LIETUVOS AGRARINIŲ IR MIŠKŲ MOKSLŲ CENTRO FILIALO SODININKYSTĖS IR DARŽININKYSTĖS INSTITUTO IR ALEKSANDRO STULGINSKIO UNIVERSITETO MOKSLO DARBAI. SODI

LIETUVOS AGRARINIŲ IR MIŠKŲ MOKSLŲ CENTRO FILIALO SODININKYSTĖS IR DARŽININKYSTĖS INSTITUTO IR ALEKSANDRO STULGINSKIO UNIVERSITETO MOKSLO DARBAI. SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ. 2014. 33(1 2). Trešnės ir paprastosios vyšnios rudojo puvinio sukėlėjų (Monilinia spp.) rūšių identifikavimas molekuliniais metodais Birutė Frercks, Vidmantas Stanys Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialas Sodininkystės ir daržininkystės institutas, Kauno g. 30, LT-54333 Babtai, Kauno r., el. paštas b.frercks@lsdi.lt Rudąjį puvinį gali sukelti keturi giminingi ligos sukėlėjai: Monilinia laxa (Aderh. et Ruhl.) Honey, Monilinia fructigena (Aderh. et Ruhl.) Honey, Monilinia fructicola (G. Wint.) Honey ir Monilia polystroma van Leeuwen. Rūšinė Monilinia spp. sudėtis trešnės soduose Lietuvoje iki šiol nebuvo tirta. Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti Monilinia rūšis, paplitusias ant trešnės ir paprastosios vyšnios vaisių Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialo Sodininkystės ir daržininkystės instituto (LAMMC SDI) kaulavaisinių augalų kolekcijoje, taikant molekulinius metodus. Šioje kolekcijoje 2013 metais atsitiktine tvarka buvo paimti 72 Monilinia spp. ėminiai nuo trešnės ir paprastosios vyšnios vaisių. Monilinia rūšys tirtuose bandiniuose buvo nustatytos sudėtinės polimerazės grandininės reakcijos (PRG) metodu. Karantininio ligos sukėlėjo M. fructicola LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje nebuvo aptikta. Nustatyta, kad šioje kolekcijoje dominuojanti Monilinia rūšis yra M. laxa, kuri palaipsniui išstumia konkuruojantį trešnės ir paprastosios vyšnios vaisių rudojo puvinio sukėlėją M. fructigena. Reikšminiai žodžiai: Monilinia fructicola, Monilinia fructigena, Monilinia laxa, Prunus avium, Prunus cerasus, sudėtinė PGR. Įvadas. Kaulavaisinių moniliozė yra didžiausią žalą šiems ir kitiems erškėtinių šeimos augalams daranti grybinė liga (van Brouwershaven ir kt., 2010). Šia liga augalai gali sirgti per visą vegetaciją. Priklausomai nuo to, kurias augalo dalis pažeidžia, kaulavaisių moniliozė skirstoma į moniliozinę degligę (angl. blossom blight) ir rudąjį puvinį (angl. brown rot). Moniliozinė degligė plinta pavasarį, vaismedžiams žydint. Pirmiausia ant žiedų pasirodžiusios nekrozės dėmės plinta ant jaunų ūglių ir šakelių, o vaismedžiai atrodo lyg apdegę (Pileckis, 1994). Rudasis puvinys pažeidžia nokstančius vaisius ant jų susidaro rudos puvinio dėmės. Paskui, vaisiams liečiantis, sukėlėjas plinta nuo užkrėstų vaisių ant sveikų (Holb, 2008). Dėl šios ligos kiekvienais metais prarandama apie 20 30 %, o epifitotijos metais kai kuriuose Europos regionuose iki 90 % derliaus (Apostol, Véghelyi, 1994). Lietuvoje kaulavai- 33

sinių moniliozė išplito 1949 1952 metais kaip moniliozinė degligė. Tuo metu sirgo vidutiniškai 30 % paprastosios vyšnios medžių, o kai kuriuose šalies regionuose sergamumas siekė iki 60 % (Gudynaitė, 1954). Rudasis puvinys Lietuvoje išplito vėliau ir šiuo metu yra labiausiai paplitusi paprastosios vyšnios vaisių grybinė liga (Valiuškaitė ir kt., 2005). Paskutinė paprastosios vyšnios moniliozės epifitotija Lietuvoje nustatyta 2008 2010 metais (Gelvonauskienė ir kt., 2013). Kaip rudasis puvinys pažeidžia trešnės veisles, Lietuvoje nebuvo tirta. Rudąjį puvinį gali sukelti keturi giminingi ligos sukėlėjai: Monilinia laxa (Aderh. et Ruhl.) Honey, Monilinia fructigena (Aderh. Et Ruhl.) Honey, Monilinia fructicola (G. Wint.) Honey ir Monilia polystroma van Leeuwen. M. laxa ir M. fructigena yra Europoje labiausiai paplitusios patogenų rūšys (Côté ir kt., 2004; van Brouwershaven ir kt., 2010). M. polystroma morfologiškai labai panašus į M. fructigena, palyginti neseniai identifikuotas ir ypač paplitęs Japonijoje (van Leeuwen ir kt., 2002). Europoje iki šiol jis aptiktas tiktai Vengrijoje (Petroćzy, Palkovics, 2009). M. fructicola, vadinamo Naujojo pasaulio patogenu (Côté ir kt., 2004), paplitimo arealas iki praėjusio šimtmečio paskutiniųjų dešimtmečių apėmė Šiaurės ir Pietų Amerikos bei Australijos žemynus. M. fructicola, palyginti su M. laxa ir M. fructigena, yra agresyvesnis patogenas (Carstens ir kt., 2010). Šios rūšies individai vystosi esant didesniam temperatūrų intervalui, todėl vaismedžių žiedus pavasarį gali pažeisti anksčiau. Be to, šis patogenas, kitaip nei M. laxa ar M. fructigena, gali daugintis ne tik vegetatyviniu, bet ir lytiniu būdu, todėl genetiškai jis gali greičiau prisitaikyti prie pasikeitusių aplinkos sąlygų (Lichou ir kt., 2002). Nustatyta, kad Europos klimato sąlygos yra labai palankios M. fructicola plisti (van Leeuven ir kt., 2001). Dėl morfologinio Monilinia rūšių panašumo ligų sukėlėjams nustatyti vien tik vizualios patikros nepakanka (van Brouwershaven ir kt., 2010). Todėl šiuo metu Europos ir Viduržemio jūros regiono augalų apsaugos organizacija (EPPO) rekomenduoja Monilinia spp. patogenus nustatyti molekuliniais metodais (EPPO, 2012). Buvo sukurti specifiniai pradmenys Monilinia rūšims identifikuoti naudojant standartinės polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodą (Ioos, Frey, 2000). Vėliau buvo sukurtas sudėtinės PGR metodas, leidžiantis identifikuoti kelis patogenus vienos reakcijos metu (Côté ir kt., 2004). Šis metodas sėkmingai taikytas nustatant patogenų izoliatus (Poniatowska ir kt., 2013) ir tiesiogiai tiriant ėminius, paimtus iš lauko (Hrustić ir kt., 2012). M. fructicola Europoje yra priskiriamas karantininiams patogenams (EU, 2000). EPPO jį įtraukė į A1 sąrašą, į kurį įrašytų patogenų neaptinkama šiame regione. 2001 metais pirmą kartą identifikavus M. fructicola Prancūzijoje (EPPO, 2002 a), vėliau ir kitose Europos šalyse, šis ligos sukėlėjas buvo perkeltas į EPPO A2 sąrašą, į kurį įrašytų patogenų aptinkama kai kuriose EPPO šalyse, jie stebimi, kontroliuojamas jų paplitimas (EPPO, 2012). Šiuo metu M. fructicola yra pastebėtas jau trylikoje iš dvidešimt aštuonių Europos Sąjungos šalių. Neseniai karantininis patogenas M. fructicola molekuliniais metodais identifikuotas kaimyninėje Lenkijoje (Poniatowska ir kt., 2013). Baltarusijoje, tiriant izoliuotas patogenų kultūras mikrobiologiniais metodais, šio ligos sukėlėjo neaptikta (Lesik, 2013). Europos maisto saugos tarnybos (EFSA) apklausos duomenimis, Latvijoje M. fructicola nėra aptikta, tačiau reikia pabrėžti, kad specifinės patikros neatliekamos, patogenas stebimas tik vizualiai (EFSA, 2011). 34

Rudojo puvinio, pažeidžiančio paprastosios vyšnios vaisius, sukėlėjo rūšinė sudėtis Lietuvoje paskutinį kartą buvo tirta 2002 metais, taikant mikrobiologinius metodus (Valiuškaitė, 2002), Europoje vos tik pasirodžius M. fructicola patogenui. Darbo tikslas išanalizuoti Monilinia rūšių, paplitusių ant trešnės ir paprastosios vyšnios vaisių LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje, sudėtį, taikant molekulinius metodus. Tyrimo objektas, metodai ir sąlygos. Tyrimai atlikti 2011 2013 m. Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialo Sodininkystės ir daržininkystės instituto (LAMMC SDI) Sodo augalų genetikos ir biotechnologijos skyriuje. Analizei atlikti ėminiai paimti birželio mėn. paskutinįjį ir liepos mėn. pirmąjį dešimtadienį LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje. Trešnės ir paprastosios vyšnios vaisiai, ant kurių buvo matyti rudojo puvinio simptomų, buvo nuskinti atsitiktine tvarka, vienam ėminiui sudaryti imant po 4 5 vaisius nuo kas šešto vaismedžio tiriamajame plote. Iš viso buvo paimti 72 ėminiai. Nuo vaisių nuimtas micelis buvo laikomas -20 C temperatūroje. Patogenų DNR išskirta ir sudėtinė polimerazės grandininė reakcija (PGR) atlikta pagal Côté ir kt. (2004) metodiką. Išskirtos DNR koncentracija nustatyta naudojant NanoPhotometer P300 spektrofotometrą (Implen, GmbH). Visų bandinių koncentracijos suvienodintos iki 50 ng/µl, praskiedžiant steriliu distiliuotu H 2 O. Sudėtinei PGR atlikti naudoti trys specifiniai tiesioginiai Monilinia rūšių pradmenys: M. fructigena MO368-8R (DNR fragmentų dydis 402 bp), M. fructicola MO368-10R (535 bp), M. laxa Laxa-R2 (351 bp), ir bendras visoms tirtoms rūšims atbulinis pradmuo MO368-5 (Côté ir kt., 2004). Kaip neigiama kontrolė vietoj DNR naudotas H 2 O. Kaip teigiama kontrolė naudota M. laxa ir M. fructigena grynųjų kultūrų DNR. Sudėtinės PGR analizė atlikta Mastercycler personal termocikleriu (Eppendorf, Vokietija). Kiekvieno mėginio analizės buvo atliekamos dviem pakartojimais. DNR elektroforezė atlikta 2 % agarozės gelyje, kuriame yra 2 % Tris-EDTA buferio ir 8µl etidžio bromido. Geliai tirti UV šviesoje, naudojant transliuminatorių RH-5.1 (Herolab, Vokietija), ir vizualizuoti, E. A. S. Y. Win 32 kompiuterine programa (Herolab, Vokietija). Trešnės (32 veislės) ir paprastosios vyšnios (17 veislių) atsparumas rudajam puviniui įvertintas vizualiai LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje 2011 2013 metais pagal 0 5 balų vertinimo skalę: 0 visi vaisiai sveiki, 5 daugiau kaip 75 % vaisių pažeista. Apskaičiuotas atsparumo aritmetinis vidurkis ir standartinis nuokrypis. Pagal atsparumą veislės suskirstytos į 4 grupes: atsparios (pažeidimo balas 0 P < 1), vidutiniškai atsparios (1 P < 2), vidutiniškai jautrios (2 P < 3) ir jautrios (P 3). Rezultatai. LAMMC SDI kolekcijoje iš viso buvo paimti 72 ėminiai: 47 nuo trešnės, 25 nuo paprastosios vyšnios vaisių. Atlikus sudėtinę fragmentų pagausinimo reakciją, nė viename iš tirtų 72 mėginių nebuvo amplifikuotas 535 bp dydžio DNR fragmentas, būdingas M. fructicola patogenui. Visuose mėginiuose buvo aiškiai matyti amplifikuoti 351 bp (būdingas M. laxa patogenui) ir (arba) 402 bp (būdingas M. fructigena patogenui) dydžio fragmentai (1 pav.). Analizuojamuose mėginiuose dominavo M. laxa specifinis fragmentas, identifikuotas 74 % tirtų mėginių. M. fructigena patogenas aptiktas tik penkiuose tirtuose mėginiuose (7 %). Abu patogenai (M. laxa ir M. fructigena) buvo identifikuoti keturiolikoje mėginių (19 %). 35

1 pav. Specifiniai Monilinia spp. DNR fragmentai. M 1 000 bp DNR fragmentų žymuo; ml specifinis M. laxa fragmentas; mf specifinis M. fructigena fragmentas; ml, mf mėginys su abiejų patogenų fragmentais. Fig. 1. Monilinia species-specific DNA fragments. M 1 000 bp DNA ladder; ml M. laxa-specific fragment; mf M. fructigena-specific fragment; ml, mf sample with both M. laxa- and M. fructigena specific fragments. Siekiant nustatyti, ar Monilinia rūšių pasiskirstymas priklauso nuo augalo rūšies, buvo įvertinti patogenai ant trešnės ir paprastosios vyšnios vaisių atskirai (2 pav.). M. laxa patogeno dažniau buvo randama ant ėminių, paimtų nuo trešnės vaisių. M. fructigena patogeno (tiek vieno, tiek kartu su M. laxa) dažniau buvo aptinkama ant ėminių, paimtų nuo paprastosios vyšnių vaisių (2 pav.). Tarp Monilinia rūšių pasiskirstymo santykio ant trešnės ir ant paprastosios vyšnios vaisių nustatyta stipri teigiama koreliacija (r = 0,99). Todėl galima teigti, jog nepriklausomai nuo augalo rūšies tiriamuoju laikotarpiu LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje dominavo M. laxa patogenas (2 pav.). Siekiant ištirti, ar yra ryšys tarp augalo genotipo atsparumo rudajam puviniui ir Monilinia rūšies paplitimo ant tiriamo genotipo, buvo įvertintas analizuojamų trešnės ir paprastosios vyšnios veislių atsparumas šiai grybinei ligai (1 ir 2 lentelės). Trešnės veislių atsparumas įvairavo nuo 0,1 iki 2,5 balo. Iš 32 tirtų trešnės veislių 20 (63 %) buvo atsparios rudajam puviniui. Iš analizuotų trešnės veislių trys (9 %) buvo vidutiniškai jautrios, kitos (28 %) vidutiniškai atsparios šiai grybinei ligai. Paprastosios vyšnios veislių atsparumas rudajam puviniui įvairavo nuo 0,1 iki 3 balų. Paprastosios vyšnios, kaip ir trešnės, didžiausią tirtų veislių dalį (41 %) sudarė atsparios veislės. Penkios paprastosios vyšnios veislės (29 %) buvo vidutiniškai atsparios šiai ligai, keturios (24 %) pagal atsparumo balą buvo priskirtos vidutiniškai jautrių veislių grupei. Kitaip negu trešnės, viena paprastosios vyšnios veislė buvo įvertinta kaip jautri rudajam puviniui. Lyginant trešnės ir paprastosios vyšnios veislių pasiskirstymą į keturias atsparumo grupes, galima teigti, kad tirtos trešnės veislės buvo mažiau pažeistos rudojo puvinio nei paprastosios vyšnios. 36

2 pav. Identifikuotų Monilinia rūšių pasiskirstymas ant trešnės ir paprastosios vyšnios vaisių Fig. 2. Distribution of Monilinia species identified on sweet and sour cherry fruit Monilinia rūšių paplitimas trešnės skirtingo atsparumo genotipuose skyrėsi nuo jų pasiskirstymo skirtingo atsparumo paprastosios vyšnios genotipuose. M. laxa patogenas buvo identifikuotas vaisiuose tų trešnės veislių, kurios priklausė visoms keturioms atsparumo rudajam puviniui grupėms (1 lentelė). Šių trešnės veislių atsparumas buvo vidutiniškai 0,86 balo. M. fructigena patogenas aptiktas vaisiuose tik tų veislių, kurios buvo priskirtos atsparių trešnės veislių grupei (atsparumo balas vidutiniškai 0,25). Trešnės veislės, kurių vaisiuose buvo aptikti abu patogenai, taip pat buvo priskirtos atsparių veislių grupei (atsparumo balas vidutiniškai 0,37). Dešimt trešnės veislių buvo analizuota kelis kartus (1 lentelė). Ostuzenka, Rožinės, Siubarovskaya, Sunburst ir Tjucevnaja veislių vaisiuose buvo du tris kartus aptiktas tik M. laxa patogenas, o ant selekcinio numerio 5 vaisių du kartus aptiktas tik M. fructigena patogenas. Atsparių trešnės veislių: Verdisch braune, Radica, Mindaugė ir Krasny Mak, skirtinguose mėginiuose buvo identifikuoti abu patogenai (1 lentelė). Tiriant Monilinia rūšių pasiskirstymą ant skirtingo atsparumo rudajam puviniui paprastosios vyšnios veislių vaisių, M. laxa patogenas buvo identifikuotas vaisiuose tų paprastosios vyšnios veislių, kurios priklausė visoms keturioms atsparumo rudajam puviniui grupėms (atsparumas vidutiniškai 0,95 balo). Kitaip nei tiriant trešnės veisles, M. fructigena patogenas buvo identifikuotas visų atsparumo grupių, išskyrus jautrias, paprastosios vyšnios veislių vaisiuose (atsparumo balas vidutiniškai 1,5). Paprastosios vyšnios veislės, kurių vaisiuose buvo aptikti abu patogenai, priklausė visoms keturioms atsparumo rudajam puviniui grupėms. Vidutinis šių veislių atsparumas buvo mažesnis 1,9 balo. Septynių paprastosios vyšnios veislių, kurių analizė buvo atlikta kelis kartus, vaisiuose buvo identifikuoti abu patogenai, išskyrus atsparią rudajam puviniui veislę Zaranka : jos vaisiuose buvo du kartus aptiktas tik M. laxa patogenas (2 lentelė). 37

1 lentelė. Monilinia spp. patogenų paplitimas ant skirtingų trešnės veislių vaisių ir šių veislių atsparumas rudajam puviniui Table 1. Prevalence of Monilinia spp. species identified on sweet cherry accession fruit and resistance to brown rot of these accessions Veislė arba selekcinis numeris Cultivar or selection PGR metodu nustatyti kaulavaisinių moniliozės sukėlėjai * Brown rot blossom blight disease identified by PCR* M. laxa M. fructigena M. laxa ir M. fructigena Atsparumas rudajam puviniui balais Resistance to brown rot (score) Atsparumo grupė** Group of resistance ** Altenburger Melonen + - - 2,5 ± 0,25 v. j. Celestė + - - 1,3 ± 0,33 v. a. Festivalnaya + - - 0,1 ± 0,03 a. Gostinec + - - 0,8 ± 0,23 a. Gronkovaya - - + 0,5 ± 0,35 a. Jaroslavnaya + - - 1,3 ± 0,48 v. a. Krasnyj Mak + + + 0,4 ± 0,24 a. Meckenheimer + - - 1,0 ± 0 v. a. Melika + - - 1,0 ± 0,39 v. a. Merchant + - - 1,8 ± 0,25 v. a. Mindaugė + - + 0,1 ± 0,02 a. Ostuzenka +, + - - 0,2 ± 0,12 a. Radica +, + - + 0,1 ± 0,08 a. Rožinė +, +, + - - 1,5 ± 0,50 v. a. Sam + - - 2,3 ± 0,33 v. j. Severnaya + - - 0,1 ± 0,03 a. Siubarovskaya +, + - - 0,1 ± 0,03 a. Sunburst +,+ - - 0,5 ± 0,28 a. Tjucevnaya +, +, + - - 0,8 ± 0,15 a. Tverskaya - - + 0,7 ± 0,26 a. Vega + - - 2,3 ± 0,33 v. j. Verdisch braune +, + - + 0,3 ± 0,33 a. Zurba + - - 0,3 ± 0,23 a. A. L: Nr. 1118 + - - 0,1 ± 0,03 a. Agila Drogano + - - 1,5 ± 0,50 v. a. geltonoji Dniprovka Drogano + - - 0,1 ± 0 a. geltonoji Merchant Nr. 6 - + - 0,1 ± 0 a. Sam Hedelfinger + - - 0,6 ± 0,45 a. Nr. 5 - - +, + 0,6 ± 0,23 a. Nr. 6 + - - 1,7 ± 0,33 v. a. Nr. 58 + - - 0,1 ± 0,05 a. Nr. 158 + - - 1,0 ± 0 v. a. * + amplifikuotas specifinis Monilinia rūšies DNR fragmentas / * + amplified Monilinia spp. species-specific DNA fragment ** a. atspari, v. a. vidutiniškai atspari, v. j. vidutiniškai jautri / ** a. resistant, v. a. moderately resistant, v. j. moderately sensitive 38

2 lentelė. Monilinia spp. patogenų paplitimas ant skirtingų paprastosios vyšnios veislių vaisių ir šių veislių atsparumas rudajam puviniui Table 2. Prevalence of Monilinia species identified on sour cherry accession fruit and resistance to brown rot of these accessions Veislė arba selekcinis numeris Cultivar or selection PGR metodu nustatyti kaulavaisinių moniliozės sukėlėjai Brown rot blossom blight disease identified by PCR* M. laxa M. fructigena M. laxa ir M. fructigena Atsparumas rudajam puviniui balais Resistance to brown rot (score) Atsparumo grupė* Group of resistance* Griot seredko + - - 0,1 ± 0 a. Igrushka + - - 0,1 ± 0 a. Keleris sportas - - + 2,8 ± 0,17 v. j. Liubskaja - + - 1,7 ± 0,33 v. a. Nordia + - + 0,1 ± 0,02 a. North Star + - - 2,8 ± 0,25 v. j. Novodvorskaya + - - 0,0 ± 0,02 a. Pietryčių ankstyva +, + - + 2,3 ± 0,33 v. j. Roviesnica + - + 1,6 ± 0,24 v. a. Samsonovka + + - 0,1 ± 0,02 a. Shalunya + - - 0,1 ± 0,05 a. Venok + + - 2,8 ± 0,25 v. j. Zaranka +, + - - 0,3 ± 0,23 a. Zyvica + - - 1,8 ± 0,17 v. a. Verknė + - - 1,3 ± 0,33 v. a. Nr. 23 + - + 3,0 ± 0,25 j. Nr. 255 - - + 1,3 ± 0,33 v. a. * + amplifikuotas specifinis Monilinia rūšies DNR fragmentas / * + amplified Monilinia spp. species-specific DNA fragment * a. atspari, v. a. vidutiniškai atspari, v. j. vidutiniškai jautri, j. jautri / * a. resistant, v. a. moderately resistant, v. j. moderately sensitive, j. sensitive Aptarimas. Pirmosios Lietuvoje Monilinia rūšių analizės, atliktos taikant molekulinius metodus, rezultatai leidžia daryti prielaidą, kad iki šiol karantininio patogeno M. fructicola mūsų šalyje nėra pastebėta. Atliekant šią analizę Monilinia rūšys buvo tirtos ant trešnės ir paprastosios vyšnios vaisių, tačiau tirti patogenai daro žalą ir kitiems kaulavaisiniams (Holb, 2008) ir erškėtinių šeimos augalams: kriaušėms ar obelims (EPPO, 2012). Europoje karantininis patogenas M. fructicola dažniausiai buvo aptinkamas ant persiko (EPPO, 2002 a; EPPO, 2002 b; Duchoslavova ir kt., 2007; De Cal ir kt., 2009; Munda, Viršček Marn, 2010; Poniatowska ir kt., 2013), rečiau ant nektarino (Pellegrino ir kt., 2009), abrikoso (Hilber-Bodmer ir kt., 2010), naminės slyvos (Ondejková ir kt., 2010; Poniatowska ir kt., 2013), trešnės ir paprastosios vyšnios (Duchoslavova ir kt., 2007), obels (Duchoslavova ir kt., 2007; Poniatowska ir kt., 2013) ir netgi ant gervuogių (Hinrichs-Berger, Müller, 2010). Todėl 39

siekiant įsitikinti, kad Lietuvoje M. fructicola patogeno nėra, ateityje turėtų būti atlikti platesni tyrimai ne tik su trešnės ir paprastosios vyšnios, bet ir su kitais vaismedžiais, imant ėminius iš daugiau Lietuvos vietovių. Monilinia rūšinės sudėties analizė rodo, kad tiriamuoju laikotarpiu LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje tirtų trešnės ir paprastosios vyšnios veislių vaisius dažniausiai pažeidžia M. laxa patogenas. Šis patogenas dominavo ir Vengrijoje (Sződi ir kt. 2012). Ankstesniais tyrimais buvo nustatyta, kad abu patogenai M. fructigena ir M. laxa vienodai pažeidžia paprastosios vyšnios vaisius Lietuvoje (Valiuškaitė ir kt., 2005). Toks Monilinia rūšių disbalansas per tam tikrą laiką nėra naujas reiškinys. Anksčiau daugiausia žalos kaulavaisiniams Europoje darė M. laxa (Larena ir kt., 2005). Ispanijoje, atsiradus invaziniam kaulavaisinių moniliozės sukėlėjui M. fructicola, nustatyta, kad per penkerius metus dėl patogenų konkurencijos tarpusavyje M. fructigena daroma žala kaulavaisiniams sumažėjo, o M. fructicola žala pasiekė M. laxa lygmenį (Villarino ir kt., 2013). Remiantis šio tyrimo rezultatais galima daryti prielaidą, kad Lietuvos agroklimato sąlygos ir LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje auginami trešnės ir paprastosios vyšnios genotipai yra palankesni M. laxa patogenui plisti, o M. fructigena patogenas yra palaipsniui išstumiamas. Monilinia spp. patogeno plitimo intensyvumas priklauso nuo augalų atsparumo (EPPO, 2012). LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje trešnės ir paprastosios vyšnios atsparumas rudajam puviniui iki šiol nebuvo tirtas. Žinoma, kad Lietuvos agroklimato sąlygomis gamybiniuose soduose paprastosios vyšnios veislė North Star yra labai jautri moniliozinei degligei ir rudajam puviniui (Valiuškaitė ir kt., 2005). Šiuo tyrimu įvertinus paprastosios vyšnios veislių atsparumą rudajam puviniui, North Star veislė buvo priskirta vidutinio jautrumo veislių grupei. Tokiam tyrimų rezultatų skirtumui įtakos gali turėti greta augančių skirtingo atsparumo veislių fonas (derinys) LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje. Gamybiniuose soduose genotipų įvairovė maža, todėl sąlygos ligai vystytis yra palankesnės. Įvertinus trešnės ir paprastosios vyšnios veislių atsparumą rudajam puviniui, nustatyta, kad tirtos trešnės veislės buvo atsparesnės nei paprastosios vyšnios veislės. Tiriant Monilinia rūšių pasiskirstymą ant trešnės ir paprastosios vyšnios nustatyta, kad tai nepriklauso nuo augalo rūšies. M. laxa patogeno aptikta daugiausia tiek ant trešnės, tiek ant paprastosios vyšnios vaisių. Šie rezultatai sutampa su kitų mokslininkų gautais rezultatais (Gell ir kt., 2007; Sződi ir kt., 2012). Monilinia rūšių pasiskirstymas ant vienos augalo rūšies skirtingo atsparumo genotipų iki šiol nėra tirtas. Tyrimo metu M. laxa patogenas buvo identifikuotas ant visų keturių skirtingo atsparumo rudajam puviniui grupių trešnės ir paprastosios vyšnios veislių vaisių. M. fructigena sukėlėjas buvo aptiktas tik ant atsparių trešnės veislių vaisių ir ant visų keturių atsparumo grupių paprastosios vyšnios veislių vaisių. Rudajam puviniui atsparių penkių trešnės veislių ir vienos paprastosios vyšnios veislės mėginiuose kelis kartus buvo identifikuotas vienintelis patogenas M. laxa, o vieno, atsparioms veislėms priskiriamo trešnės selekcinio numerio mėginyje du kartus buvo aptiktas tik M. fructigena patogenas. Abu patogenai buvo aptikti keturių trešnės ir šešių vyšnios veislių vaisių mėginiuose, paimtuose nuo skirtingų tos pačios veislės vaismedžių. Iš gautų rezultatų neaišku, ar toks patogenų specifiškumas gali būti siejamas su trešnių arba vyšnių veislių atsparumu. Ankstesniais tyrimais, kurie 40

apima vyšnių atsparumo moniliozinei degligei dešimties metų vertinimą, nustatyta, kad vienų veislių atsparumas yra stabilus, o kitų kinta (Gelvonauskienė ir kt., 2013). Veislių atsparumo stabilumas arba kintamumas gali turėti įtakos šio tyrimo rezultatams, nes trešnių ir vyšnių veislių atsparumas rudajam puviniui buvo vertinamas tik trejus metus, kai nepasireiškė kaulavaisinių moniliozės epifitotija. Todėl šiuo metu daryti išvadas, ar veislių atsparumas rudajam puviniui yra stabilus ar kintantis, ir nustatyti ryšį su patogenų specifiškumu yra per anksti. Kita vertus, šiuo tyrimu nustatyta, kad M. laxa yra dominuojantis patogenas LAMMC SDI kolekcijoje. Be to, atsižvelgiant į besiplečiantį karantininio M. fructicola patogeno paplitimo arealą Europoje, sunku prognozuoti jo pasirodymo Lietuvoje tikimybę. Todėl ateityje Monilinia rūšių sudėtis turėtų būti stebima. Išvada. Tiriamuoju laikotarpiu LAMMC SDI kaulavaisinių augalų kolekcijoje ant trešnių ir vyšnių vaisių dominavo M. laxa sukėlėjas. Karantininio patogeno M. fructicola minėtoje kolekcijoje nebuvo aptikta. Padėka. Tyrimai atlikti vykdant programą Žemės ūkio ir miškų augalų genetika ir genotipų kryptingas keitimas. Gauta 2014 05 05 Parengta spausdinti 2014 05 15 Literatūra 1. Apostol J., Véghelyi K. 1994. Results of test crossing in oder to get disease resistant sour cherry varieties. In: H. Schmidt, M. Kellerhals (eds.), Progress in Temperate fruit breeding. Developments in Plant Breeding. Kluwer Academic Publishers, Switzerland, 53 55. 2. Carstens E., van Niekerk J. M., Laubscher W., Fourie P. H. 2010. Resolving the status of Monilinia spp. in South African stone fruit orchards. Journal of Plant Pathology, 92: 35 41. 3. Côt M. J., Tardif, M. C., Meldrum A. J. 2004. Identification of Monilinia fructigena, M. fructicola, M. laxa, and Monilia polystroma on inoculated and naturally infected fruit using multiplex PCR. Plant Disease, 88: 1 219 1 225. 4. De Cal A., Gell I., Usall J., Viñas I., Melgarejo P. 2009. First report of brown rot caused by Monilinia fructicola in peach orchards in Ebro Valley, Spain. Plant Disease, 93: 763. 5. Duchoslavova J., Siruckova I., Zapletalova E., Navratil M., Safarova D. 2007. First report of brown rot caused by Monilinia fructicola on various stone and pome fruits in the Czech Republic. Plant Disease, 91: 907. 6. EFSA. 2011. Pest risk assessment of Monilinia fructicola for the EU territory and identification and evaluation of risk management options. EFSA Journal, 9(4): 2 119 (1 155). 7. EPPO. 2002 a. First report of Monilinia fructicola in France. OEPP/EPPO Reporting Service 2002/003. 41

8. EPPO. 2002 b. Monilinia fructicola found in Austria. Reporting Service 2002/1. 9. EPPO. 2012. A review of pest surveillance techniques for detecting quarantine pests in Europe. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 42(3): 515 551. 10. EU. 2000. Council Directive 2000/29/EC of 8 May 2000 on protective measures against the introduction into the Community of organisms harmful to plants or plant products and against their spread within the Community. Official Journal of the European Communities. Legislation Series, 129: 1 112. 11. Gell I., Larena I., Melgarejo P. 2007. Genetic diversity in Monilia laxa populations in Peach Orchards in Spain. Journal of Phytopathology, 155: 549 556. 12. Gelvonauskienė D., Frercks B., Stepulaitiene I., Stanys V. 2013. Diversity of resistance to Monilinia laxa and spring frost of sour cherry germplasm. Acta Horticulturae, 976: 537 542. 13. Gudynaitė O. 1954. Vyšnių moniliozė Lietuvos TSR ir kova su ja. Žemdirbystės ir dirvožemio instituto darbai, 1: 114 128. 14. Hilber-Bodmer M., Bünter M., Patocchi A. 2010. First report of brown rot caused by Monilinia fructicola on apricot in a Swiss orchard. Plant Disease, 94: 643. 15. Hinrichs-Berger J., Müller G. 2010. First record of Monilia fructicola on blackberry fruits. Journal of Plant Diseases and Protection, 117: 110 111. 16. Holb I. J. 2008. Brown rot blossom blight of pome and stone fruits: symptom, disease cycle, host resistance, and biological control. International Journal of Horticultural Science, 14(3): 15 21. 17. Hrustić J., Grahovac M., Mihajlović M., Delibašić G., Ivanović M., Nikolić M., Tanović B. 2012. Molecular Detection of Monilinia fructigena as Causal Agent of Brown rot on Quince. Pesticidi i fitomedicina = Pesticides and phytomedicine, 27(1): 5 24. 18. Ioos R., Frey P. 2000. Genomic variation within Monilinia laxa, M. fructigena and M. fructicola, and application of species identification by PCR. European Journal of Plant Pathology, 106: 373 378. 19. Larena I., Torres R., De Cal A., Liñan M., Melgarejo P., Domenichini P. 2005. Biological control of postharvest brown rot (Monilinia spp.) of peaches by field applications of Epicoccum nigrum. Biological Control, 32: 305 310. 20. Lesik K. 2013. Monilinia species causing fruit brown rot, blossom and twig blight in apple orchards in Belarus. Proceedings of the Latvian academy of sciences (Section B), 67(683): 192 194. 21. Lichou J., Breniaux D., Mandrin J. F. 2002. Monilioses sur arbres fruitiers. Introduction d une nouvelle espèce: Monilia fructicola. Arboriculture fruitière, 558: 41 45. 22. Munda A., Viršček Marn M. 2010. First report of brown rot caused by Monilinia fructicola affecting peach orchards in Slovenia. Plant Disease, 94: 1 166. 23. Ondejková N., Hudecova M., Bacigálová K. 2010. First report on Monilinia fructicola in the Slovak Republic. Plant Protection Science, 46(4): 181 184. 24. Pellegrino C., Gullino M. L., Garibaldi A., Spadaro D. 2009. First report of brown rot of stone fruit caused by Monilinia fructicola in Italy. Plant Disease, 93: 668. 42

25. Petroćzy M., Palkovics L. 2009. First report of Monilia polystroma on apple in Hungary. European Journal of Plant Pathology, 125: 343 347. 26. Poniatowska A., Michalecka M., Bielenin A. 2013. Characteristic of Monilinia spp. fungi causing brown rot of pome and stone fruits in Poland. European Journal of Plant Pathology, 135(4): 855 865. 27. Sodo kenkėjai ir ligos. 1994. S. Pileckis (sudaryt.). Mokslo ir enciklopedijų leidykla, Vilnius, 463. 28. Sződi S., Komjáti H., Turóczi G. 2012. Characterization of M. laxa and M. fructigena isolates from Hungary with MP-PCR. Horticultural science, 39: 116 122. 29. Valiuškaitė A. 2002. Micromycetes infecting stone fruit trees. Biologija, 1: 18 21. 30. Valiuškaitė A., Raudonis L., Survilienė E. 2005. Analysis of micromycetes composition of sour cherry fruits in Lithuania. Phytopathologia Polonica, 35: 197 201. 31. van Brouwershaven I. R., Bruil M. L., van Leeuwen G. C. M., Kox L. F. F. 2010. A real-time (TaqMan) PCR assay to differentiate Monilinia fructicola from other brown rot fungi of fruit crops. Plant Pathology, 59: 548 555. 32. van Leeuwen G. C. M., Baayen R. P., Holb I. J., Jeger M. J. 2002. Distinction of the Asiatic brown rot fungus Monilia polystroma sp. nov. from M. fructigena. Mycological Research, 106: 444 451. 33. van Leeuwen G. C. M., Baayen R. P., Jeger M. J. 2001. Pest risk assessment for the countries of the European Union (as PRA area) on Monilinia fructicola. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 31: 481 487. 34. Villarino M., Egüen B., Lamarca N., Segarra J., Usall J., Melgarejo P., De Cal A. 2013. Occurrence of Monilinia laxa and M. fructigena after introduction of M. fructicola in peach orchards in Spain. European Journal of Plant Pathology, 137: 835 845. SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ. SCIENTIFIC ARTICLES. 2014. 33(1 2). Identification of sweet and sour cherry brown rot causing (Monilinia spp.) species by molecular methods B. Frercks, V. Stanys Summary Brown rot can be caused by four related pathogenic agents: Monilinia laxa (Aderh. et Ruhl.) Honey, Monilinia fructigena (Aderh. Et Ruhl.) Honey, Monilinia fructicola (G. Wint.) Honey and Monilia polystroma van Leeuwen. The composition of Monilinia species on sweet cherry fruit was not yet investigated in Lithuania. The aim of this study was to establish the Monilinia spp. species common on sweet and sour cherry fruit in the stone fruit collection at the Institute of Horticulture, LRCAF, based on molecular methods. The total of 72 samples were randomly sellected in 2013 in this stone fruit collection. The samples were identified on Monilinia species level using multiplex PCR. A quarantine pathogen M. fructicola was 43

not detected in the stone fruit collection at the Institute of Horticulture, LRCAF. Moreover, it was established that the most common Monilinia species in this collection was M.laxa. This pathogen progressively diplaces the rival pathogenic agent M. fructigena cousing brown rot on sweet and sour cherry fruit. Key words: Monilinia fructicola, Monilinia fructigena, Monilinia laxa, multiplex PCR, Prunus avium, Prunus cerasus. 44