimas = [ Ab Aa ] 100% Ab Aa tiriamojo ekstrakto bandinio absorbcijos dydis (po 30 min). Ab tuščio bandinio absorbcijos dydis (t = 0 min) Antioksidantinio aktyvumo įvertinimas naudojant ABTS + radikalų sujungimo metodą Antiradikalinio aktyvumo nustatymui žaliavų ekstraktuose taikomas ABTS + (2,2 -azinobis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfono rūgšties) radikalo sujungimo metodas. Motininio tirpalo gamyba: reagentas gaminamas atsveriant 0,0548 g (tikslus svėrinys) ABTS miltelių ir ištirpinamas 50 ml išgryninto vandens. Gautas motininis tirpalas aktyvuojamas 70 mm kalio persulfato tirpalu ir laikomas tamsaus stiklo buteliuke. Sumaišoma ir paliekama stovėti tamsioje vietoje val. Pasiekus reakcijos pusiausvyrą, ruošiamas darbinis ABTS + tirpalas: skiedžiamas motininis tirpalas išgrynintu vandeniu, kol 734 nm šviesos bangos ilgyje bus pasieka tiksli tirpalo absorbcija 0,800 ± 0,03. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas išgrynintas vanduo. Tiriamieji bandiniai ruošiami į 3 ml darbinio ABTS + tirpalo įpylus 30 μl S. palustris etanolinio ekstrakto ir gerai sumaišoma. Iš kiekvieno ekstrakto gaminama po 2 bandinius, kurie paliekami stovėti 1 h kambario temperatūroje. Praėjus šiam laikui, tiriamųjų tirpalų optinis tankis matuojamas spektrofotometru, kai šviesos bangos ilgis 734 nm.

27 27 Antiradikalinis S. palustris. ekstraktų aktyvumas išreiškiamas trolokso ekvivalentais (TE) 1 gramui žaliavos, pagal kalibracinę kreivę ir formulę (3 pav.): TE(ABTS)= c V m c trolokso koncentracija pagal kalibracinę kreivę (μmol/l); V paruošto ekstrakto tūris (ml); m atsvertas žaliavos kiekis (g). 3 pav. Trolokso kalibracinė kreivė ABTS radikalų katijonų sujungimo metodu. (n = 2) Redukcinio aktyvumo įvertinimas FRAP metodu Redukciniam S. palustris. etanolinių ekstraktų aktyvumui nustatyti naudotas FRAP metodas. Darbinis FRAP tirpalas, paruošiamas sumaišant 10 dalių 300 mm acetatinio buferio (ph = 3,6), 1 dalį 10 mm TPTZ tirpalo ir 1 dalį 20 mm geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalo. Analizei imama 3 ml darbinio FRAP reagento, į kurį pridedama 20 μl tiriamojo Stachys palustris etanolinio ekstrakto. Gerai sumaišoma. Paruošti mėginiai paliekami stovėti 1 val. tamsioje vietoje, kambario temperatūroje. Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 3 ml darbinio FRAP reagento įdedant 20 μl 70 % (V/V) etanolio. Tiriamojo tirpalo absorbcija matuojama esant 593 nm šviesos bangos ilgiui. Redukcinis aktyvumas išreiškiamas trolokso ekvivalentais (TE) 1 gramui žaliavos, kuris apskaičiuojamas remiantis kalibracine kreive (4 pav.) ir formule:

28 28 c V TE(FRAP)= m c trolokso koncentracija iš kalibracinės kreivės (μmol/l); V paruošto ekstrakto tūris (ml); m atsvertas žaliavos kiekis (g). 4 pav. Trolokso kalibracinė kreivė FRAP redukcinės galios vertinimo metodu. (n = 3) 2.6. Duomenų analizė Gautų duomenų statistinei analizei ir grafikų sudarymui buvo naudojama MS Office 365 Excel (Microsoft, JAV) programa. Visi eksperimentiniai tyrimai buvo atliekami su dviem tos pačios žaliavos bandiniais, kurių kiekvienas buvo matuojamas bent po 2 kartus (iš viso 4 matavimai). Iš gautų duomenų buvo vedamas aritmetinis vidurkis bei apskaičiuota rezultatų standartinė paklaida. Tiesinės regresijos modelio tinkamumui apskaičiuotas determinacijos koeficientas R 2. Parinktas reikšmingumo lygmuo 0,05, todėl rezultatai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p < 0,05. Koreliacinių ryšių įvertinimas buvo atliktas vadovaujantis Pirsono tiesinės koreliacijos koeficientu.

29 29 3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS 3.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas Atliekant tyrimus su augalinėmis žaliavomis, siekiama išekstrahuoti kuo didesnius tiriamųjų junginių kiekius. Fenolio junginių ekstrahavimui iš augalinių žaliavų įtakos turi keli veiksniai, tokie kaip jų cheminis pobūdis, naudojamas ekstrahavimo metodas, dalelių dydis, trukmė ir laikymo sąlygos bei šalutinių medžiagų buvimas [18]. Todėl reikia eksperimentiškai parinkti tinkamas ekstrakcijos sąlygas, tokias kaip ekstrakcijos trukmė, temperatūra, parinkti tinkamą tirpiklį ar jo mišinį. Parinkus tinkamas ekstrakcijos sąlygas, gaunami ekstraktai turintys didžiausius fenolinių junginių kiekius ir pasižymintys didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu. Remiantis moksline literatūra, daugiausiai biologiškai aktyvių junginių išekstrahuojama naudojant tokius tirpiklius kaip metanolį, dichlormetaną, acetoną [17]. Dažnai ekstrahavimo metodams reikia naudoti organinius tirpiklius, kurie yra brangūs, pavojingi aplinkai ir reikalauja brangių šalinimo procedūrų [29]. Todėl šiame tyrime kaip ekstrahavimo tirpiklis buvo pasirinktas etanolis, kuris yra ne tik geras tirpiklis bet taip pat yra pripažintas saugiu naudoti eksperimentiniams tyrimams [17,29,60]. Tinkamiausios ekstrakcijos sąlygos S. palustris žaliavoms buvo optimizuotos įvertinus ekstrahento poliškumą, ekstrakcijos trukmę bei parinkus temperatūrinį rėžimą. Ekstraktai buvo gaminami iš antžeminių pelkinių notrų (S. palustris) žaliavų (lapų, stiebų, žiedų), kurios buvo surinktos masinio žydėjimo metu Šilėnų k. augavietėje Ekstrahento poliškumo įvertinimas Norint nustatyti, tirpiklio poliškumo įtaką biologiškai aktyvių medžiagų išeigai, buvo pagaminti 40 %, 50 %, 60 %, 70 % ir 80 % etanolinio ir išgryninto vandens mišiniai. Šio tyrimo metu buvo taikomas paprastosios maceracijos metodas. Ant 0,050 g žaliavos (tikslaus svėrinio) buvo užpilama po 10 ml atitinkamos koncentracijos etanolio ir išgryninto vandens mišinio. Su kiekvienos koncentracijos tirpikliu buvo ekstrahuota po 2 mėginius. Mėginiai buvo purtomi 60 min. automatinėje purtyklėje, paskui laikomi tamsaus stiklo taroje, tamsioje vietoje 24 val. Po šio laikotarpio mėginiai pakartotinai buvo purtomi automatinėje purtyklėje 60 min. ir filtruojami per popierinį filtrą į tamsaus stiklo buteliukus. Biologiškai aktyvių medžiagų išeigos nustatymui buvo naudojamas Folin-Ciocalteu metodas. Gauti rezultatai pateikiami 5 pav. ir išreikšti galo rūgšties ekvivalentais.

30 GRE, mg/g % 50% 60% 70% 80% Etanolio koncentracija (V/V), proc. 5 pav. Ekstrahento poliškumo įvertinimas S. palustris antžeminės dalies bandiniuose paprastosios maceracijos metodu. GRE galo rūgšties ekvivalentai. (n=2) Iš 5 pav. matyti, kad temperatūrinis rėžimas turi didelę įtaką tiriamų junginių išeigai. Nustatyta, kad didžiausias fenolinių junginių kiekis, išekstrahuotas iš pelkinių notrų žaliavų, kai etanolio ir išgryninto vandens koncentracija yra 70 %. Iš to matyti, kad išekstrahuoti fenolinių junginių kiekiai didėjo, didėjant etanolio koncentracijai iki 70 % V/V, o pasiekus 80 % V/V - sumažėjo. Taip pat mokslininkų nustatyta, kad naudojant % V/V etanolinius mišinius gaunamas didžiausias kiekis ekstrahuojamų medžiagų [30]. Atsižvelgus į gautus tyrimo rezultatus ir mokslininkų išvadas, buvo pasirinkta kaip ekstrahentą naudoti 70 % etanolio ir išgryninto vandens mišinį tolimesniems pelkinių notrų žaliavų tyrimams Ekstrakcijos ultragarsu trukmės parinkimas Ekstrakcijos efektyvumui padidinti buvo naudojamas ultragarsas. Antžeminės S. palustris augalų dalys buvo veikiamos ultragarsu 5, 10, 15 ir 20 min., esant 30 C ± 5 C temperatūrai. Fenolinių junginių kiekio nustatymui buvo taikytas Folin-Ciocalteu metodas. Gauti rezultatai pateikiami 6 pav.

31 GRE, mg/g min 10 min 15 min 20 min Trukmė, min. 6 pav. Ultragarso įtaka fenolinių junginių kiekiui S. palustris antžeminės dalies bandiniuose, kai ekstrahentas 70% (V/V) etanolis. GRE galo rūgšties ekvivalentai. (n=2) Didžiausia fenolinių junginių išeiga pasiekta vykdant ekstrakciją ultragarsu 15 min. (75,22 mg/g). Nors po 5 min išeiga buvo mažesnė palyginus su maceracijos metodu, tačiau ilgėjant ekspozicijos trukmei išeiga didėjo. Nustatyta, kad fenolinių junginių išeiga didėjo S. palustris ekstraktus veikiant ultragarsu iki 15 minučių, o veikiant žaliavas ultragarsu ilgiau nei 15 minučių, fenolinių junginių kiekis sumažėjo. Bandinius veikiant ultragarsu 15 min., nustatyti didesni fenolinių junginių kiekiai (73,22 mg/g) nei paprastąja maceracija (68,95 mg/g). Atsižvelgiant į gaunamą didesnę išeigą ir mažesnį laiką, tolimesnei bandinių gamybai pasirinktas ekstrakcijos ultragarsu metodas Ekstrakcijos ultragarsu temperatūros nustatymas Siekiant nustatyti didžiausius fenolinių junginių kiekius atsižvelgiant į ultragarso vonelės temperatūrą, etanoliniai pelkinių notrų bandiniai buvo ekstrahuojami ankščiau tyrimais pagrįstomis sąlygomis: tirpiklis 70 % (V/V) etanolio ir išgryninto vandens mišinys ir veikiami ultragarsu 15 min ultragarso vonelėje. Bandiniai buvo ekstrahuojami esant šioms temperatūroms: 30, 40, 50, 60 ir 70 ± 5 C temperatūroje. Gauti rezultatai pavaizduoti 7 pav.

32 GRE, mg/g Temperatūra, C 7 pav. Ekstrakcijos ultragarsu temperatūros įtaka S. palustris antžeminės dalies mėginiuose. Ekstrahentas 70% (V/V) etanolis, ekstrakcijos trukmė - 15 min. GRE galo rūgšties ekvivalentai. (n=2) Rezultatai parodė, kad ne tik ekstrahavimo trukmė, bet ir temperatūrinis rėžimas daro didelę įtaką fenolinių junginių išeigai. Iš grafiko matyti, kad didžiausia fenolinių junginių išeiga buvo pasiekta, kai temperatūra siekė 40 ± 5 C. Taip gali būti todėl, kad šiluma padidina fenolinių junginių ekstrahavimosi efektyvumą. Esant aukštesnei temperatūrai, padidėja fenolinių junginių tirpumas, difuzijos greitis taip pat sumažėja tirpiklio klampumas ir paviršiaus įtemptis [19]. Bandinių išeiga didėjo, didėjant temperatūrai iki 40 ± 5 C, o prie dar aukštesnės temperatūros išekstrahuotų fenolinių junginių kiekiai ėmė mažėti. Prie 70 ± 5 C fenolinių junginių išeiga buvo mažiausia, tai galėjo lemti fenolinių junginių savybė degraduoti esant aukštai temperatūrai. Be to esant aukštai temperatūrai gali padidėti tirpiklio nuostoliai dėl garavimo ir taip padidinti ekstrahavimo sąnaudas [19]. Atsižvelgiant į tai, tolimesniems S. palustris žaliavų tyrimams buvo pasirinkta naudoti 40 ± 5 C prie kurios fenoliniai junginiai buvo išekstrahuoti didžiausiais kiekiais Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas S. palustris žaliavose Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymui S. palustris augalinėse žaliavose buvo taikytas spektrofotometrinis Folin-Ciocalteu metodas. Bendrieji fenolinių junginių kiekiai buvo nustatyti antžeminėse S. palustris dalyse skirtingais augalo vegetacijos etapais 2019 m. ir 2020 m. rinktuose žaliavose. Gauti rezultatai pateikiami 8 pav.

33 GRE, mg/g GRE, mg/g m m Radviliškio raj Panevėžys Pasvalio raj Masinis augimas Butonizacija Žydėjimas Sėklų branda Radviliškio raj Panevėžys Pasvalys Meldiškiai Masinis augimas Butonizacija Žydėjimas Sėklų branda 8 pav. Bendrojo fenolinių junginių kiekio kitimas S. palustris antžeminės dalies bandiniuose skirtingomis vegetacijos fazėmis. GRE galo rūgšties ekvivalentai. (n=2) Bendrojo fenolinių junginių kiekio kitimo dėsningumas buvo panašus abiem tirtais metais. Nustatyta, kad tiek 2019 m., tiek 2020 m., rinktose augalinėse S. palustris antžeminėse dalyse, daugiausiai fenolinių junginių buvo sukaupta masinio augimo ir butonizacijos etapais, o mažiausiai sėklų brandinimo fazėje. Didžiausi fenolinių junginių kiekiai nustatyti masinio augimo fazėje - vidutiniškai 65,97 mg/g ±13,70 mg/g. Panašūs duomenys gauti ir butonizacijos fazėje; vidutiniškai šių biologiškai aktyvių medžiagų nustatyta 63,72 mg/g ± 13,65 mg/g. Žydėjimo fazėje vidutiniškai fenolinių junginių buvo sukaupta 58,66 mg/g ± 11,51 mg/g. Vidutiniškai mažiausias fenolinių junginių kiekis buvo nustatytas sėklų brandinimo fazėje t.y. 48,51 mg/g ± 13,42 mg/g. Siekiant išsiaiškinti, kaip fenolinių junginių kiekis pasiskirsto skirtingose augalo antžeminėse dalyse bei kaip šių junginių kiekiai įvairuoja tarp skirtingų Lietuvos regionų, buvo atliktas tyrimas atskirai tiriant žiedus, lapus ir stiebus iš 21 skirtingos augavietės 2019 m. ir iš 8 skirtingų augaviečių 2020 m. (9 pav.). Nustatytas fenolinių junginių kiekis atskirose pelkinių notrų morfologinėse dalyse suriktuose žaliavose įvairavo labai plačiose ribose nuo 18,77 mg/g iki 110,74 mg/g. Iš grafiko matyti, kad didžiausią fenolinių junginių kiekį tiek 2019 m. tiek 2020 m. sukaupia lapai, o mažiausią stiebai. Tiriamuoju laikotarpiu surinktų lapų žaliavos vidutiniškai sukaupė mg/g ± 17,97 mg/g tiriamųjų junginių. Bendras fenolinių junginių amplitudė lapų bandiniuose įvairavo tarp 42,57 mg/g iki 110,73 mg/g. Didžiausi fenolinių junginių kiekiai lapų bandiniuose nustatyti Alėjų, Ukmergės, Šilalės ir Zarasų augaviečių bandiniuose atitinkamai 42,05 %, 38,46 %, 32,61 %, 29,98 % daugiau už aritmetinį vidurkį. Mažiausi šių BAM kiekiai rasti Kėdainių augaviečių rinktoje žaliavoje 83,11 % mažiau už apskaičiuotą aritmetinį vidurkį.

34 Plungė Vilniaus raj. Tauragė Kelmė Kėdainių raj. Panevėžys Alytus Kelmės raj. Ukmergė Utena Alėjai Kretingos raj. Šilalė Telšių raj. Zarasai Pasvalio raj. Radviliškio raj. Kaunas Anykščių raj. Jurbarko raj. Šiaulių raj. Telšiai* Petrašiūnai* Kužiai* Šilėnai* Radviliškis* Panevėžys* Pasvalys* Meldiškiai* GRE, mg/g Stiebai Žiedai Lapai 9 pav. Bendrojo fenolinių junginių kiekio kitimas gamtinėse cenopopuliacijose rinktuose S. palustris L. lapų, žiedų ir stiebų bandiniuose surinktuose m. GRE galo rūgšties ekvivalentai. (n=2) * - žaliavos iš pažymėtų augaviečių buvo rinktos 2020 m. Žieduose šių BAM ribos kito nuo 18,77 iki 69,68 mg/g/. Vidutiniškai augalai savo žieduose sukaupė 47,54 mg/g ± 16,38 mg/g fenolinių junginių. Didžiausi fenolinių junginių kiekiai žiedų bandiniuose nustatyti iš Ukmergės ir Zarasų augaviečių rinktų augalų (atitinkamai 95,58 % ir 77,00 % daugiau už aritmetinį vidurkį), o mažiausi iš Pasvalio augaviečių (beveik du kartus mažiau už aritmetinį vidurkį). S. palustris stiebų bandiniuose vidutinis fenolinių junginių kiekis buvo mažiausias. Vidutiniškai stiebuose nustatyta 29,91 mg/g ± 10,7 mg/g fenolinių junginių, net 2,6 karto mažiau nei lapų žaliavose. Didžiausi šių medžiagų kiekiai stiebų mėginiuose rasti Ukmergės augavietėje net du kartus daugiau už aritmetinį vidurkį. Gauti rezultatai palyginti su tyrimu, kuriame buvo nustatytas bendrasis fenolinių junginių kiekis S. palustris antžeminių dalių bandiniuose iš Vengrijos ir Prancūzijos 96 % etanoliniuose ekstraktuose spektrofotometriniu metodu, panaudojant Folin-Ciocalteu reagentą. Gauti rezultatai parodė, kad vidutinis bendrasis fenolinių junginių kiekis mėginių iš Prancūzijos siekė 249,84 ± 1,85 mg/g, o iš Vengrijos 176,26 ± 1,38 mg/g [24]. Lietuvoje rinktose S. palustris žaliavose sukaupiami mažesni fenolinių junginių kiekiai, tačiau ir šuo atveju, jie buvo didesni palyginus su S. officinalis [27]. Nustatyta, kad fenolinių junginių kiekis vaistinių notrų (S. officinalis L.) augaluose, kurie buvo surinkti iš 13 skirtingų Lietuvos cenopopuliacijų, kinta nuo 5,35 ± 0,24 mg/g iki 29,30 ± 0,91 mg/g.

35 Fenolio rūgščių kiekis, mg/g Fenolio rūgščių kiekis, mg/g 35 Didžiausi fenolinių junginių kiekiai nustatyti lapų žaliavų bandiniuose, o mažiausi stiebų mėginiuose [25]. Mūsų atliktų tyrimų tendencijos panašios, tačiau S. palustris žaliavose nustatyti didesni fenolinių junginių kiekiai, kurie taip pat kito platesnėse ribose. Tokius didelius fenolinių junginių kiekius esančius S. palustris žaliavoje galimai lėmė feniletanoidinių glikozidų ir izoskutelareino darinių gausa [24]. Apibendrinant galima teigti, daugiausiai fenolinių junginių augalai sukaupia vegetacijos pradžioje, o mažiausiai - vegetacijos pabaigoje t.y. sėklų brandinimo fazėje. Lietuvos gamtinėse cenopopuliacijose augančios pelkinės notros daugiausiai fenolinių junginių sukaupia lapuose, o mažiausiai stiebuose. Palyginus gautus duomenis iš skirtingų augaviečių, galima teigti, kad daugiausia fenolinių junginių nustatyta iš Ukmergės ir Alėjų augaviečių surinktų žaliavų, o mažiausiai iš Kėdainių. žaliavose 3.3. Bendrojo fenolio rūgščių kiekio nustatymas Stachys palustris L. Bendrojo fenolio rūgščių kiekiui nustatyti buvo panaudotas spektrofotometrijos metodas naudojant Arnow reagentą. Gauti tyrimo rezultatai skirtingomis S. palustris vegetacijos fazėmis išreikšti chlorogeno rūgštimi ir pateikiami grafike (10 pav.) 2019 m Radviliškio raj Panevėžys Pasvalio raj Masinis augimas Butonizacija Žydėjimas Sėklų branda m. Radviliškio raj Panevėžys Pasvalys Meldiškiai Masinis augimas Butonizacija Žydėjimas Sėklų branda 10 pav. Bendrojo fenolio rūgščių kiekio kitimas S. palustris antžeminės dalies bandiniuose skirtingomis vegetacijos fazėmis. GRE galo rūgšties ekvivalentai. (n=2)

36 Plungė Vilniaus raj. Tauragė Kelmė Kėdainių raj. Panevėžys Alytus Kelmės raj. Ukmergė Utena Alėjai Kretingos raj. Šilalė Telšių raj. Zarasai Pasvalio raj. Radviliškio raj. Kaunas Anykščių raj. Jurbarko raj. Šiaulių raj. Telšiai* Petrašiūnai* Kužiai* Šilėnai* Radviliškis* Panevėžys* Pasvalys* Meldiškiai* Fenolio rūgščių kiekis, mg/g 36 Tiek 2019 m., tiek 2020 m. rinktose antžeminės dalies žaliavose daugiausia fenolio rūgščių nustatyta masinio augimo ir butonizacijos periodais, o mažiausiai sėklų brandinimo fazėje. Tiriamuoju laikotarpiu masinio augimo tarpsniu vidutiniškai buvo nustatyta 55,93 mg/g ± 9,76 mg/g fenolio rūgščių. Panašūs rezultatai gauti ir butonizacijos fazėmis 52,86 mg/g ± 9,78 mg/g fenolio rūgščių. Mažiausias vidutiniškas fenolio rūgščių kiekis nustatytas sėklų brandinimo fazėje t.y. 32,23 mg/g ± 12,29 mg/g. Žydėjimo tarpsniu nustatyta, kad fenolio rūgščių kiekis vidutiniškai siekė 45,13 mg/g ± 11,94 mg/g. Matyti, kad fenologinio kintamumo tendencijos buvo panašios abiem tirtais metais. Kaip fenolio rūgščių kiekis pasiskirsto skirtingose augalo morfologinėse dalyse bei kaip šių junginių kiekiai įvairuoja skirtingose Lietuvos gamtinėse augavietėse pavaizduoti 11 pav Stiebai Žiedai Lapai 11 pav. Bendrojo fenolio rūgščių kiekio kitimas S. palustris L. bandiniuose, surinktuose iš gamtinių cenopopuliacijų skirtingose augalo morfologinėse dalyse (n=2) * - žaliavos iš pažymėtų augaviečių buvo rinktos 2020 m. Iš grafiko matyti, daugiausia fenolio rūgščių nustatyta lapuose, o mažiausi kiekiai nustatyti stiebų bandiniuose. Šių BAM kiekių amplitudė varijuoja labai plačiuose ribose: nuo 5,58 mg/g iki 88,59 mg/g. Nustatyta, kad didžiausi fenolio rūgščių kiekiai nustatyti lapų žaliavose. BAM kiekis lapų bandiniuose įvairavo nuo 31,91 mg/g iki 88,59 mg/g. Vidutinis fenolio rūgščių kiekis lapų bandiniuose buvo 57,93 mg/g ± 14,14 mg/g. Labiausiai išsiskyrė iš Alėjų ir Ukmergės augaviečių surinktų lapų žaliavos, kuriose atitinkamai nustatyta 52,92 % ir 44,76 % daugiau fenolio rūgščių už apskaičiuotą aritmetinį vidurkį. Mažiausiai šių biologiškai aktyvių medžiagų nustatyta iš Plungės, Pasvalio,

37 37 Kėdainių augaviečių surinktų lapų žaliavų atitinkamai 81,54 %, 73,13 %, 62,9 % mažiau už aritmetinį vidurkį. Žiedų bandiniuose fenolio rūgščių kiekių amplitudė įvairavo nuo 11,72 mg/g iki 36,34 mg/g. Vidutiniškai augalas tiriamuoju laikotarpiu žieduose sukaupė 31,42 mg/g ± 13,17 mg/g fenolio rūgščių. Alėjų k. augavietėje surinktų žiedų žaliavoje fenolio rūgščių buvo sukaupta du kartus daugiau nei už aritmetini vidurkį. Kiek mažesni fenolio rūgščių kiekiai nustatyti iš Ukmergės, Radviliškio ir Meldiškių augaviečių surinktų žiedų žaliavose atitinkamai 64,76 %, 56,20 %, ir 53,15 % daugiau už aritmetinį vidurkį. Mažiausi šių BAM kiekiai žieduose nustatyti Šiaulių augavietėje - tris kartus mažiau už aritmetinį vidurkį, o Plungės ir Kretingos augavietėse surinktose žaliavose beveik du kartus mažiau už aritmetinį vidurkį. Mažiausi fenolio rūgščių kiekio kitimai tarp gamtinių S. palustris cenopopuliacijų nustatyti stiebų bandiniuose. Aritmetinis stiebų bandinių vidurkis 15,02 mg/g ± 5,76 mg/g. Didžiausias fenolio rūgščių kiekis stiebų bandiniuose nustatytas iš Kauno ir Alėjų augavietėse rinktose žaliavose beveik du kartus daugiau už apskaičiuotą aritmetinį stiebų vidurkį. Gauti rezultatai palyginti su kitomis mokslinėmis publikacijomis. Buvo tiriami S. palustris polifenolių sudedamųjų dalių kiekiai, kaip ekstrahentą naudojant alkoholinius tirpiklius, o gauti rezultatai buvo išreikšti procentais. Nustatyta, jog S. palustris vidutiniškai sukaupia apie 6.37 ± 0.22 % fenolio rūgščių. Taip pat nustatyta, kad šių biologiškai aktyvių medžiagų koncentracija didžiausia S. palustris (6.37 ± 0.22 %) ir S. recta (5.76 ± 0.46 %) rūšyse, o mažiausia S. alpina (2.01 ± 0.04 %). S. officinalis nustatyta beveik 2,4 karto (2.67 ± 0.08 %) mažiau šių biologiškai aktyvių medžiagų nei pelkinės notros tyrimų žaliavose [27]. Kitas tyrimas buvo atliktas 2018 m. Lietuvoje su vaistinių notrų (S. officinalis L.) skirtingomis morfologinėmis dalimis. Kaip ir mūsų tyrime nustatyta, kad didžiausias bendrasis fenolio rūgščių kiekis aptiktas lapų žaliavose, o mažiausias stiebų žaliavose. Lapuose šių junginių vidutiniškai nustatyta apie 196,08 ± 9,8 mg/g, o žieduose 107,43 ± 5,37 mg/g [25]. Nors mūsų atlikto tyrimo metu pelkinių notrų žaliavose identifikuotas mažesnis fenolio rūgščių kiekis, tačiau dinamika buvo panaši. Taigi, išanalizavus gautus duomenis, galima padaryti išvadą, kad didžiausiais kiekiais fenolio rūgščių pasižymi S. palustris žaliavos lapai, o mažiausi kiekiai nustatyti stiebuose. Gamtinėse cenopopuliacijose gamtoje augančios pelkinės notros sukaupia didžiausius fenolio rūgščių kiekius iš Alėjų ir Ukmergės lokacijų rinktose žaliavose. Daugiausiai šių biologiškai aktyvių medžiagų augalas sukaupia vegetacijos pradžioje masinio augimo ir butonizacijos tarpsniais, o mažiausiai sėklų brandinimo fazėje.

38 RE, mg/g RE, mg/g Bendro flavonoidų kiekio nustatymas S. palustris žaliavose Bendrajam flavonoidų kiekiui įvertinti pelkinių notrų žaliavose naudotas spektrofotometrinis metodas, kuriame augaliniai žaliavos ekstraktai buvo veikiami metenamino ir aliuminio chlorido tirpalais, parūgštintoje terpėje. Kaip flavonoidų koncentracija įvairuoja skirtingomis augalo vegetacijos fazėmis pavaizduota 12 pav m m Radviliškio raj Panevėžys Pasvalio raj Masinis augimas Butonizacija Žydėjimas Sėklų branda Radviliškio raj Panevėžys Pasvalys Meldiškiai Masinis augimas Butonizacija Žydėjimas Sėklų branda 12 pav. Bendrojo flavonoidų kiekio kitimas S. palustris antžeminės dalies bandiniuose skirtingomis vegetacijos tarpsniais. RE - rutino ekvivalentai. (n=2) Fenologinio kintamumo tendencijos buvo panašios abiem tirtais metais. Iš grafiko matyti, kad tiek 2019 m., tiek 2020 m. didžiausia bendro flavonoidų kiekio koncentracija antžeminės dalies mėginiuose nustatyta masinio augimo ir butonizacijos tarpsniais, o mažiausia sėklų brandoje. Vidutiniškai daugiausiai flavonoidų tiriamuoju laikotarpiu nustatyta butonizacijos fazėje rinktose antžeminių dalių žaliavose (vid. 34,04 mg/g ± 6,63 mg/g). Kiek mažesni kiekiai nustatyti ir masinio augimo tarpsnyje vidutiniškai 30,79 mg/g ± 5,55 mg/g. Žydėjimo fazėje nustatyta, kad tiriamuoju laikotarpiu vidutiniškai buvo sukaupta 26,42 mg/g ± 6,87 mg/g tiriamųjų junginių. Mažiausia bendroji flavonoidų koncentracija, abejais žaliavos rinkimo metais, buvo gauta augalo vegetacijos pabaigoje sėklų brandinimo fazėje. Nustatyta, kad šioje fazėje tiriamasis augalas vidutiniškai sukaupia 18,73 mg/g ± 4,86 mg/g flavonoidų. Taip pat buvo atliktas tyrimas su skirtingomis augalo morfologinėmis dalių žaliavomis, kurios buvo surinktos iš skirtingų Lietuvos augaviečių. Gauti rezultatai pateikti 13 pav.

39 Plungė Vilniaus raj. Tauragė Kelmė Kėdainių raj. Panevėžys Alytus Kelmės raj. Ukmergė Utena Alėjai Kretingos raj. Šilalė Telšių raj. Zarasai Pasvalio raj. Radviliškio raj. Kaunas Anykščių raj. Jurbarko raj. Šiaulių raj. Telšiai* Petrašiūnai* Kužiai* Šilėnai* Radviliškis* Panevėžys* Pasvalys* Meldiškiai* RE, mg/g Stiebai Žiedai Lapai 13 pav. Bendrojo flavonoidų kiekio kitimas S. palustris L. gamtinėse cenopopuliacijose surinktuose lapų, žiedų ir stiebų bandiniuose. RE - rutino ekvivalentai. (n=2) * - žaliavos iš pažymėtų augaviečių buvo rinktos 2020 m. Iš grafiko matyti, kad didžiausia flavonoidų koncentracija nustatyta augalo lapuose, o mažiausias šių biologiškai aktyvių medžiagų kiekis nustatytas stiebuose. Flavonoidų kiekis atskirose pelkinių notrų morfologinėse augalo dalyse įvairavo plačiose ribose nuo 5,69 mg/g iki 66,71 mg/g. Tiriamuoju laikotarpiu surinktuose žaliavose didžiausias bendrojo flavonoidų kiekis nustatytas lapų žaliavos bandiniuose. Vidutiniškai pelkinės notros lapuose sukaupė 43,58 mg/g ± 12,41 mg/g tiriamųjų junginių. Šių biologiškai aktyvių medžiagų kiekis lapų bandiniuose kito plačiausiose ribose t.y. nuo 20,39 mg/g iki 66,71 mg/g. Didžiausia flavonoidų koncentracija nustatyta Kretingos augavietėje surinktų lapų žaliavose 53,07 % daugiau už aritmetinį vidurkį. Pakankamai dideli kiekiai lapuose nustatyti ir žaliavose, surinktuose iš Plungės, Kelmės, Ukmergės, Šiaulių ir Šilėnų augaviečių, - atitinkamai 31,43 %, 31,57 %, 35,97 %, 32,83 % ir 43,58 % daugiau už aritmetinį vidurkį. Mažiausias flavonoidų kiekis lapų bandiniuose nustatytas Pasvalio ir Kėdainių rajono augavietėse 20,39 mg/g ir 22,3 mg/g du kartus mažiau už aritmetinį vidurkį. Žiedų bandiniuose flavonoidų kiekis kito taip pat gana plačiose ribose nuo 11,81 mg/g iki 57,71 mg/g. Vidutinis žiedų bandinių aritmetinis vidurkis tiriamuoju laikotarpiu siekė 29,19 mg/g ± 10,8 mg/g. Didžiausias flavonoidų kiekis žiedų bandiniuose nustatytas iš Kretingos augavietės, kuris buvo net du kartus didesnis už aritmetinį vidurkį. Mažiausias flavonoidų kiekis nustatytas žiedų bandiniuose, kurie buvo surinkti iš Tauragės ir Pasvalio augaviečių 12,87 mg/g ir 11,81 mg/g

40 40 beveik du kartus mažiau už aritmetinį vidurkį. Taip pat pakankamai maži kiekiai nustatyti iš Vilniaus, Kėdainių ir Telšių augaviečių atitinkamai 83,35 %, 75,52 % ir 69,9 % mažiau už aritmetinį vidurkį. Vidutiniškai stiebuose nustatyta 15,08 mg/g ± 5,6 mg/g flavonoidų. Didžiausias bendras flavonoidų kiekis stiebuose nustatytas Alėjų k. augavietės bandinyje, kuris buvo net du kartus didesnis už aritmetinį vidurkį. Rezultatai palyginti su mokslinėmis publikacijomis. Kroatijos ir Austrijos mokslininkai atliko tyrimą su 7 Stachys rūšimis (S. alpina, S. officinalis, S. palustris, S. recta subsp. Recta, S. recta subsp. Subcrenata, S. salviifolia ir S. sylvatica) siekiant įvertinti polifenolių sudedamųjų dalių kiekius. Kaip ekstrahentas naudoti alkoholiniai tirpikliai, o gauti rezultatai išreikšti procentais. Nustatyta, jog S. palustris vidutiniškai bendrai sukaupia apie 0.28 ± 0.01 % flavonoidų. Taip pat nustatyta, kad šių biologiškai aktyvių medžiagų koncentracija didžiausia S. palustris (0.28 ± 0.01%), Stachys alpina (0.30 ± 0.01%) ir Stachys sylvatica (0.29 ± 0.01%) rūšyse, o mažiausi Stachys salviifolia (0.13 ± 0.01%). Vaistinių notrų (S. officinalis L.) žaliavose flavonoidų nustatyta 0.15 ± 0.00 %, o tai yra beveik dvigubai mažiau nei pelkinių notrų (S. palustris) žaliavose nustatytas flavonoidų kiekis [27]. Mūsų atlikto tyrimo metu nustatyti ženkliai didesni flavonoidų kiekiai S. palustris žaliavose. Gauti rezultatai palyginti su Lietuvoje 2018 m. atliktu tyrimu, kuriame buvo tiriamos vaistinių notrų (S. officinalis L.) žaliavos. Kaip ir mūsų tyrime buvo nustatyta, kad vaistinės notros vidutiniškai daugiausiai flavonoidų sukaupia lapuose, o mažiausiai - stiebuose. Taip pat nustatyta, kad flavonoidų bendras aritmetinis vidurkis lapų žaliavose yra 18,55 ± 0,92 mg/g, o žieduose - 8,33 ± 0,42 mg/g [25]. Atsižvelgiant į rezultatus, galima daryti išvadą, kad pelkinės notros Lietuvos augavietėse sukaupia beveik dvigubai daugiau flavonoidų nei vaistinės notros, augančios Lietuvos cenopopuliacijose. Lietuvoje atliktų tyrimų dinamika sutampa su užsienyje atliktų tyrimų rezultatais. Apibendrinus gautus rezultatus galima teigti, kad daugiausiai BAM pelkinės notros sukaupia masinio augimo ir butonizacijos laikotarpiais, o mažiausiai - vegetacijos pabaigoje t.y. sėklų brandinimo fazėje. Lietuvos gamtinėse cenopopuliacijose augančios pelkinės notros daugiausiai fenolinių junginių, kaip ir kitų tirtų biologiškai aktyvių medžiagų, sukaupia lapuose, o mažiausiai stiebuose. Palyginus gautus duomenis iš skirtingų augaviečių, galima teigti, kad geriausia žaliavas rinkti iš Šilėnų ar Kretingos augaviečių dėl didesnio flavonoidų sukaupiamo kiekio.

41 Fe 2+ surišimas, % Fe 2+surišimas, % 3.5 Chelatinio aktyvumo nustatymas Fe 2+ jonų sujungimo metodu S. palustris ekstraktuose 41 Chelatinio aktyvumo įvairavimas skirtingų fazių surinktose pelkinių notrų ekstraktuose yra pateikiamas 14 pav. Rezultatai išreiškiami procentais, kurie nustatomi pagal dvivalentės geležies ir ferozino komplekso absorbcijos sumažėjimą m. Radviliškio raj Panevėžys Pasvalio raj m. Radviliškio raj Panevėžys Pasvalys Meldiškiai Masinis augimas Butonizacija Žydėjimas Sėklų branda Masinis augimas Butonizacija Žydėjimas Sėklų branda 14 pav. Fe 2+ jonų chelatinio aktyvumo įvertinimas S. palustris antžeminės dalies ekstraktuose skirtingomis vegetacijos fazėmis. (n=2) Fenologinio kintamumo tendencijos buvo panašios abiem tirtais metais. Iš pateikto grafiko matyti, kad didžiausia geležies (II) jonų sujungimo geba pasižymėjo ekstraktai paruošti iš S. palustris antžemines dalies žaliavų, surinktų masinio augimo ir butonizacijos tarpsniais. Mažiausiu aktyvumu pasižymėjo ekstraktai iš pelkinių notrų žaliavų, surinktų vegetacijos pabaigoje (sėklų brandoje). Vidutinis chelatinis aktyvumas pelkinių notrų ekstraktuose masinio augimo tarpsnyje siekė 25,19 % ± 2,39 %. Butonizacijos fazės metu pelkinių notrų ekstraktai gebėjo vidutiniškai chelatuoti 22,38 % ± 3,37 % geležies jonų. Vidutinis antioksidacinis aktyvumas žydėjimo fazėje siekė 17,28 % ± 3,1 %. Mažiausias chelatinis aktyvumas, kaip ir kitais metodais, nustatytas vegetacijos pabaigoje sėklų brandos tarpsniu, vidutiniškai 12,64 % ± 2,42 %. Chelatinio aktyvumo įvairavimas skirtingose augalo morfologinėse dalyse ir skirtingose Lietuvos gamtinėse cenopopuliacijose surinktų žaliavų ekstraktuose pateikiamas 15 pav.

42 Plungė Vilniaus raj. Tauragė Kelmė Kėdainių raj. Panevėžys Alytus Kelmės raj. Ukmergė Utena Alėjai Kretingos raj. Šilalė Telšių raj. Zarasai Pasvalio raj. Radviliškio raj. Kaunas Anykščių raj. Jurbarko raj. Šiaulių raj. Telšiai* Petrašiūnai* Kužiai* Šilėnai* Radviliškis* Panevėžys* Pasvalys* Meldiškiai* Fe 2+ surišimas, % Lapai Žiedai Stiebai 15 pav. Fe 2+ jonų sujungimo įvertinimas gamtinėse S. palustris cenopopuliacijose surinktuose lapų, žiedų ir stiebų ekstraktuose. (n=2) * - žaliavos iš pažymėtų augaviečių buvo rinktos 2020 m. Iš grafiko matyti, kad pelkinių notrų ekstraktų gebėjimas chelatuoti dvivalentės geležies jonus kito nuo 6,93 % iki 30,37 %. Didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo lapai, mažesniu žiedai, o mažiausiu stiebai. Apskaičiuotas vidutinis lapų chelatinis aktyvumas yra 27,01 % ± 3,19 %. Chelatinio aktyvumo amplitudė pelkinių notrų ekstraktuose svyravo nuo 18,8 % iki 30,37 %. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas lapų ekstraktų iš Alėjų augavietės pagaminto ekstrakto 12,43 % daugiau už aritmetinį vidurkį. Mažiausias chelatinis aktyvumas nustatytas lapų ekstraktuose iš Kretingos augaviečių 43,67 % mažiau už aritmetinį vidurkį. S. palustris žiedų bandiniai pasižymėjo vidutiniu 20,79 % ± 3,07 % chelatiniu aktyvumu, o amplitudė kito ribose nuo 12,15 % iki 24,1 %. Didžiausias gebėjimas chelatuoti geležies (II) jonus nustatytas žiedų ekstraktuose iš žaliavų, surinktų iš Alėjų, Petrašiūnų ir Radviliškio (2020 m.) augaviečių atitinkamai 15,92 %, 18,13 % ir 15,96 % daugiau už apskaičiuotą vidurkį. Silpniausias chelatinis aktyvumas nustatytas ekstraktų, pagamintų iš Utenos, Kretingos ir Šilalės augaviečių surinktų žiedų žaliavų atitinkamai 66,05 %, 35,7 % ir 71,11 % mažiau už apskaičiuotas vidutines reikšmes. Stiebų ekstraktuose iš pelkinių notrų žaliavų, nustatytas vidutinis 14,13 % ± 3,59 % gebėjimas chelatuoti geležies (II) jonus. Tuo tarpu efektyviausiai geležies jonus chelatavo ekstraktai, pagaminti iš Pasvalio r. (2020 m.) ir Kužių k. augavietėse surinktų žaliavų atitinkamai 35,31 % ir 35,35 % daugiau už aritmetinį stiebų vidurkį. Gauti rezultatai palyginti su 2018 m. Lietuvoje atliktais chelatinio aktyvumo nustatyto tyrimais taikant FIC metodą su vaistinių notrų (S. officinalis L.) etanoliniais (70 % V/V) ekstraktais,

43 43 paruoštais iš skirtingų morfologinių dalių. Tyrimo metu nustatyta, kad stipriausiu gebėjimu chelatuoti geležies (II) jonus pasižymi lapų ekstraktai vidutiniškai 49,97 ± 4,9 proc, o silpniausiu ekstraktų stiebai. Žiedų ekstraktų chelatinio aktyvumo bendras aritmetinis vidurkis - 30,86 % ± 3,92 % [25]. Nors gautų rezultatų dinamika panaši kaip ir S. palustris, tačiau S. officinalis pasižymi kiek stipresniu antiradikaliniu aktyvumu nei S. palustris. Duomenų apie S. palustris ekstraktų chelatines savybes rasti nepavyko, tačiau buvo atliktas tyrimas su Stachys eteriniais aliejais m. mokslininkai įvertino geležies (II) jonų chelatinį aktyvumą trijose Stachys rūšių eteriniuose aliejuose: S. inflata, S. lavandulifolia, S. byzantina. Tyrimams naudota dujų chromatografijos ir masių spektrometrijos analizė. Gauti tyrimai išreikšti mg/g, kuris S. inflata rūšyje siekė ± 0.23, S. lavandulifolia 36,21 ± 0.55, o S. byzantina ± Pasak mokslininkų, galima teigti, jog atlikus trijų populiarių Stachys rūšių eterinių aliejų palyginamąjį tyrimą, paaiškėjo, kad iš jų išgaunami eteriniai aliejai gali būti laikomi stiprių ir natūralių antioksidantų šaltiniu [46]. Apžvelgus rezultatus, galima teigti, kad pelkinių notrų ekstraktai stipriausiu antioksidaciniu poveikiu pasižymi vegetacijos pradžioje. Didžiausia geba chelatuoti geležies (II) jonus pasižymėjo pelkinių notrų lapų ekstraktai, o mažiausia stiebų ekstraktai. Stipriausiu antioksidaciniu poveikiu pasižymėjo ekstraktai, pagaminti iš Alėjų k. augavietės surinktų žaliavų, o silpniausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo iš Kretingos augaviečių surinktų žaliavų ekstraktai. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas sutinka su fitocheminių rodiklių sklaida Antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH laisvųjų radikalų sujungimo metodu pelkinių notrų (S. palustris) žaliavos ekstraktuose Norint nustatyti antioksidacinį aktyvumą S. palustris žaliavos ekstraktuose buvo taikytas DPPH radikalų sujungimo metodas. Šio metodo absorbcijos sumažėjimas yra atvirkščiai proporcingas oksidaciniam aktyvumui taip pat ir antioksidatorių kiekiui tiriamajame ekstrakte. Prieš tyrimą pirmiausiai buvo vykdoma metodo optimizacija naudojant ekstraktus, kurie buvo pagaminti iš toje pačioje augavietėje surinktų S. palustris augalo dalių. Ekstraktų ir laisvųjų DPPH radikalų mišinių absorbcijos pokyčiai buvo matuojami kas 60 s išviso 30 min esant 515 nm bangos ilgiui, kol buvo pasiekta dinaminė pusiausvyra. Tyrimas buvo atliekamas su S. palustris žaliavų ekstraktais, pagamintais iš Šilėnų k. augavietėse surinktų pelkinių notrų žaliavų.

44 DPPH surišimas, % DPPH surišimas, % 44 Tyrimų metu nustatyta, kad dinaminė pusiausvyra stiebų bandiniuose pasiekta po 26 min, žiedų bandiniuose 28 min, o lapų bandiniuose po 30 min. Po 30 min absorbcijos dydis kito nežymiai t.y. mažiau nei 1%, todėl tolimesnio tyrimo trukmei buvo pasirinkta - 30 min. Buvo atliktas tyrimas siekiant nustatyti, kokioje augalo augimo fazėje gebėjimas sujungti laisvuosius radikalus yra didžiausias, o gauti rezultatai pateikti 16 pav m m. 0 Radviliškio raj Panevėžys Pasvalio raj 0 Radviliškio raj Panevėžys Pasvalys Meldiškiai Masinis augimas Butonizacija Žydėjimas Sėklų branda Masinis augimas Butonizacija Žydėjimas Sėklų branda 16 pav. Gebėjimas sujungti DPPH radikalus proc. S. palustris antžeminės dalies bandiniuose skirtingomis vegetacijos fazėmis. (n=2) Kintamumo dėsningumas buvo panašus abiem tirtais metais. Vidutiniškai daugiausiai DPPH radikalų S. palustris antžeminės dalies žaliavos ekstraktai gebėjo sujungti masinio augimo ir butonizacijos periodais, o mažiausiai sėklų brandinimo fazėje. Masinio augimo fazėje surinktų žaliavų ekstraktai tiriamuoju laikotarpiu vidutiniškai gebėjo sujungti 79,00 % ± 7,43 % DPPH radikalų. Kiek mažesnis antioksidacinis ekstraktų aktyvumas nustatytas butonizacijos periodu vidutiniškai 74,61% ± 11,66 %. Žydėjimo metu antioksidacinis ekstraktų aktyvumas vidutiniškai siekė 64,01 % ± 9,48 %. Žaliavų, kurios buvo rinktos sėklų brandinimo periodu, ekstraktai gebėjo sujungti vidutiniškai tik 49,13 % ± 8,87 % DPPH radikalų. Taip pat buvo atliktas tyrimas su skirtingomis augalo dalimis, kurios buvo surinktos iš skirtingų Lietuvos augaviečių, siekiant įvertinti antioksidacinio aktyvumo įvairavimą tarp gamtoje augančių pelkinių notrų žaliavų. Gauti rezultatai pavaizduoti 17 pav.

45 Plungė Vilniaus raj. Tauragė Kelmė Kėdainių raj. Panevėžys Alytus Kelmės raj. Ukmergė Utena Alėjai Kretingos raj. Šilalė Telšių raj. Zarasai Pasvalio raj. Radviliškio raj. Kaunas Anykščių raj. Jurbarko raj. Šiaulių raj. Telšiai* Petrašiūnai* Kužiai* Šilėnai* Radviliškis* Panevėžys* Pasvalys* Meldiškiai* DPPH surišimas, % ,00% 90,00% 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% Lapai Žiedai Stiebai 17 pav. Antiradikalinio aktyvumo įvertinimas DPPH radikalų sujungimo metodu S. palustris ekstraktuose skirtingose cenopopuliacijose. (n=2) * - žaliavos iš pažymėtų augaviečių buvo rinktos 2020 m. Iš pateikto grafiko matyti, kad didžiausiu antiradikaliniu aktyvumu pasižymėjo lapų ekstraktai iš pelkinių notrų žaliavų, kiek mažesniu žiedų, o mažiausiu stiebų ekstraktai. Antiradikalinis aktyvumas DPPH radikalų sujungimo metodu S. palustris ekstraktuose kito ribose nuo 39,44 % iki 89,34 %. Apskaičiuota vidutinė lapų ekstraktų DPPH sujungimo geba yra 72,34 % ± 9,12 %. Antiradikalinis pelkinių notrų lapų ekstraktų aktyvumas kito nuo 49,88 % iki 89,34 %. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas lapų ekstraktų, kurie buvo pagaminti iš šių augaviečių surinktų lapų žaliavų: Zarasų, Ukmergės, Alėjų, Šilalės ir Radviliškio atitinkamai 23,5 %, 18,16 %, 14,99 %, 17,41 % ir 17,79 % daugiau už aritmetinį vidurkį. Mažiausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas lapų bandiniuose iš Kėdainių ir Plungės augaviečių atitinkamai 45,02 % ir 22,48 % mažiau už aritmetinį vidurkį. S. palustris ekstraktai, pagaminti iš žiedų žaliavos, pasižymėjo vidutiniu 61,28 % ± 9,33 % antiradikaliniu aktyvumu. Antiradikalinio pelkinių notrų žiedų ekstraktų aktyvumo amplitudė kito nuo 44,84 % iki 85,21 %. Didžiausias gebėjimas sujungti DPPH radikalus nustatytas žiedų ekstraktuose iš žaliavų, surinktų iš Ukmergės ir Zarasų augaviečių atitinkamai 35,26 % ir 39,03 % daugiau už apskaičiuotą vidurkį. Silpniausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas ekstraktų, gautų iš Plungės, Kėdainių ir Šiaulių augaviečių surinktų žiedų žaliavų atitinkamai 36,69 %, 21,44 % ir 22,6 % mažiau už apskaičiuotas vidutines reikšmes.

46 46 Ekstraktuose, pagamintų iš pelkinių notrų stiebų žaliavų, nustatytas vidutiniškas 51,4 % ± 8,51 % gebėjimas sujungti laisvuosius DPPH radikalus. Stipriausiu antiradikaliniu aktyvumu pasižymėjo ekstraktai, pagaminti iš S. palustris žaliavų, surinktų iš Utenos, Ukmergės ir Radviliškio augaviečių atitinkamai 35,21 %, 34,31 % ir 32,54 % daugiau už aritmetinį stiebų vidurkį. Rezultatai palyginti su 2018 m. Lietuvoje atliktu tyrimu, kurio metu buvo įvertintas antioksidacinis aktyvumas vaistinių notrų (S. officinalis L.) ekstraktuose su skirtingomis augalo morfologinėmis dalimis. Tyrimo metu nustatyta, kad stipriausiu gebėjimu sujungti DPPH radikalus pasižymi ekstraktų lapai, o silpniausiu stiebų ekstraktai. Tyrimų rezultatai parodė, kad tirtų S. officinalis lapų ekstraktų antiradikalinio aktyvumo aritmetinis vidurkis yra 61,00 ± 3,25 %, žiedų - 45,56 ± 2.18 % [25]. Gautų rezultatų dinamika panaši kaip ir S. officinalis, tačiau S. palustris pasižymi kiek stipresniu antiradikaliniu aktyvumu nei S. officinalis. Gauti rezultatai palyginti su tyrimu, kurį atliko Kroatijos ir Austrijos mokslininkai. Buvo tiriamos 7 Stachys rūšys (S. alpina, S. officinalis, S. palustris, S. recta subsp. Recta, S. recta subsp. Subcrenata, S. salviifolia ir S. sylvatica) bei jų antioksidacinis aktyvumas naudojant DPPH laisvųjų radikalų sujungimo metodą. Nustatyta, kad alkoholiniai (metanoliniai, etanoliniai) ekstraktai pasižymėjo didežiausiu antioksidaciniu aktyvumu. Metanolio ekstraktai su S. recta ir S. palustris laisvuosius radikalus sujungė stipriausiai atitinkamai 1.96 ± 0.86 IC 50 ir 2.67 ± 0.03 IC 50. Vaistinių notrų (Stachys officinalis L.) antioksidacinis aktyvumas (10.6 ± 0.2 IC 50 buvo žymiai didesnis nei pelkinių notrų. Visų tirtų Stachys rūšių ekstraktų antiradikalinis aktyvumas buvo didesnis nei etaloninio junginio rutino. Mokslininkai padarė išvadą, kad visi Stachys genties augalai yra perspektyvūs kaip natūralūs antioksidantų šaltiniai [27]. Apibendrinant rezultatus, galima teigti, kad S. palustris augalinių žaliavų ekstraktų antiradikalinis aktyvumas kinta priklausomai nuo morfologinės augalo dalies. Didžiausias gebėjimas sujungti DPPH radikalus nustatytas lapų žaliavų ekstraktuose, o silpniausias stiebų. Antžeminės dalies S. palustris ekstraktai pasižymėjo didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu vegetacijos pradžioje, o silpniausiu sėklų brandinimo fazėje. Atsižvelgiant į pelkinių notrų fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų tyrimų rezultatus bei antioksidacinį bandinių aktyvumą, nustatytą DPPH radikalų sujungimo metodu, galima daryti išvadą, kad minėtų BAM kiekis lemia antiradikalinį aktyvumą bandiniuose; didėjant šių junginių kiekiui, didėja ir gebėjimas sujungti laisvuosius radikalus, taigi taip pat pasižymi didesniu antioksidaciniu aktyvumu.

47 TE, μmol/g TE, μmol/g 3.7. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS sujungimo metodu S. palustris ekstraktuose 47 Antioksidacinis S. palustris ekstraktų aktyvumas buvo vertinamas ir ABTS metodu, kuris pagrįstas mėlynai žalio ABTS radikalo redukcija antioksidantais. Ekstraktų absorbcija matuojama UV spektrofotometru esant 734 nm bangos ilgiui. Antioksidacinis ekstraktų aktyvumas buvo nustatytas antžeminėse S. palustris dalyse skirtingomis augalo vegetacijos fazėmis (18 pav.) m m Radviliškio raj Panevėžio raj Pasvalio raj Masinis augimas Butonizacija Žydėjimas Sėklų branda Radviliškio raj Panevėžys Pasvalys Meldiškiai Masinis augimas Butonizacija Žydėjimas Sėklų branda 18 pav. ABTS radikalo sujungimo geba S. palustris antžeminės dalies bandiniuose skirtingomis vegetacijos fazėmis. TE- trolokso ekvivalentai. (n=2) Tyrimo metu nustatyta, kad tarp skirtingų augalo vegetacijos tarpsnių geba sujungti ABTS radikalus kito pakankamai plačiose ribose nuo 26,31 μmol/g iki 59,31 μmol/g priklausomai nuo fenologinio tarpsnio. Fenologinio kintamumo tendencijos buvo panašios abiem tirtais metais. Stipriausiu antiradikaliniu aktyvumu pasižymėjo antžeminių dalių ekstraktai iš masinio augimo ir butonizacijos fazėmis surinktos pelėkinių notrų žaliavos. Vidutinis antiradikalinis aktyvumas masinio augimo fazėje siekė 48,81 μmol/g ± 7,5 μmol/g. Kiek mažesnis vidutinis antioksidacinis aktyvumas nustatytas butonizacijos ir žydėjimo tarpsniais atitinkamai 46,52 μmol/g ± 6,71 μmol/g ir 42,89 μmol/g ± 6,78 μmol/g. Ekstraktų, gautų iš sėklų brandos tarpsnyje surinktų pelkinių notrų žaliavų, antioksidacinis aktyvumas buvo silpniausias vidutiniškai 36,94 μmol/g ± 7,02 μmol/g. Antioksidacinio aktyvumo įvairavimas skirtingose Lietuvos regionuose bei skirtingose augalo morfologinėse dalyse pateiktas grafike (19 pav.).

48 Plungė Vilniaus raj. Tauragė Kelmė Kėdainių raj. Panevėžys Alytus Kelmės raj. Ukmergė Utena Alėjai Kretingos raj. Šilalė Telšių raj. Zarasai Pasvalio raj. Radviliškio raj. Kaunas Anykščių raj. Jurbarko raj. Šiaulių raj. Telšiai* Petrašiūnai* Kužiai* Šilėnai* Radviliškis* Panevėžys* Pasvalys* Meldiškiai* TE, μmol/g Lapai Žiedai Stiebai 19 pav. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ABTS radikalų sujungimo metodu gamtinėse S. palustris cenopopuliacijose surinktuose lapų, žiedų ir stiebų ekstraktuose. TE- trolokso ekvivalentai. (n=2) * - žaliavos iš pažymėtų augaviečių buvo rinktos 2020 m. ABTS radikalo sujungimo gebos skirtinguose augalo antžeminių dalių ekstraktuose, gautuose iš skirtingų Lietuvos augaviečių surinktų S. palustris žaliavų, amplitudė pasiskirsto labai plačiose ribose nuo 15,49 μmol/g iki 68,91 μmol/g. Tiek 2019 m. tiek 2020 m. rinktos lapų žaliavos ekstraktai pasižymėjo didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu, o mažiausiu stiebų ekstraktai. Tokia pati tendencija nustatyta ir kitais metodais. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas sujungiant ABTS radikalus nustatytas lapų ekstraktuose, kuris kito ribose nuo 36,28 μmol/g iki 68,91 μmol/g, o vidutiniškai 55,61 μmol/g ± 9,07 μmol/g. Ekstraktų, pagamintų iš Vilniaus, Alytaus, Alėjų, Anykščių, Šilėnų ir Pasvalio augavietėse surinktų žaliavų, nustatytas didžiausias antioksidacinis aktyvumas. Jis atitinkamai buvo 16,97 %, 18,00 %, 19,25 %, 23,28 %, 23,91 % ir 23,77 % didesnis už vidurkį. Nustatyta, jog lapų ekstraktai iš pelkinių notrų žaliavų, surinktų iš Ukmergės ir Kėdainių augaviečių, pasižymėjo silpniausia radikalų sujungimo geba atitinkamai 53,28 % ir 45,49 % mažiau už vidutinę reikšmę. Antioksidacinio aktyvumo amplitudė sujungiant ABTS radikalus žiedų ekstraktuose kito ribose nuo 29,82 μmol/g iki 57,89 μmol/g, o vidutiniškai 44,29 μmol/g ± 7,70 μmol/g. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas žiedų ekstraktų, pagamintų iš pelkinių notrų žiedų žaliavų, surinktų iš Alytaus, Alėjų, Telšių ir Petrašiūnų augaviečių. Jose aktyvumas atitinkamai siekė 25,46 %, 30,57 %, 30,7 % ir 28,29 % daugiau už vidutines reikšmes. Mažiausias gebėjimas sujungti ABTS radikalus žiedų ekstraktuose nustatytas iš Plungės augavietėje surinktos žaliavos. Antioksidacinis

49 49 aktyvumas buvo 48,52 % mažesnis už vidutinį žiedų antioksidacinį aktyvumą. Panašios reikšmės gautos ir Utenos, Šiaulių ir Pasvalio augaviečių bandiniuose atitinkamai 28,33 %, 26,21 %, 31,46 % mažiau už vidurkį. Iš gautų rezultatų matyti, kad stiebų ekstraktai pasižymėjo silpniausia ABTS sujungimo geba. Antiradikalinis aktyvumas stiebų ekstraktuose varijavo nuo 15,49 μmol/g iki 50,93 μmol/g, vidutiniškai 33,13 μmol/g ± 8,07 μmol/g. Stiebų ekstraktuose, pagamintų iš Petrašiūnų ir Meldiškių augavietėse surinktų žaliavų, nustatyta didžiausia ABTS sujungimo geba 53,72 % ir 41,32 % didesnė už vidutinę. Gauti rezultatai palyginti su 2018 m. Lietuvoje atlikto tyrimo rezultatais, kuriame buvo tiriamas antioksidacinis ekstraktų aktyvumas ABTS metodu vaistinių notrų (S. officinalis L.) žaliavose, surinktų iš skirtingų Lietuvos cenopopuliacijų. Tyrimo metu buvo apskaičiuotos vidutinės reikšmės kiekvienai augalo morfologiniai daliai, kurios - lapų ekstraktams siekė 24,5 ± 1,23 μmol/g, o žiedų - 14,93 ± 0,74 μmol/g [25]. Kaip ir šiame tyrime, mažesnis antioksidacinis aktyvumas gautas stiebų ekstraktuose, o didžiausias antioksidacinis aktyvumas lapų ekstraktuose. Įvertinus gautus rezultatus matyti, kad pelkinės notros pasižymi geresniu gebėjimu sujungti ABTS radikalus nei vaistinės notros. Duomenų su S. palustris ekstraktais nepavyko rasti, tačiau Irane buvo vertinamos 3 Stachys rūšių (S. byzantina, S. inflata, S. lavandulifolia) gebėjimas surišti ABTS radikalus. Nustatyta, kad S. byzantina, S. inflata ir S. lavandulifolia antioksidacinis aktyvumas atitinkamai siekė ± 1.50 mg/g TE, ± 3.24 mg/g TE ir ± 8.47 mg/g TE [46]. Gauti rezultatai patvirtina, kad Stachys genties augalai pasižymi reikšmingu antiradikaliniu aktyvumu. Apžvelgus rezultatus, galima teigti, kad pelkinių notrų ekstraktai stipriausiu antiradikaliniu poveikiu pasižymi masinio augimo ir butonizacijos tarpsniais. Didžiausia geba sujungti ABTS radikalus pasižymėjo pelkinių notrų lapų ekstraktai, o mažiausia stiebų. Stipriausia geba sujungti ABTS radikalus pasižymėjo ekstraktai iš pelkinių notrų žaliavų, surinktų iš šių augaviečių: Anykščių, Alėjų ir Šilėnų Antioksidacinio aktyvumo nustatymas FRAP redukciniu metodu S. palustris ekstraktuose Siekiant įvertinti redukcinį potencialą pelkinių notrų ekstraktuose buvo naudota dar viena metodika antioksidacinio poveikio įvertinimui FRAP. Šioje metodikoje naudojama gelsva Fe 3+ -

50 TE, μmol/g TE, μmol/g 50 TPTZ druska, kurią antioksidantai redukuoja iki mėlynos Fe 2+ -TPTZ druskos. Nustatomas absorbcijos padidėjimas matuojant 593 nm šviesos bangos ilgyje [37]. Kaip kinta redukcinės savybės pelkinių notrų antžeminių dalių ekstraktuose, surinktuose skirtingais fenologiniais tarpsniais pavaizduota 20 pav m Radviliškio raj Panevėžys Pasvalio raj Masinis augimas Butonizacija Žydėjimas Sėklų branda 2020 m Radviliškio raj Panevėžys Pasvalys Meldiškiai Masinis augimas Butonizacija Žydėjimas Sėklų branda 20 pav. FRAP radikalo sujungimo geba S. palustris antžeminės dalies bandiniuose skirtingomis vegetacijos fazėmis. TE- trolokso ekvivalentai. (n=2) FRAP radikalo sujungimo kitimo dėsningumas buvo panašus abiem tirtais metais. Didžiausiu aktyvumu pasižymėjo ekstraktai iš antžeminės dalies pelkinių notrų žaliavų, surinktų masinio augimo fazėje ir butonizacijoje. Augalams vystantis toliau antioksidacinio aktyvumo rodmenys mažėjo. Aktyvumas kito pakankamai plačiose ribose nuo 43,32 μmol/g iki 98,31 μmol/g priklausomai nuo vegetacijos tarpsnio. Vidutinis antioksidacinis aktyvumas masinio augimo tarpsnyje siekė 87,60 μmol/g ± 7,48 μmol/g. Šiek tiek mažesnis vidurkis gautas butonizacijos fazės bandinių, kuris siekė 84,29 μmol/g ± 7,09 μmol/g. Žydėjimo fazėje vidutinis antioksidacinis aktyvumas nustatytas mažesnis 68,67 μmol/g ± 7,17 μmol/g. Mažiausias vidutinis pelkinių notrų antioksidacinis aktyvumas gautas sėklų brados tarpsnyje, kuris vidutiniškai siekė 52,95 μmol/g ± 5,72 μmol/g. Kaip redukcinis aktyvumas įvairuoja skirtinguose augalo antžeminių dalių ekstraktuose iš Lietuvos gamtinėse cenopopuliacijose augančių S. palustris žaliavų, pavaizduota paveiksle (21 pav.)

51 Plungė Vilniaus raj. Tauragė Kelmė Kėdainių raj. Panevėžys Alytus Kelmės raj. Ukmergė Utena Alėjai Kretingos raj. Šilalė Telšių raj. Zarasai Pasvalio raj. Radviliškio raj. Kaunas Anykščių raj. Jurbarko raj. Šiaulių raj. Telšiai* Petrašiūnai* Kužiai* Šilėnai* Radviliškis* Panevėžys* Pasvalys* Meldiškiai* TE, μmol/g Lapai Žiedai Stiebai 21 pav. Antiradikalinio aktyvumo įvertinimas FRAP metodu gamtinėse S. palustris cenopopuliacijose surinktuose augalo morfologinėse dalyse. TE trolokso ekvivalentai. (n=2) * - žaliavos iš pažymėtų augaviečių buvo rinktos 2020 m. Gauti rezultatai atskleidė, kad antiradikalinio aktyvumo FRAP metodu amplitudė kito labai plačiose ribose nuo 12,81 μmol/g iki 200,1 μmol/g. Kaip ir kitų antioksidacinio aktyvumo tyrimų metodų atveju, taip ir šiuo, didžiausios reikšmes nustatytos lapų ekstraktuose, o mažiausios stiebų. Lapų ekstraktų redukcinis aktyvumas vidutiniškai siekė 147,48 μmol/g ± 27,57 μmol/g, kuris kito ribose nuo 90,12 μmol/g iki 200,1 μmol/g. Stipriausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas ekstraktų, iš Pasvalio, Šilėnų, Kužių augaviečių surinktų žaliavų, atitinkamai 35,67 %, 33,06 %, 25,38 % daugiau už aritmetinį lapų ekstraktų vidurkį. Silpniausias antioksidacinis aktyvumas lapų ekstraktuose nustatytas iš šių augaviečių surinktų žaliavų: Plungės ir Radviliškio atitinkamai 63,64 %, 16,46 % mažiau už aritmetinį vidurkį. Pelkinių notrų žiedų ekstraktų redukcinio aktyvumo įverčių vidutinės reikšmes buvo beveik 2 kartus mažesnes nei lapų ekstraktų. Pelkinių notrų žiedų ekstraktuose nustatytas vidutinis antioksidacinis aktyvumas buvo 44,97 μmol/g ± 11,03 μmol/g, kuris varijavo ribose nuo 30,08 μmol/g iki 70,36 μmol/g. Stipriausias redukcinis aktyvumas užfiksuotas žiedų ekstraktų, pagamintų iš Kėdainių, Pasvalio ir Anykščių augaviečių surinktų žiedų žaliavų - atitinkamai 45,91 %, 52,25 % ir 56, 45 % daugiau už aritmetinį žiedų ekstraktų vidurkį, o mažiausias iš Radviliškio, Panevėžio atitinkamai %, 34,68 % mažiau už aritmetinį žiedų ekstraktų vidurkį. Analizuojant stiebų ekstraktus, nustatytas mažiausias antioksidacinis aktyvumas, kuris kito siauriausiose ribose nuo 12,81 μmol/g iki 31,59 μmol/g, vidutiniškai 24,83 μmol/g ± 5,86 μmol/g.

52 52 Silpniausias redukcinis aktyvumas nustatytas stiebų ekstraktuose iš S. palustris žaliavų, kurios buvo rinktos iš Telšių, Kužių, Panevėžio augaviečių, atitinkamai 75,1 %, 93,83 %, 41,56 % mažiau už vidutinį stiebų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą. Alėjų augavietėje surinktų žaliavų ekstraktų antioksidacinis aktyvumas buvo mažesnis net du kartus už aritmetinį stiebų ekstraktų vidurkį. Stipriausias antiradikalinis aktyvumas stiebų ekstraktuose nustatytas iš Kėdainių ir Zarasų augaviečių surinktų žaliavų. Jų rezultatai atitinkamai buvo 26,54 % ir 27,22 % didesni už vidutinį apskaičiuotą stiebų ekstraktų aktyvumą. Nepavyko rasti jokių duomenų apie S. palustris antioksidacinio aktyvumo įvertinimą FRAP metodu, tačiau antioksidacinis aktyvumas FRAP metodu buvo įvertintas kitose Stachys rūšyse m. mokslininkų atliktame tyrime buvo vertinamas antioksidacinis aktyvumas trijose Stachys rūšyse: S. inflata, S. lavandulifolia, S. byzantina. Tyrimas atliktas su minėtų augalų antžeminėmis dalimis (lapai, žiedai ir stiebai). Antioksidacinis aktyvumas buvo išreikštas mg/g TE ir S. inflata rūšyje siekė ± 0.55, S. lavandulifolia ± 0.13, o S. byzantina ± 1.66 [46]. Palyginus rezultatus galima teigti, kad S. palustris antioksidacinis aktyvumas varijavo panašiose ribose. Apibendrinant, galima teigti, kad stipriausiu redukciniu aktyvumu pasižymėjo antžeminės dalies pelkinių notrų ekstraktai surinkti vegetacijos pradžioje. Lapų ekstraktai labai reikšmingai išsiskyrė nuo žiedų ir stiebų ekstraktų. Lapų ekstraktų aktyvumas buvo didesnis už žiedų 2,6 karto, o už stiebų net 5 kartus. Stipriausiu redukciniu aktyvumu pasižymėjo ekstraktai, pagaminti iš Pasvalio, Šilėnų ir Kužių augavietėse rintų žaliavų Koreliacinių ryšių įvertinimas tarp bendrojo flavonoidų, fenolio rūgščių ir fenolio junginių kiekio S. palustris žaliavose bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo Siekiant geriau apibūdinti priklausomybės pobūdį ir jo stiprumą tarp tiriamųjų junginių kiekių ir jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo, buvo apskaičiuotas Pirsono koreliacijos koeficientas. Šis koeficientas įvertina tiesinio ryšio stiprumą tarp dviejų kintamųjų (pvz. tarp bendrojo fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nustatyto DPPH metodika). Koeficiento reikšmės gali būti nuo -1 iki 1. Kuo koeficientas yra arčiau vieneto, tuo stipresnis ryšys tarp kintamųjų ir atvirkščiai [47]. Kai reikšmės lygios 1, reiškia, kad koreliacija yra stipri ir teigiama, kai reikšmės lygios 0 - reiškia, kad koreliacijos nėra, kai reikšmės lygios -1, tai koreliacija stipri ir neigiama. Rezultatai laikomi statistiškai reikšmingais, kaip p 0,05 [31]. Gauti koreliacinės analizės rezultatai pateikti lentelėje (1 lentelė).

53 53 Bendras fenolinių junginių kiekis 1 lentelė. S. palustris žaliavose nustatytų bendro fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekio ir jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo koreliacijos koeficientai Bendras fenolinių junginių kiekis Bendras flavonoidų kiekis Bendras fenolio rūgščių kiekis Antioksidaci nis aktyvumas FIC Antioksidaci nis aktyvumas DPPH Antioksidaci nis aktyvumas ABTS Antioksidaci nis aktyvumas FRAP - 0,696* 0,902* 0,497* 0,799* 0,683* 0,770* Bendras fenolio rūgščių kiekis 0,692* 0,696* - 0,542* 0,782* 0,734* 0,805* Bendras flavonoid 0,696* - 0,692* 0,658* 0,600* 0,561* 0,672* ų kiekis *Koreliacija statistiškai reikšminga (p<0,05) Stipriausi ir statistiškai reikšmingi (p < 0,05) koreliaciniai ryšiai nustatyti tarp bendrojo fenolinių junginių kiekio ir bendrojo fenolio rūgščių kiekio (0,902), tarp bendrojo fenolio rūgščių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo įvertinto FRAP metodika (0,805). Taip pat stiprūs ir statistiškai reikšmingi koreliaciniai ryšiai nustatyti tarp fitocheminių rodiklių (bendrojo fenolinių junginių, bendrojo fenolio rūgščių kiekio) ir pelkinių notrų ekstraktų antioksidacinių metodų. Gauti statistinės analizės duomenys rodo silpną koreliacinį ryšį tarp bendrojo fenolinių junginių ir antioksidacinis aktyvumo nustatymo FIC metodu. Rezultatai statistiškai reikšmingi (p < 0,05). Koreliaciniai ryšiai tarp fitocheminių rodiklių ir pelkinių notrų ekstraktų antikosidacinių metodų buvo nustatyti ir mokslininkų. Nustatyta, kad bendrojo fenolio rūgščių kiekis reikšmingai koreliuoja su bendru polifenolio kiekiu ir taninais. Anot mokslininkų, flavonoidų kiekis beveik nekoreliuoja (R = 0,087) su fenolio rūgščių kiekiu. Taip pat buvo nustatyta kiek mažesnė koreliacija tarp DPPH rezultatų ir flavonoidų kiekio [27]. Panašus koreliacinės priklausomybės pobūdis gautas ir mūsų atliktos statistinės analizės metu.

54 54 4. IŠVADOS 1. Parinktos ekstrakcijos sąlygos iš Stachys palustris augalinių žaliavų, sąlygojančios didžiausią tiriamųjų junginių išeigą. Bandiniai veikiami ultragarsu 15 min ultragarso vonelėje, palaikant 30 ± 5 C temperatūrą ir kaip ekstrahentą naudojant 70 % (V/V) etanolio ir išgryninto vandens mišinį. 2. Nustatyta, kad gamtinėse cenopopuliacijose surinktų pelkinių notrų (S. palustris) antžeminėse dalyse kaupiami reikšmingi fenolinių junginių, fenolio rūgščių bei flavonoidų kiekiai, kurių kintamumas tiesiogiai priklauso nuo augalo morfologinės dalies ir cenopopuliacijų. Didžiausi biologiškai aktyvių medžiagų kiekiai nustatyti S. palustris lapuose. Šiems rodikliams taip pat būdingas charakteringas įvairavimas priklausiantis nuo augalo vegetacijos tarpsnio. Didžiausi jų rodmenys nustatyti vegetacijos pradžioje (butonizacijos ir masinio augimo fazėse). 3. Įvertinus pelkinių notrų (S. palustris) augalinių ekstraktų antioksidacinį potencialą ABTS, DPPH ir FRAP modelinėse sistemose, nustatyta, kad jiems būdingas reikšmingas antiradikalinis aktyvumas bei redukcinės savybės, kurių tendencijos sutampa su fitocheminių rodiklių dinamika S. palustris žaliavose. Stipriausiu antioksidaciniu aktyvumu in vitro pasižymėjo S. palustris lapų ekstraktai, o silpniausiu stiebų. Antioksidacinio poveikio rodikliams charakteringas fenologinis kintamumas, kurio dinamika sutampa su fitocheminių rodiklių tendencijomis pelkinių notrų žaliavose. 4. Nustatyta, kad stipriausiu gebėjimu chelatuoti dvivalentės geležies jonus pasižymėjo gamtinėse cenopopuliacijose surinkti S. palustris lapų ekstraktai, o silpniausiu stiebų ekstraktai. Didžiausias chelatinis aktyvumas įvertintas, kai ekstraktai buvo paruošti augalinių žaliavų masinio augimo ir butonizacijos fazėmis, o mažiausias vegetacijos pabaigoje t.y. sėklų brandinimo tarpsnyje. Stipriausios chelatinės savybės yra charakteringos ekstraktams paruoštiems iš S. palustris žaliavų, surinktų vegetacijos pradžioje, kurių tendencijos sutampa su fitocheminių rodiklių dinamika pelkinių notrų žaliavose. 5. Nustatyti statistiškai reikšmingi (p < 0,05) koreliaciniai ryšiai tarp bendro fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekių pelkinių notrų žaliavose bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo. Koreliaciniai ryšiai tarp minėtų rodiklių įvairavo nuo vidutinių iki labai stiprių.

55 55 5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS Atlikus pelkinių notrų (Stachys palustris L.) augalinių žaliavų (lapų, žiedų, stiebų), surinktų skirtingose gamtinėse Lietuvos cenopopuliacijose, fitocheminius tyrimus, nustatyta, jog augalo lapuose kaupiami reikšmingi kiekiai fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų, o jų ekstraktai pasižymi reikšmingu antioksidaciniu aktyvumu. Didžiausi kiekiai minėtų biologiškai aktyvių medžiagų aptikti augalo vegetacijos pradžioje. Tikslinga tyrimus tęsti su Alėjų, Ukmergės ir Šilėnų cenopopuliacijose surinktomis pelkinių notrų žaliavomis, dėl jose sukaupiamų reikšmingų kiekių bioaktyvių medžiagų. Taip pat tikslinga tyrimus tęsti su S. palustris lapų žaliavomis, taikant atrankesnius metodus individualių polifenolinių junginių sudėties įvairavimo kitimams vertinti. Išsamesni S. palustris antioksidacinių savybių bei augalų kaupiamų fenolinių junginių tyrimai leistų geriau suvokti bioaktyvių medžiagų kaupimosi dėsningumus ir antioksidacinio poveikio mechanizmus. Dėl kaupiamų reikšmingų kiekių fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų, galimas augalo pritaikymas maisto ir farmacijos pramonėje, kaip konservantų ar natūralių antioksidantų šaltinis.

56 56 6. NAUDOTA LITERATŪRA 1. Tundis, R., Peruzzi, L., & Menichini, F. Phytochemical and biological studies of Stachys species in relation to chemotaxonomy: A review. Phytochemistry, (2014). 102, Lekavičius, A. Vadovas augalams pažinti; Mokslas p Chirinos, R., Rogez, H., Campos, D., Pedreschi, R., & Larondelle, Y.. Optimization of extraction conditions of antioxidant phenolic compounds from mashua (Tropaeolum tuberosum Ruíz & Pavón) tubers. Separation and Purification Technology, (2007) 55(2), Darbyshire SJ, Francis A, Mulligan GA, Graham GL, Stephen J. Darbyshire Agriculture and Agri-Food Canada ECand ORC, Ardath FrancisAgriculture and Agri-Food Canada ECand ORC, et al. The Biology of Canadian Weeds. Canadian Journal of Plant Science Ahmet C. Gören Use of Stachys Species (Mountain Tea) as Herbal Tea and Food Rec. Nat. Prod. 8:2 (2014) S.M.Venkateshappa and K.P.Sreenath Potential medicinal plants of lamiacea American International Journal of Research in Formal, Applied& Natural Sciences, June-August, 2013, pp El Mokni, R., Faidi, K., Joshi, R. K., Mighri, Z., El Aouni, M. H., & Hammami, S. Essential oil composition and antioxidant activity of Stachys officinalis subsp. algeriensis (Lamiaceae) from a wild population in Tunisia. European Food Research and Technology, (2018). 244(9), Bilušić Vundać, V. Taxonomical and Phytochemical Characterisation of 10 Stachys Taxa Recorded in the Balkan Peninsula Flora: A Review. Plants, (2019). 8(2), Thakur, P., Kumar, A., & Kumar, A. Targeting oxidative stress through antioxidants in diabetes mellitus. Journal of Drug Targeting, (2018) Khoddami A, Wilkes MA, Roberts TH. Techniques for analysis of plant phenolic compounds. Molecules. 2013;18(2) 11. Martins, S., Mussatto, S. I., Martínez-Avila, G., Montañez-Saenz, J., Aguilar, C. N., & Teixeira, J. A. Bioactive phenolic compounds: Production and extraction by solid-state fermentation. A review. Biotechnology Advances, (2011). 29(3), Háznagy-Radnai, E., Balogh, Á., Czigle, S., Máthé, I., Hohmann, J., & Blazsó, G. Antiinflammatory Activities of Hungarian Stachys species and Their Iridoids. Phytotherapy Research, (2011). 26(4), Taylor, Kenneth, and Phillip Rowland. "Biological flora of the British Isles: Stachys palustris L." Journal of ecology (2011):

57 Chirinos, R., Rogez, H., Campos, D., Pedreschi, R., & Larondelle, Y. Optimization of extraction conditions of antioxidant phenolic compounds from mashua (Tropaeolum tuberosum Ruíz & Pavón) tubers. Separation and Purification Technology, (2007). 55(2), Bilušić Vundać, V., Brantner, A. H., & Plazibat, M. Content of polyphenolic constituents and antioxidant activity of some Stachys taxa. Food Chemistry, (2007). 104(3), Pandey, K. B., & Rizvi, S. I. Plant Polyphenols as Dietary Antioxidants in Human Health and Disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, (2009), Ruesgas-Ramón, M., Figueroa-Espinoza, M. C., & Durand, E. Application of Deep Eutectic Solvents (DES) for Phenolic Compounds Extraction: Overview, Challenges, and Opportunities. Journal of Agricultural and Food Chemistry, (2017). 65(18), Mokrani, Abderrahmane, and Khodir Madani. "Effect of solvent, time and temperature on the extraction of phenolic compounds and antioxidant capacity of peach (Prunus persica L.) fruit." Separation and Purification Technology (2016): Liguori, I., Russo, G., Curcio, F., Bulli, G., Aran, L., Della-Morte, D., Abete, P. Oxidative stress, aging, and diseases. Clinical Interventions in Aging, (2018). Volume 13, Rahal, A., Kumar, A., Singh, V., Yadav, B., Tiwari, R., Chakraborty, S., & Dhama, K. Oxidative Stress, Prooxidants, and Antioxidants: The Interplay. BioMed Research International, (2014). 2014, Haminiuk, C. W. I., Maciel, G. M., Plata-Oviedo, M. S. V., & Peralta, R. M.. Phenolic compounds in fruits - an overview. International Journal of Food Science & Technology, (2012) 47(10), Nagarajan, S., Nagarajan, R., Kumar, J., Salemme, A., Togna, A. R., Saso, L., & Bruno, F. Antioxidant Activity of Synthetic Polymers of Phenolic Compounds. Polymers, (2020). 12(8), Tomou, E.-M., Barda, C., & Skaltsa, H. Genus Stachys: A Review of Traditional Uses, Phytochemistry and Bioactivity. Medicines, (2020). 7(10), Venditti, A., Frezza, C., Bianco, A., Serafini, M., Cianfaglione, K., Nagy, D. U., Maggi, F. Polar Constituents, Essential Oil and Antioxidant Activity of Marsh Woundwort (Stachys palustrisl.). Chemistry & Biodiversity, (2017). 14(3), e Talijūnė E. Vaistinių notrų (Stachys officinalis L.) augalinių žaliavų fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo įvertinimas. Magistro darbas, LSMU, 2018; 26. Taylor, K., & Rowland, P. Biological Flora of the British Isles: Stachys palustris L. Journal of Ecology, (2011). 99(4), Bilušić Vundać, V., Brantner, A. H., & Plazibat, M. Content of polyphenolic constituents and antioxidant activity of some Stachys taxa. Food Chemistry, (2007). 104(3),

58 Kendir, C., van den Akker, M., Vos, R., & Metsemakers, J. Cardiovascular disease patients have increased risk for comorbidity: A cross-sectional study in the Netherlands. European Journal of General Practice, (2017). 24(1), Mustafa, A., Trevino, L. M., & Turner, C. Pressurized Hot Ethanol Extraction of Carotenoids from Carrot By-Products. Molecules, (2012). 17(2), Jacotet-Navarro, M., Laguerre, M., Fabiano-Tixier, A.-S., Tenon, M., Feuillère, N., Bily, A., & Chemat, F. What is the best ethanol-water ratio for the extraction of antioxidants from rosemary? Impact of the solvent on yield, composition, and activity of the extracts. ELECTROPHORESIS, (2018). 39(15), Bermudez-Edo, M., Barnaghi, P., & Moessner, K. Analysing real world data streams with spatiotemporal correlations: Entropy vs. Pearson correlation. Automation in Construction, (2018). 88, Bilušić Vundać, V. Taxonomical and Phytochemical Characterisation of 10 Stachys Taxa Recorded in the Balkan Peninsula Flora: A Review. Plants, 8(2), 32. (2019). 33. Vu, M., Yu, J., Awolude, O. A., & Chuang, L. Cervical cancer worldwide. Current Problems in Cancer. (2018). 34. Łuczaj, Ł. J., Svanberg, I., & Köhler, P. Marsh woundwort, Stachys palustris L. (Lamiaceae): an overlooked food plant. Genetic Resources and Crop Evolution, (2011). 58(5), Tomou, E.-M., Barda, C., & Skaltsa, H. Genus Stachys: A Review of Traditional Uses, Phytochemistry and Bioactivity. Medicines, (2020). 7(10), Alam, M. N., Bristi, N. J., & Rafiquzzaman, M. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharmaceutical Journal, (2013). 21(2), Sunitha D. A Review on antioxidant methods. Asian journal of pharmaceutical and clinical research Pisoschi A. M., Negulescu G. P. Methods for Total Antioxidant Activity Determination: A Review Methods for Total Antioxidant Activity Determination: A Review. Biochem & Anal Biochem 2011,1: Ebrahimzadeh MA, Pourmorad F, Bekhradnia AR. Iron chelating activity, phenol and flavonoid content of some medicinal plants from Iran. Afr. J. Biotechnol, 208;7(18): Sulaiman M., Tijani H. I., Abubakar B. M., Haruna S., Hindatu Y., Ndejiko J., Idris A. An Overview of Natural Plant Antioxidants: Analysis and EvaluationAdvances in Biochemistry. Vol. 1, No. 4, 2013, pp

59 Caleja, C., Barros, L., Antonio, A. L., Oliveira, M. B. P. P., & Ferreira, I. C. F. R. A comparative study between natural and synthetic antioxidants: Evaluation of their performance after incorporation into biscuits. Food Chemistry, (2017). 216, Milevskaya, V. V., Temerdashev, Z. A., Butyl skaya, T. S., & Kiseleva, N. V. Determination of phenolic compounds in medicinal plants from the Lamiaceae family. Journal of Analytical Chemistry, (2017). 72(3), Medina, M. B. Simple and Rapid Method for the Analysis of Phenolic Compounds in Beverages and Grains. Journal of Agricultural and Food Chemistry, (2011). 59(5), Amorim ELC, Almeida de Castro VTN, Melo JG, Chernichiarro Correa AJ, Silva Peixoto Sobrinho TJ. Standard Operating Procedures (SOP) for the Spectrophotometric Determination of Phenolic Compounds Contained in Plant Samples. Latest Res into Qual Control. 2012; 45. Cheynier, V. Phenolic compounds: from plants to foods. Phytochemistry Reviews, (2012). 11(2-3), Bahadori, M. B., Maggi, F., Zengin, G., Asghari, B., & Eskandani, M. Essential oils of hedgenettles (Stachys inflata, S. lavandulifolia, and S. byzantina) have antioxidant, anti-alzheimer, antidiabetic, and anti-obesity potential: A comparative study. Industrial Crops and Products, (2020). 145, Kimantaitė G. Įmonių susijungimų ir įsigijimų įtaka Baltijos šalių ekonomikai. Magistro darbas, KTU, 2016;

60 60 7. PRIEDAI 1 priedas DARBO RĖMIMO, AUTORIAUS INDĖLIO IR GALIMO INTERESŲ KONFLIKTO DEKLARACIJA Daiva Dabrickytė Pelkinių notrų (Stachys palustris L.) augalinių žaliavų fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas The investigation of phenolic compounds and antioxidant activity of Marsh woundwort (Stachys palustris L.) plants Darbas remiamas Farmacijos fakulteto, vaistų chemijos katedros lėšomis. Patvirtinu, kad baigiamasis darbas atliktas ir parašytas savarankiškai, nepažeidžiant kitiems asmenims priklausančių autorinių teisių. Daiva Dabrickytė, parašas

61 61 2 priedas