1

KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS Vaida Batulevičienė Varlės vidurinių smegenų stogo (tectum) neuronų aktyvumo, sujaudinus vieną tinklainės ganglinę ląstelę, tyrimas Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai, biologija (01 B) Kaunas, 2006

Disertacija rengta 2001 2005 metais Kauno medicinos universitete Mokslinis vadovas: Habil. dr. Antanas Kuras (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, biologija 01 B) Konsultantas: Dr. Armantas Baginskas (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, biofizika 02 B)

TURINYS 1. SANTRUMPOS... 4 2. ĮVADAS... 5 2.1. Darbo naujumas ir reikšmė... 8 2.2. Darbo tikslas ir uždaviniai... 8 2.3. Ginamieji disertacijos teiginiai... 9 3. LITERATŪROS APŽVALGA... 10 3.1. Varlės tinklainės ganglinės ląstelės projekcija tektume... 10 3.1.1. Struktūrinė charakteristika... 10 3.1.2. Funkcinė charakteristika... 21 3.2. Jaudinančio glutaminerginio neurono poveikis nerviniam tinklui įvairių glutamato receptorių aktyvinimas... 27 3.2.1. Joniniai ne-nmda glutamato receptoriai... 28 3.2.2. Joniniai NMDA receptoriai... 32 3.2.3. Metabotropiniai glutamato receptoriai... 34 3.3. Įvairių glutamato receptorių aktyvinimas dirginant vieną aksoną... 37 3.3.1. Pavienio neurono poveikio nerviniam tinklui tyrimas unitarinių jaudinančių sinapsinių potencialų registravimo metodu... 38 3.3.2. Pavienio neurono poveikio nerviniam tinklui tyrimas individualių sinapsinių potencialų registravimo metodu... 42 3.4. Apibendrinimas... 45 4. DARBO METODOLOGIJA... 47 4.1. Gyvūnai... 47 4.2. Tirpalai... 47 4.3. Gyvūno paruošimas... 48 4.4. Stimuliavimas... 50 4.5. Registravimas... 51 4.6. Farmakologinių medžiagų panaudojimas... 55 4.7. Duomenų analizė... 55 5. REZULTATAI... 57 5.1. Tektumo neuronų atsakas į antrosios rūšies pavienės ganglinės ląstelės stimuliavimą... 57 5.1.1. Veikimo ir greiti sinapsiniai potencialai, greitų sinapsinių potencialų porinis palengvinimas... 57 5.1.2. Populiaciniai atsakai... 60 5.1.3. Populiacinių atsakų prigimtis... 61 5.1.4. Lėtas neigiamas potencialas... 67 5.1.5. Lėto neigiamo potencialo prigimtis... 68 5.2. Tektumo neuronų atsako ypatumai, stimuliuojant pirmosios rūšies pavienę ganglinę ląstelę. 73 5.2.1. Veikimo ir greiti sinapsiniai potencialai, greitų sinapsinių potencialų porinis palengvinimas... 73 5.2.2. Populiaciniai atsakai... 74 5.2.3. Populiacinių atsakų prigimtis... 75 5.2.4. Lėtas neigiamas potencialas... 75 5.2.5. Lėto neigiamo potencialo prigimtis... 75 6. TYRIMŲ REZULTATŲ APIBENDRINIMAS IR APTARIMAS... 80 6.1. Pavienės retinotektalinės skaidulos sukeltas tektumo neuronų viršslenkstinis sujaudinimas.. 80 6.2. Ne-NMDA ir NMDA receptorių sujaudinimas... 84 6.3. NMDA atsaką sąlygojantys veiksniai... 86 6.4. Lėta neigiama banga... 87 6.5. Du tektumo neuronų viršslenkstinio sujaudinimo lygiai... 88 6.6. Imobilizuotos varlės dirbtinis plaučių ventiliavimas... 90 7. IŠVADOS... 92 8. MOKSLINIŲ DARBŲ SĄRAŠAS... 93 9. CITUOTOS LITERATŪROS SĄRAŠAS... 94 3

1. SANTRUMPOS A SP greito sinapsinio potencialo amplitudė A VP veikimo potencialo amplitudė AMPA alfa-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolpropioninė rūgštis DL-AP-5 aminofosfovalerijono rūgštis EEG elektroencefalograma f 2/1 porinio palengvinimo koeficientas GABA gama-aminosviesto rūgštis gsp greitas sinapsinis potencialas GTF guanozintrifosfatas ilnb ilgo latentiškumo neigiama banga lnb lėta neigiama banga lnp lėtas neigiamas potencialas NMDA N-metil-D-aspartatas SŽ stimulo žymė T 1/2 greito sinapsinio potencialo trukmė jo pusės amplitudės lygyje tlnb trumpo latentiškumo neigiama banga UJSP unitarinis jaudinantis sinapsinis potencialas VP veikimo potencialas 4

2. ĮVADAS Nustatyta, kad norint sukelti postsinapsinio neurono impulsinį aktyvumą, paprastai, reikia vienu metu sujaudinti keletą presinapsinių aksonų (D. Debanne et al., 1995; E.H. Buhl et al., 1997; M.C. Angulo et al., 1999; D. Feldmeyer et al., 2002; M.J. Ferragamo and D. Oertel, 2002). Presinapsinių aksonų aktyvumo sukelti postsinapsiniai potencialai erdviškai sumuojasi dendritiniame medyje bei neurono kūne, pasiekdami viršslenkstinį lygį. Tačiau, ne retai ir vieno aksono veikimo potencialų pliūpsnio sukelti jaudinantys sinapsiniai potencialai (vadinami unitariniais arba individualiais, priklausomai nuo to, registruojami jie ląstelės viduje ar išorėje) dėl dažninio palengvinimo ir laikinio sumavimosi gali pasiekti viršslenkstinį lygį (R. Miles and R.K. Wong, 1986; I. Araki and W.C. De Groat, 1996; A.B. Ali and A.M. Thomson, 1998; H. Markram et al., 1998). Tik retais atvejais pavienis veikimo potencialas gali sukelti viršslenkstinį neurono sujaudinimą (J.J.Jr. Guinan and R.Y. Li, 1990; V. Egger et al., 1999; D. Feldmeyer et al., 1999). Glutamatas yra pagrindinis jaudinantis centrinės nervų sistemos transmiteris, kuris veikia dviejų tipų jonotropinius postsinapsinius receptorius: ne-nmda (pogrupiai: AMPA ir kainatiniai) ir NMDA (R. Dingledine and C.J. McBain, 1994). Unitarinių jaudinančių sinapsinių potencialų ir srovių registravimo metodais parodyta, kad abiejų tipų, ne-nmda ir NMDA, receptoriai yra išsidėstę daugelyje glutaminerginių centrinės nervų sistemos sinapsių kartu (P. Stern et al., 1992; D. Debanne et al., 1995; I. Araki and W.C. De Groat, 1996; M.C. Angulo et al., 1999; N. Emptage et al., 1999; D. Feldmeyer et al., 1999, 2002; L.Y. Wang, 2000; E. Hanse and B. Gustafsson, 2001; S.S. Kumar and J.R. Huguenard, 2001). Dirginant vieną presinapsinį aksoną, daugumoje šių sinapsių NMDA receptorių aktyvinimas buvo pasiektas nefiziologinėmis sąlygomis: kai magnio jonai buvo pašalinti iš ekstraląstelinės terpės arba postsinapsinė membrana buvo depoliarizuojama, leidžiant srovę į neurono kūną. Nežymus unitarinių postsinapsinių NMDA srovių aktyvinimas fiziologinėmis 5

sąlygomis buvo stebėtas tik retais atvejais (I. Araki and W.C. De Groat, 1996; D. Debanne et al., 1998; N. Emptage et al., 1999). Varlės tinklainės ganglinių ląstelių projekcija vidurinių smegenų stoge (lot. tectum opticum, toliau tekste tektumas) yra klasikinis objektas, tiriant sinapsinį perdavimą centrinėje nervų sistemoje in vivo (J. Witpaard and H.E. Keurs, 1975; A. Kuras and N. Gutmaniene, 2001; N. Hoshino and N. Matsumoto, 2003) ir in vitro (A. Nistri et al., 1990; W.P. Hickmott and M. Constantine-Paton, 1993; C.J. Yu et al., 2003). H.R. Maturana et al. (1960) pirmieji parodė, kad varlės tinklainės ganglines ląsteles galima suskirstyti į penkias klases pagal jų atsakus į skirtingus regos stimulus. Šios ganglinių ląstelių klasės vadinamos krašto (arba pirmosios klasės), dėmės (arba antrosios klasės), judančio krašto (arba trečiosios klasės), užtemdymo (arba ketvirtosios klasės) ir tamsos (arba penktosios klasės) detektoriais. Varlės tinklainės pavienių ganglinių ląstelių veikimo potencialų pliūpsnius taip pat galima sukelti, dirginant jas elektros srovės impulsais (S.A. George and W.B. Marks, 1974; A.V. Kuras and N.P. Chusainoviene, 1981; A. Kuras and N. Gutmaniene, 1997). Vienos ganglinės ląstelės impulsinio aktyvumo tektume sukeltą atsaką individualų sinapsinį potencialą (arba EEG kvantą; A.M. Gutman, 1980), galima registruoti ekstraląsteliniu mikroelektrodu, patalpintu tos ganglinės ląstelės aksono šluotelėje (J. Gruodis et al., 1972; A.M. Gutman and A.V. Kuras, 1974; J. Witpaard and H.E. Keurs, 1975; A.V. Kuras and N.P. Chusainoviene, 1981; A. Kuras and N. Gutmaniene, 1997). Varlės judančio krašto (trečiosios klasės) ir tamsos (penktosios klasės) detektorių aksonai baigiasi šluotelėmis tame pačiame tektumo F sluoksnyje, sudarydami glutaminergines sinapses ant šalia išsidėsčiusių (tektumo aštuntojo sluoksnio) ir giliau esančių (tektumo šeštojo ir ketvirtojo sluoksnių) neuronų dendritų (H.R. Maturana et al., 1960; Iu.B. Manteifel, 1977; G. Lázár et al., 1983; A. Kuras and N. Gutmaniene, 2001). Registruojant individualius sinapsinius potencialus, tektumo F sluoksnyje buvo išskirtos 6

dviejų rūšių regos skaidulų šluotelės: vienų sinapsėse transmiterio sąnaudos, tenkančios vienam veikimo potencialui, yra mažos, kitų žymiai didesnės (A.V. Kuras and N.P. Chusainoviene, 1986). Pirmosios rūšies šluotelių individualūs sinapsiniai potencialai yra palyginti mažos amplitudės ir jiems būdingas stiprus porinis palengvinimas (A.V. Kuras and N.P. Chusainoviene, 1986). Tuo tarpu antrosios rūšies šluotelių sinapsiniai potencialai yra žymiai didesnės amplitudės, o jų porinis palengvinimas kur kas mažesnis (A.V. Kuras and N.P. Chusainoviene, 1986). Pastarojo darbo rezultatų palyginimas su kitų darbų rezultatais, gautais panaudojant optinį ganglinių ląstelių stimuliavimą (H.R. Maturana et al.,1960; A.M. Gutman and A.V. Kuras, 1974), rodo, kad pirmosios ir antrosios rūšies šluoteles galima priskirti trečiosios ir penktosios klasių detektorių aksonams. Tiriant varlės retinotektalinio perdavimo tektumo F sluoksnyje fiziologinius ir farmakologinius ypatumus (A.V. Kuras and N.P. Chusainoviene, 1984, 1986; R.J. Blistrabas et al., 1989a, b; A.M. Gutman et al., 1989; A. Kuras and N. Gutmaniene, 2001), vos viename darbe buvo stebėtas viršslenkstinis tektumo neuronų sujaudinimas, kurį atspindėjo populiaciniai atsakai neigiamos smailės, iškylančios individualių sinapsinių potencialų viršūnėse (A.V. Kuras and N.P. Chusainoviene, 1984). Nustatyta, kad sinchroniškai sujaudinus didelį varlės retinotektalinių skaidulų skaičių, tektume sukeltas suminis atsakas susideda iš komponenčių, susijusių su ne- NMDA ir NMDA receptorių aktyvinimu (W.P. Hickmott and M. Constantine-Paton, 1993). Iki šiol nėra atlikta darbų, kurie rodytų, kad varlės tinklainės viena ganglinė ląstelė gali sukelti tektumo neuronų NMDA atsaką. Taip pat nėra išaiškinta, ar ne-nmda ir NMDA receptoriai yra išsidėstę kartu varlės vienos ir tos pačios regos skaidulos sudaromose sinapsėse. Anglies dvideginis iš varlės organizmo yra pašalinamas, visų pirma, per plaučius (D.C. Jackson and B.A. Braun, 1979). Manoma, kad susikaupęs anglies dvideginis gali slopinti glutaminerginį perdavimą centrinėje nervų sistemoje (J.E. Coelho et al., 2000; K.S. 7

Hsu et al., 2000; Y.K. Park et al., 2002). Tiriant varlės retinotektalinį perdavimą, iki šiol varlės plaučių dirbtinis ventiliavimas nebuvo taikytas. 2.1. Darbo naujumas ir reikšmė Šiame darbe pirmą kartą įdiegėme imobilizuotos varlės plaučių dirbtinį ventiliavimą, tikėdamiesi, kad jos fiziologinės būsenos pagerėjimas dėl anglies dvideginio pašalinimo iš organizmo turės įtakos viršslenkstiniam tektumo neuronų sužadinimui ir šių neuronų NMDA receptorių aktyvinimui, elektriškai stimuliuojant tinklainės vieną ganglinę ląstelę. Įdiegus dirbtinį plaučių ventiliavimą, mums pavyko patikimai sukelti varlės tektumo neuronų viršslenkstinį sužadinimą, stimuliuojant vieną retinotektalinę skaidulą. Mūsų gauti rezultatai nauji dar ir tuo, kad jie rodo, jog vienos ganglinės ląstelės (tikriausiai tamsos ir judančio krašto detektoriaus) veikimo potencialų pliūpsniai gali aktyvinti varlės tektumo neuronuose NMDA receptorius. Mūsų darbas rodo, kad plaučių ventiliavimas yra būtinas, norint išlaikyti gerą imobilizuotos varlės fiziologinę būklę eksperimento metu. Todėl, atliekant varlės retinotektalinio perdavimo fiziologinius tyrimus, derėtų taikyti plaučių dirbtinį ventiliavimą. Mūsų gauti rezultatai rodo galimybę vienos regos skaidulos sužadinimu aktyvinti tektobulbospinalinį laidą ir tuo sukelti varlės motorinę reakciją. Manome, kad šio darbo rezultatai padės suprasti vietinio nervinio tinklo funkcionavimo mechanizmus. 2.2. Darbo tikslas ir uždaviniai Darbo tikslas nustatyti, ar veikimo potencialų pliūpsniai varlės pavienėse regos skaidulose, kurios projektuojasi į tektumo F sluoksnį, gali sukelti tektumo neuronų viršslenkstinį sujaudinimą ir NMDA receptorių aktyvinimą. Darbo uždaviniai: 8

1. Elektriškai stimuliuojant pavienę regos skaidulą tinklainėje, sukelti tektume populiacinius atsakus. 2. Nustatyti registruojamų populiacinių atsakų prigimtį ir šaltinį farmakologinėmis manipuliacijomis bei keičiant registruojančio elektrodo gylį. 3. Elektriškai stimuliuojant pavienę regos skaidulą tinklainėje, sukelti tektume lėtus (100 ir daugiau milisekundžių trukmės) potencialus. 4. Nustatyti sukeltų lėtų potencialų prigimtį farmakologinėmis manipuliacijomis. 2.3. Ginamieji disertacijos teiginiai 1. Tam tikro intensyvumo veikimo potencialų pliūpsniai, sukelti pavienėje regos skaiduloje, kuri baigiasi tektumo F sluoksnyje, patikimai sukelia tektumo grįžtamo ryšio neuronų viršslenkstinį sujaudinimą. Viršslenkstinis sujaudinimas pasiekiamas dėl sinapsinio perdavimo dažninio palengvinimo. 2. Intensyvesni (didesnio dažnio ir trukmės) veikimo potencialų pliūpsniai, sukelti pavienėje regos skaiduloje, kuri baigiasi tektumo F sluoksnyje, patikimai sukelia NMDA receptorių atsaką fiziologinėmis sąlygomis. NMDA receptorių aktyvinimas pasiekiamas, visų pirma, dėl individualių ne-nmda sinapsinių potencialų laikinio sumavimosi ir dažninio palengvinimo. NMDA atsako metu stebimas ne tik grįžtamo ryšio neuronų, bet ir eferentinių tektumo neuronų impulsinis aktyvumas. 9

3. LITERATŪROS APŽVALGA 3.1. Varlės tinklainės ganglinės ląstelės projekcija tektume 3.1.1. Struktūrinė charakteristika Šiuolaikiniam supratimui apie stuburinių gyvūnų regos sistemos struktūrą ir funkciją pradžią davė S.R. Cajal darbai (S.R. Cajal, 1892, vertė S.A. Thorpe and M. Glickstein, 1972; S.R. Cajal, 1894, cit. iš R. Granit, 1968; S.R. Cajal, 1909, 1911, cit. iš P. Pasik and T. Pasik, 2000). Pirmą kartą panaudojęs impregnavimo sidabro druskomis metodą stuburinių gyvūnų akies tinklainės tyrimui, S.R. Cajal suskirstė tinklainės nervines ląsteles į tipus pagal jų morfologiją: lazdeles, kolbeles, bipolines, amakrinines bei ganglines (S.R. Cajal, 1892, vertė S.A. Thorpe and M. Glickstein, 1972; S.R. Cajal, 1894, cit. iš R. Granit, 1968; S.R. Cajal, 1909, 1911, cit. iš P. Pasik and T. Pasik, 2000). Nors tuo metu sinapsės sąvoka dar nebuvo žinoma, S.R. Cajal jau aprašė varlės tinklainės neuronų tarpusavio ryšius su galvos smegenų neuronais (S.R. Cajal, 1894, cit. iš R. Granit, 1968; S.R. Cajal, 1909, 1911, cit. iš P. Pasik and T. Pasik, 2000). S.R. Cajal darbai labai svarbūs dar ir tuo aspektu, kad jie pademonstravo daugelio stuburinių gyvūnų, tarp jų ir varlės, tinklainės sandaros esminius panašumus (S.R. Cajal, 1892, vertė S.A. Thorpe and M. Glickstein, 1972; S.R. Cajal, 1894, cit. iš R. Granit, 1968; S.R. Cajal, 1909, 1911, cit. iš P. Pasik and T. Pasik, 2000). Vėlesni tyrinėtojai atskleidė sudėtingus varlės tinklainės neuronų tarpusavio ryšius bei varlės tinklainės neuronų ryšius su vidurinių smegenų tektumu (H.R. Maturana et al., 1960; J.Y. Lettvin et al., 1961; J.E. Dowling, 1968, 1970). Dabar jau gerai žinoma, kad varlės tinklainė yra sudaryta iš trijų sluoksnių neuronų kūnų ir dviejų sluoksnių nervinių skaidulų (1, 2 pav.). Dėl būdingo neuronų kūnų sluoksnių vaizdo skersiniame tinklainės pjūvyje šie sluoksniai buvo pavadinti granuliniais arba branduolių sluoksniais (H.R. Maturana, 1959; H. Kolb et al., 2001). Išoriniame granuliniame sluoksnyje 10

1 pav. Stuburinių gyvūnų tinklainės nervinių ląstelių ryšių schema. A, amakrininė ląstelė; B, bipolinė ląstelė; F, fotoreceptorių vidiniai segmentai; G, ganglinė ląstelė H, horizontalioji ląstelė. Signalas iš fotoreceptorių ganglinėms ląstelėms perduodamas per bipolines ląsteles, tačiau šį signalo perdavimą moduliuoja horizontaliosios ląstelės, sudarydamos sinapses su fotoreceptoriais ir bipolinėmis ląstelėmis, bei amakrininės ląstelės, sudarydamos sinapses su bipolinėmis ir ganglinėmis ląstelėmis. Modifikuota, remiantis J.E. Dowling (1970) piešiniu. 11

2 pav. Pievinės varlės tinklainės architektūros schema. A, amakrininė ląstelė; B, bipolinė ląstelė; G, ganglinė ląstelė. H, horizontalioji ląstelė; K, kolbelė; L, lazdelė; M, miulerio ląstelė. Dešinėje paveikslo pusėje nurodyti tinklainės sluoksnių pavadinimai. Modifikuota, remiantis E.G. Shkolnik-Yaros et al. (1971) piešiniu. 12

yra išsidėsčiusios fotorecepcinės nervinės ląstelės, lazdelės ir kolbelės, viduriniame granuliniame sluoksnyje bipolinių, amakrininių ir horizontaliųjų nervinių ląstelių kūnai, o vidiniame granuliniame sluoksnyje ganglinių ląstelių kūnai (1, 2 pav.). Išoriniame nervinių skaidulų sluoksnyje horizontaliųjų ir bipolinių ląstelių dendritai sudaro sinapses su fotorecepcinėmis ląstelėmis (1 pav.) (H.R. Maturana, 1959; J.E. Dowling, 1968, 1970; H. Kolb et al., 2001; H. Kolb, 2003). Vidiniame nervinių skaidulų sluoksnyje bipolinių ir amakrininių nervinių ląstelių ataugos sudaro sinapses su ganglinių ląstelių dendritais (1 pav.) (J.E. Dowling, 1968, 1970; H. Kolb et al., 2001). Ganglinių ląstelių aksonai regos nervu ir regos laidu pasiekia vidurinių smegenų tektumą ir kitus regos centrus (H. Kolb et al., 2001). Jau seniai yra žinoma, kad varlės tinklainės ganglinės ląstelės pasižymi nevienoda išorine morfologija (H.R. Maturana, 1959; A.V. Kalinina, 1974). Pavyzdžiui, tiriant varlės Rana pipiens regos sistemą, buvo nustatyta, kad šios rūšies varlės tinklainėje yra apie 440 tūkstančių mažų (7-10 µm skersmens) ir apie 12 tūkstančių didelių (14-20 µm skersmens) ganglinių ląstelių (H.R. Maturana, 1959). Manoma, kad didelės ganglinės ląstelės į tektumą siunčia mielinines, o mažosios nemielinines skaidulas (H.R. Maturana et al., 1960, N. Nikrui, 1969; L.N. Diachkova and Iu.B. Manteifel, 1970; C. Straznicky and I.T. Straznicky, 1988). Varlės tinklainės ganglinės ląstelės taip pat pasižymi skirtinga dendritų išorine morfologija (A.V. Kalinina, 1974) ir nevienodais dendritų išsišakojimo ypatumais (J.Y. Lettvin et al., 1961; J.K. Kock et al., 1989; K.M. Shamim et al., 1997). J.Y. Lettvin et al. (1961) siūlymu, varlės tinklainės ganglines ląsteles pagal dendritų išsišakojimą galima skirti į du tipus: pirmojo tipo ląstelėms būdingi gausiai ir tankiai išsišakoję dendritai, o antrojo negausiai ir retai išsišakoję dendritai. Tuo tarpu J.K. Kock et al. (1989), remdamasis morfologiniais kriterijais, varlės tinklainės ganglines ląsteles suskirstė į penkis tipus. Pasak J.K. Kock et al. (1989), pirmojo tipo ganglinės ląstelės buvo mažo dydžio ir gausiausios. Likusių J.K. Kock et al. (1989) aprašytų tipų ganglinės ląstelės buvo vidutinio dydžio ir 13

stambios bei pasižymėjo nevienoda dendritinio medžio forma. K.M. Shamim et al. (1997) varlės tinklainės dideles ganglines ląsteles suskirstė į tris tipus pagal dendritinio medžio formą. Pastarųjų autorių duomenimis, pirmojo tipo ganglinės ląstelės (0,2% visų ganglinių ląstelių) buvo didžiausios, o jų dendritinis medis išsidėstęs vidinio nervinių skaidulų sluoksnio paviršiuje. Antrojo K.M. Shamim et al. (1997) aprašyto tipo didelių ganglinių ląstelių buvo daugiausiai (0,7%), o jų dendritinis medis gausiai išsišakojo dviejuose vidinio nervinių skaidulų sluoksnio gyliuose. Trečiojo šių autorių aprašytojo tipo ląstelėms (0,1%) buvo būdingas dendritinis medis, išsišakojęs visai greta vidinio granulinio sluoksnio. K.M. Shamim et al. (1997) duomenimis, visų trijų tipų didelės ganglinės ląstelės varlės tinklainėje suformuoja tris taisyklingas bei tarpusavyje nepriklausomas mozaikas ir, tikėtina, pasižymi skirtingomis funkcijomis. Nors darbai, nagrinėjantys varlės ganglinių ląstelių morfologijos ir funkcijos sąryšius yra labai negausūs, tačiau pripažįstama, kad skirtingų funkcinių klasių ganglinės ląstelės pasižymi nevienoda morfologija (C. Straznicky and I.T. Straznicky, 1988; H. Kolb, 2003). Didelės ganglinės ląstelės yra ketvirtosios ir penktosios funkcinių klasių ląstelės (detektoriai), vidutinio dydžio trečiosios funkcinės klasės, o mažos pirmosios ir antrosios funkcinių klasių ganglinės ląstelės (H.R. Maturana et al., 1960; C. Straznicky and I.T. Straznicky, 1988). Įdomu pažymėti, kad aukštesniųjų stuburinių tinklainės ganglinės ląstelės pasižymi ženkliai didesne struktūrine ir funkcine įvairove nei varliagyvių ganglinės ląstelės. Remiantis struktūriniais ir funkciniais ypatumais, siūloma primatų ganglines ląsteles skirti net į 20 tipų (H. Kolb, 2003). Nustatyta, kad įvairių rūšių varlių regos nervą sudaro nuo 300 tūkstančių iki 450 tūkstančių nervinių skaidulų, o jų kiekis atitinka tinklainės ganglinių ląstelių skaičių (H.R. Maturana, 1959; H.R. Maturana et al., 1960; O.J. Grüsser and U. Grüsser-Cornehls, 1976). 14

Didžioji dalis (95-97%) varlės regos nervo skaidulų yra nemielinininės (S.R. Bruesch and L.B. Arley, 1942; H.R. Maturana, 1959; H.R. Maturana et al. 1960; O.J. Grüsser and U. Grüsser-Cornehls, 1976). Dauguma (apie 85%) regos nervo ir regos laido skaidulų projektuojasi į vidurinių smegenų tektumą (V.M. Vinogradova et al., 1973; E.L. Singman and F. Scalia, 1990). Maža dalis (5%) skaidulų nueina į kitus regos centrus tarpinėse smegenyse ir vidurinių smegenų dangtyje (O.J. Grüsser and U. Grüsser-Cornehls, 1976). Ilgą laiką manyta, kad varlės ganglinių ląstelių tiesioginė projekcija į tektumą yra grynai kontralateralinė, t. y. tinklainės ganglinių ląstelių aksonai regos kryžmėje pereina į kitos pusės regos laidą ir projektuojasi į kitos pusės tektumo kalnelį. Tačiau yra darbų rodančių, kad nedideliam kiekiui (apie 2%) varlės tinklainės ganglinių ląstelių aksonų yra būdinga ipsilateralinė projekcija į tektumą, t. y. šios skaidulos nepersikryžiuoja ir pasiekia tos pačios pusės tektumo kalnelį (E.L. Singman and F. Scalia, 1990). Be to, ipsilateralinė projekcija taip pat būdinga tų ganglinių ląstelių aksonams, kurie projektuojasi į tarpinių smegenų regos centrus (O.J. Grüsser and U. Grüsser-Cornehls, 1976). Elektrofiziologiniais ir histocheminiais metodais nustatyta, kad varlės tinklainės ganglinių ląstelių aksonų projekcija tektumo paviršiuje yra susijusi su šių ląstelių topografija tinklainėje. Kitais žodžiais tariant, ganglinių ląstelių aksonų projekcijai tektume yra būdinga retinotopinė organizacija (R.M. Gaze, 1958; H.D. Potter, 1968; G. Lázár et al., 1983). Regėjimo lauko viršutinė dalis projektuojasi į priekinį tektumo paviršių, o medialinis regėjimo lauko kvadrantas į lateralinį tektumo paviršių. Kuo medialiau regėjimo lauke yra stimulas, tuo lateraliau tektume yra jo projekcija (O.J. Grüsser and U. Grüsser-Cornehls, 1976; N. Montgomery and K.V. Fite, 1989). Apatinė regėjimo lauko dalis projektuojasi atitinkamai į užpakalinį tektumo paviršių (O.J. Grüsser and U. Grüsser-Cornehls, 1976). Priekinis viršutinis regėjimo lauko kvadrantas projektuojasi į tektumo viršutinės 15

3 pav. Varlės tektumo vidinės sandaros schema, parodanti nervinių ląstelių kūnų ir ataugų sluoksninį pasiskirstymą. Kairėje pusėje skaičiai nuo 1 iki 9 nurodo tektumo sluoksnio numerį. Taškinės linijos žymi tektumo sluoksnių ribas. Kairėje piešinio pusėje schematiškai parodytas nervinių ląstelių kūnų ir nervinių skaidulų pasiskirstymas, tuo tarpu dešinėje piešinio pusėje parodytas detalus nervinių struktūrų vaizdas. Varlės tinklainės ganglinių ląstelių aksonai pasibaigia tektumo devintajame sluoksnyje. Varlės tektumo F sluoksnis yra tektumo devintojo sluoksnio apatinė dalis greta tektumo aštuntojo sluoksnio. a, didelė piramidinė ląstelė; b ir c, dideli kriaušiniai neuronai; d, tinklainės ganglinių ląstelių aksonų šluotelės; e, aksonas, kylantis iš gilesniųjų neuronų kūnų sluoksnių į regos skaidulų sluoksnius; f, didelė ganglinė ląstelė; g, maža kriaušinė ląstelė su aksonu, kuris nusileidžia į šeštąjį tektumo sluoksnį ir grįžta į regos skaidulų sluoksnius; h, maža kriaušinė ląstelė su į aksoną panašia atauga; i, žvaigždiškos formos neuronas; j, amakrininė ląstelė; k, tarpinių smegenų aferentinio neurono aksono šluotelė. Modifikuota, remiantis Székely et al. (1973) piešiniu. 16

dalies rostro-lateralinę sritį, o regėjimo lauko viršutinis šoninis kvadrantas į kaudomedialinę tektumo sritį (S.H. Chung et al., 1973). Varlės tektumą sudaro du pusapvaliai kalneliai, išsidėstę vidurinių smegenų dorsalinėje pusėje. Tektumo skersiniame pjūvyje yra matomi nervinių ląstelių kūnų ir nervinių skaidulų sluoksniai, kuriuos priimta numeruoti nuo vieno iki devynių, pradedant nuo tektumo skilvelių paviršiaus ir baigiant išoriniu tektumo paviršiumi (3 pav.) (H.D. Potter, 1969; L.N. Diachkova and Iu.B. Manteifel, 1979; T.E. Hughes, 1990). Didžioji dalis tektumo nervinių ląstelių kūnų yra išsidėstę antrajame, ketvirtajame, šeštajame ir aštuntajame sluoksniuose (3 pav.). Tuo tarpu trečiasis, penktasis, septintasis ir devintasis tektumo sluoksniai yra sudaryti iš nervinių skaidulų su nedidele priemaiša nervinių ląstelių kūnų (3 pav.). Tinklainės ganglinių ląstelių aksonų šluotelės užima devintąjį ir, iš dalies, aštuntąjį tektumo sluoksnius (3 pav.). Devintasis tektumo sluoksnis dar yra smulkiau skirstomas į sluoksnius, kurie žymimi raidėmis nuo A iki F, pradedant tektumo paviršiumi (H.D. Potter, 1969; L.N. Diachkova and Iu.B. Manteifel, 1979; G. Lázár et al., 1983; T.E. Hughes, 1990). Nedidelė dalis varlės tinklainės ganglinių ląstelių aksonų patenka į tektumo aštuntojo sluoksnio apatinę dalį ir greta tektumo septintojo sluoksnio suformuoja siaurą regos skaidulų G sluoksnį (H.D. Potter, 1969). Varlės tinklainės ganglinių ląstelių aksonai pasiekia devintąjį tektumo sluoksnį, kur jų šluotelės sudaro sinapses su į tą patį sluoksnį patekusiais tektumo neuronų dendritais (L.N. Diachkova and Iu.B. Manteifel, 1970; Iu.B. Manteifel and L.N. Diachkova, 1974). Tinklainės ganglinių ląstelių aksonų šluotelės taip pat sudaro sinapses su kitų neuronų aksonų šluotelėmis, patenkančiomis į tektumo devintąjį sluoksnį (L.N. Diachkova and Iu.B. Manteifel, 1970; Iu.B. Manteifel and L.N. Diachkova, 1974). Didžiąją dalį akso-aksoninių sinapsių sudaro mielininiai tinklainės ganglinių ląstelių aksonai (Iu.B. Manteifel and L.N. Diachkova, 1974). Be nervinių skaidulų, varlės tektumo devintajame sluoksnyje yra 17

aptinkamos įvairios smulkios nervinės ląstelės: žvaigždiškos ląstelės trumpais aksonais, bipolinės horizontaliosios ląstelės, unipolinės amakrininės ląstelės (3 pav.). Visos šios ląstelės taip pat sudaro sinapses su tinklainės ganglinių ląstelių aksonų šluotelėmis bei su šluotelėmis aksonų, kurie kyla iš gilesniųjų tektumo sluoksnių į viršutinius tektumo sluoksnius (G. Sétáló and G. Székely, 1967; Iu.B. Manteifel, 1977). Daugelio ganglinių ląstelių aksonų šluotelės plačiai šakojasi visame devintajame sluoksnyje (H.D. Potter, 1969, 1972). Nustatyta, kad regos skaidulų A, C ir E sluoksniai pasižymi didesniu nemielininių skaidulų kiekiu, lyginant su B, D, F, G sluoksniais (Iu.B. Manteifel, 1977, 1983; R. Gabriel et al., 1998). Varlės tektumo aštuntajame sluoksnyje yra aptinkamos kriaušinės nervinės ląstelės, kurių aksonai pasibaigia tektumo gilesniuosiuose sluoksniuose ir ten išsišakoja arba vėl pakyla iki devintojo sluoksnio (3 pav.) (Iu.B. Manteifel, 1977). G. Lázár et al. (1983) šias kriaušines nervines ląsteles suskirstė į du tipus. Pasak G. Lázár et al. (1983), pirmojo tipo nervinėms ląstelėms būdinga kriaušės, ovalo arba apvali forma, jos turi dažniausiai vieną, rečiau du dendritus. Šių ląstelių dendritai kyla į tektumo D sluoksnį ir ten išsišakoję sudaro sinapses su tinklainės ganglinių ląstelių aksonų šluotelėmis bei kitų nervinių ląstelių dendritais (G. Lázár et al., 1983). Pirmojo tipo kriaušinių nervinių ląstelių aksonai pakyla vertikaliai iki tektumo F sluoksnio, pasisuka stačiu kampu ir driekiasi per ribą tarp E ir F sluoksnių. Pasiekę tektumo kraštą, šie aksonai pasisuka tektumo skilvelio kryptimi ir, kirtę tektumo aštuntąjį sluoksnį išsišakoja tektumo septintajame sluoksnyje (G. Lázár et al., 1983). G. Lázár et al. (1983) nustatyto antrojo tipo neuronų kūnams būdinga išimtinai kriaušės forma. Antrojo tipo kriaušinių neuronų dendritai pakyla į tektumo paviršių net iki B sluoksnio, o jų aksonai driekiasi tiesiai į septintąjį tektumo sluoksnį (G. Lázár et al., 1983). G. Lázár et al. (1983) prie antrojo tipo kriaušinių neuronų priskyrė taip pat ir piramidines nervines ląsteles. Be visų minėtų nervinių ląstelių, varlės tektumo aštuntajame sluoksnyje 18

Iu.B. Manteifel (1977) aptiko vertikalių bipolinių neuronų, kurių aksonai nusileidžia į gilesnius tektumo sluoksnius. Nors varlės tektumo septintasis sluoksnis yra laikomas skaidulų sluoksniu (3 pav.), tačiau, detaliau ištyrus, šiame sluoksnyje buvo aptikta neuronų kūnų. Varlės tektumo septintojo sluoksnio neuronai kai kurių autorių dar yra vadinami septintojo sluoksnio ganglinėmis ląstelėmis (G. Lázár et al., 1983). Šių neuronų kūno forma yra pailga, o dendritų šakos kyla į tektumo paviršių ir pasibaigia įvairiose devintojo sluoksnio srityse (G. Lázár et al., 1983). Septintojo sluoksnio neuronus G. Lázár et al. (1983) suskirstė į dvi grupes. Pirmosios grupės neuronų aksonai ipsilateraliai arba kontralateraliai projektuojasi į tarpinių smegenų gumburą (G. Lázár et al., 1983). Antrajai tektumo septintojo sluoksnio neuronų grupei G. Lázár et al. (1983) priskyrė dideles ganglines ląsteles, kurių aksonai driekėsi tektobulbospinalinio laido sudėtyje, o dendritai dažniausiai pasibaigdavo F sluoksnyje, ir rečiau B ir D sluoksniuose. Manoma, kad antrajame, ketvirtajame ir šeštajame varlės tektumo sluoksniuose yra susitelkę net apie 75 % visų tektumo neuronų (3 pav.) (H.R. Maturana et al., 1960). Šiems tektumo sluoksniams yra būdingi dideli piramidiniai ir dideli kriaušiniai neuronai (3 pav.) (Iu.B. Manteifel, 1977). Piramidinių ląstelių aksonai driekiasi į septintąjį tektumo sluoksnį (3 pav.) (Iu.B. Manteifel, 1977). Iu.B. Manteifel (1977) duomenimis, didelių kriaušinių neuronų dendritų šakojimasis yra gana įvairus. Antrojo ir ketvirtojo sluoksnių kriaušiniai neuronai turi po vieną ilgą dendrito šaką, kuri pasiekia devintąjį varlės tektumo sluoksnį ir ten sudaro sinapses su tinklainės ganglinių ląstelių aksonais (3 pav.) (Iu.B. Manteifel, 1977). Antrajame ir ketvirtajame tektumo sluoksniuose Iu.B. Manteifel (1977) aptiko neuronų, kurių trumpi dendritai išsišakojo trečiajame, penktajame ir šeštajame sluoksniuose. Be to, Iu.B. Manteifel (1977) duomenimis, daugelio antrajame šeštajame tektumo sluoksniuose išsidėsčiusių neuronų apikaliniai dendritai šakojasi regos skaidulų sluoksnių plačiame gylio 19

diapazone (3 pav.). Kaip ir Iu.B. Manteifel (1977), G. Lázár et al. (1983) varlės tektumo šeštajame sluoksnyje aptiko piramidines nervines ląsteles ir didelius kriaušinius neuronus (3 pav.). G. Lázár et al. (1983) duomenimis, didelių kriaušinių neuronų aksonai driekiasi į septintąjį tektumo sluoksnį, o šie neuronai gali turėti tiek labai platų, tiek ir gana siaurą dendritinį medį. Šeštajame tektumo sluoksnyje G. Lázár et al. (1983) aptiko didelių ganglinių ląstelių, kurių dendritai devintojo sluoksnio B pasluoksnyje sudarė sinapses su tinklainės ganglinių ląstelių aksonais. Dalis šių didelių šeštojo sluoksnio ganglinių ląstelių dendritinių šakų pateko ir į F sluoksnį. Pastarųjų ląstelių aksonai driekėsi septintuoju tektumo sluoksniu (G. Lázár et al., 1983). Apibendrinant daugelio struktūrinių tyrimų rezultatus, galima teigti, kad varlės tektumo neuronai yra organizuoti vertikalaus nervinio ryšio principu: giliuosiuose tektumo sluoksniuose esančių neuronų dendritai pasiekia devintąjį sluoksnį. Tektumo nervinių skaidulų sluoksniuose išsišakoję aksonai sudaro sinapses su gilesniųjų tektumo sluoksnių neuronų vertikaliai orientuotais dendritais. Varlės tektumas gauna signalus ne tik iš sujaudintų tinklainės ganglinių ląstelių. Tektumo neuronai sudaro sinapses su skaidulomis, ateinančiomis iš vidurinių smegenų sąsmaukos branduolio (nucleus isthmus lot.) (S.B. Udin, 1987; J.F. Dann and L.D. Beazley, 1990; S.B. Udin et al., 1990; E.R. Gruberg et al., 1994; Z. Li and K.V. Fite, 2001) bei pretektumo (W.W. Schwippert and J.P. Ewert, 1995). Yra atlikta tyrimų, patvirtinančių regos sistemos ryšius su kitomis sensorinėmis sistemomis: varlės tektumas gauna signalus iš sąsmaukos branduolio, į kurį ateina skaidulos iš varlės klausos (W. Wilczyniski and R.G. Northcutt, 1977; A. Kulik and C. Matesz, 1997) ir uoslės (M. Kemali and V. Guglielmotti, 1987) centrų. Pastaraisiais metais tyrinėjama įvairių faktorių įtaka varlės tinklainės ganglinių ląstelių aksonų šluotelės formavimui (T.M. Elul et al., 2003; F. Mann et al., 2004). 20

Imunohistocheminių metodų pagalba stengiamasi išaiškinti įvairių neurotransmiterių ir neuromoduliatorių (enkefalino, somatostatino, substancijos P) išsidėstymą varlės regos sistemoje (S.L. Stuesse et al., 2001). Preliminarūs pastarųjų tyrimų rezultatai rodo, kad varlės tektumo neuronų neuropeptidų sąstatas yra panašus į žinduolių centrinės nervų sistemos neuronų (S.L. Stuesse et al., 2001). 3.1.2. Funkcinė charakteristika Varlės tinklainės ganglinės ląstelės pasižymi ne tik skirtinga morfologija, tačiau ir skirtingomis funkcinėmis savybėmis. Pagal reagavimą į regos stimulus varlės tinklainės ganglinės ląstelės yra skirstomos į penkias klases, kurios kitaip dar vadinamos detektoriais (J.Y. Lettvin et al., 1959, 1961; H.R. Maturana, 1959; H.R. Maturana et al., 1960). Pirmosios klasės tinklainės ganglinės ląstelės, krašto detektoriai, reaguoja į judantį arba stovintį šviesesnio arba tamsesnio už foną objekto kraštą nepriklausomai nuo krašto kreivumo. Šios klasės ganglinės ląstelės nereaguoja, jei yra keičiamas bendras apšvietimas. Krašto detektoriui sujaudinti reikia objekto su tam tikrais parametrais. Judančiam objektui sustojus, šio detektoriaus atsakas būna stipresnis (30-40 veikimo potencialų per sekundę), o po to išsilygina (10-15 veikimo potencialų per sekundę) (J.Y. Lettvin et al., 1959, 1961; H.R. Maturana et al., 1960). Reaguodamas į didesnį nei 20 skersmens objektą, krašto detektorius generuoja silpnesnį atsaką nei reaguodamas į mažesnius objektus. Šio detektoriaus atsako stiprumas priklauso nuo objekto judėjimo greičio. Kaip yra optimalus objekto dydis, kuris sukelia stipriausią atsaką, taip yra ir optimalus objekto judėjimo greitis bei optimali objekto padėtis varlės regėjimo lauke šio detektoriaus atsakui sukelti (H.R. Maturana et al., 1960). Detektoriaus stimuliavimo dirgikliu metu išjungus šviesą, atsakas nutrūksta, o įjungus, esant dirgikliui toje pačioje vietoje, šio detektoriaus atsakas atsistato (H.R. Maturana et al., 1960). 21

Antrosios klasės tinklainės ganglinių ląstelių, dėmės detektorių, funkcinės savybės yra panašios į krašto detektorių, tačiau šie detektoriai reaguoja tik į judantį, o ne į stovintį objektą (J.Y. Lettvin et al., 1959, 1961; H.R. Maturana et al., 1960). Dėmės detektoriaus maksimaliam sujaudinimui optimalus stimulas yra nuo 2 iki 5 skersmens. Šio detektoriaus sujaudinimas yra stipresnis, kuo kreivesnis ir daugiau kampų turi objektas. Didesnis nei maksimalų sujaudinimą sukeliantis objektas taip pat gali sukelti šio detektoriaus atsaką, tačiau šiuo atveju atsakas bus žymiai silpnesnis, ypač jei to didelio objekto kraštas yra tiesus (H.R. Maturana et al., 1960). Dėmės detektoriai į dirgiklį atsako nuolat generuodami veikimo potencialus. Judančiam mažam tamsiam objektui šviesiame fone regėjimo lauke sustojus, dėmės detektoriaus atsakas nutrūksta. Įvykus užtemdymui, netgi mažesnės nei 0,1 s trukmės, šios klasės ganglinių ląstelių atsakas nutrūksta, o vėl įjungus šviesą, detektorius nebeatsako į tokį patį stimuliavimą. Kaip ir krašto detektoriai, dėmės detektoriai nėra sujaudinami tik bendro apšvietimo pokyčiais. Krašto ir dėmės detektorius yra sunku atskirti eksperimentiškai, kadangi nėra griežtos ribos tarp šių ląstelių aksonų šluotelių pasiskirstymo tektume. Manoma, kad dalis tinklainės ganglinių ląstelių pasižymi ir krašto, ir dėmės detektorių funkcinėmis savybėmis (H.R. Maturana et al., 1960). Trečiosios klasės ganglinės ląstelės, judančio krašto detektoriai, reaguoja į judantį objektą su kontrastinga riba (H.R. Maturana et al., 1960). Priešingai dėmės detektoriams, šios ganglinės ląstelės stipriau reaguoja ne į mažą, o į didelį, apie 7-12 skersmens, objektą. Priešingai anksčiau minėtiems detektoriams, šios ganglinės ląstelės reaguoja į bendro apšvietimo skirtumus bei į šviesios dėmės įjungimą ir išjungimą. Į šviesios dėmės įjungimą trečiosios klasės ganglinių ląstelių reakcija būna stipresnė nei į išjungimą. Judančio krašto detektorius žymiai stipriau reaguoja į judantį nei į stovintį objektą. Jeigu judantis objektas yra sudėtingos struktūros, detektoriaus reakcija būna silpnesnė nei į paprastos (apvalios) formos objektą. Trečiosios klasės ganglinės ląstelės į šviesios dėmės įjungimą ir išjungimą 22

atsako dviejų - keturių veikimo potencialų pliūpsniu. Į judantį objektą judančio krašto detektoriaus reakcija būna stipresnė keli 7-12 veikimo potencialų pliūpsniai. Reaguodamos į lėtai judantį objektą šios klasės ganglinės ląstelės atsako ištęstu veikimo potencialų pliūpsniu. Daugelis šios klasės ganglinių ląstelių pasižymi foniniu aktyvumu, kuris sustiprėja padidinus bendrą apšvietimą. Palaipsniui mažinant bendrą apšvietimą, judančio krašto detektorius nustoja reagavęs į judantį dėmės stimulą greičiau nei pirmosios ir antrosios klasės ganglinės ląstelės. Šio detektoriaus reakcija greitai susilpnėja, jeigu pasikartoja judančio objekto trajektorija. Registruojant tektumo gylyje, kur trečiosios klasės ganglinių ląstelių terminalės driekiasi netoli antrosios klasės ląstelių terminalių, judančio krašto detektoriaus reakcija yra stipresnė į bendro apšvietimo pokyčius, o giliau išsidėsčiusių šio detektoriaus terminalių generuojamas atsakas yra stipresnis į judantį dirgiklį (H.R. Maturana et al., 1960). Nuo krašto ir dėmės detektorių judančio krašto detektorius skiriasi dar ir ganglinės ląstelės aksonu sklindančio signalo greičiu. Šio detektoriaus aksonai, priešingai krašto ir dėmės detektoriams, yra mielininiai. Judančio krašto detektoriui būdingas signalo sklidimo greitis yra apie 2 m/s, o dėmės ir krašto detektoriams apie 0,5 m/s ir mažesnis (H.R. Maturana et al., 1960). Ketvirtosios klasės ganglinė ląstelė, užtemdymo detektorius, reaguoja besitęsiančiu atsaku į bendro apšvietimo išjungimą. Šis detektorius taip pat reaguoja į judantį objektą ir į tamsaus objekto sustojimą regėjimo lauke. Kadangi šio detektoriaus aksonai yra mielininiai, signalo sklidimo greitis jais yra didelis apie 8 m/s. Užtemdymo detektoriaus atsakas būna žymiai stipresnis tuo atveju, kai užtemdymas yra regėjimo lauko centre, o ne periferijoje. Šio detektoriaus atsakas prasideda didelio dažnio (100-300 Hz) 1-4 veikimo potencialų pliūpsniu, kuris pereina į kelias sekundes trunkančią 18-20 Hz veikimo potencialų seką. Po šios veikimo potencialų sekos užtemdymo detektorius dar kelias minutes generuoja veikimo potencialus 5 Hz dažniu (H.R. Maturana et al., 1960). 23

Penktosios klasės ganglinės ląstelės, tamsos detektoriaus, aktyvumas yra atvirkščiai proporcingas bendro apšvietimo intensyvumui, o tamsoje šio detektoriaus atsakas yra maksimalus (H.R. Maturana et al., 1960). Tamsos detektorius pasižymi foniniu aktyvumu netgi esant ryškiam apšvietimui. H.R. Maturana et al. (1960) atkreipė dėmesį, kad šis detektorius nereaguoja nei į dėmės stimulą nei judantį objektą. Specifinio šiam detektoriui atsako į tinklainės optinį stimuliavimą H.R. Maturana et al. (1960) neišskyrė. A.V. Kuras and N.P. Chusainoviene (1986), stimuliuodami varlės tinklainę elektros srovės impulsais, tektumo F sluoksnyje, kur pasak H.R. Maturana et al. (1960) pasibaigia trečiosios ir penktosios klasės ganglinių ląstelių aksonai, užregistravo dviejų rūšių tektumo neuronų atsakus. Stimuliuojant dviejų srovės impulsų pliūpsniu, buvo stebimas retinotektalinėse sinapsėse registruojamo sinapsinio potencialo porinis palengvinimas (A.V. Kuras and N.P. Chusainoviene, 1986). Porinis palengvinimas yra antrojo sinapsinio potencialo padidėjimas dėl į sinapsinį plyšį išmetamo didesnio neurotransmiterio kiekio. Kalcio jonų likutis presinapsinėje terminalėje po pirmojo sinapsnio potencialo generavimo prisideda prie kalcio jonų, patekusių į neuroną antrojo veikimo potencialo metu, ir šis nedidelis kalcio jonų koncentracijos padidėjimas lemia nevienodą neurotransmiterio išsiskyrimą dviejų sinapsinių potencialų generavimo metu, intervalui tarp impulsų esant nuo 20 iki 500 ms (P.A. Salin et al., 1996). Vienos rūšies ganglinių ląstelių sukeltų sinapsinių potencialų amplitudės buvo mažos ir jiems buvo būdingas stiprus porinis palengvinimas. Kitos rūšies ganglinių ląstelių sukelti sinapsiniai potencialai buvo žymiai didesni, tačiau porinis palengvinimas buvo ženkliai mažesnis (A.V. Kuras and N.P. Chusainoviene, 1986). Optiniu stimulu A.M. Gutman and A.V. Kuras (1974) sujaudino ganglinę ląstelę ir registravo varlės tektumo F sluoksnyje atsaką, labai panašų į vėliau A.V. Kuras and N.P. Chusainoviene (1986) minėtame sluoksnyje registruotą didesnį porinį palengvinimą turinį atsaką. Didesnės amplitudės ir mažesnio porinio palengvinimo atsako regos stimulu sukelti A.M. Gutman and 24

A.V. Kuras (1974) nepavyko. Regos stimulu sukelti tamsos detektoriaus (penktosios klasės) atsaką greičiausiai yra labai sudėtinga, tad ir darbų, aprašančių šį detektorių, yra labai mažai (H.R. Maturana et al.,1960; T. Reuter and K. Virtanen, 1972). Taigi, greičiausiai mažesniais sinapsiniais potencialais ir didesniu poriniu palengvinimu pasižyminčios ganglinės ląstelės yra judančio krašto detektoriai. Tuo tarpu didesniais sinapsiniais potencialais ir mažesniu poriniu palengvinimu pasižyminčios ganglinės ląstelės greičiausiai yra tamsos detektoriai. Varlės regos nervo regeneracijos eksperimentais buvo nustatyta, kad šio nervo sudėtyje besidriekiančios mielininės nervinės skaidulos yra trečiosios ir ketvirtosios klasių ganglinių ląstelių aksonai, o nemielininės nervinės skaidulos pirmosios ir antrosios klasės ganglinių ląstelių aksonai (H.R. Maturana et al., 1960; V.M. Vinogradova et al., 1973). Sprendžiant pagal tektume registruojamo signalo latentiškumą (laiko tarpą nuo stimulo žymės iki registruojamo atsako veikimo potencialo), manoma, kad penktosios klasės ganglinių ląstelių aksonai yra mielininiai (A.V. Kuras and N.P. Chusainoviene, 1986). Skirtingų detektorių mielininės skaidulos skiriasi savo storiu: trečiosios klasės ganglinių ląstelių aksonai yra plonesni už ketvirtosios klasės ganglinių ląstelių aksonus (H.R. Maturana et al., 1960). Be to, skirtingų klasių ganglinės ląstelės pasižymi skirtinga morfologija. Pirmosios ir antrosios klasių ganglinės ląstelės yra mažesnės už trečiosios ir ketvirtosios klasių ganglines ląsteles (H.R. Maturana et al., 1960; V.M. Vinogradova et al., 1973; J.P. Ewert et al., 1974; R.V. Stirling and E.G. Merrill, 1987). Kiekvienos klasės ganglinės ląstelės aksono šluotelė pasibaigia tam tikrame varlės tektumo gylyje. Sujaudintos ganglinės ląstelės aksono atsakas registruojamas gana plačiai regos skaidulų sluoksniuose, ir skirtingų klasių ganglinių ląstelių aksonų šluotelės gali persikloti. Tačiau kiekvieno detektoriaus atsakas yra stipriausias tam detektoriui būdingame gylyje. Apie 100 µm gylyje, tektumo B ir C sluoksniuose yra išsidėsčiusios pirmosios klasės ganglinių ląstelių aksonų terminalės (H.R. Maturana et al., 1960; R.M. Gaze and M.J. 25

Keating, 1969; J. Witpaard and H.E. Keurs, 1975). Po pirmos klasės tinklainės ganglinių ląstelių terminalėmis, tarp varlės tektumo C ir D sluoksnių, apie 100-200 µm gylyje, yra išsidėsčiusios antrosios klasės ganglinių ląstelių aksonų terminalės (H.R. Maturana et al., 1960; J.P. Ewert et al., 1974; J. Witpaard and H.E. Keurs, 1975). Varlės tektumo F sluoksnyje, apie 250-350 µm gylyje, yra registruojamas judančio krašto ir tamsos detektorių aksonų terminalių aktyvumas (H.R. Maturana et al., 1960; R.M. Gaze and M.J. Keating, 1969; J.P. Ewert et al., 1974; S.A. George and W.B. Marks, 1974; J. Witpaard and H.E. Keurs, 1975). Ketvirtosios klasės ganglinių ląstelių aksonų terminalės yra išsidėsčiusios apie 400 µm gylyje, G sluoksnyje (H.R. Maturana et al., 1960; R.M. Gaze and M.J. Keating, 1969; J. Witpaard and H.E. Keurs, 1975). Varlės tektumo G sluoksnis yra gana siauras ir išsidėstęs tarp aštuntojo ir septintojo tektumo sluoksnių, kuriuose yra aptinkami nervinių ląstelių kūnai (G. Lázár et al., 1983). Nervinių ląstelių kūnai yra aptinkami taip pat ir pačiame G sluoksnyje (J. Witpaard and H.E. Keurs, 1975; G. Lázár et al., 1983). Todėl, ekstraląsteliniu elektrodu registruojant ketvirtosios klasės ganglinių ląstelių atsakus, kartu gali būti registruojami ir tektumo neuronų atsakai, o detektoriaus atsakas nebūna labai "švarus" (H.R. Maturana et al., 1960). Susiejus morfologinius (G. Lázár et al., 1983) ir fiziologinius (H.R. Maturana et al., 1960; R.M. Gaze and M.J. Keating, 1969; S.A. George and W.B. Marks, 1974; J. Witpaard and H.E. Keurs, 1975; O.J. Grüsser and U. Grüsser-Cornehls, 1976) varlės regos sistemos tyrimus buvo nustatyta, kad tinklainės ganglinių ląstelių aksonu sklindantis signalas, perduotas tektumo nervinėms ląstelėms, tektobulbospinaliniu keliu pasiekia skeleto skersaruožius raumenis (A. Cobas and M. Arbib, 1992; J.R. King and C.M. Comer, 1996). Varlei reaguojant į aplinką, yra sužadinamos daugelio klasių tinklainės ganglinės ląstelės, tačiau varlės staigią reakciją į stimulą lemia tos ganglinės ląstelės, kurių aksonai yra mielininiai (O.J. Grüsser and U. Grüsser-Cornehls, 1976). Natūralioje aplinkoje varlės 26

tinklainės trečiosios klasės ganglinės ląstelės yra atsakingos už grobio gaudymą, nors dalyvauja ir slepiantis bei išvengiant pavojaus (O.J. Grüsser and U. Grüsser-Cornehls, 1976). Apie varlės tinklainės penktosios klasės ganglines ląsteles nėra daug žinoma, tačiau manoma, kad jos, paprastai, yra sužadinamos dideliu judančiu objektu, t. y. varlei iškilusios grėsmės atveju (O.J. Grüsser and U. Grüsser-Cornehls, 1976). Kuo intensyvesnis, efektingesnis regos stimulas, tuo greitesnė yra išvengimo reakcija (J.P. Ewert et al., 1974). 3.2. Jaudinančio glutaminerginio neurono poveikis nerviniam tinklui įvairių glutamato receptorių aktyvinimas Glutamatas yra pagrindinis jaudinantis neurotransmiteris žinduolių centrinėje nervų sistemoje. Pirmieji tyrinėtojai pastebėjo, kad glutamatas depoliarizuoja nugaros smegenų neuronų membraną (D.R. Curtis et al., 1961). Vėlesni tyrimai atskleidė svarbų glutamato vaidmenį sudėtinguose centrinės nervų sistemos signalo perdavimo mechanizmuose, įskaitant ir atminties formavimąsi. Glutamatas aktyvina jonotropinius ir metabotropinius receptorius. Glutamato jonotropinis receptorius yra membranos pora, sudaryta iš keturių arba penkių membraną kertančių baltyminių subvienetų su santykinai didele, lyginant su GABA ar acetilcholino receptoriais, ląstelės išorėje esančia N-terminale. Jonotropiniai glutamato receptoriai skirstomi į dvi grupes pagal juos veiksmingiausiai sujaudinančius agonistus: į NMDA ir ne- NMDA. Glutamato NMDA receptorius sujaudina N-metil-D-aspartatas, o ne-nmda alfaamino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolpropioninė rūgštis (AMPA) ir kuiskulatas arba kainatas (J.C. Watkins and H.J. Olverman, 1987). Metabotropiniai glutamato receptoriai nesuformuoja membraną kertančios poros, bet ląstelės viduje jungiasi su G-baltymu. Visiems metabotropiniams glutamato receptoriams yra būdingas septynių membraną kertančių domenų motyvas. 27

3.2.1. Joniniai ne-nmda glutamato receptoriai Ne-NMDA receptoriai yra AMPA ir kainatiniai, tačiau ilgą laiką jie buvo traktuojami kartu, kadangi veiksmingiausiai AMPA receptorius sujaudinantis agonistas taip pat veiksmingai sujaudina ir kainatinius receptorius, o kainatas analogiškai sujaudina AMPA receptorius. Bendri ne-nmda receptorių antagonistai, 6-ciano-7-nitrokvinoksalin-2,3- dionas (CNQX), 6,7-dinitrokvinoksalin-2,3-dionas (NBQX), vienodai veiksmingai blokuoja AMPA ir kainatinius receptorius. Šie du ne-nmda receptorių tipai pasižymi panašiomis kinetinėmis savybėmis. AMPA ir kainatiniai receptoriai valdo greitą sinapsinį perdavimą ir pasižymi tokiu pačiu joniniu laidumu: AMPA ir kainatinių receptorių kanalais kalio jonai išteka iš ląstelės, o natrio jonai į ląstelę. Taip pat svarbu pažymėti, kad prie ne-nmda receptorių prisijungus neurotransmiteriui, neuronas yra sujaudinamas prie ramybės membraninio potencialo (E.A. Barnard, 1997). Autoradiografijos metodu, panaudojus ligandus su radioaktyvia žyme, nustatyta, kad ne-nmda receptoriai yra paplitę hipokampe, išoriniuose galinių smegenų žievės sluoksniuose ir smegenėlių granuliniame sluoksnyje (D.T. Monaghan et al., 1984; C.W. Cotman et al., 1995). AMPA receptoriai. Glutamato AMPA receptoriai yra laidūs vienvalenčiams jonams (natrio, kalio bei cezio) ir silpnai laidūs dvivalenčiams jonams (kalcio, magnio). Agonistui susijungus su AMPA receptoriumi prie ramybės membraninio potencialo (-60 mv), sukeliama unitarinė postsinapsinė srovė susidedanti iš įtekančių į ląstelę natrio jonų ir tuo pačiu kanalu iš ląstelės ištekančių kalio jonų. Kadangi įtekanti natrio jonų srovė yra stipresnė nei ištekančių kalio jonų, postsinapsinės ląstelės membrana yra depoliarizuojama. Glutamato AMPA receptorius sudaro subvienetai, žymimi GluR-1, GluR-2, GluR- 3, GluR-4 arba GluR-A, GluR-B, GluR-C, GluR-D. Skirtingi glutamato AMPA receptorių subvienetai pasižymi panašia amino rūgščių seka. Pavyzdžiui, GluR-1 ir GluR-2 subvienetų 28

amino rūgščių sekos panašumas siekia 70%, o tarp GluR-2 ir GluR-3 73% (J. Boulter et al., 1990; K. Keinanen et al., 1990). Skirtingi GluR subvienetai gali sudaryti įvairius derinius, kurių funkcinis vaidmuo iki šiol nėra pilnai išaiškintas. Šiuo metu intensyviai tyrinėjami GluR-1 ir GluR-2 subvienetai, kadangi jie suformuoja hipokampo neuronų AMPA receptorius ir greičiausiai atlieka svarbų vaidmenį ilgalaikės potenciacijos metu formuojant atmintį (W.B. Schmitt et al., 2003; M.C. Oh and V.A. Derkach, 2005). AMPA receptorių įvairovę taip pat nulemia alternatyvi subvienetų dviejų padėčių būsena: flip arba flop. Šios būsenos nulemia sužadinto receptoriaus farmakologines ir kinetines savybes (B. Sommer et al., 1990). Ląstelių kultūrose nagrinėjant GluR2flip/GluR4flip subvienetų vaidmenį AMPA receptorių laidumui pastebėta, kad šis subvienetų derinys sukelia pailgintą natrio jonų įtekėjimą, tačiau neturi įtakos kalcio jonų laidumui (M. Iizuka et al., 2000). Kita vertus, S. Schmid et al. (2001), nagrinėjęs AMPA receptorių subvienetų pasiskirstymą žiurkės galvos smegenų kamieno klausos centruose nustatė, kad srityse, kur dominuoja GluR3flop ir GluR4flop, joniniai kanalai pasižymi greita kinetika ir dideliu kalcio jonų laidumu, o tose srityse, kur yra daugiau GluR2flip subvienetų, kalcio jonų laidumas yra žymiai mažesnis ir joninių kanalų kinetika yra žymiai lėtesnė (S. Schmid et al., 2001) Nors kalcio jonų laidumas didžiąja dalimi yra reguliuojamas NMDA receptorių, nustatyta, kad dvivalenčių jonų laidumu taip pat pasižymi ir AMPA receptoriai, tik šių receptorių laidumas yra perpus mažesnis nei NMDA receptorių (R. Dingledine et al., 1992). Kalcio jonų laidumu pasižymi homomeriniai receptoriai, sudaryti iš GluR1, GluR3 arba GluR4 subvienetų. Tuo tarpu sudaryti iš GluR2 subvienetų glutamato homomeriniai receptoriai nėra laidūs kalcio jonams. Tiriant suaugusių žiurkių hipokampo CA1 srities piramidinius neuronus buvo parodyta, kad genetiškai pakeitus AMPA receptorių subvienetus į GluR2, kalcio jonai nebegali patekti į ląstelę, todėl ląstelė žūva (S. Liu et al., 2004). 29

Kadangi daugelis AMPA ir kainatinių receptorių agonistų ir antagonistų yra bendri, ilgą laiką AMPA receptoriai nebuvo atskiriami nuo kainatinių. Tik pastaraisiais metais, atkreipus dėmesį į AMPA receptorių specifiškumą kalcio jonų laidumui dėl GluR2 subvieneto savybių bei panaudojus specifiškus AMPA receptorių subvienetams imunoreagentus, buvo išaiškintas tikslus AMPA receptorių išsidėstymas centrinėje nervų sistemoje (W. Vandenberghe et al., 2001; S.A. Aicher et al., 2002; D.A. DiGregorio et al., 2002; W. Kamphuis et al., 2003; P.S. Pinheiro et al., 2003). Kainatiniai receptoriai. Dėl kainatinių ir AMPA receptorių farmakologinių ir kinetinių savybių panašumo buvo ieškoma paprastų ir pigių būdų, kaip atskirti šiuos du receptorių tipus. Kainatinių receptorių buvimas nustatomas pagal specifinį jautrumą abiejų tipų receptorius (AMPA ir kainatinius) veikiančioms medžiagoms: konkanavalinui A, ciklotiazidinui ir aniracetamui (L.A. Wong and M.L. Mayer, 1993). Molekuliniame lygyje buvo nustatyta kainatinių receptorių subvienetų, GluR5-GluR7 bei KA1ir KA2, amino rūgščių seka (J. Lerma et al., 1993; U. Wullner et al., 1997 ). Savo amino rūgščių sekomis jie skiriasi nuo AMPA receptorių subvienetų. Pastaraisiais metais nustatytos medžiagos, selektyvios būtent tam tikriems kainatinių receptorių subvienetams: agonistai (S)-2-amino-3- (3-hidroksi-5-tert-butil-4-izotiazolil)propioninė rūgštis (ATPA), (S)-5-jodovilardinas ir antagonistai gama-d-glutamilaminometilsulfoninė rūgštis (GAMS) bei dekahidroizokvinolino dariniai LY293558, LY377770 ir LY382884 (A. Alt et al., 2004). Šios medžiagos veikia GluR5 subvienetą turinčius kanalus, tačiau nėra veiksmingos GluR6 subvienetų homomerams (A. Alt et al., 2004). K. Ito et al. (2004) tyrinėję hipokampo kainatinius ir AMPA receptorius, nustatė jų sukeliamos jaudinančios postsinapsinės srovės kinetinius skirtumus. AMPA receptoriams būdingas dažninis palengvinimas bei nuo NMDA receptorių nepriklausoma ilgalaikė 30

potenciacija. Tuo tarpu kainatinių receptorių sukelta srovė pasižymi silpnu dažniniu palengvinimu ir jai nėra būdinga ilgalaikė potenciacija (K. Ito et al., 2004). Autoradiografijos būdu tiriant kainatinius ir AMPA receptorius, buvo nustatyta, kad abiejų šių tipų receptorių tankumas skirtingose žiurkės galinių smegenų srityse yra nevienodas (D.T. Monaghan et al., 1984; C.W. Cotman et al., 1995). Kainatiniai receptoriai buvo aptikti žiurkės hipokampo CA3 srityje, dryžuotajame kūne, pusrutulių žievės giliuosiuose sluoksniuose, tarpinių smegenų gumburo branduoliuose (C.W. Cotman et al., 1995). Taip pat nustatyta, kad kainatiniai receptoriai dalyvauja jaudinančiame sinapsiniame perdavime žinduolių tinklainėje (S.H. DeVries and A.E. Schwartz, 1999) bei sensoriniame sinapsiniame perdavime žinduolių nugaros smegenyse (P. Li et al., 1999). Daugumos CNS neuronų postsinapsinėse membranose AMPA ir kainatiniai receptoriai yra aptinkami kartu. Žiurkių hipokampo įterptiniuose neuronuose kainatiniai receptoriai buvo aptikti tose pačiose sinapsėse kartu su AMPA receptoriais (D.T. Monaghan et al., 1984; C.W. Cotman et al., 1995). Lyginant šių abiejų tipų receptorių sukeltą postsinapsinę srovę pastebėta, kad kainatinių receptorių srovė yra žymiai mažesnė ir lėtesnė nei AMPA receptorių, todėl M. Frerking and P. Ohliger-Frerking (2002) iškilo klausimas, kokia yra postsinapsinių kainatinių receptorių funkcinė reikšmė. Buvo nustatyta kad kainatinių receptorių sukelta membranos depoliarizacija yra pakankamai didelė stimuliuojant nedidelį kieki aferentinių skaidulų (M. Frerking and P. Ohliger-Frerking, 2002). Kad būtų pasiekta tokio pat dydžio depoliarizacija stimuliuojant tokį pat kiekį aferentinių skaidulų ir sužadinant AMPA receptorius, reikia didesnio stimuliavimo dažnio (M. Frerking and P. Ohliger-Frerking, 2002). Tačiau tetaninio stimuliavimo signalas postsinapsiniam neuronui perduodamas dėl AMPA receptorių aktyvinimo (M. Frerking and P. Ohliger-Frerking, 2002). Manoma, AMPA receptorių ir kainatinių receptorių vaidmuo formuojant trumpalaikę atmintį yra nevienodas (M. Frerking and P. Ohliger-Frerking, 2002). 31

3.2.2. Joniniai NMDA receptoriai Skirtingai nei AMPA ir kainatiniai, NMDA receptoriai pasižymi ypatingu pralaidumu kalcio jonams. NMDA receptorius nėra lengva sujaudinti, kadangi šie kanalai yra nuo įtampos priklausomu būdu užblokuoti ląstelės išorėje esančiais magnio jonais. Neurono membranai esant netoli ramybės potencialo, magnio jonas yra prisijungęs prie atviro kanalo iš išorės ir neleidžia kitiems jonams judėti per kanalą. Kai ląstelės membrana yra depoliarizuojama, magnio jonai yra išmetami iš kanalo tuomet kiti jonai gali laisvai judėti per kanalą (I.B. Levitan and L.K. Kaczmarek, 2002). NMDA receptorių laidumą jonams įtakoja magnio jonų koncentracija ląstelės išorėje. Registruojant NMDA receptoriaus kanalo laidumą esant skirtingoms magnio jonų koncentracijoms ląstelės išorėje ir -60 mv membraniniam potencialui, NMDA sukeldavo įtekančią unitarinę srovę (C. Hammond, 1996). Tačiau buvo pastebėta, kad NMDA receptoriaus kanalas buvo visiškai atviras tik tuomet, kai ląstelės išorėje buvo pašalinti magnio jonai (C. Hammond, 1996). Tarpląstelinėje terpėje esant magnio jonams, kanalas fliuktuodavo tarp atviro ir uždaro periodų. Susumavus fliuktavimo periodus, buvo nustatyta, kad kuo didesnė magnio jonų koncentracija ląstelės išorėje, tuo trumpiau aktyvintas kanalas būna atviras (C. Hammond, 1996). Nors tam tikrose stuburinių centrinės nervų sistemos sinapsėse glicinas veikia kaip slopinantis neurotransmiteris, pastebėta, kad ši amino rūgštis atlieka svarbų vaidmenį aktyvinant NMDA receptorius. Glicinas veikia kaip koagonistas ir kartu su glutamatu jungiasi prie receptoriaus (I.B. Levitan and L.K. Kaczmarek, 2002). Tarpląstelinėje terpėje stipriai padidinus glicino koncentraciją, žymiai padidėjo registruojamos NMDA receptorių valdomos jaudinančios postsinapsinės srovės (K.S. Wilcox et al., 1996). 32

Taigi, NMDA receptorius yra gana neįprastas, nes jo sujaudinimui reikalingos dvi sąlygos: turi veikti ligandas (glutamatas ir greičiausiai kartu glicinas) bei neurono membrana turi būti depoliarizuota, ką paprastai sukelia ne-nmda tipo glutamato receptoriai. Dar vienas skiriamasis NMDA receptorių valdomų kanalų bruožas yra tai, kad jie atsiveria ir užsiveria lėčiau nei ne-nmda receptorių kanalai. Pirmiausia buvo pastebėta, kad kai kurie neuronai į sujaudinimą atsako dviejų dalių atsaku, susidedančiu iš greito ir lėto komponentų (N. Dale and A. Roberts, 1985; J.H. Bollmann et al., 1998). Naudojant NMDA receptorių antagonistą amino-5-fosfovalerijono rūgštį (APV) ir AMPA/kainatinių receptorių antagonistą 2,3-cis-piperidindikarboksilinę rūgštį (PDA) buvo parodyta, kad greitą signalo komponentą sukelia AMPA/kainatinių receptorių sujaudinimas, o lėtą NMDA receptorių sujaudinimas (N. Dale and A. Roberts, 1985; J.H. Bollmann et al., 1998). Glutamatas, patekęs į sinapsinį plyšį, jungiasi su postsinapsiniais NMDA ir ne-nmda receptoriais. Kol membraninis potencialas yra netoli ramybės potencialo ir dauguma NMDA receptorių yra užblokuoti magnio jonais, glutamatas sujaudina tik ne-nmda receptorius. Jei ši ne-nmda receptorių sukelta depoliarizacija yra pakankama ir iš NMDA kanalų yra pašalinami magnio jonai bei sujaudinami NMDA receptoriai, įtekanti per šiuos kanalus srovė sustiprėja ir membrana yra papildomai depoliarizuojama. Kuo labiau depoliarizuojama membrana, tuo daugiau NMDA receptorių sujaudina glutamatas. Fiziologinėmis sąlygomis, kai magnio jonai nėra pašalinami iš tarpląstelinės terpės ir postsinapsinio neurono membrana nėra papildomai depoliarizuojama, centrinėje nervų sistemoje signalo perdavime dalyvaujantys ne-nmda receptoriai sudaro sąlygas NMDA receptorių sužadinimui. Taigi, daugumoje centrinės nervų sistemos sinapsių abiejų tipų, ne-nmda ir NMDA, receptoriai yra išsidėstę kartu postsinapsinio neurono membranoje. Toks receptorių išsidėstymas buvo nustatytas žiurkės hipokampo neuronuose (D. Debanne et al., 1995), galvos smegenų kamieno neuronuose (J.A. O'Brien et al., 1997; J.H. Bollmann et al., 1998), pusrutulių žievės 33

įterptiniuose neuronuose (M.C. Angulo et al., 1999) bei somatosensorinės žievės neuronuose (V. Egger et al., 1999; D. Feldmeyer et al., 1999, 2002). Signalo perdavime iš varlės akies tinklainės į tektumą taip pat dalyvauja ne-nmda ir NMDA receptoriai kartu, tačiau NMDA receptorius pavyko sujaudinti tik stimuliuojant daugelį regos skaidulų (P.W. Hickmott and M. Constantine-Paton, 1993). Toje pačioje ląstelėje esant įvairių tipų receptoriams ląstelė gali skirtingai reaguoti į skirtingo intensyvumo sinapsinį stimuliavimą. Vidutinis stimuliavimas sujaudina tik AMPA ir/arba kainatinius receptorius į ją negali įtekėti didelis kalcio jonų kiekis ir ląstelės membrana yra mažai depoliarizuojama (I.B. Levitan and L.K. Kaczmarek, 2002). Stipresnis stimuliavimas sukelia ir ne-nmda, ir NMDA receptorių sujaudinimą, kurio metu į ląstelę patenka žymiai daugiau kalcio jonų (I.B. Levitan and L.K. Kaczmarek, 2002). Dėl NMDA receptorių sužadinimo postsinapsinio neurono membrana depoliarizuojama taip stipriai, kad postsinapsinis neuronas ne tik generuoja veikimo potencialus, bet ir sukelia sinapsinį potencialą postsinapsinis neuronas yra sužadinamas virš slenksčio (D. Debanne et al., 1995; J.H. Bollmann et al., 1998; M.C. Angulo et al., 1999; V. Egger et al., 1999; D. Feldmeyer et al., 1999, 2002). Kai kuriuose centrinės nervų sistemos neuronuose dėl NMDA receptorių sukeltos stiprios postsinapsinės membranos depoliarizacijos yra aktyvinami L tipo kalciniai kanalai ir yra generuojamas plato potencialas (F.S. Lo and R.R. Mize, 2000). 3.2.3. Metabotropiniai glutamato receptoriai Jonotropiniai glutamato receptoriai yra ligando (neurotransmiterio) valdomi jonų kanalai, tad šie receptoriai valdo jaudinančius glutamato sinapsinius atsakus. Visiškai kitaip veikia metabotropiniai glutamato receptoriai. Per GTF-surištus baltymus (G-baltymus) metabotropiniai receptoriai aktyvina efektorinio fermento sistemą. Ramybės būsenoje G- baltymas yra prisijungęs guanozindifosfato molekulę. Glutamatui sujaudinus metabotropinį 34

receptorių, receptorius sąveikauja su G-baltymu sukeldamas jo konformacinius pakitimus, sąlygojančius guanozindifosfato pakitimą į guanozintrifosfatą. Aktyvintas G-baltymas susiriša su efektoriniu fermentu. F. Sladeczek et al. (1985) bei F. Nicoletti et al. (1987) pirmieji parodė, kad 1) smegenyse egzistuoja su G-baltymu sujungti glutamato receptoriai, ir 2) glutamatas ne tik dalyvauja greitame jaudinančiame sinapsiniame perdavime centrinėje nervų sistemoje, bet ir moduliuoja signalo perdavimą neuronų grandinėse. Yra nustatyti 8 metabotropinių glutamato receptorių potipiai, kurie suskirstyti į 3 grupes pagal amino rūgščių sekos panašumus ir aktyvinamas efektorinių fermentų sistemas. Pirmajai grupei priskiriami mglur1 ir mglur5 receptoriai, aktyvinantys fosfolipazę C (PLC). Ši grupė veiksmingai aktyvinama kuiskulatu ir dihidroksifenilglicinu (DHPG). Antrajai grupei priklausantys mglur2 ir mglur3 slopina adenililciklazės veikimą. Antrąją receptorių grupę aktyvina (2S, 1 R, 2 R, 3 R)-2-(2 3 -dikarboksiciklopropil)glicinas (DCG- IV). Trečioji metabotropinių receptorių grupė (mglur4, mglur6, mglur7 ir mglur8) taip pat slopina adenililciklazę, o veiksmingiausias šios grupės agonistas yra L-2-amino-4- fosfosviesto rūgštis. Kaip ir kiti su G-baltymu susiję receptoriai, metabotropiniai glutamato receptoriai sudaryti iš 7 membraną kertančių subvienetų, o N-terminalė yra ląstelės išorėje. Vienas iš dėsningiausių metabotropinių glutamato receptorių sujaudinimo efektų įvairiose smegenų srityse yra sinapsinio perdavimo moduliacija. Daugelyje smegenų sričių mglur sumažina glutamato išsiskyrimą iš presinapsinių terminalių (R.W. Gereau and P.J. Conn, 1995) arba moduliuoja inhibuojantį GABAerginių receptorių poveikį (M.A. Desai and P.J. Conn, 1991). Glutamato receptoriai atlieka svarbų vaidmenį tinklainėje vykstančiame sinapsiniame perdavime. Yra žinoma, kad fotoreceptoriai yra pastoviai depoliarizuoti tamsoje, tad pastoviai išskiria neurotransmiterį glutamatą į sinapses, tarp fotoreceptorių ir bipolinių ląstelių. Bipolinių ląstelių yra dvi grupės: ON ir OFF. Veikiamos glutamato OFF 35

ląstelės yra depoliarizuojama dėl AMPA/kainatinių receptorių sužadinimo, o ON bipolinės ląstelės sujaudinimo atveju yra hiperpoliarizuojamos. Šioje hiperpoliarizacijoje dalyvauja trečiosios grupės metabotropiniai receptoriai mglur6, aktyvindami cgmf fosfodiesterazę arba inhibuodami guanililciklazę (N. Tian and M.M. Slaughter, 2003). Naudojant metabotropiniams glutamato receptoriams specifines medžiagas nustatyta, kad šie receptoriai moduliuoja NMDA receptorius ir nuo NMDA receptorių priklausomus procesus. Tiriant nėgės motorinius neuronus, nustatyta, kad sujaudinti metabotropiniai glutamato receptoriai padidina motorinių neuronų NMDA receptorių sukeltos srovės stiprumą. Dėl metabotropinių glutamato receptorių sukelto NMDA receptorių aktyvumo sustiprėjimo padidėdavo nėgės judėjimo ritmo dažnis (P. Krieger et al., 2000). Priimta ilgalaikę potenciaciją sieti su jonotropinių glutamato receptorių sujaudinimu, tačiau buvo nustatyta, kad trišakio nervo branduolio neuronuose sukeliant ilgalaikę potenciaciją dalyvauja ne jonotropiniai, o metabotropiniai glutamato receptoriai mglur5 (Y.C. Liang et al., 2005). Tiriant pusrutulių žievės neuronų sinapsinius ryšius, buvo sukeliama nervinio tinklo ilgalaikė potenciacija ir ilgalaikė depresija (M.J. Eckert and R.J. Racine, 2004). Metabotropinių glutamato receptorių antagonistas šią ilgalaikę potenciaciją ženkliai sumažino, tačiau nepaveikė ilgalaikės depresijos, kas parodo, jog šiuo atveju metabotropiniai glutamato receptoriai susiję išimtinai tik su ilgalaike potenciacija (M.J. Eckert and R.J. Racine, 2004). Buvo nustatyta, kad antrosios grupės metabotropiniai glutamato receptoriai hipokampe sukeltą ilgalaikę potenciaciją veikia slopinančiai, o specifiniais agonistais sujaudinus šiuos receptorius buvo stebimas ilgalaikės depresijos sustiprėjimas (B. Poschel et al., 2005). 36

3.3. Įvairių glutamato receptorių aktyvinimas dirginant vieną aksoną Įvairių tipų glutamato receptoriai dalyvauja signalo perdavime ir moduliavime įvairiose centrinės nervų sistemos dalyse (M. Hollmann and S. Heinemann, 1994), tačiau daugelyje centrinės nervų sistemos vietų šių receptorių funkcinė reikšmė nėra pilnai išaiškinta. Norint suprasti, kaip glutamato receptorių aktyvinimas veikia nervinio tinklo sujaudinimą, pirmiausia yra stengiamasi išaiškinti, kaip yra sujaudinami glutamato receptoriai vienoje postsinapsinėje struktūroje, kai signalas į postsinapsinį neuroną yra perduodamas vienu presinapsiniu aksonu. Glutamato receptoriai ir jų moduliatoriai yra tiriami sujaudinant vieną presinapsinį aksoną ir postsinapsiniame neurone registruojant sukeltą atsaką. Vieno neurono atsakas gali būti registruojamas viduląsteliniu būdu arba ląstelės išorėje. Priklausomai nuo to, kaip stipriai sužadinamas postsinapsinis neuronas, registravimo metu gali būti stebimas ne tik sujaudinto neurono membranos potencialo kitimas, bet gali būti sujaudinami neuronai, su kuriais postsinapsinis neuronas sudaro sinapses. Tokiu būdu įjungiama nervinė grandinė bei sužadinamas nervinis tinklas. Paprastai tokie tyrimai atliekami nagrinėjant gerai žinomas stuburinių gyvūnų centrinės nervų sistemos kelių neuronų sudaromas grandines, kurias sužadina neurotransmiteris glutamatas. Dažnas tyrimų objektas yra hipokampas, galvos smegenų kamieno motoriniai centrai, įvairūs pusrutulių centrai bei regos sistemos atskiros dalys: tinklainė, tektumas, šoninis kelinis kūnas (P.W. Hickmott and M. Constantine-Paton, 1993; L.M. Grover and T.J. Teyler, 1994; D. Debanne et al., 1995; I. Araki and W.C. De Groat, 1996; H. Markram et al., 1998; J.A. O'Brien et al., 1997; J.H. Bollmann et al., 1998; M.C. Angulo et al., 1999; N. Emptage et al., 1999; Z.F. Mainen et al., 1999; T.J. Webber et al., 1999;L.Y. Wang, 2000; E. Hanse and B. Gustafsson, 2001; S.S. Kumar and J.R. Huguenard, 2001; D. Feldmeyer et al., 1999, 2002; R. Conti and J. Lisman, 2003; N.V. Krasteniakov et al., 2004). Panaudojant specifinius 37

glutamato receptorių blokatorius pagal sukeltą neurone atsaką galima nustatyti, kokie receptoriai ir kokiu būdu dalyvauja formuojant atsaką. 3.3.1. Pavienio neurono poveikio nerviniam tinklui tyrimas unitarinių jaudinančių sinapsinių potencialų registravimo metodu Unitarinis jaudinantis sinapsinis potencialas (UJSP) tai sinapsinis atsakas, kurį sukelia vieno presinapsinio neurono impulsinis aktyvumas. Unitariniai jaudinantys sinapsiniai potencialai yra registruojami viduląsteliniu būdu, aštrų elektrodą įvedus į ląstelę arba prisiurbiamuoju elektrodu pritraukus nervinę ląstelę, suardžius prisiurbimo vietoje membraną ir sudarius viduląstelinį kontaktą (O.P. Hamill et al., 1981; B. Hille, 1992; E. Neher and B. Sakmann, 1992). Unitarinių jaudinančių sinapsinių potencialų registravimo metodas leidžia nustatyti, kokie receptoriai yra išsidėstę vieno neurono membranoje ir ištirti tų receptorių savybes. Yra nustatyta, kad daugelio centrinėje nervų sistemoje sudaromų sinapsių postsinapsinių neuronų membranoje yra NMDA ir ne-nmda receptoriai (D. Debanne et al., 1995; I. Araki and W.C. De Groat, 1996; J.A. O'Brien et al., 1997; J.H. Bollmann et al., 1998; M.C. Angulo et al., 1999; N. Emptage et al., 1999; L.Y. Wang, 2000; E. Hanse and B. Gustafsson, 2001; S.S. Kumar and J.R. Huguenard, 2001; D. Feldmeyer et al., 1999, 2002). Kai postsinapsinėje membranoje yra išsidėstę NMDA ir ne-nmda receptoriai kartu, sinapsė pasižymi dinamine įvairove: į skirtingo pobūdžio presinapsinio aksono stimuliavimą (vienetinį impulsą, vienetinių impulsų pliūpsnius, tetaninį stimuliavimą) atsakas yra nevienodas (L.M. Grover and T.J. Teyler, 1994; I. Araki and W.C. De Groat, 1996; H. Markram et al., 1998; D. Feldmeyer et al., 1999; L.Y. Wang, 2000; N.V. Krasteniakov et al., 2004). Sinapsės aktyvumas kinta priklausomai nuo išskiriamo transmiterio kiekio ir sujaudintų joninių glutamato receptorių kiekio (Z.F. Mainen et al., 1999; T.J. Webber et al., 1999; L.Y. Wang, 2000; R. Conti and J. Lisman, 2003). 38

Fiziologinėmis sąlygomis vieno presinapsinio neurono sukeltas sinapsės dinamiškumas viduląsteliniu būdu registruojamas nedažnai, kadangi aktyvinti NMDA receptorius fiziologinėmis sąlygomis yra gana sudėtinga (I. Araki and W.C. De Groat, 1996; D. Debanne et al., 1998; T.J. Webber et al., 1999). Paprastai NMDA receptorių aktyvinimui sudaromos palankios sąlygos papildomai depoliarizuojant postsinapsinę membraną (D. Debanne et al., 1995; H. Markram et al., 1998; M.C. Angulo et al., 1999; S.S. Kumar and J.R. Huguenard, 2001; N.V. Krasteniakov et al., 2004). Kai postsinapsinės membranos depoliarizacija yra artima ramybės potencialui, sukeltas UJSP yra pilnai blokuojamas ne-nmda receptorių antagonistu (M.C. Angulo et al., 1999; S.S. Kumar and J.R. Huguenard, 2001). Tuo tarpu papildomai depoliarizavus postsinapsinės ląstelės membraną, sukeltą jaudinantį postsinapsinį potencialą sumažina NMDA receptorių antagonistas aminofosfovalerijono rūgštis (D. Debanne et al., 1995; H. Markram et al., 1998; M.C. Angulo et al., 1999; S.S. Kumar and J.R. Huguenard, 2001; N.V. Krasteniakov et al., 2004). Fiziologinėmis sąlygomis tokia papildoma postsinapsinės ląstelės depoliarizacia yra pasiekiama dėl aktyvinamų ne-nmda receptorių. T.J. Webber et al. (1999) registravo triušio šoninio kelinio kūno neurone sukeltą atsaką. Šie autoriai parodė, kad ne-nmda receptoriai ląstelės membraną gali depoliarizuoti tik iki slenksčio. Dėl ne-nmda receptorių sukeltos membranos depoliarizacijos yra pašalinami NMDA receptorius blokuojantys magnio jonai. Aktyvinus NMDA receptorius, ląstelė jau generuoja veikimo potencialus (T.J. Webber et al., 1999). NMDA receptorių aktyvinimui yra svarbi magnio jonų koncentracija tarpląstelinėje terpėje (C. Hammond, 1996). Tarpląstelinėje terpėje sumažinus magnio jonų koncentraciją, aktyvinamas žymiai didesnis NMDA receptorių kiekis lyginant su NMDA receptorių aktyvinimu fiziologinėmis sąlygomis (D. Feldmeyer et al., 1999, 2002; Z.T. Zhu et al., 2004). Tuo tarpu R. Enoki et al. (2004) ir J.J. O'Connor et al. (1995) NMDA receptorių 39

aktyvinimui reikalingą postsinapsinio neurono membranos depoliarizaciją pasiekė sinapsėse blokuodami GABA receptorius. Stimuliuojant vieną presinapsinį aksoną fiziologinėmis sąlygomis postsinapsinėje membranoje aktyvinti NMDA receptorius yra pavykę vos keletui tyrėjų (I. Araki and W.C. De Groat, 1996; D. Debanne et al., 1998; N. Emptage et al., 1999). Norint fiziologinėmis sąlygomis pašalinti iš NMDA receptoriaus kanalo juos blokuojančius magnio jonus, tai yra, norint pakankamai depoliarizuoti postsinapsinę membraną, buvo naudojamas stimuliavimas didelio dažnio pasikartojančiais impulsais (I. Araki and W.C. De Groat, 1996). N. Emptage et al. (1999) atlikti tyrimai parodė, kad fiziologinėmis sąlygomis net ir vienos dendritinės sinapsės aktyvinimas gali sukelti NMDA receptorių sujaudinimą. Postsinapsiniame neurone sukeltas NMDA receptorių atsakas yra reikšmingas sužadinant nervinį tinklą. N.V. Krasteniakov et al. (2004) pastebėjo, kad hipokampo CA1 srities sinapsėse nuo postsinapsinės membranos depoliarizavimo stiprumo priklauso, ar sujaudinimas yra ikislenkstinis, kai neurone sukeliami tik jaudinantys sinapsiniai potencialai, ar viršslenkstinis, kai postsinapsinis neuronas jau generuoja somatinius veikimo potencialus. Postsinapsinę membraną depoliarizavus iki -50 mv, postsinapsiniame neurone buvo registruojami tik ikislenkstiniai jaudinantys sinapsiniai potencialai (N.V. Krasteniakov et al., 2004). Depoliarizavus postsinapsinę membraną iki -40 mv, postsinapsinis neuronas jau generavo veikimo potencialus (N.V. Krasteniakov et al., 2004). Daugumoje atvejų neurono plastiškumą valdančių NMDA receptorių sujaudinimui reikalingas dažninis palengvinimas, erdvinis bei laikinis sumavimasis, tad presinapsinis neuronas buvo stimuliuojamas pasikartojančiu stimulu (I. Araki and W.C. De Groat, 1996; D. Debanne et al., 1998; H. Markram et al., 1998; M.C. Angulo et al., 1999). Sinapsėse, kur presinapsinio aksono šluotelė suformuoja kompaktišką tankią sinapsių struktūrą su postsinapsinio neurono dendritais, sinapsinis atsakas yra pakankamai didelis, kad netgi 40

vienas UJSP gali būti viršslenkstinis, o NMDA receptoriai gali būti aktyvinami stimuliuojant vieną presinapsinį aksoną fiziologinėmis sąlygomis (D. Feldmeyer et al., 1999). Varlės tinklainės ganglinių ląstelių aksonų šluotelės, kurios sudaro sinapses su tektumo neuronais, taip pat yra tankios bei kompaktiškos (H.D. Potter, 1969, 1972). P.W. Hickmott and M. Constantine-Paton (1993) tyrinėjo šias sinapses stimuliuodami regos laidą ir viduląsteliniu būdu registruodami sukeltą atsaką varlės tektumo šeštojo ir aštuntojo sluoksnių neuronuose. Buvo nustatyta, kad registruojamą signalą formuoja ne-nmda ir NMDA receptoriai. Tačiau NMDA receptorių atsaką pavyko sukelti tik sujaudinus daugelį presinapsinių aksonų (P.W. Hickmott and M. Constantine-Paton, 1993). Ląstelės elektrinio aktyvumo registravimas viduląsteliniu būdu yra plačiai naudojamas, tačiau šis metodas turi ir trūkumų. Membraninius potencialus registruojant aštriu elektrodu gali būti suardytas ląstelės citoskeletas ir organoidai, ko pasėkoje nervinė ląstelė gali žūti. Viduląstelinio stimuliavimo ir registravimo izoliuotame preparate privalumas, kad galima registruoti izoliuotus ląstelėje vykstančius procesus, kartu yra ir trūkumas, kadangi yra suardoma natūrali neuroną supanti aplinka ir neuronas negauna signalų iš kitų neuronų. Taip pat ir pjūviuose atliekant viduląstelinį registravimą gali būti nutraukti kai kurie su registruojamu neuronu sudaromi ryšiai. Viduląstelinio registravimo metu, kai pipete yra prisiurbiama neurono membrana ir prisiurbimo vietoje membrana yra suardoma, pipetės turinys yra suliejamas su neurono membrana. Tuomet ilgai trunkančio registravimo metu vyksta difuzinis ląstelės citoplazmos ir pipetės turinio maišymasis. Dėl šios priežasties citoplazma netenka funkciškai svarbių molekulių, kaip ciklinis AMPA, ATF, GTF ir gali susilpnėti kai kurios registruojamos joninių kanalų srovės (N. Akaike and N. Harata, 1994). 41

3.3.2. Pavienio neurono poveikio nerviniam tinklui tyrimas individualių sinapsinių potencialų registravimo metodu Individualus sinapsinis potencialas tai vieno aksono sinapsinių srovių sąlygotas elektrinis potencialas, registruojamas tarpląstelinėje terpėje, dar vadinamas EEG (elektroencefalogramos) kvantu (A.M. Gutman, 1980). A.M. Gutman (1980) teoriškai pagrindė EEG kvantų registravimo galimybes. Individualių sinapsinių potencialų registravimo metodika buvo įdiegta nepriklausomai dviejų grupių mokslininkų: L.M. Mendell and E. Henneman (1971) užsienyje ir Kauno medicinos instituto neurofiziologų (J. Gruodis et al., 1972; A.M. Gutman and A.V. Kuras, 1974) Lietuvoje. L.M. Mendell and E. Henneman (1971) aštriu mikroelektrodu viduląsteliniu būdu motoneuronuose registravo katės blauzdos dvilypio raumens vienos juntamosios aferentinės skaidulos sukeltus jaudinančius postsinapsinius potencialus. L.M. Mendell and E. Henneman (1971) įsitikino, kad šalia esantys įterptiniai neuronai nebuvo sužadinami, ištraukdami mikroelektrodą iš ląstelės ir registruodami signalą ląstelės išorėje. Registruojamas ląstelės išorėje vienos aferentinės skaidulos sukeltas atsakas buvo priešingo poliškumo nei registruojamas ląstelės viduje (L.M. Mendell and E. Henneman, 1971). Kauno medicinos instituto neurofiziologai EEG kvanto tyrimų objektu pasirinko varlės retinotektalines sinapses (J. Gruodis et al., 1972; A.M. Gutman and A.V. Kuras, 1974; A.V. Kuras, 1974). Presinapsinius veikimo potencialus ir jų sukeltus sinapsinius potencialus jie užregistravo varlės retinotektalinio aksono šluotelėje šviesos stimulu sužadindami ganglinės ląstelės recepcinį lauką (J. Gruodis et al., 1972; A.M. Gutman and A.V. Kuras, 1974; A.V. Kuras, 1974). Retinotektalinio aksono šluotelė yra kompaktiška (H.D. Potter, 1969, 1972), todėl įmanoma registruoti vienos regos skaidulos su postsinapsiniais neuronais sudaromų sinapsių aktyvumą. Sukeltas atsakas būna pakankamai didelis, kadangi retinotektalinis aksonas sudaro iki 10 3 sinapsių (H.D. Potter, 1969, 1972). Šviesos stimulu sužadinant varlės tinklainės ganglinių ląstelių recepcinį 42

lauką buvo remiamasi H.R. Maturana et al. (1960) nustatytu varlės tinklainės penkių klasių ganglinių ląstelių sužadinimo metodu. Farmakologinėmis medžiagomis buvo nustatyta EEG kvanto sinapsinė prigimtis (J. Gruodis et al., 1972; A.M. Gutman and A.V. Kuras, 1974; A.V. Kuras, 1974). Sukeltą tektumo atsaką registruojant dviem mikroelektrodais, nutolusiais vienas nuo kito tam tikru atstumu, buvo ištirtas EEG kvanto generavimo laukas (A.V. Kuras, 1974). Taip pat buvo nustatyta, kad varlės retinotektalinio perdavimo sinapsės yra jaudinančios (J. Gruodis et al., 1972; A.M. Gutman and A.V. Kuras, 1974; A.V. Kuras, 1974) ir pasižymi dažniniu palengvinimu (A.M. Gutman and A.V. Kuras, 1974; A.V. Kuras and N.P. Chusainoviene, 1986). Tai, kad varlės vieno retinotektalinio aksono sukeltą sinapsinį atsaką galima registruoti ekstraląstelinėje terpėje ir vienos retinotektalinės skaidulos sukelti sinapsiniai potencialai pasižymi dažniniu palengvinimu, patvirtino J. Witpaard and H.E. Keurs (1975). J. Witpaard and H.E. Keurs (1975) šviesos stimulu sužadino retinotektalinę skaidulą ir ekstraląsteliniu elektrodu registravo tektume sukeltą atsaką. J. Witpaard and H.E. Keurs (1975) atkreipė dėmesį į skirtingo stimulo sukeltų atsakų pasiskirstymą skirtinguose tektumo gyliuose. Dažniniu palengvinimu pasižymintis atsakas buvo registruojamas 200 µm, 300 µm ir 400 µm gylyje (J. Witpaard and H.E. Keurs, 1975). J.T. McIlwain (1978) ekstaląsteliniu elektrodu registravo EEG kvantą katės keturkalnio viršutiniame kalnelyje retinotektalinės skaidulos šluotelėje. J.T. McIlwain (1978) naudojo šviesos ir elektros srovės stimulą. Retinotektalinės skaidulos dirginimui naudodami elektros srovę, J.T. McIlwain (1978) stimuliuojantį elektrodą įvesdavo į regos laidą. Tuo tarpu A.V. Kuras and N.P. Chusainoviene (1981) varlės retinotektalinės skaidulos atsakų registravimui tektume pritaikė pavienės tinklainės ganglinės ląstelės dirginimą elektros srove. Pastarasis metodas vėliau buvo ištobulintas (A.V. Kuras and N.P. Chusainoviene, 1984; R. Blistrabas et al., 1989a, b, 1990; A. Kuras and N. Gutmaniene, 1995, 1997, 2000). Elektriškai stimuliuodami vieną retinotektalinę skaidulą ir varlės tektumo F sluoksnyje registruodami 43

sukeltą atsaką A.V. Kuras and N.P. Chusainoviene (1986) nustatė, kad šiame sluoksnyje pasibaigiančios dviejų rūšių skaidulos, greičiausiai judančio krašto ir tamsos detektorių (H.R. Maturana et al., 1960), skiriasi neurotransmiterio kvantine išeiga sinapsėse. Panaudojant pastarąjį metodą taip pat buvo nustatyta, kad mikromolinės kadmio jonų koncentracijos blokuoja retinotektalinį perdavimą (R. Blistrabas et al., 1989a, b). Tai, kad kadmio chloridas nutraukė varlės retinotektalinį perdavimą, parodė, kad viena iš galimų kadmio jonų prisijungimo vietų yra presinapsinių potencialų valdomi kalcio jonų kanalai (R. Blistrabas et al., 1989a, b). Elektriškai stimuliuojant varlės tinklainę ir sukeltus atsakus registruojant tektume, buvo nustatyta, kad tektumo neuronų dendritai pasižymi netiesinėmis elektrinėmis savybėmis (A.M. Gutman et al., 1989) bei tai, kad retinotektalinėse sinapsėse glutamato išskyrimą skatina endogeninis acetilcholinas, veikdamas presinapsinius nikotininius cholino receptorius (A. Kuras and N. Gutmaniene, 2000). Svarbu paminėti, kad varlės retinotektalinio perdavimo tyrimai, panaudojant individualių sinapsinių potencialų registravimo metodą, buvo atliekami in vivo netaikant dirbtinio plaučių ventiliavimo (J. Gruodis et al., 1972; A.M. Gutman and A.V. Kuras, 1974; A.V. Kuras, 1974; A.V. Kuras and N.P. Chusainoviene, 1981, 1984, 1986; R. Blistrabas et al., 1989a, b, 1990; A. Kuras and N. Gutmaniene, 1995, 1997, 2000). Šiuo atveju eksperimentinis gyvūnas yra imobilizuojamas ir savarankiškai kvėpuoti negali, kas gali lemti prastą eksperimentinio gyvūno fiziologinę būklę. Varlė per odą iš aplinkos įsisavina deguonį, tačiau didžioji dalis anglies dvideginio kvėpuojant yra šalinama per plaučius (D.C. Jackson and B.A. Braun, 1979). Anglies dvideginis, kaupdamasis varlės organizme, gali sąlygoti varlės nereagavimą į aplinką (J.G.Jr. King et al., 1999). Anglies dvideginio kaupimasis organizme vyksta varlei žiemojant (R.G. Boutilier et al., 1997). Nustatyta, kad acidozės atveju slopinamas jaudinantis sinapsinis perdavimas: presinapsinėje terminalėje yra blokuojamas glutamato išskyrimas (J.E. Coelho et al., 2000; K.S. Hsu et al., 2000; Y.K. Park 44

et al., 2002). Netaikydami dirbtinio plaučių ventiliavimo, A.V. Kuras and N.P. Chusainoviene (1984) varlės tektumo F sluoksnyje registravo vienos retinotektalinės skaidulos sukeltus tektumo neuronų atsakus. Šie autoriai vieninteliu atveju tektumo neuronų aktyvumo įrašuose kartu su sinapsiniais potencialais stebėjo populiacinius atsakus neigiamas smailes, kurios rodo tektumo neuronų viršslenkstinį sujaudinimą (A.V. Kuras and N.P. Chusainoviene, 1984). 3.4. Apibendrinimas Apžvelgta literatūra rodo, kad: 1. Centrinėje nervų sistemoje postsinapsinių neuronų viršslenkstinis sujaudinimas, paprastai, stebimas sinchroniškai sudirginus daugelį presinapsinių skaidulų. Tačiau, neretai neuronų viršslenkstinis sujaudinimas yra pasiekiamas vieno presinapsinio neurono pliūpsninio aktyvumo metu dėka unitarinių jaudinančių sinapsinių potencialų dažninio palengvinimo ir laikinio sumavimosi. Pavieniai viršslenkstiniai unitariniai jaudinantys sinapsiniai potencialai buvo stebimi labai retai. 2. Daugumoje glutaminerginių centrinės nervų sistemos sinapsių ne-nmda ir NMDA receptoriai yra lokalizuoti kartu. Tačiau, daugeliu atvejų, dirginant vieną presinapsinį aksoną, NMDA receptorių aktyvinimas buvo pasiektas nefiziologinėmis sąlygomis: kai magnio jonai buvo pašalinti iš tarpląstelinės terpės, arba postsinapsinė membrana buvo depoliarizuojama, leidžiant srovę į neurono kūną. Nežymios unitarinės postsinapsinės NMDA srovės fiziologinėmis sąlygomis buvo stebimos tik retais atvejais. Taip pat yra žinoma, kad NMDA receptoriai vaidina svarbų vaidmenį neuronų jaudrumo ir sinapsinio plastiškumo mechanizmuose. 3. Varlės judančio krašto ir tamsos detektoriai yra siejami su labai svarbiomis grobio gaudymo ir pavojaus išvengimo reakcijomis, todėl keleto jų arba net vieno veikimo 45

potencialų pliūpsniai galėtų (turėtų) sukelti viršslenkstinį tektumo neuronų sujaudinimą. Šių regos skaidulų aktyvumo sukelti individualūs jaudinantys glutaminerginiai sinapsiniai potencialai yra pakankamai dideli, jiems būdingas dažninis palengvinimas ir laikinis sumavimasis veikimo potencialų pliūpsnių metu. 4. Varlės retinotektalinių skaidulų sinapsėse gali būti lokalizuoti abiejų tipų, ne- NMDA ir NMDA, receptoriai, nes daugelio regos skaidulų sinchroniško padirginimo sukeltuose tektumo atsakuose buvo stebimos su šiais receptoriais susijusios komponentės. Tačiau iki šiol nėra bandyta sukelti tektumo neuronų NMDA receptorių atsaką pavienės regos skaidulos dirginimu, ir nėra atsakyta į klausimą, ar ne-nmda ir NMDA receptoriai yra kartu vienos ir tos pačios regos skaidulos sinapsėse. 5. Visi bandymai su imobilizuotomis varlėmis in vivo iki šiol buvo atliekami be dirbtinės plaučių ventiliacijos. Galima tikėtis, jog plaučių dirbtinė ventiliacija gali pagerinti varlės fiziologinę būseną, kadangi plaučiai yra svarbūs pašalinant anglies dvideginį iš varlės organizmo. 46

4. DARBO METODOLOGIJA 4.1. Gyvūnai Tyrimams buvo panaudoti 38 suaugusių pievinių varlių Rana temporaria patinai (4 pav.). Tyrimai buvo atliekami laikantis tarptautinių elgesio su eksperimentiniais gyvuliukais taisyklių ("Principles of laboratory animal care", NIH publication No 86-23, revised 1985; European Communities Council Directive of 24 November 1986, 86/609/EEC) ir gavus Lietuvos Respublikos Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos leidimą Nr. 0030. 4.2. Tirpalai Tyrimuose naudojome fiziologinį ringerio tirpalą (ph 7,3-7,4), kurio sudėtis (mm): NaCl, 116; KCl, 2,5; CaCl 2, 1,8; MgCl 2, 1.0; NaHCO 3, 1,2; NaH 2 PO 4 2H 2 O, 0,17. Varlės imobilizavimui naudojome acetilcholino nikotininių receptorių specifinio antagonisto d- tubokurarino chlorido (Sigma Chemical Co, JAV) 0,1% tirpalą aukščiau minėtos sudėties fiziologiniame tirpale. Varlės vietinei anestezijai buvo panaudotas 0,5% novokaino tirpalas (Sanitas, Kaunas). Varlės retinotektaliniame perdavime dalyvaujančių receptorių tyrimui buvo panaudoti glutamato jonotropinių receptorių nespecifinis antagonistas kynureninė rūgštis (4-hydroksikvinolin-2-karboksilinė rūgštis, Aldrich Chem. Co) ir specifinis glutamato NMDA receptorių antagonistas aminofosfovalerijono rūgštis (DL-AP-5, Aldrich Chem. Co). Kynureninės rūgšties (0,5 mm) ir aminofosfovalerijono rūgšties (100 µm) tirpalai buvo paruošiami pridedant šių medžiagų į minėtą fiziologinį tirpalą. Tiek fiziologinis tirpalas, tiek ir farmakologinių medžiagų tirpalai buvo paruošiami tą pačią dieną prieš eksperimentą. 47

4.3. Gyvūno paruošimas Varles operavome bendros anestezijos, kurią sukėlėme padidindami anglies dvideginio koncentraciją įkvepiamame ore (A. Forslid et al., 1986; H. Mitsuda et al., 1988; J.G.Jr. King et al., 1999; L. Martoft et al., 2003), sąlygomis. Šis anestezijos metodas buvo pasirinktas siekiant išlaikyti gerą varlės fiziologinę būklę eksperimento metu. Kaip rodo kitų autorių darbai, priešingai daugeliui kitų anestezijos būdų, anestezija anglies dvideginio dujomis yra trumpalaikė ir nutraukus šių dujų padavimą, eksperimentinis gyvūnas greitai atsigauna (A. Forslid et al., 1986). Anestezuota anglies dvideginiu varlė buvo perkeliama į vonelę su šaltu (1-4 ºC) vandeniu. Papildomai anestezijai į varlės viršutinį voką ir į poodį virš tektumo buvo suleidžiama 0,6 ml novokaino tirpalo. Praėjus 10 min. po novokaino injekcijos, buvo pradedamas varlės akies ir tektumo preparavimas. Varlės tektumas buvo atidengiamas H.R. Maturana et al. (1960) pasiūlytu metodu. Žirklėmis buvo nukerpama varlės viršugalvio oda bei trepanuojamas kaukolės skliautas virš tektumo. Nukirpus varlės tektumą dengiantį galvos smegenų kietąjį dangalą, minkštąjį dangalą pašalinome plona (1-2 µm skersmens) volframo vielele stereoskopinio mikroskopo MBS-10 (Lomo, Rusija) pagalba. Atidengus tektumą, varlės dešiniosios akies tinklainė buvo paruošiama S.A. George and W.B Marks (1974) aprašytu būdu. Žirklėmis nukirpome viršutinį ir apatinį vokus, mirksėjimo membraną, iškirpome odeną. Tada pipete buvo išsiurbiamas akies lęšiukas ir stiklakūnis. Išsiurbus akies lęšiuką ir stiklakūnį, akies obuolio ertmė buvo užpildoma fiziologiniu tirpalu. Atlikus chirurgines operacijas varlė buvo perkeliama į užtemdytą kamerą ir imobilizuojama, suleidžiant į raumenį 0,2-0,3 mg d-tubokurarino. Eksperimento metu atidengtas tektumas buvo perfuzuojamas fiziologiniu tirpalu. Varlės plaučiai buvo dirbtinai ventiliuojami (atliekamas dirbtinis kvėpavimas), įstačius vamzdelį į varlės gerklę. 48

4 pav. Suaugusi pievinė varlė, Rana temporaria, jai būdingoje aplinkoje vasarą. 49