Transgeniniai augalai

Transkriptas

1 m. Žmogiškųjų išteklių plėtros veiksmų programos 3 prioriteto Tyrėjų gebėjimų stiprinimas VP1-3.1-ŠMM-05-K priemonės MTTP tematinių tinklų, asociacijų veiklos stiprinimas projektas Lietuvos Biochemikų draugijos potencialo kurti žinių visuomenę didinimas (Nr. VP1-3.1-ŠMM-05-K ) Augalų laikinos genų raiškos sistemos ir jų panaudojimas medicinoje Aušra Ražanskienė UAB Nomads VU BTI 2012

2 Kuo remiasi augalų genų inžinerija? Dirvožemio bakterijos Agrobacterium tumefaciens sukelia augalų auglius. Jos tai daro genetinės transformacijos pagalba.

3 Kaip agrobakterijos sukelia augalų auglius, arba natūrali genetinė transformacija

4 Agrobakterijų Ti plazmidės schema T-DNR sritis iš Ti plazmidės yra perkeliama į augalo chromosomą. Auksinas ir citokininas yra augaliniai hormonai, skatinantys ląstelių dalijimąsi ir augimą (jie ir sukelia auglių susidarymą). Opinas yra bakterijos maistas.

5 Agrobakterijų Ti plazmidės pritaikymas augalų genų inžinerijai Norint, kad T-DNR ne sukeltų auglius, o koduotų žmogui naudingus baltymus, auksino, citokinino ir opino genai pakeičiami žmogui naudingais genais. Dažniausia šių genų raiškai naudojami stiprūs promotoriai (35S, ubi, akt) Šiuolaikiniai augalų transformacijai naudojami vektoriai vadinami binariniais, nes gali replikuotis tiek E. coli, tiek A. tumefaciens.

6 Transgeninių augalų gavimo metodika Atsparumo antibiotikui genas Svetimas genas Agrobakterija Transformuota augalo ląstelė Binarinis vektorius Augalo ląstelė Augalo ląstelių kultūra ant terpės su antibiotiku Transgeninis augalas Regeneruojantis transgeninis augalas ant terpės su antibiotiku

7 Pavyzdys: pomidoro transformacija Skilčialapiai inkubuojami su transformuotų Agrobakterijų suspensija Ir perkeliami ant terpės su antibiotiku Transgeniniai pomidorai ir galiausiai pasodinami į žemę Iš transformuotų ląstelių regeneruoja augaliukai Regenerantai perkeliami ant ilginimo terpės, po to ant įšaknijimo terpės,

8 Transgeniniai augalai rekombinantinių baltymų sintezei Privalumai: Eukariotinė sistema teisingai susivynioję rekombinantiniai baltymai Pigi žaliava Pigus auginimas Saugūs naudoti terapijai : nėra žmogaus patogenų (gyvūnų ląstelių kultūros) ir endotoksinų (E. coli). Trūkumai: Labai ilgas procesas nuo konstrukto iki sėklos (3 mėn Arabidopsiui, 6 mėn tabakui ar pomidorui). Norint pasidauginti pakankamai sėklos didesniems kiekiams augalų auginti, užtrunka ne vienerius metus. Dažnai mažos rekombinantinio baltymo išeigos; susiduriama su PTGS. Glikozilinimas (galima apeiti) Neturi sialo rūgšties (jau irgi galima apeiti)

9 Laikina genų raiška Infiltravus į augalus A. tumefaciens su binariniu vektoriumi 35S-GUS, pastebėta: -GUS raiška stebima 2 dienos po infiltracijos, pasiekia maksimumą 3-4 dieną, ir nusilpsta iki 10 dienos. Tai yra laikina raiška nuo laisvos, neintegruotos T-DNR dieną atsiranda nauja, GUS ekspresijos banga, kuri koreliuoja su atsparumu kanamicinui ir auglio formavimusi. Tai reiškia T-DNR integraciją įgenomą. Tik dalis patekusių įląstelę T-DNR integruojasi į genomą.

10 Laikinos raiškos sistemos - technologijos Agroinfiltracija binariniais vektoriais Agroinfekcija rekombinantiniais virusais Agroinfiltracija išmontuotais virusiniais vektoriais

11 Binarinių vektorių pagrindu sukonstruotos laikinos raiškos sistemos : - Lengvai ir greitai sukonstruojamos. - Galima didelių (>2kb genų) baltymų sintezė. - Galima sintetinti keletą baltymų kartu, infiltruojant į augalą keletą agrobakterijų kamienų iš karto. - Baltymo išeigas galima ženkliai padidinti naudojant pagalbinius kamienus su virusiniais PTGS slopikliais ir parenkant signalines sekas. - Aprašytos rekombinantinio baltymo išeigos siekia iki 1,5g baltymo/kg šv.biomasės.

12 Projektas: rekombinantinių žmogaus citokinų sintezė augalų laikinos raiškos sistemoje, naudojant binarinius vektorius BTI EGIS (UAB Profarma užsakymu) Interferonas (IFN2alfa) ir granuliocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius (GCSF)

13 BTI EGIS Metodika Rekombinantinių agrobakterijų suspensija vakuumo arba švirkšto be adatos pagalba infiltruojama į 5-6 savaičių augalo lapų tarpląstelines ertmes. Potranskripciniam genų nutildymui slopinti naudojami rekombinantiniai agrobakterijų kamienai su virusinėmis HC-Pro (Helper component proteazėmis). Po 6-7 dienų iš lapų gryninami rekombinantiniai baltymai. 7 savaičių amžiaus N. benthamiana Lapo pjūvio schema

14 Rezultatai Signalinės sekos BTI EGIS Klonuotos 4 signalinės sekos: M.domestica pektinazės signalinė seka: MALKTQLLWSFVVVFVVSFSTTSCSG Skirta sekrecijai į apoplastą. N. tabacum RBC S1 signalinė seka: MASSVLSSAAVATRSNVAQANMVAPFTGLKSAA SFPVSRKQNLDITSIASNGGRVQC Skirta nukreipimui į chloroplastus. A. rusticana HRP C N signalinė seka: MHSPSSTSFTWILITLGCLAFYASLSDA Skirta nukreipimui į endoplazminį tinklą K. marxiana poligalakturonazės signalinė seka: MLFSNTLLIAAASALLAEASPLEKR Skirta sekrecijai į apoplastą Sukonstruoti binariniai vektoriai, kuriuose šios signalinės sekos sulietos su GFP.

15 BTI EGIS HC (Helper Component)-proteazės Klonuotos dvi HC-proteazės, dažnai naudojamos laikinos raiškos sistemoje (inhibuoja RISC, RNA induced silencing complex): -Bulvių viruso Y (PVY) HC-PRO, -Slyvų raupų viruso (PPV) HC-PRO.

16 BTI EGIS Sukonstruotos laikinos raiškos sistemos patikrinimas Infiltruoti 5 ir 6 savaičių amžiaus N. benthamiana augalai. Naudoti agrobakterijų kamienai su konstrukcijomis: phellsgate 35S-GFP phellsgate 35S-MdPekt -GFP phellsgate 35S-PPV-HC-Pro phellsgate 35S-PYV-HC-Pro phellsgate 35S-KmPG-GFP phellsgate 35S-HRP-GFP 5 parą po infiltracijos augalų lapų mėginiai analizuoti fluorescensine mikroskopija.

17 BTI EGIS GFP (be signalinių sekų) GFP UV UV su GFP filtru GFP + PPV HC-PRO GFP + PYV HC-PRO 40x 400x

18 MdPekt -GFP BTI EGIS Pekt-GFP Pekt-GFP + PPV HC-PRO Pekt-GFP + PYV HC-PRO 40x 400x

19 HRP N-GFP BTI EGIS HRP-GFP HRP-GFP + PPV HC-PRO HRP-GFP + PYV HC-PRO 40x 400x

20 KmPG-GFP BTI EGIS KmPG-GFP KmPG-GFP +PYV HC-PRO 40x 100x 400x

21 BTI EGIS Sukonstruota laikinos raiškos sistema yra funkcionali ir visos patikrintos signalinės sekos veikia. GFP fluorescencija didžiausia naudojant KM PG signalinę seką. PPV ir PYV HC proteazės sustiprina GFP raišką (ypač naudojant HRP ir Pekt signalines sekas).

22 Agroinfiltracija binariniais vektoriais IFN2α-GFP ir GCSF-GFP ekspresija N. benthamiana BTI EGIS Sukonstruota laikinos raiškos sistema buvo pritaikyta chimerinių IFNalfa-GFP ir GCSF-GFP baltymų sintezei phellsgate 35S IFN2α GFP phellsgate 35S MdPekt IFN2α GFP phellsgate 35S KmPG IFN2α GFP phellsgate 35S HRP IFN2α GFP phellsgate 35S RBCS1 IFN2α GFP phellsgate 35S GCSF GFP phellsgate 35S MdPekt GCSF GFP phellsgate 35S KmPG GCSF GFP phellsgate 35S HRP GCSF GFP phellsgate-35s-rbcs1-gcsf-gfp + phellsgate 35S PPV HC Pro PTGS slopiklis

23 SIGNALINĖ SEKA GFP IFN- GFP GCSF- GFP BTI EGIS polygalacturonase pectinase HRP C N RUBISCO S1

24 Laikina IFN-GFP ir GCSG-GFP raiška N. benthamiana (5dpi) M M SDS-PAGE ir WB su Mab anti-gfp 1.RBC-GFP 2.RBC-GFP 3.PG-IFN-GFP 4.PG-IFN-GFP 5.Pekt-IFN-GFP 6.Pekt-IFN-GFP 7.HRP-IFN-GFP 8.HRP-IFN-GFP 9.HRP-IFN-GFP

25 BTI EGIS Išvados Tiek IFN2α GFP, tiek GCSF-GFP raiška didžiausia naudojant RBC S1 ir KmPG signalines sekas. Apytikris rekombinantinio baltymo sintezės lygis gali siekti iki 10% ląstelės bendro baltymo. IFN2α GFP ir GCSF-GFP maksimaliai raiškai pasiekti būtina naudoti PTGS slopiklį (HC-Pro kamieną). IFN2α sudaro baltymų agregatus, naudojant pektinazės ir poligalakturonazės signalines sekas. Tolesnis darbo etapas : IFN2α ir GCSF monomerų ir oligomerų sintezė.

26 Binarinių vektorių pagrindu sukonstruotos laikinos raiškos sistemos : - Lengvai ir greitai sukonstruojamos. NE - Galima sintetinti didelius baltymus. GAL IR TAIP - Galima sintetinti keletą baltymų kartu, infiltruojant į augalą keletą agrobakterijų kamienų iš karto. TAIP - Baltymo išeigas galima ženkliai padidinti naudojant pagalbinius kamienus su virusiniais PTGS slopikliais ir parenkant signalines sekas. TAIP - Aprašytos rekombinantinio baltymo išeigos siekia iki 1,5g baltymo/kg šv.biomasės. TAIP

27 Agroinfekcija rekombinantiniais virusais Dažniausia naudojami teigiamos viengrandės RNR virusai. Dvejopas panaudojimas: Epitopų prezentacija. Įterpiant epitopus į paviršiaus baltymo seką, gaunama chimerinė virusinė dalelė. Rekombinantinio baltymo sintezė, įterpiant pilno ilgio koduojančią seką prieš paviršiaus baltymo geną.

28 Laikinai raiškai naudojamų virusų genomai Juodos rodyklės pozicijos, į kurias paviršiaus baltyme buvo įterpti epitopai. Brūkšniuoti stačiakampiai pozicijos, į kurias į genomą buvo įterpti svetimi baltymai. CP, paviršiaus baltymas; HC-Pro, helper component proteinazė; Hel, helikazė; MP, judėjimo baltymas; LCP, didysis paviršiaus baltymas; Pol, RNR-priklausoma RNR polimerazė; Pro, proteazė; ProC, proteazės kofaktorius; Reg, reguliacinis baltymas; TGB, trijų genų blokas; VPg, prie genomo prisijungęs virusinis baltymas; P1-Pro, P1-Proteazė; P3, baltymas P3; 6K, 6 kda baltymas; SCP, mažasis paviršiaus baltymas; VPg-Pro, VPg-Proteazė. (*) pralaidus terminacijos kodonas. CPMV, cowpea mosaic virus pupuolės mozaikos virusas; PPV, plum pox virus šarkos virusas; PVX, potato virus X bulvių virusas X; TBSV, tomato bushy stunt virus; TMV, tobacco mosaic virus tabako mozaikos virusas.

29 Agroinfiltracija rekombinantiniais virusais Pagrindiniai trūkumai: Įterptos sekos dydžio ir sudėtingumo apribojimai. Negalima įterpti didelių fragmentų, virusai tampa nestabilūs. Rekombinantiniai virusai nėra biosaugūs, gali išplisti aplinkoje.

30 Agroinfiltracija išmontuotais virusais MagnICON technologija Naudojamas ne vienas, o iškart 3 vektoriai. 5 ir 3 moduliai atitinka išmontuoto viruso pradžią ir pabaigą, Streptomyces fago C31 integrazė juos rekombinuoja augalo ląstelės branduolyje. Kam? 1. Labai paprastas ir greitas vektorių konstravimas 2. Labiau atitinka biosaugos reikalavimus Marillonnet S et al. PNAS 2004;101:

31 Agroinfiltracija išmontuotais virusais MagnICON technologija Iš anksto paruošta serija skirtingų 5 modulių ir integrazės konstruktas, patogus klonavimui 3 modulis. Marillonnet S et al. PNAS 2004;101:

32 Agroinfiltracija išmontuotais virusais MagnICON technologija Visas lapas UV Protoplastas UV 1,a,f - neinfiltruotas lapas 2,b,g - ubikvitino s.s. (citozolis) 3,c,h - kalretikulino s.s. (apoplastas) 4,d,i - Rubisko s.s. (chloroplastas) 5,6,e,j - be s.s. (citozolis) 7,8 - be s.s.6his-gfp (citozolis) SDS-PAGE Coomassie Bendras tirpių lapų baltymų ekstraktas Skirtingos signalinės sekos leidžia parinkti optimalias sintezės sąlygas kiekvienam rekombinantiniam baltymui Marillonnet S et al. PNAS 2004;101:

33 Agroinfiltracija išmontuotais virusais MagnICON technologija Sisteminio judėjimo funkciją turintys provektoriai leidžia virusiniams replikonams sistemiškai judėti augale. Marillonnet S et al. PNAS 2004;101: Iki 10x didesnė rekombinantinio baltymo sintezė nei naudojant binarinius vektorius. GFP sintezės kinetika 7, 10, 10 ir 17 dpi

34 Agroinfiltracija išmontuotais virusais MagnICON technologija MagnICON technologija įgalina sintezė toje pačioje ląstelėje, vienu metu ir panašiu intensyvumu, du skirtingus baltymus, naudojant tarpusavyje nekonkuruojančius virusinius vektorius. Protoplastai, išskirti iš N. benthamiana lapo, infiltruoto TMV-DsRED ir PVX-GFP vektoriais. UV Raudona šviesa Tokiu pačiu principu vienu metu galima sintetinti ir sunkiąją bei lengvąją rekombinantinių antikūnų grandines. Marillonnet S et al. PNAS 2004;101:

35 Projektas : terapiniai baltymai veterinarijai, naudojant MagnICON vektorius UAB Nomads Naudoti sintetiniai genai su optimizuotais kodonais: Streptococcus fago muramidazė (PlyGBS) Streptococcus fago muramidazė (Cpl-1) Streptococcus fago amidazė (PAL)

36 Bakteriolizinis aktyvumas Baltymas PlyGBS Cpl-1 PAL Aktyvumas Group B Streptococci Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae

37 PlyGBS sintezėtmv sistemoje 72 kda M wt A Ch C PlyGBS, nukreipto į skirtingus ląstelės kompartmentus, ekspresija 5dpi. 55 kda 43 kda Viršuje: bendrų ląstelės baltymų SDS-PAGE Coomasie, Apačioje: Western hibridizacija su anti-6his Mab. 34 kda A apoplastas, Ch chloroplastas, 26 kda C citozolis (5dpi) 72 kda 55 kda 43 kda 34 kda M A wt Ch wt C wt

38 Cpl-1 sintezėtmv sistemoje 72 kda 55 kda 36 kda 28 kda 72 kda 55 kda 36 kda 28 kda wt M Cpl-1, nukreipto į skirtingus ląstelės kompartmentus, sintezė 6dpi. Pakartotiniai mėginiai atitinka skirtingus bakterijų praskiedimus. Viršuje: bendrų ląstelės baltymų SDS- PAGE Coomassie, Apačioje: Western hibridizacija su anti-6his Mab. 1, 2 Cpl-1 apoplastas 3, 4 - Cpl-1 chloroplastas 5, 6 - Cpl-1 citozolis WT- neigiama kontrolė, augalai infiltruoti tuščiais vektoriais.

39 Pal sintezė TMV sistemoje 72 kda 55 kda 36 kda 28 kda 72 kda 55 kda 36 kda 28 kda M wt Pal, nukreiptos į skirtingus ląstelės kompartmentus, sintezė 6dpi. Pakartotiniai mėginiai atitinka skirtingus bakterijų praskiedimus. Viršuje: bendrų ląstelės baltymų SDS-PAGE Coomassie, Apačioje: Western hibridizacija su anti-6his Mab. 1, 2 Pal apoplastas 3, 4 - Pal chloroplastas 5, 6 - Pal citozolis WT- neigiama kontrolė, augalai infiltruoti tuščiais vektoriais.

40 Cpl-1 ir Pal ekstrakcijos optimizavimas M wt kda 55 kda 40 kda 35 kda 25 kda 15 kda 10 kda Cpl-1 ir Pal konstruktais infiltruotų N.benthamiana lapų bendrų baltymų ekstraktų, gautų naudojant skirtingus ekstrakcijos buferius SDS-PAGE Coomassie dažymas MW Cpl-1 ~42 kda MW Pal ~37 kda 1 Cpl-1 chloroplaste, 5 dpi Buferis A 2 - Cpl-1 chloroplaste, 5 dpi Buferis B 3 - Cpl-1 chloroplaste, 5 dpi Buferis C 4 - Pal chloroplaste, 6 dpi Buferis A 5 - Pal chloroplaste, 6 dpi Buferis B 6 - Pal chloroplaste, 6 dpi Buferis C 7 Pal chloroplaste, 6 dpi Buferis A 8 - Pal chloroplaste, 6 dpi Buferis B

41 PlyGBS, Cpl-1 ir Pal galima išgryninti Ni+ afinine chromatografija natyviomis sąlygomis Pirmieji baltymo gryninimo bandymai: FT W1 W2 E1 E2 E3 E4 E5 FT W1 W2 E1 E2 E3 FT W1 W2 E1 E2 E3 E4 E5 70 kda 55 kda 40 kda 35 kda 25 kda 15 kda PlyGBS Cpl-1 Pal SDS-PAGE Coomassie dažyti geliai

42 Toliau: Tolesnis baltymų gryninimas Bakteriolizinio aktyvumo išmatavimas in vitro Eksperimentai su gyvūnais

43 Laikinos raiškos sistemų sėkmingo pritaikymo pavyzdžiai Rekombinantiniai antikūnai; Rekombinantiniai antigenai vakcinoms; Į virusus panašios dalelės; Terapiniai baltymai.

44 Rekombinantiniai antikūnai ne Hodžkino limfomos (NHL) gydymui (MagnIcon) NHL Limfocitų vėžys; gali būti B arba T ląstelių. Apie 300 naujų atvejų kasmet Lietuvoje, apie JAV. Apie 25% visų atvejų sudaro iki šiol laikoma nepagydoma folikulinė B ląstelių limfoma. Dauguma pacientų, praėję chemoterapiją, radioterapiją arba abliacinę anti-b-limfocitų antikūnų terapiją, vis tiek atkrinta. Nors B-ląstelių navikai ir, ypatingai, folikuliniai navikai gali būti labai įvairūs, jie turi ir bendrų bruožų: kiekvienas piktybinių B ląstelių klonas sintetina unikalų ląstelės paviršiaus imunoglobuliną (Ig), kuris tarnauja kaip navikui specifinis markeris. Ši savybė gali būti panaudota individualizuotų, pacientui specifinių vakcinų kūrimui. Naujausi NHL gydymo būdai kaip tik ir fokusuojasi ties galimybe vakcinuoti pacientus jų pačių idiotipais, konjuguotais su didele imunogeniška molekule, pav. KLH (keyhole limpet hemocyanin) kartu su GM-CSF.

45 Kas yra idiotipinė vakcina? Idiotipas : imunoglobulino molekulės dalis, suteikianti jam unikalumą, dažniausiai tai yra antigeno jungimosi vieta. Idiotipinė vakcina: pacientas yra imunizuojamas rekombinantiniu antikūnu, kuris turi tą patį idiotipą, kuris randamas ant vėžinės ląstelės paviršiaus. Rekombinantinis antikūnas yra konjuguotas su su didele imogeniška molekule KLH, taigi jis yra imunogeniškas ir sukelia pacientui imuninį atsaką. Susiformavę paciento antikūnai atpažįsta vėžines ląsteles ir jas naikina.

46 Individualizuotos idiotipinės vakcinos NHL gydymui pavyzdys: MyVax vakcina (susintetinta žinduolių ląstelėse) Limfomos gydymas imunizuojant rekombinantiniu idiotipu. (A)MyVax vakcinos gamybos ir skyrimo schema. PGR, polymerazinė grandininė reacija; Id, idiotipas; VH ir VL, sunkiosios ir lengvosios grandinės variabilūs regionai; KLH, keyhole limpet hemocyanin. (B) Chemoterapijos ir imunizacijų grafikas. (Timmerman et al., 2009 Leuk Lymphoma)

47 Augaluose susintetintos individualizuotos idiotipinės vakcinos NHL gydymui (magnicon technologija) 20-ties pacientų variabilūs Idregionai su augalų signaliniais peptidais buvo klonuoti į magnicon vektorius. Sunkioji grandinė buvo ekspresuota TMV vektoriuje, o lengvoji PVX vektoriuje, arba atvirkščiai. Skirtingų rekombinantinių Ig sintezės lygiai A) 13 pacientų rigg raiška N. benthamiana. Bendro lapų baltymų ekstrakto PAGE Coomassie. Numeruoti mėginiai atittinka skirtingų pacientų Ig. A20 pelės limfomos Ig, S- žmogaus IgG1/kappa standartas, U- neigiama kontrolė iš neinfiltruoto N. benthamiana augalo. B) Fermentinės imunosorbentinės analizės (ELISA) būdu nustatyti tų pačių pacientų rigg sintezės lygiai. Rekombinantinio IgG išeiga išreikšta IgG baltymo gramais vienam kilogramui šviežios lapo biomasės. Bendandi M et al. Ann Oncol 2010;21:

48 rigg sintezė augaluose yra greita ir efektyvi Augaluose sintetinamos lengvosios ir sunkiosios grandinės susirenka į pilnus IgG. Gauti rigg sintezės lygiai (iki 4,8g/kg šviežios biomasės arba iki 75% bendro ląstelės baltymo) yra artimi teorinei galimybių ribai. Nuo klonavimo iki nustatymo ELISA visas procesas užtrunka dvi savaites. Vienam NHL pacientui gydyti reikia iki 25mg Ig, dar 200mg reikalingi proceso kontrolei, ir kokybės testavimui. Šitoks kiekis gali būti išgrynintas iš mažiau nei 1kg lapų biomasės. Transfekuojant 5 kg augalų biomasės vienai vakcinai, net ir blogai besisintetinantys kandidatai gali būti pagaminti pakankamais kiekiais patenkinti klinikiniams poreikiams.

49 Augaluose susintetinti rigg yra glikozilinti augalams specifiniu glikozilinimu... Coomassie mėliu dažytas išgrynintų 9 pacientų rigg SDS-PAGE gelis. Tų pačių baltymų imunoblotas su anti-fukozės ir antiksilozės antikūnais. Bendandi M et al. Ann Oncol 2010;21:

50 ... tačiau šis glikozilinimas netrukdo jų terapiniam poveikiui Augaluose susintetinto 38C13 Ig imunogeniškumas 38C13 pelių limfomos modelyje A anti-38c13 titrai vakcinuotose pelėse (10d po antros vakcinacijos) B pelės, imunizuotos augaluose susintetinto 38C13 IgG-KLH konjugatu apsaugotos nuo įskiepyto naviko. (Pelės imunizuotos 2 kartus, po 12 dienų joms padaryta poodinė 38C13 vėžinių lastelių injekcija. IgM-KLH teigiama kontrolė, hibridomose susintetinta vakcina.) Bendandi M et al. Ann Oncol 2010;21:

51 Augaluose susintetinto A20 imunoglobulino sukeliama apsauga pelių limfomos A20 modelyje Pelės, imunizuotos magnicon sistemoje susintetintu A20 IgG1-keyhole limpet hemocyanin (KLH) konjugatu yra apsaugotos nuo apkrėtimu vėžiu. (Du kartus IgG-KLH imunizuotoms pelės po oda sušvirkšta A20 vėžinių ląstelių). Bendandi M et al. Ann Oncol 2010;21:

52 Išvados Augaluose susintetinti rekombinantiniai antikūnai gali būti gaminami labai sėkmingai ir greitai; Augaluose susintetinti rekombinantiniai antikūnai yra ne mažiau aktyvūs negu hibridomose pagaminta vakcina (tiriant du eksperimentinius pelių limfomos modelius);... į tolesnius klausimus atsakys šiuo metu vykdomi klinikiniai tyrimai.

53 Augaluose susintetintas Transuzumabas (Herceptin) (MagnICON) Žmogaus epidermio augimo faktoriaus receptorius 2 (HER2/neu) yra onkogenas, susijęs su nenormaliu ląstelių augimu krūties vėžio atveju 20-30% krūties vėžio atvejų. Transuzumabas (Herceptin) humanizuotas monokloninis antikūnas, kuris atpažįsta HER2/neu ir yra sėkmingai naudojamas krūties vėžio gydymui. Deja, toks gydymas labai brangus. Rekombinantinis transuzumabas sintetinamas (CHO) kininio žiurkėno kiaušidžių ląstelių kultūroje. Augaluose susintetintas Transuzumabas galėtų būti pigesnė alternatyva.

54 Augaluose susintetintas transuzumabas (Plant made transuzumab, PMT) (Komarova et al., 2011 PLoS ONE) Infiltracijai naudoti vektoriai. Lengvoji grandinė susintetinta naudojant PVX vektorių, o sunkioji TMV vektorių. Coomassie dažyti SDS-PAGE išfrakcionuoti baltymai prieš gryninimą (1 takelis), ir po baltymo A afininės kolonos gryninimo. 2 takelis FT, 3-11 surinktos išgrynintų baltymų frakcijos. PMT ir transuzumabo palyginimas. Coomassie dažyti išfrakcionuoti baltymai kairėje PAGE, dešinėje SDS-PAGE.

55 PMT slopina vėžinių ląstelių linijos augimą taip pat gerai, kaip transuzumabas PMT poveikis krūties vėžio ląstelių linijai SK-BR-3. PMT sukeltas augimo slopinimas palyginus su trastuzumab (Herceptin, Hoffmann-La Roche). Rituximab (Hoffmann- La Roche) neigiama kontrolė. Komarova et al., 2011 PLoS ONE

56 Įskiepyto naviko eksperimentuose PMT yra efektyvesnis už transuzumabą PMT slopina auglio augimą pelėse naudojant įskiepyto žmogaus Her2+ kiaušidžių vėžio modelį 6 dienos po SKOV3 implantacijos: 20mg/kg PMT injekcija, po to, 16 dienų bėgyje, 8 10mg/kg PMT injekcijos. Kontrolinė grupė fiziologinio tirpalo injekcijos. Auglio dydis matuotas 10-14, ir dienos po SKOV3 implantacijos. Komarova et al., 2011 PLoS ONE

57 Vakcinos Vakcinos prieš virusus Vienkomponentės Subvienetų vakcinos VLP vakcinos Vakcinos prieš bakterinius patogenus

58 Augaluose susintetintos į virusus panašios dalelės (VLP). Gripo viruso dalelės (D Aoustet al Plantbiotechnology journal; Medicago Inc) H5N1 ir H1N1 hemagliutininas ir matrikso baltymas klonuoti į binarinius agrobakterijų vektorius. Hemagliutininą sintetinančiuose augaluose formuojasi į virusus panašios dalelės 6dpi baltymai išskirti iš N. benthamiana lapų ir išgryninti

59 Gripo viruso VLP pumpuruoja nuo plazminės membranos VLP lipidų analizė parodė, kad tai yra augalų plazminės membranos baltymai. Dalelių pumpuravimas nuo plazminės membranos buvo nufotografuotas. D Aoust et al Plant biotechnology journal

60 VLP yra imunogeniškos ir efektyvios Hemagliutinacijos slopinimo eksperimentas. Pelės imunizuotos 2 kartus. Serumų HI titrai nustatyti 14d po paskutinės imunizacijos. (1grupė = 5 BALB/c pelės) Apsaugojimo eksperimentai. 75d po imunizacijos pelės buvo apkrėstos mirtina A/Vietnam/1194/04 viruso doze. (1grupė = 8 BALB/c pelės) D Aoust et al Plant biotechnology journal

61 Gripo viruso VLP augaluose kovai su pandemija Rekombinantinio HA (hemagliutinino) baltymo išeiga yra 50mg/kg šviežių lapų svorio, Jei teorinė viena žmogaus vakcinos dozė 30μg, iš 1kg infiltruotų lapų 1500 vakcinos dozių, 1m2 šiltnamio plote per 6 savaites galima išauginti 2kg lapų, 5000m2 šiltnamio per 3 mėnesius 30 milijonų vakcinos dozių, Vakcina gali būti pagaminta praėjus 18 dienų nuo viruso sekos nustatymo.

62 H5 VLP vakcinos ikiklinikiniai ir klinikiniai tyrimai. Šeškų vakcinacija Kūno temperatūra Kūno masė Išgyvenimo procentas Bendra savijauta (Preclinical and Clinical Development of Plant-Made Virus-Like Particle Vaccine against Avian H5N1 Influenza. Landry et al., 2010 PLoS ONE. Medicago Inc.)

63 H5 VLP vakcinos ikiklinikiniai ir klinikiniai tyrimai Puikūs rezultatai gauti su šeškų imunizacija I stadijos klinikiniai tyrimai žmonėse, imunizuotuose 2 kartus 21 dienos intervalu 5, 10 arba 20μg VLP parodė: Vakcina gerai toleruojama, šalutiniai poveikiai silpni arba vidutinai (dažniausiai pasitaikė skausmas injekcijos vietoje) Nepastebėta stiprių alerginių reakcijų. Hemagliutinacijos inhibicijos ir mikroneutralizacijos rezultatai gerai tarpusavyje koreliuoja. 96% tiriamųjų, gavę 20μg VLP dozę, išvystė mikroneutralizacijos atsaką. Visa tai rodo, kad augalinė VLP gripo vakcina turi būti toliau tiriama ir vystoma. (Preclinical and Clinical Development of Plant-Made Virus-Like Particle Vaccine against Avian H5N1 Influenza. Landry et al., 2010 PLoS ONE. Medicago Inc.)

64 Maro vakcina (Protection conferred by recombinant Yersinia pestis antigens produced by a rapid and highly scalable plant expression system. Santi et al., 2005 PNAS (MagnICON) Yersinia pestis maro sukėlėjas, iki šiol endeminis Afrikoje, Azijoje ir Amerikos žemynuose (perneša blusos). Buvo sukurta gyva susilpninta vakcina, tačiau šalutiniai poveikiai pasirodė pernelyg stiprūs. Pagrindiniai antigenai, kurie tiktų subvienetų vakcinos gamybai: kapsulės baltymas F1 ir sekretuojamas baltymas V. Abu šie antigenai yra imunogeniški ir įrodytas jų apsauginis efektas tyrimuose su gyvūnais. Santi L et al. PNAS 2006;103:

65 Konstruktai MagnICON vektorių pagrindu Santi L et al. PNAS 2006;103:

66 Baltymų sintezės rezultatai 7 dpi surinktų N. benthamiana mėginių baltymų. SDS-PAGE Coomassie geliai (A - F1, B - V baltymų konstruktai) 1- neinfiltruoto lapo baltymai 2, 3 F1 ir V konstruktais be signalinės sekos (citozolyje) infiltruoti lapai 4, 5 - F1 ir V konstruktais su į apoplastą nukreipiančiais signalais infiltruoti lapai 6 - F1 ir V konstruktais su į chloroplastą nukreipiančiu signalu infiltruoti lapai 7 - F1-GFP ir V-GFP konstruktais infiltruoti lapai, 8 - F1-DsRED ir V-DsRED konstruktais infiltruoti lapai, 9 GFP konstruktu infiltruoti lapai. Santi L et al. PNAS 2006;103: Nustatyta citozolyje susintetintų rekombinantinių baltymų išeiga: V- 2 mg/g šviežio svorio F1-2 mg/g šviežio svorio F1V- 1 mg/g šviežio svorio

67 Jūrų kiaulyčių serumo antikūnų susidarymas po vakcinacijos išgrynintais rekombinantiniais Y. pestis antigenais Anti-F antikūnai Anti-V antikūnai Jūrų kiaulytės buvo vakcinuotos 3 kartus ir po kiekvienos vakcinacijos nustatyti anti-f1 ir anti-v antikūnų titrai. Galima teigti, kad visi 4 rekombinantinių baltymų preparatai sukėlė panašaus lygio titrus po 3 vakcinacijos, tik chimerinis baltymas F1V buvo lėtesnis susidarant anti-v antikūnams. Santi L et al. PNAS 2006;103:

68 Vakcinuotų jūrų kiaulyčių išgyvenamumas po infekcijos Y. pestis (CO92) aerozoliu Jūrų kiaulytės vakcinuotos 2 kartus. Praėjus 4 savaitėms po antros vakcinacijos kiaulytės buvo apkrėstos maru. Nė viena neskiepyta kiaulytė neišgyveno ilgiau 6 dienų. V antigenas buvo efektyviausias, išgyveno 6 iš 8 kiaulyčių F1-V (5 iš 8), F1-his (3 iš 8). Netgi tos kiaulytės, kurios neišgyveno iki bandymo pabaigos, visos gyveno ilgiau, negu kontrolinės. Santi L et al. PNAS 2006;103:

69 Laikina genų raiška rekombinantinių baltymų sintezei augaluose Privalumai: Teisingai susivynioję baltymai Pigi žaliava Saugūs naudoti terapijai (nėra žmogaus patogenų ir endotoksinų) Labai greitas procesas Didelės išeigos Galima ekspresuoti subvienetų vakcinas ir imunoglobulinus Trūkumai Glikozilinimas (galima apeiti) Neturi sialo rūgšties (galima apeiti) Kaskart reikalinga nauja transfekcija

70 Augaluose susintetinti medicininės paskirties baltymai, pasiekę klinikinių tyrimų stadiją Glucocerebrosidase/Protalix, Stadija III (baigti tyrimai) Interferon alpha/biolex, Stadija II Insulin/Sembiosys, Stadija I-II Anti-HIV Mab PharmaPlanta, Stadija I Laikinos raiškos sistemose susintetinti baltymai: NHL vakcina/icon-bayer, Stadija I Gripo vakcina/medicago, Stadija I Gripo vakcina/fraunhofer US, Stadija I Norovirus vakcina/vaxx, Stadija I Anti-Ebola Mab, Mapp, Stadija I

71 Ačiū už dėmesį RBCS1-INFα-GFP