Veršelių žarnyno ligų patomorfologinė analizė

Transkriptas

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA Veterinarijos fakultetas Daumantas Pekšys Veršelių žarnyno ligų patomorfologinė analizė Pathomorphological analysis of intestinal diseases in calves Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS Darbo vadovas: doc. dr. Alius Pockevičius Kaunas, 2016

2 DARBAS ATLIKTAS UŽKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas Veršelių žarnyno ligų patomorfologinė analizė. 1. Yra atliktas mano paties. 2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje. 3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. (data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. (data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO (data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (aprobacijos data) (katedros vedėjo (-os) vardas, pavardė) (parašas) Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1) 2) (vardas, pavardė) Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas: (parašai) (data) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas, pavardė) (parašas) 2

3 TURINYS SANTRUMPOS... 5 SANTRAUKA... 6 SUMMARY... 7 ĮVADAS LITERATŪROS APŽVALGA Plonųjų žarnų histologinė sandara Storųjų žarnų histologinė sandara Veršelių viduriavimas Patogenai, dažniausiai sukeliantys veršelių žarnyno ligas Escherichia coli Clostridium perfringens Salmonella spp Cryptosporidium parvum Rotavirusai Koronavirusai Herpesvirusai MEDŽIAGOS IR METODAI Patologinis anatominis tyrimas Histopatologinis tyrimas Mėginių paruošimas Dažymas hematoksilinu eozinu (H E) Statistinė analizė REZULTATAI Savų patomorfologinių tyrimų rezultatų analizė Bendrieji duomenys Plonųjų ir storųjų žarnų histologiniai pokyčiai

4 Plonųjų ir storųjų žarnų histologinių pokyčių statistinė analizė Patologijos centre atliktų veršelių gaišenų patologinio anatominio tyrimo rezultatų analizė Anketos duomenų analizė REZULTATŲ APTARIMAS IŠVADOS LITERATŪROS SĄRAŠAS PRIEDAI

5 SANTRUMPOS GALT gut-associated lymphoid tissue su žarna susijęs limfoidinis audinys GVD Galvijų virusinė diarėja GVDV Galvijų virusinės diarėjos virusas GRV Galvijų rotavirusas GCoV Galvijų koronavirusas GToV Galvijų torovirusas ETEC Enterotoksigeninė Escherichia coli IgG Imunoglobulinas G HE dažyta hematoksilinu ir eozinu 5

6 SANTRAUKA Veršelių žarnyno ligų patomorfologinė analizė Daumantas Pekšys Magistro baigiamasis darbas Buvo atliktas patologinis anatominis tyrimas 32 veršelių gaišenoms, iš kurių buvo paimta 20 plonųjų ir storųjų žarnų mėginių histopatologiniam tyrimui. Taip pat buvo išanalizuotos dažniausios 72 veršelių gaišimo priežastys pagal LSMU VA Užkrečiamųjų ligų katedros Patologijos centro metų skrodimo duomenis bei pagal atliktos veterinarijos gydytojų apklausos duomenis. Vertinant nustatytų patologijų dažnumą buvo atliekami skaičiavimai ir nustatomas statistinis patikimumas. Gauti tyrimų rezultatai palyginti su užsienio ir Lietuvos autorių publikacijomis. Nustatyta, kad dažniausios veršelių gaišimo priežastys gyvulininkystės ūkiuose yra virškinimo sistemos susirgimai. Privačių veterinarijos gydytojų apklausos duomenimis, 57 proc. veršelių gaišimo priežasčių yra virškinamojo trakto ligos. Atliekant retrospektyvią metų Patologijos centro veršelių skrodimo duomenų analizę nustatyta, kad 67 proc. veršelių gaišimo priežasčių buvo susiję su virškinimo sistema. Dažniausios žarnyno patologijos, nustatytos veršeliams, buvo ūmus katarinis enterokolitas (38 proc.) ir ūmus katarinis enteritas (21 proc.). Savo tyrimo metu atliekant patologinį anatominį tyrimą dažniausiai nustatytos patologijos buvo ūmus katarinis enteritas (40 proc.) ir ūmus katarinis enterokolitas (20 proc.). Histopatologinio tyrimo duomenimis dažniausiai nustatytos plonųjų žarnų patologijos buvo limfocitinis plazmocitinis uždegimas (90 proc.), gaurelių atrofija (70 proc.) ir gleivinės nekrozė (55 proc.). Storosiose žarnose dažniausiai aptikta limfocitinis plazmocitinis uždegimas (95 proc.) bei gleivinės nekrozė (40 proc.). Taip pat nustatyta, kad plonojo žarnyno pažeidimų aptikta daugiau ir jie buvo sunkesni nei storajame žarnyne. Raktažodžiai: veršeliai, žarnynas, ligos, patomorfologija. 6

7 SUMMARY Pathomorphological analysis of intestinal diseases in calves Daumantas Pekšys Master s Thesis A post-mortem examination of 32 dead calves was carried out and 20 samples of small and large intestine were collected for histopathological analysis. The most common causes of death in 72 calves was analysed according to data from autopsies carried out during year The data was collected from the LUHS VA DID Pathology centre database. Also, a large animal veterinarians survey was carried out to find out the most common intestinal diseases. Data collected was analysed statistically and compared to results from other foreign and Lithuanian studies. The most common causes of death in calves were related to the disorders of digestive system. Large animal veterinarians survey suggested, that 57 % causes of calf death were gastrointestinal diseases. Retrospective analysis of calf autopsies during year in Pathology cetre revealed, that 67 % of death causes in calves were related to digestive system diseases. The most common pathologies found in the intestines of calves were acute catarrhal enterocolitis (38 %) and acute catarrhal enteritis (21 %). Own data of a post-mortem examination revealed that the most common pathologies were acute catarrhal enteritis (40 %) and acute catarrhal enterocolitis (20 %). Pathomorphological analysis of my own study revealed that the most common pathologies in the small intestine were lymphocytic plasmacytic inflammation (90 %), villous atrophy (70 %) and necrosis of mucosa (55 %). The most common pathologies in the large intestine were lymphocytic plasmacytic inflammation (95 %), and necrosis of mucosa (40 %). It was noticed, that lesions in the small intestine were more common and severe than those found in the large intestine. Key words: calves, intestine, diseases, pathomorphology. 7

8 ĮVADAS Veršelių žarnyno ligos ir pagrindinis jų požymis viduriavimas (dar vadinama veršelių diarėja) yra vienas dažniausiai pasitaikančių simptomų ir viena pagrindinių ekonominių nuostolių galvijininkystėje priežasčių metų Junginių Valstijų pieninių galvijų Nacionalinės gyvūnų sveikatos stebėsenos sistemos duomenimis, 57 proc. veršelių iki 31 dienos amžiaus mirties priežasčių buvo žarnyno ligos (1). Labai panašus gaištamumas tarp pieninių veršelių iki 31 dienos amžiaus dėl žarnyno ligų aprašomas ir Pietų Korėjoje 53,4 proc. visų gaišimo priežasčių (2). Skaičiuojama, kad ekonominiai nuostoliai, susiję su veršelių žarnyno susirgimais Norvegijoje, kurioje per metus užauginama apie veršelių, siekia apie 10 milijonų JAV dolerių per metus (3). Lietuvoje ši problema taip pat aktuali ir kelia daug nuostolių galvijų augintojams bei veterinarijos gydytojams. Remiantis Lietuvos mokslininkų atliktais tyrimais, 1999 metais tarp visų užregistruotų galvijų ligų net 36,27 proc. sudarė virškinimo organų ligos, o iš jų net 61,29 proc. gydytų galvijų buvo veršeliai metais tarp visų užregistruotų galvijų susirgimų virškinimo organų ligos sudarė 29,87 proc. ir iš jų net 65,63 proc. buvo veršeliai. Lyginant gaišimo priežastis, 2002 metais Lietuvoje tarp užregistruotų 4590 nugaišusių galvijų, 2660 galvijų gaišimo priežastis buvo virškinamojo trakto ligos. Iš jų net 1920 buvo veršeliai, kas atitinka 72,18 proc., o skaičiuojant visų nugaišusių galvijų tarpe, veršeliai nugaišę dėl virškinamojo trakto ligų sudarė net 41,83 proc. (4). Net labai moderniuose ūkiuose Lietuvoje ir pasaulyje ši problema veršelių tarpe pasitaiko dažniau nei bet kurios kitos organizmo sistemos susirgimai. Dažniausios veršelių žarnyno ligų priežastys yra infekcinės kilmės, jas sukelia virusai, bakterijos arba parazitiniai pirmuonys. Susirgę veršeliai viduriuoja, netenka daug skysčių, dehidratuoja, dėl prastos savijautos atsisako maitintis ir išsekę nugaišta. Šiuo darbu bus stengiamasi atskleisti dažniausiai pasitaikančias veršelių žarnyno ligas, jų sukėlėjus, požymius, nustatomus veršeliui esant dar gyvam ir po gaišimo. Didžiausias dėmesys bus kreipiamas į patologinius anatominius pokyčius skrodimo metu bei mikroskopinius pakitimus plonosiose ir storosiose žarnose. Atlikti tyrimai gali būti naudingi tolimesniems ir išsamesniems veršelių žarnyno susirgimų tyrimams ateityje. Darbo tikslas: atlikti veršelių žarnyno ligų pasireiškimo analizę atliekant patomorfologinius tyrimus. 8

9 Darbo uždaviniai: 1. Atlikus veršelių gaišenų patologinį anatominį tyrimą ir žarnų mėginių histopatologinį tyrimą, išanalizuoti diagnozuotas žarnų patologijas ir galimą jų tarpusavio ryšį bei veršelių amžiaus įtaką nustatytiems žarnų pakitimams. 2. Atlikti retrospektyvią m. LSMU VA Patologijos centre atliktų patologinių anatominių tyrimų analizę, nustatant dažniausias veršelių gaišimo priežastis bei pasitaikiusias žarnyno patologijas. 3. Atlikti stambių gyvūnų veterinarijos gydytojų apklausos apie veterinarinėje praktikoje diagnozuojamas veršelių žarnyno ligas ir veršelių gaišimo priežastis analizę. 9

10 1. LITERATŪROS APŽVALGA 1.1. Plonųjų žarnų histologinė sandara Plonasis žarnynas yra suskirstytas į tris dalis: dvylikapirštę žarną (duodenum), tuščiąją žarną (jejunum) bei klubinę žarną (ileum) (5,6). Visų žarnų sienelę histologiškai galima suskirstyti į 4 sluoksnius: gleivinę, pogleivinę, raumeninį sluoksnį bei adventiciją arba serozą. Gleivinės sluoksnis susideda iš epitelinių ląstelių, išklojančių žarnų spindį bei mezenchiminių ląstelių, kurios sudaro gleivinės pamatinę membraną bei raumeninį gleivinės sluoksnį. Šių ląstelių tipų, jų funkcijų virškinimo ir absorbcijos procese supratimas labai svarbus diagnozuojant žarnyno ligas (7). Visų žinduolių plonųjų žarnų gleivinės sluoksnis sudarytas iš gaurelių, kurie labai padidina žarnų paviršiaus plotą rezorbcijos procese. Atrajotojų žarnų gaureliai būna trumpi ir stori. Ties gaurelių pagrindu yra epitelio invaginacijos, vadinamos Liberkiuno (J. L. Lieberkühn) kriptomis arba žarnų liaukomis. Šios kriptos yra pagrindinis žarnų epitelio atsinaujinimo šaltinis. Gleivinės raumeninis dangalas, susidedantis iš dviejų lygiųjų raumenų sluoksnių atskiria kriptas nuo pogleivinės sluoksnio. Pogleivinė atrajotojų organizme sudaryta iš puriojo jungiamojo audinio. Raumeninis plonųjų žarnų sienelės sluoksnis sudarytas iš lygiųjų raumenų ir yra padengtas seroza (8). 1 pav. Schematinis plonosios žarnos histologinės ir anatominės sandaros vaizdas (9). Plonojo žarnyno virškinimo ir absorbcijos funkcijos yra vykdomos keleto specializuotų struktūrų. Virškinimo funkcijai atlikti reikalingi virškinimo fermentai bei nemažas kiekis gleivių, 10

11 kurios apsaugo gleivinę išklojusias ląsteles nuo mechaninių pažeidimų bei dirginančių medžiagų poveikio. Fermentus gamina stulpinės (absorbcinės) ląstelės bei kasa (pancreas) (5). Žarnų gleivinė padengta šešių tipų epitelinėmis ląstelėmis. Absorbcinės epitelinės ląstelės paprastai yra vadinamos enterocitais, taip pat yra nediferencijuotos arba kriptų epitelinės ląstelės, taurinės ląstelės, Paneto ląstelės, enterochromafininės (neuroendokrininės, argentafininės) ląstelės bei M ląstelės (7). Enterocitai yra stulpinės ląstelės, žarnų spindyje padengtos mikrogaureliais. Paviršiuje jie turi glikokaliksą, kuriame saugomi virškinimo ir absorbcijos fermentai. Daugelis maisto medžiagų yra rezorbuojama per tarpląstelinius tarpus tarp šių ląstelių. Besidaugindami enterocitai juda aukštyn kriptomis link žarnų gaurelių viršūnių, kol pasiekia ekstruzijos zoną, esančią gaurelio viršuje. Atsiskyrę enterocitai yra pašalinami su išmatų mase. Enterocitai yra greičiausiai atsinaujinančios ląstelės organizme (7). Paprastosios stulpinės žarnų liaukos (Liberkiuno kriptos) yra išklotos įvairaus tipo ląstelėmis. Pagrindinės šių liaukų ląstelės yra nediferencijuotos stulpinės ląstelės. Šios ląstelės dauginasi mitozės būdu, diferencijuojasi ir migruoja į gaurelių viršų, kartu stumdamos ir stulpines absorbcines ląsteles bei taurines ląsteles (5). Ties atrajotojų plonųjų žarnų gaurelių pagrindu yra randamos acidofilinės granuliuotos ląstelės (Pani ląstelės). Jos yra piramidės formos, su iškilusiomis sferinėmis acidofilinėmis granulėmis, išsidėsčiusiomis tarp ląstelės branduolio ir ląstelės viršūnės. Šios ląstelės yra labai diferencijuotos ir labai specializuotos. Pani ląstelės turi visas charakteristikas kaip ir fermentus produkuojančios ląstelės kasoje, ir yra pakankamai įrodymų, kad jos produkuoja peptidazes, kurios hidrolizuoja peptidų jungtis bei išskiria antibakterines medžiagas lizinus. Pani ląstelės labai svarbios reguliuojant žarnyno mikroflorą. Šių ląstelių degranuliaciją ir antimikrobinių medžiagų išsiskyrimą indukuoja priešuždegiminių citokinų (gama interferono) išsiskyrimas (5,10). Taurinių ląstelių funkcija yra gleivių sekrecija. Jos yra tiek gaurelių viršuje, tiek kriptose. Šių ląstelių skaičius didėja žarnomis judant į kaudalinę pusę (7). Enterochromafininės ląstelės, dar žinomos kaip argentafininės ląstelės dėl jų afiniškumo sidabrui, yra enteroendokrininės ląstelės. Jos aptinkamos kriptose ir išskiria serotoniną, katecholaminus, gastriną, somatostatiną, cholecistokininą, sekretiną, bombeziną, enterogliukagoną ir kitas biologiškai aktyvias medžiagas. Šios ląstelės savo produkuojamas medžiagas išskiria į aplinkinius audinius, bet ne į žarnų spindį, todėl yra endokrininės (7,11). M ląstelės, taip vadinamos dėl savo paviršiaus mikroįlinkimo, formuojančio M raidės formą. Jos formuoja epitelio kupolą, kuris dengia su žarna susijusį limfoidinį audinį (GALT). Šis audinys apima pavienius limfinius mazgus, limfinių mazgų sankaupas (Pejerio plokšteles), intraepitelinius limfocitus, subepitelinius limfocitus, plazmos ląsteles bei makrofagus. Limfoidinio audinio 11

12 sankaupos, dar vadinamos Pejerio plokštelėmis, yra aptinkamos plonosiose žarnose ir matomos kaip gleivinės iškilimai. Pagrindinė M ląstelių funkcija yra antigenų, esančių žarnų spindyje, pateikimas GALT. Kartais M ląstelės tampa infekcijos vartais tokių sukėlėjų kaip Salmonella, Yersinia, Rhodococcus spp. bei galvijų virusinės diarėjos (GVD) virusams (5,7). Brunerio (J. C. Brunner) liaukos, kurių daugiausiai yra dvylikapirštėje žarnoje, išskiria muciną, kuris dengia gleivinę, prijungia imunoglobulinus ir saugo ją nuo žalingų veiksnių (7,8). Savojoje gleivinės plokštelėje (Lamina propria) yra mezenchiminių ląstelių, kurių skaičius didėja sąveikoje su antigenais. Žarnų limfoidinis audinys sudaro apie 25 proc. viso kūno limfoidinės masės ir susideda iš ląstelių, esančių savojoje gleivinės plokštelėje ir GALT. Palyginimui ši masė yra didesnė nei blužnies (5,7) Storųjų žarnų histologinė sandara Storasis žarnynas anatomiškai taip pat yra suskirstytas į tris dalis: akląją žarną (caecum), gaubtinę žarną (colon) ir tiesiąją žarną (rectum). Tai yra vieta, kurioje vyksta mikrobinis pašaro virškinimas, vandens, vitaminų ir elektrolitų absorbcija bei gleivių sekrecija. Nors anatomiškai šios struktūros labai skiriasi, akląją, gaubtinę ir tiesiąją žarnas sunku diferencijuoti histologiškai. Lyginant su plonosiomis žarnomis pagrindiniai skirtumai yra šie: nėra gleivinės gaurelių, ilgesnės, mažiau susuktos paprastos vamzdinės žarnų liaukos su daug taurinių ląstelių, taip pat nėra acidofilinių (Pani) ląstelių bei daug didesnis limfmazgių skaičius (5). Storųjų žarnų gleivinė daug storesnė nei plonųjų, ji turi gilias kriptas. Storųjų žarnų gleivinė išklota stulpinėmis absorbcinėmis ląstelėmis, daug taurinių ląstelių, taip pat yra endokrininių ląstelių ir pamatinių kamieninių ląstelių. Atsiskyrusios paviršinės epitelio ląstelės yra pašalinamos su išmatų mase ir atsinaujina apytiksliai kas 6 dienas (8). (7). Savoji gleivinės plokštelė ir pogleivinės sluoksnis yra tokie patys kaip ir plonajame žarnyne Raumeninio sluoksnio lygieji raumenys formuoja išilgines klostes, kurios lotyniškai vadinamos taenia coli. Tiesiojoje žarnoje raumeninio sluoksnio lygieji raumenys formuoja žiedinį raumenį analinį sfinkterį (8). Naminių gyvūnų aklojoje žarnoje yra didelis kiekis limfinių mazgelių, išsidėsčiusių per visą jos ilgį. Atrajotojų aklojoje žarnoje didžiausias jų kiekis yra ties aklosios žarnos atsivėrimu į klubinės žarnos perėjimą į gaubtinę žarną (5). Atrajotojų akloji žarna yra reliatyviai maža ir neturi didelės reikšmės virškinimo procese. Čia vyksta dalis mikrobinio virškinimo. Nėra gleivinės gaurelių, gleivinėje yra gleives gaminančių liaukų, pogleivinė liaukų neturi (6). 12

13 Atrajotojų gaubtinės žarnos gleivinė yra storesnė lyginant su plonųjų žarnų gleivine. Taip yra dėl ilgų žarnų liaukų. Kadangi nėra gaurelių, gleivinės paviršius yra lygus. Taip pat lyginant su plonosiomis žarnomis yra daugiau taurinių ląstelių. Pogleivinė dažnai yra išsiplėtusi dėl gausaus limfinio audinio, kuris dažnai perauga ir raumeninį sluoksnį. Tokiais atvejais gleivinės liaukos gali tęstis ir pogleivinėje (5). Taip pat kaip ir aklosios ir gaubtinės žarnos, tiesiosios žarnos gleivinė yra lygi ir išskyrus daug didesnį kiekį taurinių ląstelių, pagrindinės histologinės struktūros yra labai panašios. Atrajotojų tiesiosios žarnos sienelė yra storesnė nei gaubtinės žarnos. Išorinis išilginis tunica muscularis sluoksnis turi daugiau elastinių skaidulų nei vidinis žiedinis sluoksnis. Kranialinė tiesiosios žarnos dalis yra padengta seroza, tuo tarpu retroperitoninė dalis yra apsupta adventicijos, kuri susilieja su dubens fascija (5). Priartėjus prie tiesiosios žarnos perėjimo į analinį kanalą, atrajotojų tiesiosios žarnos gleivinė formuoja išilgines raukšles, kurios lotyniškai vadinamos columnae rectales. Visi naminiai gyvūnai ties šia vieta turi ilgą veninį rezginį, išsidėsčiusį žarnos sienelės lamina propria (8). Analinis kanalas yra terminalinis virškinamojo trakto segmentas, kuriame ties anorektaline linija, vienasluoksnis stulpinis tiesiosios žarnos epitelis pereina į daugiasluoksnį neragėjantį plokščiąjį epitelį. Taip pat ties anorektaline linija baigiasi tiesiosios žarnos tunica muscularis išorinis išilginis sluoksnis. Vidinis žiedinis sluoksnis tęsiasi per visą analinį kanalą ir jo gale susilieja su vidiniu analiniu sfinkteriu, kuris yra apsuptas skeleto raumens, vadinamo išoriniu analiniu sfinkteriu (5). Atrajotojų analinio kanalo gleivinė yra lygi ir neturi liaukų (8) Veršelių viduriavimas Viduriavimas arba diarėja yra vienas pagrindinių žarnyno infekcijos ar kitokios kilmės žarnų pažeidimo simptomų. Viduriavimas pasireiškia kaip pasėkmė daugybės virškinamojo trakto gynybinių mechanizmų veiklos, kuriuos apima: nepatogeninės žarnyno mikrofloros (konkuruojančios su patogenine mikroflora) veikla, žarnų ir kitų liaukų sekretai, skrandžio rūgštis, žarnų peristaltiniai ir antiperistaltiniai judesiai, epitelinių ląstelių kaita, tulžies druskos, imunologiniai mechanizmai, taip pat kepenų Kupferio ląstelių veikla (7). Laikoma, kad įvairiuose regionuose, pieninių galvijų bandose, naujagimių veršelių (iki 31 dienos amžiaus) diarėjos paplitimas siekia iki 19,1 proc. bei rizika susirgti net iki 21,2 proc. (12,13). Jaunesnių nei 31 dienos amžiaus veršelių dažniausia mirties priežastis yra enteritas, dėl kurio gaišta 13

14 net iki 4,9 proc. viduriavusių veršelių, o didžiausia gaišimo rizika sergant enteritu yra antrąją gyvenimo savaitę (12,14). Diarėja arba viduriavimas paprastai aprašoma kaip išmatų pasišalinimo dažnumo, jų vandeningumo ir kiekio padidėjimas. Viduriavimas gali būti pirminis žarnyno ligos simptomas, arba nespecifinis atsakas į įvairius susirgimus kaip sepsis, toksemija arba į kitos organų sistemos sutrikimą (13,15,16,17). Normaliomis sąlygomis kiekvieną dieną dideli kiekiai izotoninio skysčio patenka į priekinę žarnyno dalį. Visas virškinamasis traktas dažnai yra apibūdinamas kaip sistema, kuria prateka didelis kiekis skysčio, ir net 80 proc. šių skysčių sudaro įvairūs sekretai, ir tik 20 proc. patenka su maistu (16). Didžioji dalis šio skysčio yra rezorbuojama, ir tik labai mažas kiekis apie 5 procentus yra pašalinama su išmatomis. Šis skystis patenka su maistu, taip pat endogeninės sekrecijos metu viršutiniame virškinamajame trakte. Žarnyne vyksta skysčių absorbcija ir sekrecija, todėl net menki šios sistemos sutrikimai gali sukelti diarėją (15,16). Pagrindiniai mechanizmai, galintys sukelti skysčių absorbcijos ir sekrecijos mechanizmo disbalansą, o taip pat ir viduriavimą, yra šie: sutrikęs jonų transportavimas, pasyvi malabsorbcija, žarnų peristaltikos suaktyvėjimas, osmosinis efektas bei audinių hidrostatinis slėgis bei padidėjęs pralaidumas (16). Diarėja dėl sutrikusio jonų transporto gali būti sukelta dėl sumažėjusios natrio jonų absorbcijos per gaurelių enterocitus arba dėl padidėjusios chloro jonų sekrecijos, vykstančios kriptų ląstelėse. Taip pat šie abu procesai gali vykti vienu metu. Šiuos pokyčius sukelia enterotoksinai, kuriuos išskiria enterotoksigeninės Escherichia coli (18). Šios bakterijos, prisitvirtinusios prie žarnų paviršiaus fimbrijų adhezinais, išskiria enterotoksinus. Karščiui labilaus toksino A subvienetas aktyvuoja adenilato ciklazę, esančią ant bazolateralinės membranos, kuri sukelia intraląstelinio ciklinio adenozinmonofosfato (AMF) produkciją. Ciklinio AMF produkcijos padidėjimas žarnų gaurelių ląstelėse sumažina natrio jonų absorbciją, dėl ko sumažėja ir vandens absorbcija. Tuo tarpu kriptų ląstelėse yra stimuliuojamas chloro jonų bei vandens išskyrimas (16). Padidėjusi žarnų motorika gali prisidėti prie viduriavimo vystymosi, kadangi sumažėja pašaro masių tranzitinis laikotarpis ir nepakanka laiko įvykti normaliai absorbcijai. Tačiau padidėjusios žarnų motorikos reikšmė, kaip vienos iš viduriavimo priežasčių, šiuo metu laikoma nedidele (7,16). Viduriavimas taip pat gali būti skysčių malabsorbcijos pasėkmė. Jei sumažėja skysčių absorbcija, o sekrecijos procesai, taip pat audinių skysčių tekėjimas dėl hidrostatinio slėgio išlieka normalūs, vystosi diarėja. Vandens malabsorbcija sumažina natrio jonų aktyvų transportą iš žarnų 14

15 spindžio. Malabsorbcija taip pat ištinka tada, kai morfologiniai pokyčiai žarnyne sumažina absorbuojantį paviršių. Geriausias tokių morfologinių pokyčių pavyzdys yra gaurelių susitraukimas, sukeltas virusinio enterito. Didelio žarnų gaurelių enterocitų kiekio netekimas sukelia absorbcijos funkcijos sutrikimus. Kartu su absorbcinio paviršiaus sumažėjimu, sumažėja ir virškinamasis paviršius, o tai gali sukelti osmosinę diarėją (16). Šeriant veršelius iki soties, į gaubtinę žarną patenka didelis kiekis laktozės, kuri skatina pienarūgščių bakterijų vystymąsi. Daugėjant šių bakterijų, vyksta laktozės hiperfermentacija, gaminami dideli kiekiai pieno rūgšties arba laktato. Laktatas prastai rezorbuojamas ir traukia vandenį į žarnų spindį osmoso būdu, pasunkindamas diarėją (16). Audinių hidrostatinis slėgis normaliomis sąlygomis lemia nuolatinį vandens sunkimąsi iš žarnų gleivinės į žarnų spindį, todėl, esant malabsorbcijai, tai gali prisidėti prie viduriavimo patogenezės. Šis vandens sunkimasis gali sustiprėti dėl gleivinės uždegimo, kuris dar labiau palengvina skysčių tekėjimą tarp enterocitų (16). Pagrindinis cukrus, esantis karvės piene laktozė, yra skaldomas į gliukozę ir galaktozę dalyvaujant fermentui galaktozidazei (laktazei), kuri yra aptinkama ant tuščiosios žarnos enterocitų mikrogaurelių. Šie monosacharidai yra iškart absorbuojami, dėl to turi mažą osmosinį efektą. Virusiniai enteropatogenai naikina subrendusius enterocitus, sukeldami nuolatinį šio fermento trūkumą. Dėl to laktozė nesuskaidyta patenka į gaubtinę žarną. Jeigu veršelis turėtų gerai išsivysčiusią gaubtinės žarnos gleivinę ir gaubtinės žarnos mikroflorą, ši laktozė būtų suskaidyta į trumpagrandes riebiąsias rūgštis, o šios būtų rezorbuojamos per gaubtinės žarnos gleivinę. Šis procesas palengvintų natrio jonų ir vandens rezorbciją. Tačiau jaunas gyvūnas paprastai neturi gerai išvystytos gaubtinės žarnos gleivinės ir mikrofloros, todėl laktozė kartu su vandeniu sulaikoma žarnų spindyje ir tokiu būdu sukeliama diarėja (16) Patogenai, dažniausiai sukeliantys veršelių žarnyno ligas Veršelių diarėją gali sukelti daug įvairių infekcinių agentų. Galvijininkystės veterinarijos specialistai bei galvijų augintojai visame pasaulyje yra sukaupę nemažai žinių apie daugelį enteropatogenų. Dauguma pirminių žarnyno ligų sukėlėjų veterinarinėje medicinoje yra žinomi jau keletą dešimtmečių, tačiau vis dar turi daug įtakos veršelių auginimui. Devyni skirtingi enteropatogenai yra laikomi pagrindiniais (GRV, GCoV, GVDV, Salmonella spp., E. coli, Clostridium perfringens, bei Cryptosporidium parvum) arba atsirandančiais patogenais (galvijų kalicivirusai, GToV), sukeliančiais naujagimių veršelių viduriavimą (19). 15

16 Enterotoksiniai Escherichia coli K99/F5 kamienai, rota ir koronavirusai, taip pat Cryptosporidium spp. ( 85 proc. C. Parvum) yra patys svarbiausi enteropatogenai, sukeliantys naujagimių veršelių viduriavimą visame pasaulyje. Jų tarpe rota virusai ir C. Parvum yra dažniausiai išskiriami iš jaunų veršelių išmatų mėginių (13,20,21,22,23). E. coli K99/F5 paprastai sukelia diarėją veršeliams iki 1 4 dienų amžiaus, o likę trys enteropatogenai dažniausiai sukelia diarėją 1 3 savaičių amžiaus veršeliams. Naujagimių veršelių diarėją sukeliantys enteropatogenai pagal aptikimo dažnumą skirstomi taip: E. coli 2,6 45,1 proc., rotavirusai 17,7 79,9 proc., koronavirusai 3,1 21,6 proc. bei C. parvum 27,8 63,0 proc. (13,23,24,25,26). Lietuvos mokslininkų m. atliktais tyrimais nustatyta, kad labiausiai Lietuvoje paplitę veršelių viduriavimą sukeliantys patogenai yra rota ir koronavirusai, kurių paplitimas gali siekti 44,7 ir 43,4 proc. Taip pat, anot tyrėjų, veršelių virusinę diarėją dažnai apsunkina antrinės bakterinės infekcijos, labai pasunkinančios jų būklę. To paties tyrimo metu nustatyta, kad virusiniu enteritu veršeliai dažniau serga žiemą ir pavasarį (27). Enteropatogenai, dažniausiai išskiriami iš diarėja sergančių naujagimių veršelių, kartais yra aptinkami ir sveikų veršelių išmatose, kas leidžia daryti prielaidą, kad ne visada patogeno buvimas organizme sukelia ligą (13,23) Escherichia coli Escherichia coli pagal viruelntiškumą gali būti skirstoma į šešias grupes: enterotoksigeninė E. coli (ETEC), shiga toksiną išskirianti E. coli, enteropatogeninė E. coli, enteroinvazinė E. coli bei enterohemoraginė E. coli (28,29). Šių bakterijų tarpe dažniausias naujagimių veršelių diarėjos sukėlėjas yra ETEC kamienai, produkuojantys K99 (F5) adhezijos antigeną (paprastai vadinamas E. coli K99 + ) ir karštyje stabilų enterotoksiną (29). Naujagimiai veršeliai labiausiai pažeidžiami ETEC infekcijai per pirmąsias 4 gyvenimo dienas. Dažniausias klinikinis požymis vandeninga diarėja (30). Po patekimo ETEC infekuoja žarnų epitelį ir dauginasi žarnų gaurelių enterocituose. Dėl žemo ph (mažiau nei 6,5), distalinė plonųjų žarnų dalis yra palankiausia vieta ETEC kolonizacijai. Paveiktose žarnose paprastai stebima gaurelių atrofija dėl infekuotų ląstelių netekimo bei lamina propria pažeidimas. Bakterija prisijungimui prie žarnų senelės išskiria K99 antigeną (31). Po kolonizacijos žarnų epitelyje ETEC išskiriamas karštyje stabilus toksinas veda prie padidėjusios chloro jonų sekrecijos į žarnų spindį. Tai osmotiškai traukia vandenį į žarnų spindį ir sukelia sekrecinę diarėją (16). Skrodimo metu aptinkamos išsiplėtę plonosios žarnos, sienelės suglebę, spindis pripildytas permatomo, gelsvo skysčio, kartais dujų. Chilozinis skystis, aptinkamas mezenterinėse limfagyslėse, 16

17 labai panašus į gyvūnų, nesirgusių enteritu. Tai rodo, kad kitaip nei prie malabsorbcinės diarėjos, sekrecinės diarėjos metu absorbciniai procesai gali vykti normaliai. Mikroskopiškai žarnos gali atrodyti nepakitę. Dažnai net nebūna žarnų uždegimo. Paveikti gyvūnai būna dehidratavę, išsekę, aplink išangę ir tarpvietėje matomos skystos išmatos (7) Clostridium perfringens Clostridium perfringens yra Gram teigiama, sporas gaminanti anaerobinė bakterija, kuri sukelia didelę įvairovę žinduolių ir paukščių ligų (32). Šie mikroorganizmai gali būti suskirstyti į penkis tipus (A, B, C, D ir E) pagal 4 pagrindinių toksinų gamybą: alfa (α), beta (β), epsilon (ε) bei jota (ι) (33). A tipo kamienai gamina tik α toksiną, B tipo kamienai gamina α, β ir ε toksinus, C tipo kamienai išskiria α ir β toksinus, D kamienai sekretuoja α ir ε toksinus ir E kamienas išskiria α ir ι toksinus. Tarp šių grupių C tipas dažnai siejamas su veršelių diarėja, tačiau ne taip dažnai kaip E. coli, Salmonella spp., Rota, Corona virusai ar C. parvum (34). α toksinas yra pagrindinis letalinis toksinas, kuris sukelia ląstelių lizę dėl membranos fosfolipidų hidrolizės (35,36). β toksinas yra labai jautrus tripsinui ir sukelia gleivinės nekrozę. Enterotoksinai sukelia diarėją ir žarnų spazmus (37). Dauguma naminių gyvūnų yra imlūs visų tipų C. perfringens infekcijoms dėl plataus šios bakterijos paplitimo aplinkoje. Naujagimiai veršeliai, kurie išskiria mažai proteolitinių fermentų virškinamajame trakte (pvz. tripsino), gali būti lengvai infekuojami C. perfringens C tipo, nes β toksinas yra pripažįstamas kaip pagrindinis virulentingumo faktorius, atsakingas už klinikinius požymius, sukeliamus gyvūnams paveiktiems šios bakterijos. Žarnų pažeidimai paprastai charakterizuojami kaip difuzinis arba daugiažidininis hemoraginis nekrozinis enteritas bei viduriavimas kruvinomis išmatomis (38) Salmonella spp. Salmonella enterica gali kolonizuoti labai daug imlių gyvūnų virškinamąjį traktą. S. enterica serovaras Typhimurium (S. typhimurium) ir serovaras Dublin (S. dublin) yra labiausiai paplitę sukėlėjai, sukeliantys salmoneliozę atrajotojams (39,40). Salmonella infekcija turi didelę įvairovę klinikinių sipmtomų, svyruojančių nuo asimptominės infekcijos iki klinikinės salmoneliozės. Ūmi viduriavimo liga yra dažniausiai sutinkama esant S. typhimurium ir sisteminė liga, paprastai asocijuojama su S. dublin. Salmonelioze dažniausiai serga jaunesni nei 3 savaičių amžiaus veršeliai. Dažniausi pažeidimai, stebimi paveiktų veršelių tarpe, yra pseudomembrana ant plonųjų žarnų gleivinės ir padidėję mezenteriniai limfiniai mazgai. Infekuoti veršeliai gali būti zoonozių šaltinis, plintantis per maistą ar tiesioginio kontakto metu (41). 17

18 Pagrindinis mechanizmas, paaiškinantis Salmonella virulentiškumą, apima galimybę prasiskverbti pro žarnų gleivinę, daugintis limfoidiniuose audiniuose ir išvengti šeimininko gynybinių sistemų. Tai veda prie sisteminės ligos. Salmonella kolonizuoja M ląsteles, enterocitus ir tonzilių audinius (42). Po limfoidinio audinio infekavimo (pvz. tonzilių audinio), salmonelės lengvai plinta po visą kūną infekuodamos mononuklearines ląsteles ir fagocitus (43). Kliniškai salmoneliozė charakterizuojama kaip vandeninga ir gleivinga diarėja, su fibrino ir kraujo priemaiša. Nors Salmonella gali sukelti diarėją tiek suaugusiems, tiek jauniems individams, infekcija daug dažnesnė ir sukelia daug rimtesnius simptomus veršeliams nuo 10 dienų iki 3 mėnesių amžiaus. Veršeliai gali platinti sukėlėją ilgą laiko tarpą ir su pertraukomis, priklausomai nuo infekcijos laipsnio (klinikinė, subklinikinė infekcija) (44) Cryptosporidium parvum Cryptosporidium parvum yra parazitinis pirmuonis, kuris yra dažnai siejamas su žmonių ir naujagimių veršelių gastrointestinalinio trakto ligomis. Veršeliai, infekuoti C. parvum, gali sirgti asimptomiškai, arba dažnai pasireiškia stipri diarėja su dehidratacija (45,46). Yra apie 24 Cryptosporidium rūšys (47). Galvijai paprastai užsikrečia C. parvum, C. bovis, C. ryanae arba C. andersoni. C. parvum yra laikoma pagrindine priežastimi, sukeliančia veršelių diarėją, ir potencialia zoonozių priežastimi (48). Kai tik C. parvum patenka į virškinamąjį traktą, oocistos praranda apvalkalą ir išleidžia sporozoitus, kurie pažeidžia enterocitus. Iš oocistų atsiskyrę sporozoitai dauginasi nelytiniu būdu (I merogonija) ir lytiniu būdu (II merogonija), kol susidaro makrogametocitai ir mikrogametocitai. Vėliau makrogametocitai su makrogametomis sporogonijos proceso metu formuoja zigotą arba kitaip oocistą su keturiais sporozoitais. Šios formos oocistos palieka šeimininką su išmatomis ir aplinkoje gali išbūti ilgiau nei mėnesį. Jos išgyvena ganėtinai nepalankiomis sąlygomis aukštoje temperatūroje ir drėgmėje, atlaiko silpną UV spinduliuotę ir netgi yra atsparios daugumai dezinfekcinių priemonių. Aplinka, kurioje yra oocistų gali būti infekcijos šaltinis tiek žmonėms tiek gyvūnams (49). C. parvum invazija į enterocitus žarnų citoskeleto struktūrose sukelia tokius pokyčius kaip mikrogaurelių netekimas ir stulpinių epitelio ląstelių sutrumpėjimas, kas veda prie sunkios žarnų gaurelių atrofijos (50). Pažeistas žarnų epitelis sukelia ilgalaikį maisto medžiagų neįsisavinimą ir sulėtėjusį augimą dėl malabsorbcijos ir nesuvirškinto pieno žarnų spindyje fermentacijos (51). 18

19 Rotavirusai Galvijų rotavirusas yra vienas pagrindinių etiologinių veršelių diarėjos faktorių. Virusas priklauso Rotavirus genčiai ir Reoviridae šeimai. Rotavirusas yra neapvalkalėtasis virusas, turintis 11 dvigubų RNR segmentų, yra labai stabilus plačioje ph ir temperatūros amplitudėje (52). Yra septynios rotavirusų serogrupės (nuo A iki G), klasifikuojamos pagal antigeninius ir genetinius tarpinės kapsidės proteino (VP6) panašumus ir skirtumus. A grupės rotavirusai yra pagrindiniai rotavirusinės infekcijos sukėlėjai naminių gyvūnų tarpe (53). A grupės rotavirusai dar yra klasifikuojami į P arba G tipus, priklausomai nuo antigeninių ir genetinių panašumų pagal VP4 (proteazei jautrų baltymą) ir VP7 (glikoproteiną), kurie sudaro išorinę viriono kapsidę ir indukuoja antivirusinių antikūnių produkciją. Naminių gyvūnų tarpe yra žinoma 16 G tipų ir 27 P tipai (54). Galvijų rotavirusai yra G1, G6, G8 arba G10 tipo (55). G6 ir G10 tipai tarp atrajotojų yra labiausiai paplitę (56). Nors VP4, VP6 ir VP7 baltymai atlieka pagrindinį vaidmenį išlaikydami viruso struktūrą, viruso prisijungime ir antigeniškume, nestruktūrinis glikoproteinas 4 (NSP4) yra pagrindinis virusinis enterotoksinas. Šis baltymas taip pat sąveikauja su ląstelės homeostaze, padidindamas kalcio jonų srautą į citoplazmą. Šie pakitimai sukelia drąstiškus pokyčius maisto medžiagų ir vandens judėjime per žarnų epitelį, todėl yra daug svarbesni ligos patogenezėje nei histopatologiniai pažeidimai (57). Galvijų rotavirusas paprastai sukelia viduriavimą veršeliams tarp 1 ir 2 savaičių amžiaus. Veršelių geriamas pienas yra puiki terpė rotavirusams išgyventi didelius gastrointestinalinio trakto ph pokyčius (58). Tai padeda paaiškinti faktą, kodėl žindomi veršeliai yra labiausiai jautrūs viduriavimui. Virusas turi labai trumpą inkubacinį periodą (12 24h) ir sukelia poūmę diarėją. Po infekavimo, 5 7 dienas veršeliai išskiria didelius viruso kiekius su išmatomis, taip užteršdami aplinką ir platindami virusą. Virusas replikuojasi plonųjų žarnų gaurelių epitelio ląstelių citoplazmoje. Subrendusių enterocitų žūtis, pažeistų ląstelių aktyvuojama enterinė nervų sistema ir virusinio enterotoksinio (NSP4) išskyrimas sukelia malabsorbcinę diarėją. Virusinė infekcija sukelia gaurelių atrofiją ir paprastai pažeidžia kaudalinę plonojo žarnyno dalį (53) Koronavirusai Galvijų koronavirusas yra apvalkalėtasis, viengrandis RNR virusas. Šis patogenas yra Betacoronavirus genties narys, anksčiau klasifikuotos kaip 2a grupės koronavirusai. Ši virusinė infekcija tarp atrajotojų gali pasireikšti kaip trys skirtingi sindromai: a) veršelių diarėja 1 2 gyvenimo savaitę; b) žiemos dizenterija su hemoragine diarėja suaugusiems gyvūnams; ir c) respiratorinės ligos, įskaitant ir galvijų respiratorinių ligų kompleksą tiek suaugusiems, tiek jauniems 19

20 galvijams (59,60). Šio viruso smaigalyje esantis S baltymas yra labai svarbus viruso patekimui į ląstelę, taip pat neutralizuojant antikūnius (61). S baltymas susideda iš dviejų subvienetų (S1 ir S2) ir yra itin svarbus viruso ir viruso nešiotojo sąveikoje. S1 subvienetas yra atsakingas už prisitvirtinimą prie šeimininko ląstelių receptorių, tuo tarpu S2 subvienetas padeda viruso apvalkalui susilieti su šeiminko ląstelės membrana (62). Virusinė infekcija prasideda plonosiose žarnose ir paprastai išplinta po visą žarnyną į gaubtinę žarną. Mikroskopiškai, paveiktų plonųjų žarnų gaureliai ir gaubtinės žarnos kriptos atrofuojasi, taip pat ištinka savosios gleivinės plokštelės nekrozė. Iš pradžių viruso S baltymas ir hemagliutininesterazės (HE) baltymas prikimba ir susijungia su žarnų epitelio ląstelėmis. Virusas replikuojasi enterocituose ir viruso palikuonys yra išskiriami į žarnų spindį natūralių sekrecinių procesų metu ir dėl ląstelių lizės. Pagrindinis šio viruso taikinys yra subrendę gaurelių epitelio ląstelės, tačiau kriptų enterocitai taip pat paveikiami. Paveiktų veršelių klinikiniai požymiai dažniausiai tęsiasi ilgiau dėl viruso žalos, padarytos kriptų enterocitams (63) Herpesvirusai Herpesvirusai, dar kitaip vadinami Infekcinio galvijų rinotracheito virusai veršeliams iki 2 savaičių amžiaus gali sukelti rimtus pažeidimus gastrointestinaliniame trakte esant generalizuotai infekcijai. Paprastai plonųjų žarnų pažeidimas, esant generalizuotai šio tipo infekcijai jauniems veršeliams būna netgi dominuojantis. Priekinėje žarnyno dalyje makroskopiškai randami nekrozės židinėliai, kurie dažniausiai būna susiję su atsirandančiomis gleivinės opomis šliuže ir Liberkiuno kriptose (16). 20

21 2. MEDŽIAGOS IR METODAI Tyrimas buvo atliktas m. LSMU VA Užkrečiamųjų ligų katedroje, Patologijos centre bei įvairiuose Lietuvos pieninių galvijų ūkiuose. Buvo atliktas 32 veršelių gaišenų patologinis anatominis tyrimas, iš jų paimta 20 plonųjų ir storųjų žarnų mėginių histopatologiniam tyrimui. Atlikta m. retrospektyvi LSMU VA Patologijos centre skrostų veršelių makroskopinių pakitimų analizė. Kasmetinės stambių gyvūnų veterinarijos gydytojų konferencijos metu dalyviai užpildė 35 anketas apie veršelių susirgimų pasireiškimą, jos susistemintos ir išanalizuotos. Patologinis anatominis tyrimas. 32 veršelių gaišenos m. Patologijos centre atliktų patologinių anatominių tyrimų duomenų rinkimas, 72 veršeliai. Anketos duomenų rinkimas, užpildytos 35 anketos. 20 veršeliai su žarnų pakitimais, paimta 20 mėginių histopatologiniam tyrimui. Histologinių preparatų ruošimas ir analizavimas mikroskopu Gautų rezultatų statistinė analizė 2 pav. Tyrimo schema. 21

22 2.1. Patologinis anatominis tyrimas Patologinio anatominio tyrimo metu įvertinta veršelių plonųjų ir storųjų žarnų anatominė padėtis, anatominiai patologiniai pokyčiai, spalva, vienodumas, dujų kiekis, taip pat išmatų spalva, konsistencija, gleivių ir kitų išskyrų kiekis, išplovus išmatas įvertinta gleivinės būklė. Kartu apžiūrėti prieskrandžiai ir šliužas, jų gleivinė, turinys. Didelis dėmesys skirtas mezenterinių limfinių mazgų būklei, jų dydžiui, spalvai, konsistencijai, skersinio pjūvio išvaizdai. Patologinis anatominis tyrimas atliktas ne vėliau kaip 12 val. po gaišimo dėl galimos gleivinės enterocitų autolizės ir bakterijų veiklos sukeltų pakitimų. Mėginiai histopatologiniam tyrimui imti žarnų žirklėmis, plonųjų žarnų iš tuščiosios žarnos kaudalinės dalies, storųjų iš kranialinės gaubtinės žarnos labiausiai pažeistų vietų stengiantis imti riboje su sveiku audiniu, jeigu tai įmanoma. Jeigu nebuvo rasta makroskopinių žarnų pakitimų, mėginiai histopatologiniam tyrimui imami nebuvo Histopatologinis tyrimas Mėginių paruošimas Mėginiai ruošti Patologijos centro histopatologinių tyrimų laboratorijoje. Veršelių žarnų gabaliukai fiksuoti 10 proc. formalino tirpalu netrumpiau nei 3 dienas plastikiniuose indeliuose. Po fiksacijos ne vėliau kaip po 7 dienų mėginiai buvo sudėti į biopsines kasetes ir 24 val. plauti šaltu tekančiu vandeniu. Po plovimo biopsinės kasetės sudėtos į audinių įmirkymo prietaisą Shandon Pathcentre (Thermo Scientific, JAV), kuriame mėginiai buvo dehidratuojami po 2,5 val. 60, 80 ir 96 etilo alkoholyje ir atliktas jų skaidrinimas izopropanolio tirpale po 1,5 val. 3 kartus iš eilės bei chloroforme 3 kartus po 1,5 val. Toliau tiriamieji mėginiai 4,5 val buvo laikomi užlieti 60 C temperatūros parafinu. Po 24 val. mėginiai įlieti į parafininius blokus naudojant audinių įliejimo aparatą Tess 99 (MEDITE, JAV). Parafininiai blokai atvėsinti ant atvėsinimo stalelio ir supjaustyti 4µm storio pjūviais naudojant rotacinį mikrotomą Accu - Cut SRM TM (Sakura, Japonija). Vėliau pjūviai ištiesinami 37 C temperatūros vandens vonelėje ir perkeliami ant objektinio stiklelio. Objektiniai stikleliai su supjaustytais audiniais 5 val. paliekami 37 C temperatūroje ant kaitinimo plokštės bei dar 24 valandoms patalpinami 37 C termostate, kuriame yra džiovinami. Po džiovinimo termostate, audinių pjūviai yra dažomi hematoksilinu eozinu naudojant specialų histologinių pjūvių automatinio dažymo įrenginį Sakura Tissue-Tek DRS (Japonija) Dažymas hematoksilinu eozinu (H E) 1. Pirmiausia atliekamas deparafinavimas ksilenu du kartus po 6 ir 7 minutes. Iš audinio pašalinamas parafinas. 2. Rehidratavimas izopropanoliu 2 min. ir 96 etilo alkoholiu 4 min. 22

23 3. 3 min. skalaujama vandeniu, pašalinamas alkoholis. 4. Dažoma hematoksilinu 10 min., 5 min. preparatas merkiamas į vandenį, tada dar 2 min. į 96 etilo alkoholį ir vėl 5 min. į vandenį. 5. Dažoma eozinu 5 min. ir 1 min. plaunama vandeniu. 6. Atliekama nudažytų mėginių dehidratacija, 1 min. 96 etilo alkoholiu ir 1 min. izopropanoliu. Skaidrinama ksilenu 1 min. 7. Nudažyti mėginiai dengiami dengiamaisiais stikleliais ir ilgalaikio saugojimo dengiamąja terpe Shandon Consul Mount TM (Thermo Scientific, JAV) 2.3. Statistinė analizė Atlikta gautų tyrimo duomenų statistinė analizė, siekta nustatyti amžiaus ir lyties įtaką veršelių žarnų susirgimams ir tam tikrų patologijų pasireiškimui. Išanalizuota m. Patologijos centre skrostų veršelių žarnų įvairių makroskopinių pakitimų dažnumas. Taip pat išanalizuoti anketų duomenys (1 priedas), kuriose apklausti stambių gyvūnų veterinarijos gydytojai nurodė dažniausiai savo praktikoje sutinkamus veršelių žarnų susirgimus ir jų dažnumą tarp kitų susirgimų. Tyrimų rezultatai ir jų statistiniai duomenys susisteminti ir apskaičiuoti kompiuterine programa Microsoft Excel 2013 ir SPSS statistiniu paketu. Dviejų kintamųjų ryšio patikimumui apskaičiuoti buvo naudojamas Maknemaro (Chi) kriterijus. Tyrimų rezultatai buvo laikomi patikimais kai p<0,05. 23

24 3. REZULTATAI 3.1. Savų patomorfologinių tyrimų rezultatų analizė Bendrieji duomenys Iš 32 veršelių, kuriems buvo atliktas patologinis anatominis tyrimas, paimta 20 plonųjų ir storųjų žarnų mėginių histopatologiniam tyrimui, kadangi šiems veršeliams buvo nustatytos įvairios žarnyno patologijos. Antros pagal dažnumą, atliekant patologinį anatominį tyrimą, buvo kvėpavimo patologijos (n=9). 9% 28% 63% Virškinamojo trakto patologijos Mišrios patologijos Kvėpavimio sistemos patologijos 3 pav. Patologinio anatominio tyrimo rezultatai. Šių veršelių tarpe 55 proc. sudarė buliukai ir 45 proc. telyčios. Veršeliai taip pat suskirstyti į dvi amžiaus grupes: iki 1 savaitės amžiaus (50 proc.) ir nuo 1 savaitės iki 2 savaičių amžiaus veršeliai (50 proc.). 1 lentelė. Veršelių pasiskirstymas pagal lytį ir amžių. Ištirta mėginių Lytis Amžius buliukai telyčios iki 1 sav. nuo 1 sav Šiose 20 veršelių gaišenų patologinio anatominio tyrimo metu makroskopiškai buvo nustatytos įvairios žarnyno patologijos. Dažniausiai (40 proc. atvejų) pasitaikiusi patologija buvo ūmus katarinis enteritas. Kitos, rečiau pasitaikiusios patologijos buvo: ūmus serozinis enteritas (10 proc.), ūmus katarinis enterokolitas (20 proc.), lėtinis enterokolitas (15 proc.) ir ūmus katarinis gastroenteritas (15 proc.). 24

25 2 lentelė. Patomorfologinės diagnozės. Ūmus katarinis enteritas 8 Ūmus serozinis enteritas 2 Ūmus katarinis enterokolitas 4 Lėtinis enterokolitas 3 Ūmus katarinis šliužo ir plonųjų žarnų uždegimas su kazeino krešuliais 3 Viso mėginių: 20 Pagaminus histologinius preparatus, mikroskopiškai buvo atskirai vertinamos plonosios ir storosios žarnos. Plonųjų žarnų preparatuose nustatytos 9 skirtingos patologijos, storųjų žarnų preparatuose 5 skirtingos patologijos. Tiek plonosiose, tiek storosiose žarnose mikroskopuojant buvo randamos mišrios patologijos, vidutiniškai viename plonųjų žarnų mikropreparate nustatyta 3,9 skirtingų pakitimų, storosiose žarnose skirtingų patologinių pakitimų vidurkis viename preparate buvo 2,4. Pogleivinės edema Kriptų hiperplazija Mikroabscesai Gleivinės hiperemija Neutrofilinis uždegimas Limfocitinis - plazmocitinis uždegimas Gleivinės hiperplazija Gleivinės nekrozė Gaurelių atrofija Mėginių skaičius 4 pav. Nustatyti histologiniai pakitimai plonosiose žarnose. 4 paveiksle matoma, kad gleivinės hiperemija buvo nustatyta visuose (n=20, 100 proc.) plonųjų žarnų mikropreparatuose, taip pat labai dažnai nustatytas limfocitinis plazmocitinis uždegimas (n=18, 90 proc.) ir gleivinės gaurelių atrofija (n=14, 70 proc.). Kiek rečiau pasitaikė: gleivinės nekrozė (n=11, 55 proc.), kriptų hiperplazija (n=7, 35 proc.), neutrofilinis uždegimas (n=3, 15 proc.), gleivinės hiperplazija (n=2, 10 proc.), pogleivinės edema (n=2, 10 proc.) ir mikroabscesai gleivinėje (n=1, 5 proc.). 25

26 Mėginių skaičius Limfocitinis - plazmocitinis uždegimas Fibrininis uždegimas Gleivinės nekrozė Gleivinės hiperplazija Gleivinės hiperemija 5 pav. Nustatyti histologiniai pakitimai storosiose žarnose. 5 paveiksle pavaizduotas patologinių pakitimų dažnumas storosiose žarnose. Limfocitinis plazmocitinis uždegimas buvo nustatytas dažniausiai (n=19, 95 proc.), gleivinės hiperemija taip pat aptikta pakankamai dažnai (n=17, 85 proc.). Kitos patologijos nustatytos storųjų žarnų mikropreparatuose: gleivinės nekrozė (n=8, 40 proc.), fibrininis uždegimas (n=3, 15 proc.) ir gleivinės hiperplazija (n=1, atitinka 5 proc.). 26

27 Plonųjų ir storųjų žarnų histologiniai pokyčiai 6 pav. Mikroabscesas plonosios žarnos gleivinėje. (HE, x 100) Preparate matomas veršelio tuščiosios žarnos gleivinės skersinio pjūvio fragmentas, gleivinė ir pogleivinė infiltruota limfocitais, plazmocitais, matomi inkapsuliuotas darinys su uždegiminiu pūliniu eksudatu viduje, kapiliarai pripildyti kraujo hiperemija. 7 pav. Pogleivinės edema, plonoji žarna. (HE, x 100) 7 paveiksle tuščiosios žarnos pogleivinėje tarp jungiamojo audinio skaidulų susikaupę daug skysčio, padidėję tarpai tarp skaidulų, susispaudęs raumeninis sluoksnis. Gleivinėje ir pogleivinėje taip pat matomos pavienės uždegiminės ląstelės limfocitai, neutrofilai. 27

28 8 pav. Limfocitinis plazmocitinis uždegimas. (HE, x 200; iškarpa - x 400) Limfocitų ir plazminių lastelių infiltracija plonosios žarnos gleivinėje ir pogleiviniame sluoksnyje. Taip pat matomi pavieniai neutrofilai, makrofagai bei prisipildę kraujo kapiliarai - hiperemija. 9 pav. Kriptų hiperplazija ir gaurelių atrofija. (HE, x 40) 9 paveiksle matoma Liberkiuno kriptų pailgėjimas ir spindžio sumažėjimas, gaurelių ir kriptų ilgio santykis mažesnis nei 3:1 dėl gaurelių pažeidimo ir kriptų mitotinio aktyvumo padidėjimo, taip pat gaureliai užapvalinti, susitraukę, atrofiški. Matoma infiltracija limfocitais, plazmocitais bei hiperemija. 28

29 10 pav. Gleivinės hiperplazija. (HE, x 40) Plonosios žarnos gleivinė išvešėjusi, peraugusi jungiamuoju audiniu, Lamina propria gausiai infiltruota uždegiminėmis ląstelėmis: limfocitais, plazmocitais. 11 pav. Plonoji žarna, gaurelių atrofija ir nekrozė. (HE, x 100) 11 paveiksle rodyklėmis pažymėta gleivinės nekrozė, enterocitų branduoliai piknotiški, taip pat išnykę gaurelių kontūrai, daug deskvamuoto epitelio, gleivinė beveik visiškai lygi. Taip pat rodykle pažymėta hemoglobino skilimo pigmento hemosiderino sankaupos byloja apie buvusias gleivinės kraujosrūvas. 29

30 12 pav. Ūminis storosios žarnos uždegimas, fibrinino iškritimas. (HE, x 100) Stipri storosios žarnos hiperemija, gleivinę padengęs fibrino tinklas. Taip pat matomas gleivinę apėmęs limfocitinis plazmocitinis uždegimas, daug uždegiminių ląstelių bei suirusių enterocitų Plonųjų ir storųjų žarnų histologinių pokyčių statistinė analizė Histopatologiniai pokyčiai mikropreparatuose buvo vertinami atsižvelgiant į patologijų pasireiškimo dažnumą pagal lytį ir amžių, taip pat buvo ieškoma ryšio tarp skirtingų patologijų. Dviejose amžiaus grupėse mėginiai pasiskirstė tolygiai, tačiau nustatyti amžiaus įtakos tam tikrų patologinių pokyčių pasireiškimui nepavyko, kadangi duomenys buvo statistiškai nepatikimi (p>0,05). Vertinant lyties įtaką visų plonųjų ir storųjų žarnų mikroskopinių pakitimų pasireiškimui taip pat nerasta statistiškai patikimo ryšio (p>0,05). Sudarius 2x2 kontingencijos lenteles buvo lyginamas įvairių patologijų tarpusavio ryšys pagal Maknemaro kriterijų. Įvertinus duomenų statistinį patikimumą prieita tam tikrų išvadų. 3 lentelė. Gaurelių atrofijos ir kriptų hiperplazijos dažnumas. Kriptų hiperplazija Pasireiškė Nepasireiškė Viso: Gaurelių atrofija Pasireiškė Nepasireiškė Viso:

31 Paskaičiavus Maknemaro kriterijų, nustatyta, kad yra statistinis ryšys tarp gaurelių atrofijos ir kriptų hiperplazijos pasireiškimo (p<0,05). Galima kelti hipotezę, kad gaurelių atrofija pasireiškia kartu su kriptų hiperplazija. 4 lentelė. Plonųjų žarnų gleivinės nekrozės ir limfocitinio - plazmocitinio uždegimo dažnumas. Limfocitinis plazmocitinis uždegimas Pasireiškė Nepasireiškė Gleivinės nekrozė Pasireiškė Nepasireiškė Viso: Vertinant plonųjų žarnų gleivinės nekrozės ir limfocitinio plazmocitinio uždegimo pasireiškimą nustatyta, kad šios dvi patologijos taip pat dažnai pasireiškė kartu (p<0,05). 5 lentelė. Storųjų žarnų gleivinės nekrozės ir limfocitinio - plazmocitinio uždegimo dažnumas. Limfocitinis plazmocitinis uždegimas Pasireiškė Nepasireiškė Gleivinės nekrozė Pasireiškė Nepasireiškė Viso: Gleivinės nekrozė ir limfocitinis plazmocitinis uždegimas storosiose žarnose sutiko statistiškai reikšmingai (p<0,05). Todėl galima manyti, kad šios patologijos priklauso viena nuo kitos. 31

32 3.2. Patologijos centre atliktų veršelių gaišenų patologinio anatominio tyrimo rezultatų analizė Buvo surinkti 72 veršelių, per metus skrostų Patologijos centre, skrodimo duomenys. Užregistruoti duomenys iš patologinio anatominio tyrimo aktų specialiosios dalies, apie skrodimo metu rastus makroskopinius pakitimus veršelių gaišenose. Tyrimui atrinkti veršeliai iki 2 mėnesių amžiaus. Susisteminus informaciją, nustatyta, kad iš 72 gaišenų, net 48 (67 proc.) iš jų rasti įvairūs patologiniai žarnų pakitimai. Tai leidžia manyti, kad žarnyno susirgimai yra plačiai paplitusi problema tarp Lietuvoje auginamų veršelių. 33% 67% Su žarnų pakitimais Be žarnų pakitimų 13 pav. Žarnų patologinių anatominių pokyčių pasireiškimas. Nustatyti įvairūs makroskopiniai plonųjų ir storųjų žarnų pakitimai, iš kurių dažniausiai pasitaikė ūmus katarinis enterokolitas (n=27) bei ūmus katarinis enteritas (n=15). Rečiau pasitaikę patologijos buvo: katarinis hemoraginis enteritas (n=2), lėtinis enterokolitas (n=2), fibrininis hemoraginis enteritas (n=1), fibrininis kolitas (n=1). 32

33 33% 38% 1% 3% 3% 1% 21% Ūmus katarinis enterokolitas Fibrininis kolitas Katarinis - hemoraginis enteritas Ūmus katarinis enteritas Lėtinis enterokolitas Fibrininis - hemoraginis enteritas Be žarnų pakitimų 14 pav. Nustatyti žarnų makroskopiniai pakitimai. Atskirai buvo išanalizuoti veršelių, su patologiniais žarnų pakitimais duomenys (n=48). Buvo stebima, kaip pasiskirsto makroskopinių patologinių anatominių pakitimų pasireiškimas pagal lytį. Nustatyta, kad iš 48 veršelių gaišenų su patologiniais žarnų pakitimais, 19 gaišenų buvo telyčios (40 proc.) ir 29 gaišenos buvo buliukų (60 proc.). 40% 60% Buliukai Telyčios 15 pav. Žarnų patologijų pasiskirstymas pagal lytį. Visi veršeliai su žarnų makroskopiniais pakitimais (n=48) buvo suskirstyti į tris grupes pagal amžių, siekiant nustatyti, kokio amžiaus veršeliai dažniausiai gaišo dėl žarnyno ligų. Pirmajai grupei priskirti veršeliai nuo 0 dienų iki 2 savaičių amžiaus. Paaiškėjo, kad į šią grupę pateko daugiausiai, net 31 veršelis. Antrajai grupei priskirti 3 4 savaičių amžiaus veršeliai, kurių buvo mažiau 13. Trečiąją grupę sudarė veršeliai, kurių amžius nuo 5 iki 8 savaičių, tačiau į ją pateko gerokai mažiau 33

34 tik 4 veršeliai. Taigi, didžioji dalis veršelių, kuriems skrodimo metu nustatytos įvairios žarnyno patologijos, buvo jauni, naujagimiai veršeliai iki 2 savaičių amžiaus. 8% 27% 65% 0-2 sav. 3-4 sav. 5-8 sav. 16 pav. Žarnų patologijų pasiskirstymas priklausomai nuo amžiaus. Kadangi tarp visų žarnose nustatytų patologijų vyravo dvi pagrindinės ūmus katarinis enteritas (n=15) ir ūmus katarinis enterokolitas (n=27), nuspręsta išsamiau panagrinėti galimas šių dviejų pažeidimų pasireiškimo priežastis. Iš turimų duomenų buvo keliama hipotezė, dėl šių dviejų patologijų priklausomybės nuo veršelių lyties bei amžiaus. Lyginant pagal amžių, dėl labai nevienodo tiriamų gyvūnų skaičiaus skirtingose amžiaus grupėse, nuspręsta lyginti veršelius suskirsčius į dvi grupes: 1 grupė iki 2 savaičių amžiaus veršeliai ir 2 grupė vyresni nei 2 savaičių amžiaus veršeliai. Vertinant galimą lyties ir amžiaus įtaką ūmaus katarinio enterito ir enterokolito pasireiškimui, buvo sudarytos 2x2 dažnių lentelės bei paskaičiuotas Chi-kvadrato kriterijus. Nustatyta, kad iš sirgusių ūminiu katariniu enteritu veršelių (n=15), 10 veršelių buvo buliukai ir 5 buvo telyčios. Tai atitinka 67 proc. ir 33 proc.. Tačiau tyrime dalyvavo 29 buliukai ir tik 19 telyčių, todėl priklausomybę vertinti sunku. Gauti duomenys rodė, kad tarp visų tirtų buliukų ūminis katarinis enteritas pasireiškė 34 proc. buliukų, o tarp visų tirtų telyčių 26 proc. Deja, statistiškai šie duomenys nepatikimi (p>0,05), todėl negalima teigti, kad gyvūno lytis turėjo įtakos ūminio katarinio enterito pasireiškimui. 34

35 Dalis (proc.) Veršelių skaičius (vnt.) Buliukai Telyčios Lytis Pasireiškė Nepasireiškė 17 pav. Ūminio katarinio enterito pasireiškimas, priklausomai nuo lyties. Tuo pačiu metodu apskaičiuota amžiaus įtaka ūminio katarinio enterito pasireiškimui. Tarp 31 veršelio iki 2 savaičių amžiaus ūminis katarinis enteritas rastas 6 veršeliams (19 proc.). Tuo tarpu vyresnių, virš 2 savaičių amžiaus veršelių tarpe ūminis katarinis enteritas pasireiškė 8 iš 17 veršelių ir tai sudarė 47 proc.. Duomenys statistiškai patikimi (p<0,05), todėl galima teigti, kad vyresnio amžiaus veršeliai dažniau sirgo ūminiu katariniu enteritu. 100% 90% 80% 70% 9 60% 50% 25 40% 30% 20% 8 10% 0% 6 Iki 2 sav. Amžius Nuo 2 sav. Pasireiškė Nepasireiškė 18 pav. Ūminio katarinio enterito pasireiškimas priklausomai nuo amžiaus. Analizuojant dažniausiai pasitaikiusį patologinį pakitimą ūminį katarinį enterokolitą (n=27), taip pat vertinta priklausomybė nuo lyties ir amžiaus. Pagal lytį duomenys pasiskirstė apylygiai, nevertinant to, kiek tam tikros lyties individų pateko į skirtingas imtis, ūminis katarinis 35

36 veršelių skaičius (vnt.) enterokolitas pasireiškė 15 buliukų (atitinka 56 proc.) ir 12 telyčių (atitinka 44 proc.). Visų buliukų (n=29) tarpe ūminis katarinis enterokolitas pasireiškė 52 proc. buliukų. Tuo tarpu telyčių tarpe (n=19) ūminis katarinis enterokolitas pasireiškė 63 proc.. Deja, vertinant ligos pasireiškimą tarp buliukų ir telyčių, duomenys statistiškai nepatikimi (p>0,05), todėl ūminio katarinio enterokolito pasireiškimas tarp veršelių nepriklauso nuo lyties Buliukai Lytis Telyčios Pasireiškė Nepasireiškė 19 pav. Ūminio katarinio enterokolito pasireiškimas priklausomai nuo lyties. Vertinant amžiaus įtaką, nustatyta, kad net 23 iš 27 veršelių, kuriems nustatytas ūminis katarinis enterokolitas, patenka į pirmąją amžiaus grupę (iki 2 savaičių amžiaus) ir tik 4 veršeliai, kuriems nustatytas ūminis katarinis enterokolitas, buvo vyresni nei 2 savaitės. Tai atitinkamai sudarė 85 proc. ir 15 proc.. Suskirsčius visus veršelius į dvi amžiaus grupes pastebėta, kad ūminis katarinis enterokolitas gerokai dažniau pasireiškia tarp jaunesnių gyvūnų. Nustatyta, kad tarp visų tyrime dalyvavusių, jaunesnių nei 2 savaičių amžiaus veršelių (n=31), net 74 proc. pasireiškė ūmus katarinis enterokolitas (n=23). Tuo tarpu vyresnių nei 2 savaičių amžiaus grupėje (n=17), ūmus katarinis enterokolitas pasireiškė tik 23 proc. veršelių (n=4). Duomenys statistiškai patikimi (p<0,05), todėl galima teigti, kad yra ryšys tarp veršelių amžiaus ir ūmaus katarinio enterokolito pasireiškimo, ir jauniems (iki 2 sav. amžiaus) veršeliams ši patologija pasireiškia dažniau. 36

37 Veršelių skaičius (vnt.) Iki 2 sav. 8 Amžius 4 Nuo 2 sav. 13 Pasireiškė Nepasireiškė 20 pav. Ūminio katarinio enterokolito pasireiškimas priklausomai nuo amžiaus. 37

38 3.3.Anketos duomenų analizė Apklausus 35 stambių gyvūnų veterinarijos gydytojus, dirbančius įvairaus dydžio pieninių galvijų ūkiuose, dar kartą patvirtintas veršelių žarnyno problemų aktualumas. Iš visų apklaustų respondentų, net 19 (54 proc.) teigė dirbantys didesniuose nei 100 galvijų ūkiuose. Kiti 16 apklaustųjų dirba mažesniuose arba apie 100 galvijų laikančiuose ūkiuose. Apklausti veterinarijos gydytojai, kaip dažniausias veršelių gaišimo priežastis nurodė kvėpavimo sistemos arba virškinamojo trakto pažeidimus. Anketos duomenimis tai atitinkamai sudarė 40 proc. ir 57 proc. dažniausiai pasitaikančių gaišimo priežasčių. Likusius 3 proc. sudarė įvairūs kiti infekciniai ir neinfekciniai susirgimai, kaip umbilikalinės infekcijos ar kepenų pažeidimai, tačiau šiuos sutrikimus gydytojai nurodė kaip retai pasitaikančius. 3% 40% 57% Kvėpavimo sistemos ligos Virškinimo organų ligos Kitos priežastys 21 pav. Dažniausios veršelių gaišimo priežastys. Į klausimą, kokio amžiaus veršeliai dažniausiai gaišta, net 18 gydytojų (atitinka 51 proc.) nurodė, kad dažniausiai gaišta iki 1 savaitės amžiaus veršeliai ir beveik tokia pati dalis (17 apklaustųjų) nurodė, kad dažniausiai gaišta 7 14 dienų amžiaus sulaukę veršeliai. Kai kurie gydytojai (n=9) taip pat nurodė, kad retai gaišta 3 4 savaičių amžiaus veršeliai, ir 10 gydytojų teigė, kad 5 8 savaičių amžiaus veršeliai gaišta labai retai. Paprašius nurodyti dažniausiai pasitaikančias veršelių viduriavimo priežastis, 42 proc. respondentų nurodė, kad dažniausia priežastis E. coli sukelta infekcija. Dar 17 proc., kaip dažnai pasitaikančią priežastį, nurodė rotavirusus ir net 34 proc. teigė, kad dažnai viduriavimo priežastimi tampa girdymo klaidos. 38