MAISTO PAPILDŲ, KURIŲ SUDĖTYJE YRA MONAKOLINO K, TYRIMAS CHROMATOGRAFINIAIS ANALIZĖS METODAIS

Transkriptas

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS AURELIJA LADYGAITĖ MAISTO PAPILDŲ, KURIŲ SUDĖTYJE YRA MONAKOLINO K, TYRIMAS CHROMATOGRAFINIAIS ANALIZĖS METODAIS Magistro baigiamasis darbas Vientisųjų studijų programa Farmacija, valstybinis kodas 6011GX003 Studijų kryptis Farmacija Darbo vadovas: Prof. dr. Andrejus Ževžikovas KAUNAS, 2021

2 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS ANALIZINĖS TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA TVIRTINU: Farmacijos fakulteto dekanė Prof. dr., Ramunė Morkūnienė Data MAISTO PAPILDŲ, KURIŲ SUDĖTYJE YRA MONAKOLINO K, TYRIMAS CHROMATORAFINIAIS ANALIZĖS METODAIS Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas Prof. dr. Andrejus Ževžikovas Data Recenzentas Data Darbą atliko Magistrantė Aurelija Ladygaitė Data KAUNAS, 2021

3 TURINYS SANTRAUKA... 5 SUMMARY... 6 PADĖKA... 7 SANTRUMPOS... 8 SĄVOKOS... 9 ĮVADAS DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI LITERATŪROS APŽVALGA Raudonosiomis mielėmis fermentuoti ryžiai (RMFR) Monakolino K charakteristika Monakolino K cheminė sudėtis ir stabilumas Monakolino K bioprieinamumas ir farmakokinetika Monakolino K veikimo mechanizmas Monakolino K farmakologinis poveikis Monakolino K poveikis hiperlipidemijai Monakolino K poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai Monakolino K priešvėžinis poveikis Monakolino K antioksidacinis bei priešuždegiminis poveikis Monakolino K nepageidaujamas poveikis Metodai, taikomi monakolino K kokybinei ir kiekybinei analizei Monakolino K tyrimas taikant efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodą (EPC) Monakolino K tyrimas taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą (ESC) TYRIMO METODIKA IR METODAI Tyrimo objektas Kokybinis ir kiekybinis monakolino K nustatymas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos (EPC) metodu Naudoti reagentai Naudota aparatūra Etaloninio tirpalo ruošimas Tiriamųjų tirpalų ruošimas... 23

4 Analizės eiga Kokybinis ir kiekybinis monakolino K nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu Naudoti reagentai Naudota aparatūra Etaloninio tirpalo ruošimas Tiriamojo tirpalo ruošimas Analizės eiga Duomenų analizė REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos (EPC) metodo pritaikymas Tirpiklių sistemos parinkimas Kokybinis monakolino K įvertinimas maisto papilduose efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos (EPC) metodu Kiekybinis monakolino K įvertinimas maisto papilduose efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos (EPC) metodu Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodo pritaikymas Kokybinis monakolino K įvertinimas maisto papilduose efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodo validavimas Specifiškumas Tiesiškumas Glaudumas (preciziškumas) Aptikimo ir nustatymo ribos Kiekybinis monakolino K įvertinimas maisto papilduose efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu Tyrimo metu nustatytų ir maisto papildų etiketėse deklaruojamų monakolino K kiekių palyginimas IŠVADOS PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS LITERATŪROS SĄRAŠAS PRIEDAI... 48

5 SANTRAUKA A. Ladygaitės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. dr. A. Ževžikovas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas. Pavadinimas: Maisto papildų, kurių sudėtyje yra monakolino K, tyrimas chromatografiniais analizės metodais. Raktiniai žodžiai: monakolinas K, raudonosiomis mielėmis fermentuoti ryžiai, efektyvioji plonasluosknė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija. Tyrimo tikslas: atlikti monakolino K kokybinę ir kiekybinę analizę skirtinguose Lietuvoje notifikuotuose maisto papilduose chromatografiniais analizės metodais. Tyrimo uždaviniai: modifikuoti ir pritaikyti efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodiką monakolino K kokybinei ir kiekybinei analizei; modifikuoti ir pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką monakolino K kokybinei ir kiekybinei analizei; palyginti nustatytus ir skirtingų Lietuvoje notifikuotų maisto papildų etiketėse deklaruojamus monakolino K kiekius. Tyrimo objektas: trys Lietuvoje notifikuoti maisto papildai, sudėtyje turintys monakolino K. Tyrimo metodai: efektyvioji plonasluoksnė chromatografija (EPC) ir efektyvioji skysčių chromatografija (ESC). Tyrimo rezultatai ir išvados: Nustatyta, kad tinkamiausia tirpiklių sistema, monakolino K kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui EPC metodu, yra sudaryta iš dichlormetano ir etilo acetato (7:3). Monakolino K kokybinei ir kiekybinei ESC analizei pritaikytas gradientinis eliuavimas. Tinkamiausia eliuentų sistema sudaryta iš 0,1 proc. trifluoracto rūgšties ir acetonitrilo. Tyrimo metu mažiausias monakolino K kiekis aptiktas maisto papilde MP_1 (EPC 3,24 ± 0,008 mg; ESC 3,44 ± 0,06 mg), o didžiausias MP_2 (EPC 7,12 ± 0,08 mg; ESC 8,76 ± 0,05 mg). EPC ir ESC kiekybinės analizės metu nustatytas mažesnis monakolino K kiekis, nei deklaruojamas maisto papildų etiketėse. Abiejų metodikų validavimo parametrai atitiko reikalavimus, todėl jos yra tinkamos maisto papildų, sudėtyje turinčių monakolino K, kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui.

6 SUMMARY Final Master s thesis by A. Ladygaitė/ supervisor Prof. A. Ževžikovas; Department of Analytical and Toxicological Chemistry at the Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. Kaunas. Title: Food supplements containing monacolin K investigation using chromatographic analysis methods. Keywords: monacolin K, red yeast rice, high-performance thin-layer chromatography, highperformance liquid chromatography. Aim of the study: to perform qualitative and quantitative analysis of monacolin K in various notifiend in Lithuania food supplements using chromatographic analysis methods. Tasks of the study: to modify and adapt high-performance thin-layer chromatography methodology for the qualitative and quantitative analysis of monacolin K; to modify and apply high performance liquid chromatography methodology for qualitative and quantitative analysis of monacolin K; to compare determined and in different notified in Lithuania food supplements labels declared amounts of monacolin K. Objects: three notified in Lithuania food supplements, containing monacolin K. Methods: high-performance thin-layer chromatography (HPTLC), high-performance liquid chromatography (HPLC). Results and conclusions of the study: The most suitable solvent system for the qualitative and quantitative analysis of monacolin K by HPTLC is consisted of dichloromethane and ethyl acetate (7:3). For the qualitative and quantitative HPLC analysis of monacolin K, gradient elution mode was applied. The most suitable eluent system is consisted of 0.1 pct. trifluoroacetic acid and acetonitrile. During the study, the lowest amount of monacolin K was detected in food supplement MP_1 (HPTLC 3,24 ± 0,008 mg; HPLC 3,44 ± 0,06 mg), and the highest - in food supplement MP_2 (HPTLC 7,12 ± 0,08 mg; HPLC 8,76 ± 0,05 mg). Quantitative analysis of HPTLC and HPLC methods revealed lower levels of monacolin K than declared on food supplement labels. The validation parameters of both methodologies met the requirements and are suitable for the qualitative and quantitative evaluation of food supplements containing monacolin K.

7 PADĖKA Noriu nuoširdžiai padėkoti magistro baigiamojo darbo vadovui prof. dr. Andrejui Ževžikovui už informatyvias konsultacijas ir vertingus patarimus rašant darbą. Taip pat dėkoju Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros lekt. Mindaugui Marksai už pagalbą ir patarimus atliekant eksperimentinius tyrimus.

8 SANTRUMPOS DC-MS dujų chromatografija su masių spektrometrijos detektoriumi DP džiovinimas purškimu DŠ džiovinimas šalčiu ES Europos sąjunga EPC efektyvioji plonasluoksnė chromatografija ESC efektyvioji skysčių chromatografija HMG CoA 3-hidroksi-3-metilglutaril-koenzimo A reduktazė IŠL išeminė širdies liga MS masių spektrometrija MTL mažo tankio lipoproteinai PSO pasaulio sveikatos organizacija RMFR raudonosiomis mielėmis fermentuoti ryžiai UV ultravioletinė šviesa

9 SĄVOKOS Apoptozė ląstelių žūtis. Azoto oksido sintazė katalizuoja azoto oksido gamybą, todėl palaiko kraujagyslių tonusą. Cholesterogenezė cholesterolio biozintezė. Ekspresija procesas, kurio metu genų užkoduota informacija paverčiama ląstelėje esančiomis ir veikiančiomis struktūromis. Miopatija liga, kuri pasireiškia raumenų silpnumu, skausmu, mėšlungiu. Murino ląstelės paprastosios, naminių žiurkių ar pelių, ląstelės. Proliferacija nenormalus ląstelių populiacijos didėjimas dėl jų dalijimosi. Rabdomiolizė raumenų ląstelių irimas. Vainikinių arterijų šuntavimas procedūra, skirta pagerinti prastą kraujo tekėjimą į širdį, kai arterijos yra susiaurėjusios arba užblokuotos.

10 10 ĮVADAS Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) 2019 m. duomenimis daugiausiai žmonių mirė nuo išeminės širdies ligos (IŠL). Tai sudarė net 16 proc. visų pasaulio mirčių. Nuo 2000 m. didžiausias mirčių skaičius buvo dėl šios ligos, o 2019 m. nuo IŠL mirusiųjų skaičius išaugo iki 8,9 mln. [11]. Vienas iš pagrindinių rizikos faktorių, turinčių įtakos IŠL ir kitų širdies ir kraujagyslių ligų atsiradimui hipercholesterolemija. Jos išsivystymas susijęs su mažo tankio lipoproteinų (MTL) cholesterolio kiekio kraujyje padidėjimu [56]. Todėl, norint išvengti širdies ir kraujagyslių ligų, reikia mažinti MTL cholesterolio kiekį. Šiam tikslui pasiekti pacientai turi keisti savo gyvenimo būdą ir skirti ypatingą dėmesį sveikai mitybai [57]. Kadangi ne visiems pacientams lengva pakeisti savo įpročius ir ilgą laiką išlaikyti sveiką gyvenimo būdą, jiems yra skiriami vaistiniai statinų preparatai. Statinai yra pirmojo pasirinkimo vaistai, skirti sumažinti aukštą cholesterolio kiekį, tačiau klinikinėje praktikoje nustatyta, kad proc. pacientų netoleruoja vaistinių statinų preparatų [58]. Be to, daugelis jų atsisako, nes bijo nepageidaujamų reakcijų, tokių kaip: raumenų skausmas, kepenų pažeidimas ar neurologinės problemos [48,59,60]. Pastaraisiais metais moksliniai tyrimai buvo sutelkti į raudonosiomis mielėmis fermentuotų ryžių (RMFR) maisto papildus, kurie pasižymi cholesterolio kiekį kraujyje mažinančiu efektu [46,35]. Šis poveikis pasireiškia dėl to, kad RMFR sudėtyje yra monakolinas K, kuris slopina endogeninę cholesterolio sintezę [1]. Dėl šios priežasties monakolinas K turi terapinį poveikį sergantiems hipercholesterolemija, širdies ir kraujagyslių ligomis, ir yra veiksmingas pacientams, kurie netoleruoja įprastinių statinų preparatų [43]. Be to, monakolinas K pasižymi ne tik lipidus mažinančiu, bet ir citotoksiniu, priešuždegiminiu ir antioksidaciniu poveikiais [36]. RMFR reguliavimo statusas Europoje priklauso nuo įstatymų, būdingų kiekvienai šaliai. Kai kurios šalys yra nustačiusios dienos normas, ribojančias RMFR naudojimą maisto papilduose. Lietuvoje leidžiama naudoti RMFR maisto papildus be nustatytos monakolino K dienos dozės, tačiau gamintojai turi įrodyti šių produktų saugumą [13]. Nepaisant to, maisto papildai su RMFR tampa vis labiau populiarūs, todėl reikia pritaikyti paprastus, greitus ir efektyvius analizės metodus, kuriais būtų galima nustatyti ir įvertinti faktinį monakolino K kiekį maisto papilduose. Šio darbo tikslas atlikti monakolino K kokybinę ir kiekybinę analizę skirtinguose Lietuvoje notifikuotuose maisto papilduose chromatografiniais analizės metodais.

11 11 DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI Tikslas atlikti monakolino K kokybinę ir kiekybinę analizę skirtinguose Lietuvoje notifikuotuose maisto papilduose chromatografiniais analizės metodais. Uždaviniai: 1. Modifikuoti ir pritaikyti efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodiką monakolino K kokybinei ir kiekybinei analizei. 2. Modifikuoti ir pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką monakolino K kokybinei ir kiekybinei analizei. 3. Palyginti nustatytus ir skirtingų Lietuvoje notifikuotų maisto papildų etiketėse deklaruojamus monakolino K kiekius.

12 12 1. LITERATŪROS APŽVALGA 1.1. Raudonosiomis mielėmis fermentuoti ryžiai (RMFR) Rytų Azijos šalyse raudonosiomis mielėmis fermentuoti ryžiai (RMFR) (1 pav.) vartojami daugiau nei tūkstantį metų. Šis produktas dėl savo ryškios spalvos, skonio ir kvapo naudojamas ryžių vyno gamybai, maisto produktų dažymui, žuvies ir mėsos konservavimui bei liaudies medicinoje kaip vaistas, gerinantis virškinimą ir kraujotaką. Nors Azijos šalyse RMFR vis dar vartojami kaip dažiklis ar kvapiosios medžiagos maisto produktuose, Vakarų šalyse RMFR yra vienas iš dažniausiai vartojamų lipidus mažinančių preparatų [6,7]. RMFR yra gaunami fermentuojant Monascus purpureus ar kitus grybelius ant ryžių [24,37]. Fermentacijos metu susidaro daug antrinių metabolitų, fitosterolių, izoflavonoidų, riebalų rūgščių, pigmentų, monakolinai M, L, J, X) bei monakolinas K, kuris yra struktūriškai identiškas lovastatinui [12,46]. 1 pav. Raudonosiomis mielėmis fermentuoti ryžiai (RMFR)[6] 1.2. Monakolino K charakteristika Monakolinas K pagrindinis RMFR komponentas [2]. Šio junginio poveikis cholesterolio kiekio kraujyje mažinimas [30] m. Japonų profesorius Akira Endo buvo pirmasis, kuris išskyrė šią veikliąją medžiagą iš ryžių, fermentuotų Monascus ruber grybeliu, ir pavadino monakolinu K [2].

13 13 Maisto papildai su monakolinu K gaminami kruopščiai kontroliuojamoje temperatūroje ir auginimo sąlygose, fermentuojant Monascus purpureus, Monascus pilosus, Monascus floridanus, Monascus ruber, Pleurotus ostreatus ar Aspergillus terreus grybelį [24], kad padidėtų mevino rūgščių koncentracija. RMFR yra keturiolika mevino rūgščių, dar žinomų kaip monakolinai, iš kurių daugiausiai yra monakolino K (dar vadinamo lovastatinu arba mevinolinu) [44]. Tai antrinis metabolitas slopinantis 3-hidroksi-3-metilglutaril-koenzimo A (HMG CoA) reduktazę [1]. Nors monakolino K kiekis RMFR skiriasi, per dieną 2,4 g gali būti apie 4,8 mg (arba 0,2 proc. visos dozės) šio komponento [14]. Įdomu tai, jog RMFR papildų poveikis lipidams, atsižvelgiant į monakolino K dozę yra didesnis nei lovastatino [26]. Be to, 3 mg monakolino K dozė, sumažina MTL cholesterolio kiekį kraujyje kaip ir 10 mg lovastatino [23] Monakolino K cheminė sudėtis ir stabilumas Monakolinas K skaidrūs, balti, adatos formos kristaliniai milteliai. Normaliomis laboratorinėmis sąlygomis, mažai tirpūs vandenyje, tačiau gerai tirpūs organiniuose tirpikliuose, tokiuose kaip: metanolis, etanolis, acetonas, chloroformas, benzenas. Šio junginio molekulinė formulė C24H36O5, molekulinė masė - 404,55 [2]. Monakolinas K (2 pav.), dar žinomas kaip lovastatinas bei mevinolinas, nes jo formulė sutampa su šių junginių formulėmis [12,46]. Mokslininkai tyrimų metu nustatė, jog aukšta temperatūra ir didelė drėgmė turi įtakos monakolino K stabilumui. Šio junginio kiekis RMFR reikšmingai mažėja esant didelei drėgmei, aukštai temperatūrai bei saulės spinduliams [44]. Todėl svarbu RMFR produktus laikyti šaldytuve [39]. 2 pav. Monakolino K cheminė struktūra [12]

14 1.4. Monakolino K bioprieinamumas ir farmakokinetika 14 Nors monakolino K ir lovastatino struktūra identiška, jų farmakokinetinės savybės ir biologinis prieinamumas skiriasi. Lovastatinas skiriamas gydymui, kaip viena veiklioji medžiaga ir jo biologinis prieinamumas 31 proc., o monakolinas K yra tik vienas iš RMFR komponentų, todėl kiti komponentai gali pakeisti jo biologinį prieinamumą. Vartojant monakoliną su maistu jo biologinis prieinamumas padidėja proc. [3]. Lyginant su lovastatinu, monakolinas K esantis RMFR ištraukoje turi didesnį biologinį prieinamumą, todėl jo cholesterolio kiekį kraujyje mažinančios savybės yra efektyvesnės [32]. RMFR komponento monakolino K koncentracijos laiko profilis skiriasi nuo lovastatino [3]. In vivo tyrimo metu nustatyta, jog tiriamiesiems peroraliai skiriant monakolino K, jo kraujo serume padidėjo maždaug 4 kartus. Šiame tyrime išsiaiškinta, jog 5 6 mg monakolino K bioekvivalentiškumas yra toks pat kaip mg lovastatino [26]. Monakolino K farmakokinetika pasižymi santykinai trumpu pusinės eliminacijos periodu bei ribota rezorbcija žarnyne [19]. Laktono žiedo atidarymas gali įvykti esant šarminėms sąlygoms arba plonojoje žarnoje ir kepenyse fermentinės hidrolizės metu veikiant citochromo P450 (CYP450) fermentui [44] Monakolino K veikimo mechanizmas Pagrindinis monakolino K veikimo mechanizmas yra mažinti endogeninių lipidų sintezę, egzogeninių lipidų absorbciją bei skatinti jų transportavimą ir išsiskyrimą [30]. Monakolinas K veikia kaip konkurencinis 3-hidroksi-3-metilglutaril-koenzimo A (HMG CoA) reduktazės inhibitorius [1]. HMG CoA reduktazė yra reguliuojantis ir greitį ribojantis cholesterolio biosintezės fermentas [2,10]. Kadangi monakolinas K yra didelė molekulė ir jo struktūra panaši į HMG CoA reduktazę, jis užima HMG-CoA reduktazės vietą aktyviajame centre, todėl neleidžia šiam fermentui prisijungti prie substrato [9,10]. Monakolinas K mažina cholesterolio koncentraciją ląstelėse dviem skirtingais būdais: 1) slopindamas HMG-CoA reduktazės fermentą kartu ir cholesterolio biosintezę (3 pav.) ir 2) sumažindamas cholesterolio koncentracija kepenyse. Dėl to padidėja mažo tankio lipoproteinų (MTL) receptorių ekspresija kepenų ląstelių membranose ir MTL cholesterolis efektyviau pašalinamas iš kraujo [5,8,32].

15 15 3 pav. Cholesterolio biosintezės slopinimo mechanizmas [5] 1.6. Monakolino K farmakologinis poveikis Moksliniai tyrimai rodo, jog monakolinas K tinkamas vartoti sergant hiperlipidemija [21,23,24,26], širdies ir kraujagyslių sistemos ligomis [26,29], vėžiu [15,16,17,18,34]. Be to, šis RMFR komponentas turi antioksidacinį ir priešuždegiminį poveikį [22,27]. Toliau apžvelgti moksliniai tyrimai, kurie buvo vykdomi atskleidžiant šiuos poveikius Monakolino K poveikis hiperlipidemijai Mokslinių tyrimų metu nustatyta, jog hipercholesterolemijos simptomai mažėja, kai pacientai vartoja maisto papildus, sudėtyje turinčius monakolino K [40]. Pastebėta, kad 6 mėnėsius kasdieną vartojant 300 mg RMFR (sudėtyje turinčių 10 mg monakolino K) MTL cholesterolio kiekis sumažėja (17 proc. vyrams bei 16 proc. moterims) [33]. Tyrimų metu nustatyta, jog 8 savaites kasdieną

16 16 hiperlipidemija sergantiems pacientams vartojant monakoliną K MTL cholesterolio bei bendras cholesterolio kiekis sumažėja 20 proc. [3,21,26]. In vivo tyrimo metu atskleista, jog per parą suvartojant 4,8-24 mg monakolino K, po 2 24 mėnesių gydymo MTL cholesterolio kiekis vidutiniškai sumažėja 1,02 mmol/l (39,4 mg/dl) [20]. Norint sumažinti bendrojo ir MTL cholesterolio kiekį mažiausiomis efektyviomis monakolino K dozėmis, reikia ilgesnio gydymo laikotarpio (12 24 mėnesių) [3]. Taip yra todėl, kad monakolino K poveikis hiperlipidemiai pasireiškia per prisotinimo mechanizmą. Monakolinas K slopina HMG-CoA reduktazės aktyvumą, todėl organizme sutrinka endogeninio cholesterolio sintezė ir pagaminama mažiau endogeninio cholesterolio. Dėl šios priežasties cholesterolio lygis lėtai mažėja, o po kelių savaičių pasiekiamas pastovus cholesterolio lygis, kuris nekinta [46]. Kadangi RMFR sudėtyje yra monakolino K, jis tinkamas vidutinio sunkumo hipercholesterolemijos gydymui pacientams, netoleruojantiems įprastų statinų dėl raumenų skausmo [33] Monakolino K poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai RMFR esančio monakolino K poveikis širdies ir kraujagyslių ligoms identifikuotas atliekant ilgalaikius tyrimus. In vivo tyrimo metu 65 75m. pacientai, kuriems anksčiau yra buvęs miokardo infarktas, 4 metus vartojo RMFR papildus su manokolinu K. Nustatyta, kad išeminės širdies ligos (IŠL) rizika sumažėjo 31 proc., mirštamumas 31,9 proc., insultas 44,1 proc., vainikinių arterijų šuntavimo poreikis 48,6 proc. 6,4 proc. pacientų, vartojusių papildus mirė nuo IŠL, o vartojusių placebą 9 proc. Tai įrodo, jog RMFR papildai reikšmingai sumažino mirties dėl IŠL riziką 29,2 proc. [29]. Kito in vivo tyrimų metu patvirtinta, jog vartojant monakoliną K kardiovaskulinių įvykių sumažėja 37 proc., o su išemine širdies liga susijusių mirčių atvejų 31 proc. [26] Monakolino K priešvėžinis poveikis Monakolino K ir chemoterapinių vaistų deriniai gali pagerinti chemoterapijos efektyvumą. Navikų ląstelėse mevalonato sintezė vyksta greičiau dėl padidėjusio HMG-CoA reduktazės lygio ir katalizinio efektyvumo. Monakolinas K slopina HMG-CoA reduktazės aktyvumą, todėl citotoksiškai veikia vėžio ląstelės. Dėl šio poveikio jis gali būti naudojamas tiesiogiai kaip chemoterapinis vaistas [34]. Vertindami monakolino K poveikį storosios žarnos vėžiui, mokslininkai pastebėjo, kad monakolinas K sumažina žmogaus storosios žarnos vėžio ląstelių dauginimąsi ir sukelia vėžio ląstelių apoptozę [18]. Be to, monakolinas K slopina žmogaus ūminės mieloidinės leukemijos ląstelių linijos

17 17 proliferaciją, todėl mažina šios ligos plitimą [17]. Tyrimų su žiurkėmis metu nustatyta, jog peroraliai vartojama RMFR etanolinė ištrauka slopina plaučių karcinomos murino ląstelių dauginimąsi [16]. Monakolinas K citotoksiškai veikia ne tik storosios žarnos ar plaučių vėžio ląsteles, bet ir slopina prostatos auglių cholesterogenezę bei lastelių proliferaciją, todėl gali būti tinkamas prostatos vėžio prevencijai [15] Monakolino K antioksidacinis bei priešuždegiminis poveikis RMFR sudėtyje esantis monakolinas K ne tik mažina cholesterolio kiekį kraujyje, bet ir pasižymi antioksidaciniu ir priešuždegiminiu poveikiu [38]. In vitro tyrimo metu nustatyta, jog monakolinas K sureguliuoja kraujagyslių ląstelių adhezijos molekulių ekspresiją, todėl sumažėja naviko nekrozės faktoriaus stimuliuojamas žmogaus aortos endotelinių ląstelių sukibimas [36]. Pastebėta, jog ateroskleroze sergančioms žiurkėms monakolinas K pagerino endotelio azoto oksido sintazės ekspresiją [31], slopino kraujo krešėjimo aktyvaciją ir audinių faktoriaus ekspresiją [28]. Taip pat, pacientams, sergantiems IŠL, bei 6 savaites kasdien vartojantiems 1200 mg RMFR (turinčių 11,4 mg monakolino K), C reaktyvinio baltymo kiekis plazmoje sumažėja [27] Monakolino K nepageidaujamas poveikis Nors mokslinių tyrimų metu nustatyta, jog monakolinas K yra saugus produktas [20], nėščioms ir maitinančioms moterims, pacientams, vyresniems nei 70 metų ar sergantiems inkstų nepakankamumu, raumenų ligomis, vartojantiems statinus, nerekomenduojama vartoti maisto papildų su RMFR. Kadangi monakolinas K, kaip ir statinai, slopina HMG-CoA reduktazę, padidėja toksinio poveikio ir vaistų sąveikos rizika. RMFR preparatai turėtų būti vartojami tik paskyrus gydytojui. Be to, reguliariai reikia atlikti lipidų kiekio ir kepenų fermentų tyrimus, stebėti ar neatsiranda raumenų skausmas bei silpnumas, nes vartojant monakoliną K gali padidėti kreatinino kinazės lygis kraujyje, atsirasti miopatija, rabdomiolizė ar kepenų pažeidimas [13,25] Metodai, taikomi monakolino K kokybinei ir kiekybinei analizei

18 18 Populiariausias metodas taikomas monakolino K analizei efektyvioji skysčių chromatografija (ESC). Kadangi šį metodą galima derinti su ultravioletinės šviesos (UV), fluorescencijos, diodų ar fotodiodų matricos arba masių spektrometrijos (MS) detektoriumi, gaunamas išsamus kokybinis ir kiekybinis maisto papildų su monakolinu K nustatymas [42]. Tai universalus metodas, tinkamas nustatant termiškai labilių ir nelakių junginių turinio vienodumą, grynumą, tirpimo greitį [41,42]. ESC metodo privalumai: naudojamas mažas mėginio bei tirpiklio tūris, trumpas mėginių analizės laikas, didelė skiriamoji geba [37,42]. Kitas dažnai naudojamas metodas efektyvioji plonasluoksnė chromatografija (EPC). Analizuojant junginius šiuo metodu naudojamos iš netaisyklingų silikagelio dalelių sluoksnių sudarytos plokštelės [45]. Tai ekonomiškas metodas, pasižymintis didele mėginių skvarba, vizualiu profiliavimu, analize, kurios metu tiriami maži mėginių kiekiai. Pagrindinis EPC pranašumas prieš ESC - galimybė vienu metu analizuoti skirtingo pobūdžio ir sudėties mėginius, naudojant nedidelį kiekį judančiosios fazės [41,42]. Apžvelgus mokslinę literatūrą nuspręsta, jog abu metodai yra tinkami monakolino K kokybinei ir kiekybinei analizei. Toliau pateikiamos literatūroje rastos ESC ir EPC metodikos, kurių metu buvo tiriami RMFR, sudėtyje turintys monakolino K Monakolino K tyrimas taikant efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodą (EPC) Mokslininkai, V. Pandey, V. Varshney, A. Pandey [41], pritaikė EPC metodą, kurio metu tiriamas lovastatinas (monakolinas K) esantis RMFR. Tiriamojo mėginio ruošimas: 1 ml paruošto standartinio tirpalo ištirpinta 9 ml metanolio. Galutinė darbinio standartinio mėginio tirpalo koncentracija 100 ng/μl. Standartinio tirpalo ruošimas: Pasverta 10 mg lovastatino (monakolino K) standarto ir perkelta į 10 ml matavimo kolbą. Standartas ištirpinamas 10 ml metanolio naudojant ultragarso vonelę. Galutinė darbinio tirpalo koncentracija 1 mg/ml. Tyrimo metodika: Analizei naudotos EPC silikagelio 60 F254 plokštelės (10x10 cm) su sukoncentravimo zona. Prieš analizę plokštelės prisotintos metanoliu. Aktyvavimas atliktas orkaitėje esant 50 C temperatūrai. Aktyvavimo laikas 5 minutės. Standarto ir tiriamųjų tirpalų mėginiai užnešti ant plokštelės naudojant automatinį mėginių užnešėją ir 100 μl švirkštą. Mėginių nueitas kelias 60 mm. Analizei naudota tirpiklių sistema chloroformas : metanolis (95:5, V/V). Į chromatografavimo

19 19 kamerą supylus tirpiklių sistemą, kamera 20 minučių laikoma uždengta, kad pasiskirstytų tirpiklių sistemos garai. Tyrimas atliktas esant 25 ± 2 C temperatūrai. Chromatografavimo trukmė 30 minučių. Po chromatografavimo plokštelės džiovintos orkaitėje 5 minutes esant 50 C temperatūrai. Chromatografinė plokštelė stebėta prie 238 nm bangos ilgio naudojant vizualizavimo prietaisą. Tyrimo duomenys analizuoti naudojant programinę įrangą. Tyrimo rezultatai pateikti 1 lentelėje. Nors visi rezultatai yra labai panašūs, didžiausias lovastatino kiekis nustatytas (a) mėginyje, o mažiausias - (b) mėginyje [41]. 1 lentelė. Lovastatino (monakolino K) standarto tiriamųjų tirpalų įvertinimas [41] Monakolino K tyrimas taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą (ESC) S. Priatni [4] pritaikė ESC metodą su UV detektoriumi, kuriuo galima identifikuoti monakolino K kiekį RMFR kapsulėse. RMFR milteliai inkapsuliuoti atliekant džiovinimą purškimu (DP) ir džiovinimą šalčiu (DŠ). Tiriamojo mėginio ruošimas: 2,0 g RMFR produkto ekstrahuoti 20 ml etilo acetato (ph=3). Ekstrakcija atlikta purtyklės inkubatoriuje esant 130 aps./min. Ekstrakcijos laikas 2 valandos. Etilo acetato tirpalas perfiltruotas ir filtratas supilamas į dalijamąjį piltuvą. Tirpalas neutralizuotas 2 ml 5 proc. Na2CO3 ir etilo acetato frakcija atskirta. Tada etilo acetato ekstraktas išgarintas naudojant rotacinį vakuuminį garintuvą. Išdžiovinto ekstrakto mėginiai pasverti ir ištirpinti 5 ml metanolio. Standartinio tirpalo ruošimas: 1,5 mg mevinolino arba monakolino K standarto (Sigma- Aldrich) ištirpinta 0,5 ml metanolio. Tyrimo metodika: Mėginiai analizuoti ESC metodu su UV detektoriumi. Naudota C18 kolonėlė, judančioji fazė: acetonitrilas/vanduo (55:45,V/V) (ph=2,5, koreguota su H3PO4). Analizė atlikta per 20 minučių esant 26 C temperatūrai, eliuento greitis 2 ml/min. Aptikimas atliktas su UV detektoriumi, esant 238 nm bangos ilgiui.

20 20 Nustatyta, kad RMFR produkte, inkapsuliuotame atliekant DP, monakolino K kiekis 898,7 μg/g, o RMFR produkte, inkapsuliuotame atliekant DŠ, monakolino K kiekis 1458,3 μg/g. Chromatogramoje parodyta monakolino K smailė DŠ metodu (4A pav.) buvo didesnė ir suteikė geresnę skiriamąją gebą nei DP metodu (4B pav.) [4]. 4 pav. Monakolino K chromatograma inkapsuliuotame produkte DŠ (A) ir DP (B) [4]

21 21 2. TYRIMO METODIKA IR METODAI 2.1. Tyrimo objektas Šiam tyrimui pasirinkti įvairiose Europos šalyse pagaminti ir Lietuvoje notifikuoti 3 maisto papildai, kurie savo sudėtyje turi monakolino K. Tyrimo metu analizuojami šie preparatai: maisto papildas 1 (MP_1), ES; maisto papildas 2 (MP_2), Vokietija; maisto papildas 3 (MP_3), Danija. Eksperimentiniam tyrimui pasirinktų maisto papildų sudėtis pateikiama 2 lentelėje. 2 lentelė. Eksperimentiniam tyrimui pasirinktų maisto papildų sudėtis Preparato pavadinimas Sudėtis Veikliosios medžiagos kiekis 1 tabl./kaps. Farmacinė forma Augaliniai steroliai, užpildas dikalcio fosfatas, užpildas mikrokristalinė celiuliozė, raudonosiomis mielėmis Raudonosiomis fermentuotų ryžių (Monascus mielėmis fermentuotų Maisto papildas 1; (MP_1) purpureus) milteliai, kuriuose yra monakolino K, lipnumą reguliuojančios medžiagos silicio dioksidas, natrio krakmolo glikolatas, ryžių (Monascus purpureus) milteliai (3 proc.) - 333,4 mg, kuriuose yra Tabletės magnio stearatas, stabilizatorius monakolino K - 10 skersinio ryšio natrio mg. karboksimetilceliuliozė, glajinė medžiaga hipromeliozė. Rafinuotas sojų pupelių aliejus, želatina, cholino bitartratas, Maisto papildas 2; (MP_2) raudonosiomis mielėmis fermentuotų ryžių ekstraktas, kuriame yra monakolinas K, iš dalies hidrintas sojų pupelių aliejus, drėgmę išlaikančios Raudonosiomis mielėmis fermentuotų ryžių ekstraktas, kuriame yra Kapsulės medžiagos glicerolis ir sorbitolis, monakolino K - 10 visiškai hidrintas sojų pupelių aliejus, mg.

22 22 emulsiklis sojos lecitinas, išgrynintas vanduo, dažikliai geležies oksidai. Standartizuoti raudonosiomis mielėmis fermentuotų ryžių milteliai (Monascus purpureus), kuriuose yra Standartizuoti monakolino K, užpildas raudonosiomis mikrokristalinė celiuliozė, lipnumą mielėmis fermentuotų Maisto papildas reguliuojanti medžiaga dikalcio ryžių milteliai 3; fosfatas, glajinė medžiaga (Monascus purpureus) Tabletės (MP_3) hidroksipropilmetilceliuliozė, dažiklis mg, kuriuose yra titano dioksidas, kietiklis silicio monakolino K - 10 dioksidas, dažiklis geležies oksidas, mg. glajinės medžiagos talkas ir polietilenglikolis, stabilizatorius riebalų rūgščių magnio druskos Kokybinis ir kiekybinis monakolino K nustatymas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos (EPC) metodu Naudoti reagentai Šiame tyrime naudotos medžiagos, tirpikliai ir reagentai buvo analitinio švarumo. Monakolino K standartas (Mevinolinas iš Aspergillus r.), 98 proc., Sigma Aldrich, Vokietija; Metanolis 99,9 proc., Sigma Aldrich, Vokietija; Dichlormetanas 99,8 proc., Sigma Aldrich, Vokietija; Etilo acetatas 99,5 proc., Sigma Aldrich, Vokietija.

23 Naudota aparatūra 23 Standarto ir analizei skirtų medžiagų svėrimui naudotos Shimadzu AUW120D (Duisburg, Vokietija) svarstyklės. Analizei skirtų tablečių smulkinimui naudotos grūstuvė ir piestelė, o kapsulių pradūrimui pincetas. Standartas ir analizėi skirti mėginiai ištirpinti ultragarso vonelėje BioSonic UC100 (Ohio, JAV) ir centrifuguoti Centurion Scientific C2 Series (Anglija) centrifugoje. Chromatografinė analizė atlikta CAMAG Twin Trough Chamber 10x10 cm (Muttenz, Šveicarija) kameroje. Tyrimui naudotos chromatografinės stiklinės plokštelės, padengtos silikagelio sluoksniu TLC Silica Gel 60 F254, Merck, (Vokietija) 5x10 cm ir stiklinės silikagelio sluoksniu ir florescuojančiu indikatoriumi padengtos Pre-coated TLC plates Nano ADAMANT UV254, Machenerey-Nagel, (Vokietija) 10x10 cm plokštelės. Tiriamieji mėginiai ant plokštelės užnešti naudojant 100 μl Camag Linomat Syringe (Muttenz, Šveicarija) mikrošvirkštą ir pusiau automatinį mėginių užnešėją CAMAG Linomat 5 (Muttenz, Šveicarija). Tyrimo metu gauti chromatografinės plokštelės duomenys analizuoti naudojant vizualizavimo prietaisą CAMAG TLC Visualizer (Šveicarija) Etaloninio tirpalo ruošimas Pasverta 10 mg monakolino K standarto ir perkelta į 10 ml matavimo kolbą, kurioje jis ištirpintas 10 ml metanolio. Tirpinimas vykdytas ultragarso vonelėje 30 minučių. Išėmus iš vonelės gautas tirpalas centrifuguotas 20 minučių. Po to tirpalas filtruotas per 0,45 μm porų dydžio membraninį filtrą ir naudotas chromatografinei analizei. Gautas 1 mg/ml standartinis monakolino K tirpalas. Remiantis mokslininkų, V. Pandey, V. Varshney, A. Pandey, atlikto tyrimo rekomendacijomis, etaloninio tirpalo ruošimui kaip tirpiklis naudotas metanolis [41] Tiriamųjų tirpalų ruošimas Tiriamųjų mėginių tirpalai paruošti remiantis mokslininkų, S. Asthana, V. Kaur, P. Chawla, SA. Saraf, atliktu tyrimu [50]. Tiriamųjų mėginių ruošimas iš tablečių: Paimtos 2 tiriamųjų maisto papildų tabletės. Jos pasvertos bei nustatytas jų vidutinis svoris. Tabletės susmulkintos grūstuvėje. Tablečių tritūracijos svoris, atitinkantis 10 mg monakolino K,

24 24 perkeltas į 10 ml matavimo kolbą ir ištirpintas 10 ml metanolio. Tada ekstrahuota ultragarso vonelėje 30 minučių, vėliau gautas tirpalas centrifuguotas 20 minučių. Po to tirpalas filtruotas per 0,45 μm porų dydžio membraninį filtrą ir naudotas chromatografinei analizei. Tiriamojo mėginio ruošimas iš kapsulių: Paimtos 2 tiriamųjų maisto papildų kapsulės. Jos pradurtos pincetu. Kiekvienos kapsulės turinys išspaustas, pasvertas, nustatytas vidutinis svoris. Abiejų kapsulių turinys sumaišytas. Kapsulių turinio svoris, atitinkantis 10 mg monakolino K, perkeltas į 10 ml matavimo kolbą ir ištirpintas 10 ml metanolio. Gautas tirpalas ekstrahuotas ultragarso vonelėje 30 minučių, vėliau centrifuguotas 20 minučių. Po to tirpalas filtruotas per 0,45 μm porų dydžio membraninį filtrą ir naudotas chromatografinei analizei Analizės eiga Tyrimo pradžioje buvo paruošta tirpiklių sistema, sudaryta iš dichlormetano ir etilo acetato (7:3) ir supilta į chromatografavimo kamerą [51]. Prieš įdedant chromatografinę plokštelę, kamera laikoma uždengta, kad pasklistų tirpiklių sistemos garai. Po 10 μl standarto ir tiriamųjų mėginių tirpalų užnešti ant chromatografinės stiklinės silikageliu dengtos plokštelės (5x10 cm) pusiau automatiniu mėginių užnešėju. Plokštelė su užneštais standarto ir tiriamųjų medžiagų tirpalais įdėta į chomatografavimo kamerą. Tada laukta kol tirpiklių sistema pakils iki pabaigos linijos. Chromatografavimo trukmė 30 minučių. Vėliau plokštelė išimta iš kameros ir išdžiovinta traukos spintoje esant kambario temperatūrai. Chromatografinė plokštelė stebėta prie 254 nm UV šviesos bangos ilgio naudojant vizualizavimo prietaisą. Analizė pakartota dar du kartus. Analogiškai atliktas bandymas naudojant stiklines silikagelio sluoksniu ir florescuojančiu indikatoriumi padengtas plokšteles (10x10 cm). Analizė vėl pakartota du kartus. Monakolino K kokybinis identifikavimas patvirtintas lyginant tiriamųjų tirpalų gautas Rf reikšmes su monakolino K standarto Rf reikšmėmis. Monakolino K kiekybinio tyrimo duomenys analizuoti programine įranga ir monakolino K kiekis apskaičiuotas pagal kalibracinę kreivę Kokybinis ir kiekybinis monakolino K nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu

25 Naudoti reagentai 25 Šiame tyrime naudotos medžiagos, tirpikliai ir reagentai buvo analitinio švarumo. Monakolino K standartas (Mevinolinas iš Aspergillus r.), 98 proc., Sigma Aldrich, Vokietija; 0,1 proc. Trifluoracto rūgštis 99,7proc., Sigma Aldrich, Vokietija; Acetonitrilas 99,9 proc., Sigma Aldrich, Vokietija; Metanolis 99,9 proc., Sigma Aldrich, Vokietija Naudota aparatūra Standarto ir analizei skirtų medžiagų svėrimui naudotos Shimadzu AUW120D (Duisburg, Vokietija) svarstyklės. Analizei skirtų tablečių smulkinimui naudota grūstuvė ir piestelė, o kapsulių pradūrimui pincetas. Standartas ir analizėi skirti mėginiai ištirpinti ultragarso vonelėje BioSonic UC100 (Ohio, JAV) ir centrifuguoti Centurion Scientific C2 Series (Anglija) centrifugoje. Monakolinui K išskirti naudota ACE18 250x4,6 mm kolonėlė (Advanced Chromatography Technologies, Škotija), sorbendo dalelių dydis 5 μm. Tyrime naudotas Waters 2695 (Miliford, JAV) chromatografas, o junginių aptikimui pritaikytas fotodiodų matricos detektorius Waters 996 (Miliford, JAV). Analičių detekcija vykdyta nm bangų ilgio diapazone Etaloninio tirpalo ruošimas Etaloninis monakolino K tirpalas paruoštas su metanoliu. Pasverta 10 mg monakolino K standarto ir perkelta į 10 ml matavimo kolbą, kurioje jis ištirpintas 10 ml metanolio. Tirpinimas vykdytas ultragarso vonelėje 30 minučių. Išėmus iš vonelės gautas tirpalas centrifuguotas 20 minučių, o po to filtruotas per 0,45 μm porų dydžio membraninį filtrą Tiriamojo tirpalo ruošimas Tiriamųjų mėginių ruošimas iš tabletės:

26 26 Viena tiriamojo maisto papildo tabletė susmulkinta grūstuvėje. Turinys perketas į 10 ml matavimo kolbą ir ištirpintas 10 ml metanolio. Tada ekstrahuota ultragaro vonelėje 30 minučių, vėliau gautas tirpalas centrifuguotas 20 minučių. Po to tirpalas filtruotas per 0,45 μm porų dydžio membraninį filtrą ir praskiestas dar 10 kartų. Gautas tirpalas naudotas chromatografinei analizei. Tiriamojo mėginio ruošimas iš kapsulės: Vienos tiriamojo maisto papildo kapsulė pradurta pincetu. Jos turinys perkeltas į 10 ml matavimo kolbą ir ištirpintas 10 ml metanolio. Tada ekstrahuota ultragaro vonelėje 30 minučių, vėliau gautas tirpalas centrifuguotas 20 minučių. Po to tirpalas filtruotas per 0,45 μm porų dydžio membraninį filtrą ir praskiestas dar 10 kartų. Gautas tirpalas naudotas chromatografinei analizei Analizės eiga Monakolino K nustatymui pritaikytas gradientinis eliuavimas. Mobili fazė sudaryta iš eliuento A: 0,1 proc. trifluoracto rūgšties ir eliuento B: acetonitrilo (3 lentelė). Kolonėlės temperatūra 30 C. Mobilios fazės tekėjimo greitis 1,0 ml/min. Analizėje naudotas injekcijos tūris 10 μl. Detekcijai naudotas 235 nm UV šviesos bangos ilgis. Vieno mėginio chromatografavimo trukmė 22 min. Sulaikymo laikas apie 11,53 min. 3 lentelė. Mobilios fazės gradientinės sistemos kitimas Laikas (min.) Judančioji fazė A (proc.) Judančioji fazė B (proc.)

27 2.4. Duomenų analizė 27 Tyrimo metu gauti duomenys analizuoti šiomis programinėmis įrangomis: Camag VisionCATS v2.0 (Muttenz, Šveicarija), Empower Chromatography Data Software (Waters Corporation, Milford, JAV) ir Microsoft Office Excel 2018 (Microsoft, JAV).

28 28 3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS 3.1. Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos (EPC) metodo pritaikymas Tirpiklių sistemos parinkimas Analizės metu bandytos įvairios tirpiklių sistemos. Pirmiausia, remiantis V. Pandey ir kt. [41] rekomendacijomis kokybiniam EPC metodui pasirinkta tirpiklių sistema: chloroformas metanolis (95:5). Atlikus chromatografavimą ir įdėjus plokštelę į vizualizavimo prietaisą nesimatė chromatografinių dėmelių. Dėl šios priežasties tirpiklių santykis buvo sumažintas ir analizė buvo bandoma iš naujo. Tirpiklių sistemą sudarė: chloroformas metanolis (47:2,5). Kadangi atlikus chromatografinę analizę dėmelių vis tiek nesimatė, įvertinta, jog ši tirpiklių sistema nėra tinkama kokybiniam monakolino K nustatymui. Remiantis AA. Shindia [51] rekomendacijomis EPC analizei pasirinkta tirpiklių sistema sudaryta iš dichlormetano etilo acetato (7:3). Chromatografavimui panaudojus šią tirpiklių sistemą ir patalpinus plokštelę į vizualizavimo prietaisą chromatografinės dėmelės išryškėjo esant 254 nm bangos ilgiui Kokybinis monakolino K įvertinimas maisto papilduose efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos (EPC) metodu Monakolino K kokybinė analizė atlikta taikant EPC metodą. Analizė atlikta tris kartus. Tyrimo metu apskaičiuoti šie duomenys: monakolino K standartinio tirpalo bei tiriamųjų tirpalų Rf vidurkiai, standartinis nuokrypis, paklaida ir pasikliautinasis intervalas (4 lentelė). Skaičiavimai atlikti, kai pasikliautinasis lygmuo 0,95 ir klaidos tikimybė 0,05.

29 29 4 lentelė. Monakolino K Rf reikšmių vertinimas Tiriamoji medžiaga Rf reikšmių vidurkis Standartinis nuokrypis Paklaida Pasikliautinasis intervalas Monakolino K standartinis tirpalas 0,444 0,010 0,006 0,420 0,468 MP_1 0,442 0,019 0,011 0,395 0,489 MP_2 0,447 0,014 0,008 0,412 0,481 MP_3 0,442 0,016 0,009 0,403 0,480 Iš 4 lentelės duomenų galima spręsti, kad Rf reikšmės patenka į pasikliautinųjų intervalų ribas, o paklaidos neviršija 0,05 proc. ribos, todėl šis metodas yra tinkamas monakolino K analizei. 6 pav. EPC analizės chromatograma

30 30 EPC metodu buvo analizuoti trys maisto papildai (6 pav.). Chromatogramoje matomos dėmelės yra skirtingo ryškumo. Maisto papilduose MP_2 ir MP_3 dėmelės yra ryškesnės už MP_1 dėmelę. Tai galima paaiškinti tuo, jog MP_1 sudėtyje RMFR miltelių yra labai mažas kiekis (3 proc.), todėl monakolino K dėmelė nėra tokia ryški lyginant su kitomis maisto papildų dėmelėmis. Nors dėmelių ryškumas skiriasi, visų trijų tiriamųjų maisto papildų Rf reikšmės sutampa su monakolino K standartinio tirpalo Rf reikšme (Rf = 0,44). Indonezijoje, SA. Rashid ir kitų mokslininkų, atlikto tyrimo metu buvo nustatinėjamas monakolinas K, gautas fermentuojant ryžius Aspergillus tamarii grybeliu ir lyginamas su komerciniais statinų preparatais. Tyrimo chromatomatogramoje matoma, jog analizuojamųjų mėginių dėmelės, CS2 lovastatino ir ES monakolino K, nėra vienodo ryškumo, tačiau jų Rf reikšmės sutampa (Rf = 0,59) (7 pav.) [55]. 7 pav. EPC chromatograma. CS1 komercinis simvastatino standartas (Rf = 0,625); CS2 komercinis lovastatino standartas (Rf = 0,59); ES monakolinas K, gautas iš A.tamarii fermentuotų ryžių, (Rf = 0,59) [55] Apibendrinant eksperimento ir kito tyrimo metu gautus rezultatus galima teigti, jog abiejų tyrimų chromatogramose monakolino K Rf reikšmė sutampa su standartinio tirpalo Rf reikšme. Iš šio

31 31 eksperimento metu gautų rezultatų galima spręsti, kad EPC metodas yra efektyvus ir tinkamas maisto papilduose esančio monakolino K identifikavimui Kiekybinis monakolino K įvertinimas maisto papilduose efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos (EPC) metodu Atliekant kiekybinę EPC analizę buvo pagaminti 5 skirtingų koncentracijų etaloniniai monakolino K tirpalai ir sudaromas kalibracinis grafikas (8 pav.). Kalibracinė kreivė sudaryta šiose ribose: 1,05 0,3002 mg/ml. Tyrimo metu apskaičiuotas standartinis nuokrypis 5,59. Kalibracinio grafiko lygtis: y = -1, , x, y monakolino K smailės plotas, x nustatomas monakolino K kiekis. Remiantis kalibracinio grafiko lygtimi apskaičiuojamas monakolino K kiekis tiriamuosiuose maisto papilduose. 8 pav. Monakolino K kalibracinis grafikas Kiekybinė EPC analizė atlikta trims maisto papildams su RMFR, kurių sudėtyje yra monakolinas K. Kiekybinis monakolino K įvertinimas atliktas naudojant gautą kalibracinę lygtį, į kurią įstatomas chromatografinės smailės užimamas plotas. Tyrimo metu gauti matavimo vienetai perskaičiuoti ir suvienodinti su monakolino K matavimo vienetais, nurodytais maisto papildų etiketėse. Gauti rezultatai pateikiami diagramoje (9 pav.).

32 32 9 pav. EPC metodu nustatytų monakolino K kiekių tiriamuosiuose maisto papilduose palyginimas su maisto papildų etiketėse nurodytais monakolino K kiekiais Remiantis diagramos duomenimis mažiausias monakolino K kiekis nustatatytas MP_1 3,24 ± 0,008 mg. Tai sudaro 32,4 proc. maisto papildo etiketėje nurodyto monakolino K kiekio. Daugiausiai monakolino K nustatyta MP_2 7,12 ± 0,008 mg. Šis kiekis sudaro 71,2 proc. preparato etiketėje nurodyto monakolino K kiekio. MP_3 nustatytas monakolino K kiekis 5,30 ± 0,01 mg. Tai sudaro 53,0 proc. maisto papildo etiketėje nurodyto monakolino K kiekio. Tarp EPC analizės metu gautų rezultatų ir maisto papildo etiketėje nurodyto monakolino K kiekio, statistiškai reikšmingas ryšys nebuvo nustatytas, p>0,05. Apibendrinant tyrimo rezultatus galima teigti, jog EPC metodas yra tinkamas monakolino K kokybinei ir kiekybinei analizei. Šio eksperimento ir mokslinių tyrimų metu monakolinas K buvo identifikuotas pasirinktuose maisto papilduose. Analizės metu buvo nustatytas monakolino K kiekis, kuris buvo palygintas su maisto papildų etiketėse nurodytu monakolino K kiekiu Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodo pritaikymas ESC metodui mobili fazė pasirinkta pagal TD Silva ir kt. mokslininkų [54] atliktą tyrimą. Ši mobili fazė susideda iš eliuento A: 0,1 proc. trifluoracto rūgšties ir eliuento B: acetonitrilo. Pasirinktas mobilios fazės gradientinės sistemos kitimas pateiktas 3 lentelėje.

33 Kokybinis monakolino K įvertinimas maisto papilduose efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu ESC metodu atlikta kokybinė monakolino K analizė. Jos tinkamumui įvertinti bandymas kartotas penkis kartus. Apskaičiuoti monakolino K standarto ir tiriamųjų tirpalų sulaikymo laikų vidurkiai, standartinis nuokrypis, paklaida ir pasikliautinasis intervalas (5 lentelė). Rezultatai skaičiuoti, kai pasikliautinasis lygmuo 0,95 ir klaidos tikimybė 0,05. 5 lentelė. Monakolino K sulaikymo laikų vertinimas Tiriamoji medžiaga Monakolino K standartinis tirpalas Sulaikymo laikų Standartinis Pasikliautinasis Paklaida vidurkis nuokrypis intervalas (min.) 11,534 0,003 0,002 11,530 11,539 MP_1 11,538 0,019 0,011 11,490 11,587 MP_2 11,535 0,023 0,013 11,478 11,593 MP_3 11,537 0,027 0,015 11,471 11,603 5 lentelėje galima matyti, kad sulaikymo laikai patenka į pasikliautinųjų intervalų ribas, o paklaidos neviršija 0,05 proc. ribos, todėl šis metodas yra tinkamas monakolino K analizei Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodo validavimas Siekiant įvertinti analizės metu taikyto efektyviosios skysčių chromatografijos metodo tinkamumą kiekybiniam įvertinimui buvo atlikta metodo validacija. Jos metu nustatyti šie parametrai: specifiškumas, tiesiškumas, glaudumas (preciziškumas), aptikimo riba ir nustatymo riba.

34 Specifiškumas 34 Specifiškumo parametras vertintas lyginant monakolino K standartinio tirpalo (10 pav.) ir tiriamųjų medžiagų chromatogramas (11 pav.), sulaikymo laikus ir UV šviesos absorbcijos spektrus. Monakolino K standartinio tirpalo chromatograma ir tiriamųjų maisto papildų tirpalų chromatogramos stebėtos esant 235 nm bangos ilgiui. 10 pav. Monakolino K standartinio tirpalo chromatograma 11 pav. Maisto papildų, turinčių monakolino K chromatogramos (A MP_1; B MP_2; C MP_3)

35 35 Chromatogramose pastebėta, kad monakolino K standarto ir tiriamųjų mėginių tirpalų smailės ir sulaikymo laikai sutampa. Be to, sutampa ir monakolino K standartinio tirpalo UV šviesos absorbcijos spektras su tiriamųjų tirpalų UV šviesos absorbcijos spektru. Apibendrinant duomenis galima teigti, kad šis metodas atitinka specifiškumo kriterijus Tiesiškumas Tiesiškumui įvertinti buvo pagaminti 5 skirtingų koncentracijų etaloniniai monakolino K tirpalai. Kalibracijos koncentracijų ribos: 13,5 0,844 μg/ml. Pagamintiems tirpalams atliktas chromatografavimas. Kalibracinė kreivė sudaryta remiantis skirtingomis monakolino K etaloninio tirpalo koncentracijomis ir smailių plotu (12 pav.). 12 pav. Monakolino K kalibracinė kreivė Monakolino K kiekis tiriamuosiuose mėginiuose apskaičiuotas pagal kalibracinės kreivės lygtį: y = 3, x + 3, , y monakolino K smailės plotas, x monakolino K etaloninio tirpalo koncentracija. Remiantis šia lygtimi apskaičiuotos monakolino K koncentracijos tiriamųjų maisto papildų mėginiuose. Tyrimo metu gautas monakolino K kalibracinės kreivės koreliacijos koeficientas R 2 = 0, yra arti vieneto, todėl galima teigti, jog tiesiškumo kriterijus atitinka keliamus reikalavimus.

36 Glaudumas (preciziškumas) 36 Šis parametras buvo vertintas pagal standartinį nuokrypį (angl. Standard deviation) (SD) (proc.). Kiekybinėje analizėje SD turi būti 5 proc. vienai dienai ir 10 proc. dviems dienoms. Monakolino K standarto vienos dienos atsikartojamumas 0,8 proc. (13 pav.), dviejų dienų tarpinis preciziškumas 0,7 proc. (14 pav.). Atsikartojamumui įvertinti mėginiai injekuoti tą pačią dieną 5 kartus, o tarpiniam preciziškumui įvertinti dvi dienas iš eilės po 5 kartus. 13 pav. Monakolino K atsikartojamumas 14 pav. Monakolino K tarpinis preciziškumas

37 Aptikimo ir nustatymo ribos 37 Šios analizės metu nustatytos aptikimo ir nustatymo ribos. Aptikimo riba 0,210 μg/ml, nustatymo riba 0,789 μg/ml Kiekybinis monakolino K įvertinimas maisto papilduose efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu Kiekybinis tyrimas atliktas trims maisto papildams, savo sudėtyje turintiems monakolino K. Atlikus ESC analizę, buvo vertinamas monakolino K kiekis tiriamuosiuose maisto papildų mėginiuose. Monakolino K kiekis apskaičiuojamas pagal programinės įrangos sudarytą kalibracinės kreivės lygtį: y = 3, x + 3, , y smailės plotas, x tiriamosios medžiagos kiekis. Analizės metu tirti maisto papildų mėginiai buvo praskiesti 10 kartų, todėl gauti rezultatai perskaičiuoti ir suvienodinti su maisto papildų etiketėse nurodytais monakolino K vienetais, šiuo atveju miligramais (mg). Gauti tyrimo rezultatai pavaizduoti diagramoje (15 pav.). 15 pav. ESC metodu nustatytų monakolino K kiekių tiriamuosiuose maisto papilduose palyginimas su maisto papildų etiketėse nurodytais monakolino K kiekiais

38 38 Didžiausias monakolino K kiekis nustatytas MP_2 8,76 ± 0,05 mg. Šis kiekis sudaro net 87,6 proc. preparato etikėtėje nurodyto monakolino K kiekio. Mažiausias monakolino K kiekis nustatytas MP_1 3,44 ± 0,06 mg, todėl sudaro tik 34,4 proc. preparato etikėtėje nurodyto kiekio. MP_3 nustatytas monakolino K kiekis 5,14 ± 0,09 mg. Tai sudaro 51,4 proc. preparato etikėtėje nurodyto monakolino K kiekio. Tarp šios analizės metu gautų rezultatų ir maisto papildo etiketėje deklaruojamo monakolino K kiekio statistiškai reikšmingas ryšys nebuvo nustatytas, p>0,05. JAV, D. Heber ir kitų mokslininkų, atliktos analizės metu buvo tiriami devyni maisto papildai, savo sudėtyje turintys RMFR. Tyrimo metu buvo nustatinėjamas monakolino K kiekis esantis vienoje maisto papildo kapsulėje. Visose maisto papildų pakuočių etiketėse buvo nurodyta, jog vienoje tabletėje ar kapsulėje yra 10 mg monakolino K. Rezultatai atskleidė, jog maisto papilde A monakolino K kiekis buvo 1,35 mg, maisto papilde B 2,87 mg, maisto papilde C 1,80 mg, maisto papilde D 3,37 mg, maisto papilde E 0,15 mg, maisto papilde F 2,86 mg, maisto papilde G 2,51 mg, maisto papilde H 1,56 mg, maisto papilde I 2,46 mg [52]. Italijoje, L. Di Donna ir kitų mokslininkų, atlikto tyrimo metu buvo nustatinėjamas monakolino K kiekis, esantis maisto papilduose. Visose maisto papildų pakuočių etiketėse buvo nurodyta, jog vienoje tabletėje yra 10 mg monakolino K. Šios analizės metu nustatytas monakolino K kiekis, esantis vienoje tabletėje, buvo toks: maisto papilde A 5,17 mg, maisto papilde B 3,57 mg, maisto papilde C 4,14 mg [53]. Apibendrinat eksperimento rezultatus galima teigti, kad ESC metodas yra selektyvus ir tinkamas monakolino K kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui. Šio eksperimento ir mokslinių tyrimų metu atskleista, jog maisto papildų etiketėse yra nurodytas didesnis monakolino K kiekis nei nustatytas ESC metodu Tyrimo metu nustatytų ir maisto papildų etiketėse deklaruojamų monakolino K kiekių palyginimas EPC ir ESC analizių rezultatai pateikti 9 ir 15 paveikslėliuose. Tyrimui pasirinktų maisto papildų etiketėse deklaruojama, jog preparatuose yra 10 mg monakolino K. Kad būtų lengviau palyginti rezultatus, 16 paveikslėlyje pateikiama ESC metodu nustatytų ir maisto papildų etiketėse deklaruojamų monakolino K kiekių skirtumo, procentinė išraiška.