VILNIAUS UNIVERSITETO BIOTECHNOLOGIJOS INSTITUTAS COST veiklos Nr. TD0905 Epigenetics: from Bench to Bedside ATASKAITA UŽ 2011 metus Per ataskaitinį laikotarpį (2011 metais) buvo numatyti šie susitikimai: Balandžio mėn. darbo grupių susitikimas ir valdymo komiteto (šalių atstovų) susitikimas Gruodžio mėn. darbo grupių susitikimas ir valdymo komiteto (šalių atstovų) susitikimas Trečiasis COST projekto susirinkimas įvyko Splite (Kroatija) 2011 m. balandžio 29-30 d. Jame dalyvavo COST veiklos TD0905 Lietuvos atstovai Dr. Vilma Petrikaitė, Dr. Daumantas Matulis, studentės Eglė Maksimavičiūtė, Zita Liutkevičiūtė, Simona Jachimovičiūtė. Susitikimo metu dalyviai (dauguma jų nedalyvavo arba anksčiau neskaitė pranešimo antrajame COST veiklos dalyvių susitikime Brno) pristatė savo mokslinius tyrimus, ieškojo bendradarbiavimo galimybių. Visi dalyviai iš Lietuvos (Vilma Petrikaitė, Daumantas Matulis, Eglė Maksimavičiūtė, Simona Jachimovičiūtė, Zita Liutkevičiūtė) pristatė žodinius pranešimus apie Biotermodinamikos ir vaistų tyrimų skyriuje bei DNR modifikacijos tyrimų skyriuje vykdomus mokslinius tyrimus, susijusius su baltymų stabilumo ir intrinsinių biotermodinamikos parametrų tyrimais, cheminių junginių tirpumo problemomis ir pka nustatymu, amino rūgščių sąveikos mechanizmais, taip pat apie DNR modifikacijos tyrimus. Susitikimo metu daug dėmesio buvo skirta bendradarbiavimui tarp skirtingų šalių laboratorijų. Dr. Vilma Petrikaitė, dr. Daumantas Matulis ir Eglė Maksimavičiūtė dalyvavo Nadine Martinet (FR) kordinuojamos darbo grupės Epigenetics Toolbox susitikime, kur buvo daug diskutuojama apie tai, ko kiekvienas dalyvis tikisi iš galimo bendradarbiavimo tarpusavyje ir ką galėtų pasiūlyti kitiems mokslininkams. Susitikimo pabaigoje nutarta, kad Nadine Martinet parengs bendrą visų COST TD0905 dalyvių turimų epigenetikos cheminių junginių duomenų bazę (tų junginių, kuriuos mokslininkai sutiktų išsiųsti kitoms laboratorijoms) ir vėliau remiantis ja bus galima ieškoti glaudesnių bendradarbiavimo sąlyčio taškų. Taip pat įvyko COST TD0905 veiklos Valdymo komiteto posėdis, kuriame buvo išsamiai aptarti Vasaros mokyklos organizavimo klausimai, finansiniai reikalai bei trumpalaikių stažuočių klausimai. Nutarta Vasaros mokyklos organizavimą nukelti į 2012 metus, atsakingas už jos organizavimą Dr. Philippe Bertrand (FR). Dalyviai aptarė mokyklos programą ir temas, kurios galėtų būti įdomios ir patraukios bei naudingos tiek epigenetikos srityje dirbantiems chemikams, tiek biologams. Susitikimo metu Vilma Petrikaitė domėjosi trumpalaikių stažuočių tvarka ir preliminariai aptarė su Dr. Maria Berdasco (ES) galimybes atlikti priešvėžinio aktyvumo tyrimus pelėms Ispanijoje. 1
Ketvirtasis COST projekto susirinkimas įvyko University of Minho (Braga, Protugalija) 2011 m. gruodžio 15-16 d. Jame dalyvavo COST veiklos TD0905 Lietuvos atstovai Dr. Vilma Petrikaitė ir Dr. Daumantas Matulis, alternatyvus atstovas Prof. Saulius Klimašauskas. Susitikimo metu (pirmąją ir antrąją dieną) dalyviai, kurie anksčiau nedalyvavo ir nebuvo pristatę savo tyrimų, skaitė žodinius pranešimus, o tie, kurie jau buvo pristatę savo mokslinę veiklą, dalinosi gautais naujais rezultatais. Prof. Saulius Klimašauskas pristatė pranešimą apie citozino modifikacijas ir jų tyrimus, dr. Vilma Petrikaitė ir dr. Daumantas Matulis moderavo astkiras sesijas (programa pateikta priede) ir dalyvavo mokslinėse diskusijose. Pirmąją susitikimo dieną vyko Veiklos valdymo komiteto posėdis, kuriame dalyvavo COST Office atstovas Kent Hung. Posėdžio metu dalyvavo nepakankamas šalių atstovų skaičius, tad sprendimai nebuvo priimami, tačiau detaliai buvo diskutuojama apie Veiklos valdymą ir finansinę padėtį. Daugiausia dėmesio buvo skirta Vasaros mokyklos organizavimui ir finansavimui. Dr. Phillipe Bertrans (FR) pristatė išsamią mokyklos organizavimo programą, viešinimo reikalus ir preliminarų biudžetą. Taip pat daug diskutuota dėl ateinančių metų Veiklos biudžeto, aptarti trumpalaikių stažuočių klausimai. Šiame susitikime buvo daug kalbama apie bendradarbiavimo galimybes. Nadine Martinet (FR) visiems pristatė jos surinktus duomenis apie Veiklos dalyvių turimus junginius, kuriuos ji galėtų duoti epigenetiniams tyrimams, paaiškino junginių atsiuntimo tvarką. Bendrai sutarta, kad Nadine Martinet išsiųs junginius tyrimams dar sausio mėn. Pradėta galvoti ir apie epigenetinių baltymų duomenų bazę. Vienas iš dalyvavusiųjų apsiėmė apklausti visus veiklos TD0905 dalyvius ir surinkęs duomenis pasisiūlė juos apibendrinti. Susitikimo metu Vilma Petrikaitė ir Maria Berdasco (ES) aptarė trumpalaikės stažuotės Bellvitge Biomedical Research Institute (Barselona, Ispanija) klausimus. Daumantas Matulis aptarė bendro straipsnio su Latvijos atstovu rengimo reikalus ir tolimesnį bendradarbiavimą. Per 2011-uosius metus vyko intensyvus veiklos COST TD0905 dalyvių bendravimas el. paštu, aptariant mažo svorio cheminių molekulių duomenų bazės bei epigenetinių baltymų duomenų bazės kūrimo klausimus. Biotermodinamikos ir vaistų tyrimo laboratorijoje taip pat planuojama atlikti tokių junginių ir/arba baltymų tyrimus. Atsakinga Veiklos vykdytoja: Dr. Vilma Petrikaitė (parašas) 2
PRIEDAI Darbinio susitikimo, įvykusio 2011 m. balandžio 29-30 dienomis Splite (Kroatija), programa TD0905 MC meeting and Workshop Split, 29-30 April 2011 Schedule 29 April 09.30-11.00 Presentations 11.00-11.30 Coffee break 11.30-13.00 Presentations 13.00-15.00 Lunch 15.00-17.00 MC meeting 17.00-19.00 Poster session 19.00-21.00 Dinner 30 April 09.30-11.00 WG meetings 11.00-11.30 Coffee break 11.30-13.00 Presentations 13.00-15.00 Lunch 15.00-17.00 Social excursion 17.00-19.00 Poster session 19.00-21.00 Dinner 3
Darbinio susitikimo, įvykusio 2010 m. gruodžio 15-16 dienomis Bragoje (Portugalija), programa Epigenetics: Bench to Bedside December 15-16, Braga, Portugal Program 15 th of December 9.00-9.15 Registration 9.15-9.30 Welcome Note A Ganesan, Cristina Pereira-Wilson, Cândida Lucas Session 1 Chairs: M. Lahtela-Kakkonen, F. Fackelmayer, V. Petrikaite 9.30-10.00 Changes in chromatin structure and epigenetics after HDAC inhibition (Soňa Legartová, Lenka Stixová and Eva Bártová) 10.00-10.30 Antitumor activity of a small-molecule inhibitor of the histone kinase Haspin (Dori Huertas, Maria Berdasco Menendez, Manel Esteller) 10.30-11.00 Drug delivery system with HDAC inhibitors (Philippe Bertrand) 11.00-11.30 Coffee Break Session 2 Chairs: E. Mikros, A. Lehotzky 11.30-12.00 Structure-activity studies on substrate-based sirtuin inhibitors (Elina Jarho) 12.00-12.30 Discovery and Optimisation of Novel Sirtuin Inhibitors (Lisa Pirrie) 12.30-14.00 Lunch 14.00-15.30 MC meeting 15.30-17.30 Working groups meeting 17.30-18.30 Social and Wine Break 19.00 Dinner 16 th of December Session 3 Chairs: C. Chatgilialoglu, P. Trapencieris 9.00-9.30 The cost epigenetic compound library (Nadine Martinet) 9.30-10.00 The potential of microbial natural product libraries at Fundación Medina as alternative sources for epigenetic drug discovery (Olga Genilloud) 10.00-10.30 Presentation about Pfizer (Nessa Carey) 4
10.30-11.00 Coffee Break Session 4 Chairs: D. Matulis, M. Berdasco Menendez, J. Schultz 11.00-11.30 6-alkylsalicylates as selective HAT Tip60 inhibitors that target the acetyl CoA binding site (Frank Dekker) 11.30-12.00 LSD1, a new interesting target in medicinal chemistry, design, synthesis and biological evaluation of new inhibitors and rufomycin B, an old peptide for a new epigenetic frontier (Maria Tardugno) 12.00-12.30 Chemo-enzymatic approaches to genome-wide profiling of cytosine modifications (Saulius Klimasauskas) 12.30-13.00 Schistosoma Epigenetics: Targets, Regulation, New Drugs (Diana A. Stolfa) 13.00-14.30 Lunch 15.00 Afternoon Visit to Braga 5
Pranešimų, pristatytų darbiniame susitikime balandžio 29-30 dienomis Splite (Kroatija), santraukos Thermodynamics of ion pair formations in proteins Eglė Maksimavičiūtė, Vytautas Petrauskas, and Daumantas Matulis Department of Biothermodynamics and Drug Design, Vilnius University Institute of Biotechnology, LT-02241, Vilnius, Lithuania matulis@ibt.lt Thermodynamic characterization and detailed understanding of protein-protein and proteinligandinteractions are of great interest, since these interactions play a key role in a variety of biological processes, for example, phosphorylation in signal transduction. These interactions are guided by a combination of electrostatic and hydrophobic non-covalent recognition processes. Seven of the 20 naturally occurring amino acids in proteins are ionizable and may exist in negatively or positively charged form dependent on ph and their pk a s. These amino acids are responsible for many functions carried out by proteins and enzymes. Interactions between the positively and negatively charged amino acids (electrostatic bonds or salt bridges, sometimes called ionic hydrogen bonds) are among the most important interactions in proteins. On one hand, ionic groups on protein surfaces usually make them soluble (they preferentially interact with water), while on the other hand, in some cases, oppositely charged amino acid functional groups preferentially interact with each other rather than water. Ionic interactions sometimes make proteins less soluble and more prone to aggregation. Thermodynamics of ionic interactions in proteins is not well understood. There is limited information on e.g. the enthalpy of the carboxylate group of aspartate interaction with the positively charged amino group of lysine. Which ionic pair is more enthalpy or entropydriven: Lys-Asp or Arg-Asp is difficult to answer. Precise energetics depends on detailed structural parameters of interacting groups. However, it is important to determine the average standard values of enthalpies, entropies, Gibbs free energies, heat capacities, compressibilities, expansion coefficients, and other thermodynamic parameters of ionic interactions using model ionic compounds. Here we will describe how Isothermal titration calorimetry (ITC) technique was used to measure thermodynamic properties of interaction between several charged amino acids using various model approaches. Several charged polymers and copolymers were titrated at various experimental conditions including temperature, ph, buffer, as well as the concentration of the polymer and salt. Dissection of ionic interaction contributions from other contributions such as interaction with salt, is complex and model dependent. Some preliminary implications to general protein-protein ionic interactions will be discussed based on our results. 6
Towards the intrinsic lead binding thermodynamics Asta Zubrienė, Egidijus Kazlauskas, Lina Baranauskienė, Vytautas Petrauskas, and Daumantas Matulis Department of Biothermodynamics and Drug Design, Vilnius University Institute of Biotechnology V.A. Graiciuno 8, LT-02241 Vilnius, Lithuania matulis@ibt.lt The early stages of high-throughput drug discovery in pharmaceutical industry are usually based on selecting the highest affinity compounds that bind to and inhibit the target protein function. However, the affinity or association constant (K b = 1/K d ) alone provides limited information on the forces driving the binding event. The Gibbs free energy is made from enthalpic and entropic contributions to the reaction. Compounds with similar affinities often have very different enthalpic and entropic contributions due to the enthalpy-entropy compensation phenomenon. Such compounds have different reasons for binding. In the stages of optimizing the lead compound, it is important to take into consideration as many energetic contributions to the binding reaction as possible. But the enthalpic term is the most important. It is a direct measure of the net change in the number and strength of the non-covalent bonds on going from the free to the bound state. However, one has to be careful with the interpretation of the enthalpic data. It is important to carry out all necessary controls and dissect the intrinsic enthalpy from other contributions occurring in solution due to linked reactions. The structure-thermodynamics correlations cannot be applied without detailed dissection of such contributing reactions. In order to draw any enthalpic energetics-structure correlations, the determined binding enthalpy must be intrinsic. Here we will discuss several cases of how to determine the intrinsic binding thermodynamic parameters. In high throughput screening, the pharmaceutical companies usually employ methods that directly observe enzyme inhibition. Supposedly, such methods could provide more accurate estimation of inhibition efficiency than the biophysical binding measurements such as ITC. However, usually there is quite good match between the K d s and K i s determined by biophysical and enzymatic methods. Comparison for several enzymes will be provided. 7
Determination of lead compound solubility by ph titration Vilma Petrikaite and Daumantas Matulis Department of Biothermodynamics and Drug Design, Vilnius University Institute of Biotechnology V.A. Graiciuno 8, LT-02241 Vilnius, Lithuania vilma.petrikaite@bti.vu.lt, matulis@ibt.lt Compound solubility is one of the main physicochemical properties influencing ADME (Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion) properties. Together with membrane permeability it directly affects compound s oral bioavailability. In drug discovery process, many pharmacologically active compounds fail to become drugs because of their poor physicochemical properties. Therefore, there is need to determine and optimize them as early in the discovery process as possible. If compounds contain ionisable groups then compound observed solubility is strongly dependent on ph. Electrostatically charged form of the compound is significantly more soluble than the uncharged form. This should be taken into account during the determination of the intrinsic solubility of the compound and when studying thermodynamics of the compound binding to target proteins. Here we describe the determination of the solubility and pka of some resorcinol-bearing compounds that are potent inhibitors of the Hsp90 chaperone. The intrinsic solubilities and intrinsic pka s were first predicted with ADME Boxes software and then determined experimentally by ph titration. Obtained experimental results confirmed prognostic data. The difficulty of experimental determination is primarily due to several linked equilibria: the compound observed ionization pka is affected by compound solubility and the observed compound solubility is strongly affected by the ionization pka. Titrations must be carried out at various compound concentrations. The intrinsic pka can be determined only at concentrations where compound is fully soluble. The theoretical analysis of linked equilibria will be presented and method to determine compound intrinsic pka and intrinsic solubility is proposed. The method will be applied to the analysis of several compound solubilities and ionisation equilibria. 8