Ataskaitos TURINYS

Transkriptas

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDRA TVIRTINU: LSMU VA kancleris prof. H. Žilinskas 2014 m. lapkričio mėn...d. MOKSLINIŲ TYRIMŲ IR TAIKOMOSIOS VEIKLOS PROGRAMOS MAISTO KOKYBĖ IR SAUGA Taikomojo tyrimo Nr. MT Įvairių veiksnių (somatinių ląstelių skaičiaus, riebalų, laktozės kiekio, laikymo sąlygų ir kt.) įtakos kazeino kiekio kitimui žaliame piene tyrimai 2014 METŲ GALUTINĖ ATASKAITA Projekto vadovas LSMU Veterinarijos akademija, prof. A.Sederevičius Kaunas 2014

2 PROJEKTO VYKDYTOJAI 1. Antanas Sederevičius LSMU VA Anatomijos ir fiziologijos kat. prof., Virškinimo fiziologijos ir patologijos mokslinio centro vadovas; 2. Kristina Musayeva LSMU VA Virškinimo fiziologijos ir patologijos mokslinio centro jaunesnioji mokslo darbuotoja. 3. Saulius Savickis VĮ Pieno tyrimai direktorius. 4. Almantas Žakas - LSMU VA Virškinimo fiziologijos ir patologijos mokslinio centro j. mokslo darbuotojas. ~ 2 ~

3 TURINYS Įvadas Literatūros apžvalga Pieno komponentai Pieno baltymingumą įtakojantys faktoriai Pieno baltymai Baltymų nustatymo metodai Kazeinas Kazeino svarba sūrių gamyboje Kazeino kiekį įtakojantys veiksniai Tešmens uždegimo įtaka pieno kokybei Somatinės ląstelės piene Pieno natūralumo pakeitimas (falsifikavimas) metų tyrimai Tyrimų objektas ir metodai Mėginių ėmimas tyrimams Tyrimų metodika Duomenų statistinis apdorojimas Tyrimų rezultatai ir apibendrinimas Išvados metų tyrimai Tyrimų objektas ir metodai Tyrimų metodika Tyrimų rezultatai ir apibendrinimas Išvados Rekomendacijos Projekto rezultatų sklaida...40 Literatūros šaltiniai...41 Priedai...46 ~ 3 ~

4 Įvadas Žalio pieno kokybė yra pagrindinis faktorius, nuo kurio priklauso pieno produktų kokybė ir tuo pačiu jų konkurencingumas rinkoje. Į tai būtina atsižvelgti žinant, kad šalies pienininkystės tolesnis sėkmingas vystymas priklauso nuo galimybės eksportuoti pieno produktus. Pieno baltymingumas yra svarbi pieno sudėtinė dalis, pieno maistinės ir biologinės vertės bei galvijų produktyvumo rodiklis. Nuo pieno baltymų sudėties priklauso daugelio pieno produktų išeiga bei skonio savybės. Pieno baltymai nėra vienalyčiai ir susideda iš dviejų didelių grupių: kazeino ir tirpiųjų baltymų t.y. serumo (išrūgų) baltymų (Erasmus, 2001). Šios frakcijos gali būti išskaidytos į komponentus, besiskiriančius savo chemine sudėtimi (Staniškienė ir kt., 2007). Sūrių gamybai didelę reikšmę turi riebiosios pieno frakcijos ir kazeino tipo baltymai (Gudonis, 2007). Karvių piene vidutinė kazeino reikšmė siekia 79% bendrojo baltymų kiekio, tačiau veikiant įvairiems fiziologiniams (amžius, laktacija, tešmens uždegimas), genetiniams (paveldimumas) ir aplinkos (sezonas, regionas, šėrimas) faktoriams, individualių karvių piene šis rodiklis kinta nuo 68 iki 84% (Ng-Kwai-Hang, 1993). Kazeino/baltymų santykį labai įtakoja somatinių ląstelių kiekis piene. Somatinių ląstelių skaičius atspindi tešmens sveikatos būklę, todėl tai yra vienas pagrindinių pieno kokybės rodiklių. Somatinių ląstelių skaičiui padaugėjus iki tūkst/ml kinta baltymų proporcijos t.y. mažėja kazeino, daugėja bendrųjų ir išrūgų baltymų koncentracija piene (Barbano et al. 1991; Coulon et al. 1998; Tripaldi et al., 2003). Padaugėjus somatinių ląstelių didėja fermento plazmino aktyvumas. Dėl proteolitinių fermentų karvių, sergančių slaptuoju mastitu, piene prasideda baltymų irimas. Didžioji dalis kazeino suskaldoma dar prieš išmelžiant pieną pačiame tešmenyje, dėl pakilusios aukštos temperatūros, kuri yra palanki plazmino fermentacijai (Politis et al., 1988). Šiuo metu Lietuvoje superkamo pieno reikalavimuose kazeinas nėra įtrauktas į privalomųjų pieno sudėties rodiklių tyrimus. Kadangi sumažėjęs kazeino kiekis turi neigiamos įtakos technologinėms pieno savybėms, svarbioms gaminant raugintus pieno produktus, sūrius atsirado būtinybė nustatyti kazeino kiekio kitimą priklausomai nuo somatinių ląstelių skaičiaus. Darbo tikslas nustatyti įvairių veiksnių įtaką kazeino kiekio kitimui piene ir įvertinti galimybes pagal kazeino kiekio pokytį nustatyti, ar žalias pienas buvo centrifuguotas metų uždaviniai: 1. Nustatyti sveikų karvių piene kazeino kiekio kitimą priklausomai nuo somatinių ląstelių skaičiaus ir kitų pieno sudedamųjų dalių (riebalų, baltymų, laktozės, urėjos); ~ 4 ~

5 2. Nustatyti įvairių veiksnių (karvių amžiaus, veislės, laikymo sąlygų,) įtaką kazeino kiekio kitimui piene. 3. Išanalizuoti ir įvertinti kliniškai sveikų karvių kazeino kiekio kitimus priklausomai nuo pieno sudedamųjų dalių bei karvės amžiaus, veislės ir laikymo sąlygų metų uždaviniai: 1. Nustatyti kazeino kiekio kitimą karvių piene, priklausomai nuo padidinto (sergančios subklinikiniais ir klinikiniais mastitais karvės) somatinių ląstelių skaičiaus bei kitų pieno sudedamųjų dalių (riebalų, baltymų, laktozės, urėjos); 2. Nustatyti, kaip kinta kazeino kiekis, esant skirtingam centrifugavimo apsukų kiekiui; 3. Palyginti kazeino kiekio kitimą sveikų ir sergančių karvių piene. 4. Pateikti rekomendacijas, kokie kazeino kiekio pakitimai galėtų parodyti, kad pieno sudėties rodikliai netikslūs dėl įtariamo falsifikavimo. 1. Literatūros apžvalga 1.1. Pieno komponentai Pienas daugiakomponentė nepastovios sudėties sudėtinga biologinė sistema, kurios dispersinėje terpėje, t. y. vandenyje, yra ištirpusi ir nevienodai pasiskirsčiusi dispersinė fazė, t. y. sausosios pieno medžiagos (Gudonis, 2005; Raycheva et al., 2007). Be to, sudedamosios dalys nėra stabilios, jos priklauso nuo daugelio veiksnių. Pieno cheminė sudėtis priklauso nuo karvių produktyvumo krypties, veislės, laktacijos tarpsnio, pašarų cheminės sudėties. Vyraujančios medžiagos piene yra vanduo, riebalai, baltymai, laktozė ir mineralinės medžiagos (1 lentelė). Piene, kaip natūralios sudėtinės dalys, yra vitaminai, fermentai, hormonai ir kitos biologiškai aktyvios medžiagos (Walstra et al., 1999). 1 lentelė. Karvių pieno cheminė sudėtis (Walstra et al., 1999; Zootechniko žinynas, 2006) Karvių pieno cheminė sudėtis, procentais Sudėtinės dalys Nuo - iki Vidutiniškai Vanduo 82,7 90,7 87,5 Sausosios medžiagos 9,3 17,3 12,5 Riebalai 2,5-6,5 4,0 Baltymai 2,3 4,4 3,3 kazeinas 1,8 3,5 2,6 albuminas 0,2 0,7 0,5 globulinas 0,05 0,15 0,1 kiti baltymai 0,05 0,2 0,1 ~ 5 ~

6 Nebaltyminiai junginiai 0,02 0,08 0,05 Pieno cukrus (laktozė) 3,8 5,3 4,7 Mineralinės medžiag. (K,Ca,P,Na,Mg,Fe,Cu ir kt.) 0,5 1 0,7 Dujos Be to, piene gali būti ir nepageidautinos medžiagos, kaip įvairių vaistinių preparatų likučiai. Su pašarais ar kitomis priemonėmis patekę sunkieji metalai, toksinai, alkaloidai ar pašalinius kvapus sukeliančios medžiagos. Kai kurios medžiagos gali patekti iš patelių organizmo, kitos patenka iš aplinkos. Pieno sudedamosios dalys įtakoja pieno produktų sandarą, spalvą ir kvapą. Natūralios pieno sudėtinės dalys, patenkančios į pieną iš gyvulio kraujo, yra baltymai, riebalai, angliavandeniai, mineralinės medžiagos, makro- mikroelementai, vitaminai ir kitos. Baltymai tai svarbiausia ir sudėtingiausia pieno sudėtinė dalis. Bendras baltymų kiekis piene priklauso nuo pašarų kiekio, sudėties ir svyruoja tarp 3,0-3,6 %. Daugiausia pieno baltymų sintetinama pačiame tešmenyje, ir tik nedidelė jų dalis patenka iš kraujo (Staniškienė ir kt., 2007). Pagrindiniai pieno baltymų pradmenys yra kraujo plazmoje esančios aminorūgštys, polipeptidai, kraujo plazmos albuminai, globulinai, pieno liaukos parenchimos baltymai ir kitos nebaltyminės azoto medžiagos. Svarbiausi pieno baltymai yra kazeinas, laktoalbuminas ir laktoglobulinas. Jie sintetinami iš kraujo atneštų aminorūgščių. Baltymų kiekis piene, kaip ir kraujyje, yra pastovus ir jį padidinti nelengva. Tačiau jei karvės tinkamai veisiamos, šeriamos ir laikomos, gali padidėti ne tik primilžiai, bet ir pieno baltymingumas. Nustatyta, kad baltymų piene pagausėja, kai karvės šeriamos pašarais, turinčiais biologiškai vertingų baltymų (Bakutis, 2003). Pieno lipidai kaloringiausia ir labiausiai kintanti pieno sudėtinė dalis. Jos kiekis svyruoja tarp 3,2 % ir 6,0 %. Svyravimo amplitudė priklauso nuo gyvulio veislės, pašarų, sveikatos būklės, laikymo sąlygų ir kitų veiksnių (Staniškienė ir kt., 2007). Pieno riebalai susidaro pieno liaukoje, pereinant iš kraujo plazmoje esančių neutralių riebalų ir riebiųjų rūgščių. Daugiausia pieno riebiųjų rūgščių susidaro iš acetato. Pieno riebalų sintezė tešmenyje priklauso nuo prieskrandžiuose rūgstančių angliavandenių. Kuo daugiau susidaro acto rūgšties, tuo daugiau piene riebalų. Susidarę liaukinėje ląstelėje riebalų rutulėliai kartu su kazeino dalelėmis atitrūksta nuo ląstelės viršaus ir patenka į alveolių spindį. Svarbiausias angliavandenis piene yra disacharidas yra laktozė (pieno cukrus). Laktozė susidaro tik pieno liaukos sekrecinio epitelio ląstelėse iš kraujo paimtos gliukozės jai susijungus su fosforinga galaktoze (Rezamand et al., 2007). Laktozės piene vidutiniškai yra 4,7 % ir ji sudaro 90 % visų kitų piene esančių angliavandenių. Laktozė dalyvauja visuose pieno produktų gamybos procesuose, formuoja šių produktų savybes bei kokybę (Staniškienė ir kt., 2007). ~ 6 ~

7 Pieno sudėtis rodo karvių mitybą ir fiziologinę būklę. Laktozės kiekio piene rodiklis kartu su kitais gali būti taikomas karvių energijos balansui įvertinti. Karvės, kurios intensyviau mobilizuoja energijos atsargas, dažniau suserga tešmens uždegimu. Jų piene sumažėja laktozės, baltymų ir urėjos koncentracija, ženkliai padidėja somatinių ląstelių kiekis (Rezamand et al., 2007). Piene mineralines medžiagas sudaro apie 50 įvairių elementų. Bendras jų kiekis yra apie 1,0 proc. Piene jos yra organinių ir neorganinių druskų pavidalu, kurios į jį patenka iš gyvulių kraujo. Dalis šių medžiagų susidaro gyvulio organizme, dalis pereina iš pašarų. Todėl mineralinių medžiagų kiekis piene priklauso nuo gyvulio veislės, jo fiziologinės būklės, nuo pašarų, vandens kokybės bei metų laiko. Mineralinės medžiagos turi didelę įtaką pieno savybėms (termostabilumui, buferiškumui, juslinėms savybėms). Makroelementai - šių mineralinių medžiagų piene yra daugiau kaip 1 mg/l00g. Makroelementų kiekis piene priklauso nuo individualių gyvulio savybių, laktacijos ir kt. Makroelementų pokyčiai laktacijos pradžioje ir jos pabaigoje ypač ryškūs. Krekenose ypač daug kalcio, fosforo, magnio, natrio, lyginant su normaliu pienu. Paskutinėmis laktacijos savaitėmis vėl padidėja kalcio, fosforo, chloridų kiekiai. Sergančių karvių piene daug natrio, chloridų, mažiau kalio. Mikroelementai - bendras mikroelementų kiekis piene sudaro ne daugiau kaip 1 mg/l00g. Mikroelementų kiekiai piene priklauso nuo gyvulio fiziologinės būklės, laktacijos laiko, pašarų. Mikroelementai piene yra biologiškai aktyviuose junginiuose - fermentuose (Fe, Mo, Mn, Zn, Cu). Be natūralių mikroelementų, piene gali būti ir pašalinių, patekusių į pieną nuo įrengimų ir pieno laikymo talpų. Vitaminai - tai biologiškai aktyvūs pieno komponentai, kurių maži kiekiai turi svarbią reikšmę žmogaus organizmui. Dalis vitaminų turi įtakos pieno oksidaciniams - redukciniams procesams, todėl veikia kaip antioksidantai. Kai kurie vitaminai suteikia pienui ir pieno produktams spalvą, kiti stimuliuoja patekusių į pieną bakterijų dauginimosi procesus. Vieni vitaminai patenka į pieną su pašarais, kitus sintetina karvės prieskrandyje ir skrandyje esantys mikroorganizmai (Staniškienė ir kt., 2007) Pieno baltymingumą įtakojantys faktoriai Pieno baltymingumas yra svarbi pieno sudėtinė dalis, pieno maistinės ir biologinės vertės bei galvijų produktyvumo rodiklis. Ilgą laiką buvo mažai domimasi pieno baltymingumu, jis neįėjo į pieno kainos sudėtį ir nebuvo tinkamos aparatūros jiems nustatyti (Strolys,1994). Tačiau ~ 7 ~

8 atsirado ekonominis stimulas tirti karvių pieno baltymingumą ir vykdyti selekciją pagal pieno baltymingumą ir kitus požymius. Nuo pieno baltymų sudėties priklauso daugelio pieno produktų išeiga bei skonio savybės. Kartu su pieno riebumu periodiškai yra tiriamas ir baltymų kiekis piene. Pieno baltymų sudėtis ir koncentracija varijuoja priklausomai nuo daugelio veiksnių. Baltymų kiekį piene lemia veislė (Auldist et al., 2004), laktacijos tarpsnis (Ostersen, Foldager & Hermansen, 1997), laktacijos skaičius (Ng-Kwai-Hang et al., 1987), sezonas (O'Brien et al., 1999), šėrimas (Mackle et al., 1999) bei karvės sveikatingumas (Verdi, et al., 1988). Sezonas. Baltymų piene padaugėja rudenį, spalio lapkričio mėnesį, o mažiausiai kovo mėnesį (Hamletas ir kt.,1998). Pieno baltymų kaita žaliaviniame piene panaši kaip ir riebalų, tik jų kiekio mažėjimas 0,01 0,23% prasideda vasario ir baigiasi rugpjūčio mėnesį. Palyginti su vidutiniu metiniu rodikliu rudens ir gruodžio bei sausio mėnesiais pieno baltymų yra 0,02 0,23% daugiau (Pauliukas ir kt., 2005). Veršiavimosi laikas. Vasarą ir rudenį apsiveršiavusių karvių pieno baltymingumas būna nežymiai mažesnis, lyginant su apsiveršiavusiomis žiemą ir pavasarį. Daugiausia baltymų yra krekenose, mažiausiai dienų po veršiavimosi. Pieno baltymingumas didėja nuo 4 iki 8 laktacijos mėnesio, o pagal kitus duomenis, baltymų kiekis piene po apsiveršiavimo mažėja iki 12 laktacijos savaitės, tačiau tai lemia ir apsiveršiavimo sezonas. Pavyzdžiui, kovo mėnesį apsiveršiavusios karvės pieno baltymų mažiausiai bus 7 savaitę, o apsiveršiavusios spalį - 23 savaitę (Hamletas ir kt.,1998). Riebiapienių karvių pieno baltymingumas laktacijos metu kinta labiau nei liesapienių (Jukna, 1998). Paveldimumas. Nepriklausomai nuo to, kaip kokybiškai mes šersime karvę, kokią modernią technologiją įdiegsime bei laikysimės kokybiško pieno gamybos reikalavimų, ta pieno kokybės dalis, kuri priklauso nuo paveldimų savybių, nepagerės. Kokybišką pieną galime gauti tik turėdami aukštos genetinės vertės sveikas karves bei taikydami pažangias karvių šėrimo ir laikymo technologijas. Literatūros duomenimis manoma, kad pieno baltymingumas ir riebumas yra paveldimi dažniau nei pieno kiekis. Iš pieninių veislių galvijų riebiausią (net iki 9%) ir baltymingiausią pieną duoda džersių veislės karvės. Pauliukas ir kt.(2005) tyrimuose nustatė, kad visais laktacijos mėnesiais baltymų kiekis yra didžiausias Lietuvos juodmargių (3,21%), o mažiausias Danijos juodmargių karvių (3,02%). Lietuvos, Vokietijos ir Danijos juodmargių karvių pieno baltymingumas yra mažiausias per pirmuosius tris laktacijos mėnesius. Produktyvumas. Kai primilžiai didžiausi pieno baltymų būna mažiausiai. Tuo metu didžiojo prieskrandžio mikroorganizmų proteinų sintezės neužtenka, kad karvės tešmenyje sintetintųsi pakankamai pieno baltymų (Hamletas ir kt.,1998). ~ 8 ~

9 Įmitimas. Karvės, kurios būna per riebios veršiavimosi metu, turi blogesnį apetitą, jos yra jautresnės medžiagų apykaitos sutrikimams ir tai blogina pieno sudėtį (Hamletas ir kt.,1998). Šėrimas. Pieno baltymingumas didėja šeriant daug energijos ir mažiau ląstelienos turinčiais pašarais. Tačiau jie dažniausiai sumažina pieno riebumą. Energijos trūkumas būna dėl nepakankamo koncentratų kiekio arba stambiųjų pašarų stygiaus, arba jų blogos kokybės. Pastarasis veiksnys sumažina ir pieno riebumą ir baltymingumą. Pieno baltymingumas mažėja, kai racione trūksta proteinų. Didelis riebalų kiekis pašaruose sumažina pieno baltymų kiekį 0,1 0,3 %. Susmulkinti stambieji pašarai didina baltymų kiekį, tačiau per smulkus mažina pieno riebumą. Be to, gali pakenkti gyvulio sveikatai. Karvių, šeriamų tik iš varpinių augalų paruoštais pašarais (miežiais, kviečių atliekomis, pašariniais rugiais), šakniavaisiais (runkeliais, ropėmis, kitais), pieno baltymingumas mažėja. Šėrimas pilnaverčiais pašarų mišiniais 0,1 0,2 % padidina pieno baltymingumą. Kuo geriau karvės šeriamos žiemą, tuo mažiau kinta baltymų procentas piene ganiavos metu (Hamletas ir kt.,1998). Manoma, kad pridėjus į karvių racionus didžiajame prieskrandyje neskaidomų kritinių amino rūgščių lizino ir metionino, baltymų kiekį piene galima padidinti net 0,5 proc. Jų trūkumas racione yra svarbiausias pieno sintezę ribojantis veiksnys (Rulquin et al.,1993). Toks pat efektas gaunamas labai padidinus karvių prieskrandžių mikrobinę masę, nes joje šių aminorūgščių kiekis ir tarpusavio santykis idealiai tinka pieno sintezei. Daugiausia baltymų piene būna gyvulius šeriant suderintais visaverčiais pašarais, kurie atitinka karvių fiziologinius poreikius Pieno baltymai Baltymai yra makromolekuliniai junginiai, sudaryti iš α-aminorūgščių. Cheminiu požiūriu baltymai yra polipeptidai, kurių grandinėje yra nuo 50 iki keliolikos tūkstančių aminorūgščių, sujungtų peptidiniu (-CO-NH) ryšiu. Viename peptido grandinės gale yra laisva amino grupė (N-galas), kitame karboksigrupė (C-galas). Tokias struktūras turi visi baltymai (Staniškienė ir kt., 2007). Pieno baltymai yra sudėtinė baltymų grupė, turinti daugiau kaip 200 skirtingų molekulių (Ng-Kwai-Hang, 2002). Karvės piene paprastai yra apie 3,5 % baltymų skirstomų pagal jų tirpumą esant ph 4,6, iš kurių vidutiniškai 80 % sudaro kazeinas, o 20 % - išrūgų baltymai. Pieno baltymai nėra vienalyčiai ir susideda iš trijų frakcijų: kazeino (75-80 % visų pieno baltymų), tirpiųjų baltymų t.y. serumo (išrūgų) baltymų (15-20%) ir neproteininių komponentų ~ 9 ~

10 frakcija, kurių sudėtyje yra nitrogenas (5%). Šios frakcijos gali būti išskaidytos į komponentus, besiskiriančius savo chemine sudėtimi (Erasmus, 2001; Staniškienė ir kt., 2007). Kazeinu vadinama grupė baltymų, kurie nusėda parūgštinus pieną. Nusodinus kazeiną lieka išrūgų baltymai. Kazeinas sudarytas iš kazeino frakcijų, o išrūgas sudaro eilė kitų svarbių imuninių proteinų (1 priedas). Pieno serumo baltymus sudaro medžiagų grupės vadinamos albuminais(α-laktoalbuminas) ir globulinais (β-laktoglobulinas). Veikiant pieną rūgštimis ar fermentais jie lieka serume, gaminant sūrius - išrūgose. Veikiant temperatūrai (iki 70 C) jie denatūruojami, susijungia su κ-kazeinu. Tirpieji pieno baltymai yra aukštos maistinės vertės, tačiau sūrių gamyboje svarbiausias proteinų komponentas yra kazeinas (Colin et al. 1992; Hurtaud et al. 1995). Pagal karvių pieno baltymų nomenklatūrą šiuo metu egzistuoja tokie pieno baltymų variantai (Ng-Kwai-Hang & Grosclaude, 2003; Farrell et al., 2004): α s1 -kazeinas: A, B, C, D, E, F, G, H; α s2 -kazeinas: A, B, C, D; β-kazeinas: A1, A2, A3, B, C, D, E, F, G, H; κ-kazeinas: A, B, (C, E, F, G, H, I, J); β-laktoglobulinas: A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, W; α-laktoglobulinas: A, B,C. Prie pieno baltymų priskiriami fermentai, kai kurie hormonai bei riebalų apvalkalėlių baltymai. Piene taip pat aptinkami baltymų skilimo produktai ir nebaltyminis azotas (urėja). Urėja (šlapalas arba karbamidas) yra galutinis azoto apykaitos organizme produktas. Jos kiekis piene parodo azoto pusiausvyrą organizme, baltymingų ir energinių pašarų santykį karvių racione (Staniškienė ir kt., 2007) Baltymų nustatymo metodai Bendras baltymų kiekis piene nustatomas pagal bendrą azoto kiekį (N). Jis susideda iš baltyminio (PN) ir nebaltyminio azoto (NPN). Nebaltyminio azoto maistinė vertė maža, jis neturi įtakos sūrių išeigai. Apie 50% nebaltyminio azoto sudaro urėja, kitą dalį - mažos molekulinės masės azoto turintys junginiai. Pagal gautas azoto ir baltyminio azoto vertes nustatomas bendras (CRUDE)=N 6,38 ir tikrasis (TRUE)=CRUDE (NPN 6,38) baltymų kiekis. Tikrųjų baltymų yra 0,1 0,3 proc. mažiau negu bendrųjų baltymų. Jų kiekis priklauso nuo mitybos raciono ir karvių veislės. ~ 10 ~

11 Kai kuriose šalyse pieno supirkimo kaina priklauso nuo baltymų kiekio jame, kuriam nustatyti naudojamos dvi sistemos: 1. Vertinamas azoto kiekis piene (bendras baltymų kiekis, kazeinas+tirpūs baltymai+nebaltyminės kilmės azoto turinčios medžiagos, t. y. TN*6,38); šis metodas taikomas Vokietijoje, Olandijoje, Argentinoje, Kanadoje, Danijoje, Suomijoje, Estijoje, Graikijoje, Vengrijoje, Airijoje, Izraelyje, Norvegijoje, Šveicarijoje, Lietuvoje. 2. Vertinamas tik baltyminis azotas (tikrieji baltymai, (TN-NPN)*6,38); sistema taikoma Prancūzijoje, Belgijoje, JAV, Australijoje. Šalyse, kur superkamas pienas vertinamas pagal tikrųjų baltymų kiekį, atitinkamai perskaičiuojama pieno kaina. Tarptautinėje pieno produktų prekyboje naudojamas bendras baltymų kiekis. Baltymų kiekis nustatomas Kjeldalio (pamatiniu) metodu. Šiuo metodu nustatomas bendrasis ir tikrųjų baltymų kiekis. Bendrąjį pieno baltymingumą galima nustatyti ir kitais metodais: Kolfranio, kolorimetriniu, infraraudonųjų spindulių absorbcijos, refraktometriniu, fluorometriniu, formalino titravimo ir kitais (Staniškienė ir kt., 2007) Kazeinas Kazeinas yra pagrindinis pieno baltymas. Jis piene yra koloidinėje ištirpusioje formoje. Priklausomai nuo temperatūros, mechaninio ir joninio ryšio kazeinas yra nm dydžio. Esant kazeino dydžiui tarp nm kalbama apie kazeino submiceles, o esant dydžiui tarp nm apie kazeino miceles (Staniškienė ir kt., 2007). Šios micelės susidaro iš daugelio submicelių, kurios užima apie pusę micelių tūrio, kita dalis užpildyta vandeniu su jame ištirpusiais jonais, laktoze ir enzimais. Submicelės susijungia į kazeino miceles, veikiant kalcio jonais ir kalcio fosfatais, t. y. susidaro kazeino kalcio- fosfato kompleksas. Kazeinas yra termostabilus baltymas, kurio terminė denatūracija įvyksta 5-90 min. kaitinant 130 C temperatūroje, tačiau taip kaitinant pakinta kalcio-kazeinato fosfatinio komplekso (KKFK) sudėtis ir struktūra, stambėja kazeino micelės, didėja pieno klampumas. Pakitus micelių struktūrai kinta ir technologinės pieno savybės: mažėja pieno sutraukinimo šliužo fermentu greitis, blogiau atsiskiria išrūgos (Staniškienė ir kt., 2007). Kazeinas yra sudarytas iš kazeino frakcijų alfa S1( α s1-), alfa S2(α s2-), beta (β-), gama ( -), kapa (κ-). γ-kazeinas yra β-kazeino proteolitinio skilimo produktas. Trys pagrindinės kazeino ~ 11 ~

12 frakcijos (α, β, κ) pasiskirsčiusios 60 proc., 25 proc., 15 proc. nuo bendro kazeino kiekio. Kazeino frakcijas sudaro įvairios polipeptidinės grandinės, kurios sudarytos iš didelio kiekio amino rūgščių, kurios susijungusios tarpusavyje peptidinėmis jungtimis (karvių piene iš žinomų 20 amino rūgščių yra 19). Amino rūgštys labai svarbios augimo ir organizmo vystimosi procese. Kazeino frakcijos turi didelę reikšmę nusodinant (išskiriant) kazeiną. Jas sudaro kalciui jautrus kazeinas hidrofobinė dalis ir kalciui nejautrus kazeinas hidrofilinė dalis ( Кузнецов, 2003). Literatūroje minimas α s1, α s2, β ir κ kazeinus koduojančių genų polimorfizmas (Grosclaude et al., 1994). Trys pagrindinės pieno baltymų kazeinų frakcijos (α, β, κ) ir β- laktoglobulinas atskleidžia galvijų pieno baltymų genetinės įvairovės rezultatą, kuris lemia pieno fizikines ir chemines savybes. Yra žinoma, kad α s1 ir β- kazeinai gali prisijungti didelį Ca+2 jonų kiekį. Tai sukelia jų agregaciją ir juos nusodina, o κ- kazeinas neprisijungia Ca+2 jonų ir yra tirpus esant didelei Ca+2 jonų koncentracijai. Kazeino micelės paviršiuje išsidėstęs κ- kazeinas yra stabilizatorius, apsaugantis jos sudėtyje esančias αs- ir β- kazeino frakcijas nuo agregacijos (Narkevičius, 2003; Горбатовa, 2003) Kazeino svarba sūrių gamyboje Kokybišką sūrį galima pagaminti iš pieno, kuriame baltymų koncentracija yra ne mažesnė kaip 3,2 %, o kazeino koncentracija ne mažesnė kaip 2,5 % (Гудков, 2003). Fermentinė sutrauka apskritai nesusidaro, jei kazeino koncentracija yra mažesnė kaip 0,7 %. Didėjant kazeino koncentracijai piene, pagerėja jo sutraukinimo savybės, sutrumpėja koaguliacijos procesas, sutraukos tvirtėjimo laikas, padidėja sutraukos tvirtumas bei sineretinės savybės, taip pat sumažėja pamilčių kiekis bei riebalų ir baltymų nuostoliai. Tuo tarpu žemesnėmis pieno sutraukinimo savybių reikšmėmis pasižyminčiame piene kazeino koncentracija yra maždaug 10 % mažesnė kaip normaliame piene (Гудков, 2003; Ramanauskas ir kt., 2008). Sūrių gamybai didelę reikšmę turi riebiosios pieno frakcijos ir kazeino tipo baltymai, kurie sudaro 80 % bendros pieno baltymų sudėties (Gudonis, 2007) Kazeino kiekį įtakojantys veiksniai Karvių piene vidutinė kazeino reikšmė siekia 79% bendrojo baltymų kiekio, tačiau veikiant įvairiems fiziologiniams ir genetiniams faktoriams, individualių karvių piene šis rodiklis kinta nuo 68 iki 84% (Ng-Kwai-Hang, 1993). ~ 12 ~

13 Paveldimumas. Nauja pieno baltymus apsprendžiančių genų identifikavimo technologija leidžia ištirti gyvulio genotipą ir nustatyti genus, koduojančius įvairius pieno baltymų variantus bei jų struktūrines atmainas ir panaudoti juos kaip genetinius žymeklius selekcijos procese, gerinant pieno perdirbamąsias savybes, sūrių ir varškės išeigą. Pienas su κ-kazeino ir/arba β - laktoglobulino tipu BB turi didesnį kazeino/baltymų koeficientą (Rahali & Me nard, 1991; Coulon et al. 1998; Mackle et al. 1999). κ-kazeinas sudaro 1/8 kazeino ir yra labai svarbus micelių formavimuisi ir stabilizavimuisi bei veikia pieno perdirbamąsias savybes (Baltrėnaitė ir kt.,2007). Sūrių gamyboje svarbūs κ-kazeino genetiniai variantai (A, B, C, D). Karvių κ-kazeino A ir B variantų įtakos pieno produkcijai tyrimai parodė, kad κ-kazeino BB genotipo karvių piene yra daugiau riebalų, baltymų ir kazeinų, negu κ-kazeino AA genotipo karvių piene (Ng-Kwai Hang, 1998; Di Stasio and Mariani, 2000; Vaitkus ir kt., 2001; Žitny ir kt., 2002). B alelis yra patikimai susijęs su didesniu kazeino ir mažesniu išrūgų baltymo kiekiu, taigi didesniu kazeinų ir bendrų jų baltymų santykiu (Rahali & Me nard, 1991; Coulon et al. 1998; Mackle et al. 1999). Atrinkus gyvulius, turinčius pageidaujamus κ-kazeino ir β-laktoglobulino BB genotipus, galima suformuoti karvių bandas, kurios gamintų ypač gerų perdirbimo savybių pieną. Mokslininkės Miceikienė ir Pečiulaitienė (2005) ištyrusios Lietuvos pieninių galvijų populiaciją, pateikia duomenis, kad κ-kazeino BB genotipas paplitęs 0,018, o B alelis 0,218 dažniu; β-laktoglobulino BB genotipas 0,543, o B alelis 0,705 dažniu. Lietuvos pieninių galvijų selekcijos galimybės dar neišnaudotos. Pieno baltymų (α-, β- ir κ-kazeino ir sutraukinimo baltymų laktoalbumino bei laktoglobulino) kiekį lemiantys genų variantai yra paveldimi. Gaminant varškę ir sūrius iš tokių karvių pieno, kurios turi kazeino ir laktoglobulino B tipus, produktų išeiga padidėja net iki 7 proc., taip pat labai pagerėja pieno skonio savybės. Įdiegus naują DNR tyrimais pagrįstą technologiją, galima ištirti bet kokio amžiaus ir lyties gyvulių genotipą, t. y. identifikuoti genus, koduojančius pieno baltymų tipus. Jie gali būti panaudoti kaip genetiniai markeriai, formuojant specialias karvių, turinčių κ-kazeino ir β-laktoglobulino B tipą, bandas, iš kurių pieno būtų gaminamas tik sūris ir varškė (Miceikienė, Pečiulaitienė, 2005). Veislė. Nuo galvijų veislės priklauso pieno sudėtis ir tuo pačiu jo savybės. Pavyzdžiui, baltymų kiekis atskirų veislių karvių piene gali skirtis net 23 % (Mariani et al., 1995). Nuo karvių veislės priklauso kazeino bei atskirų jo frakcijų koncentracija piene. Kaip jau minėta anksčiau, tai turi labai didelės įtakos pieno sutraukinimo savybėms ir sūrių išeigai (Ramanauskas ir kt., 2008). Kazeino genotipų skirtumai tarp atskirų galvijų yra daug didesni, kaip tarp tos pačios veislės atskirų linijų. Pavyzdžiui, džersi veislės karvių piene vyrauja κ-kazeino BB genotipas, kai tuo tarpu tarp fuzu veislės galvijų jis aptinkamas daug rečiau. Skirtingų veislių karvių pienas skiriasi pagal ~ 13 ~

14 rūgštingumą, kalcio ir fosforo santykį, natūralių pienarūgščių mikroorganizmų augimo inhibitorių kiekį ir kt. Laktacija. Remiantis įvairių mokslininkų atliktais tyrimais laktacijos metu kazeino kiekis įvairuoja. Ng-Kwai-Hang su kitais bendraautoriais (1984) nustatė, kad kazeino proporcijos buvo aukščiausios labai ankstyvos laktacijos metu, o Lucey ir Fox (1992) tyrimuose nustatyta, jog kazeino yra daug mažiau vėlyvuoju laktacijos metu nei vidutiniu laikotarpiu. Tačiau kitų mokslininkų darbuose tyrimų rezultatai prieštaringi. Anot tyrėjų, bendrų pieno baltymų koncentracija ir kazeino kiekis didesnis vėlyvos laktacijos laikotarpiu (Ostersen et al.,1997; Auldist et al.,1998; Coulon et al., 1998). Pasak tyrėjo S. Ostersen (1997) viduryje laktacijos kazeino koncentracija gali siekti maksimumą, o išrūginių baltymų atitinkamai sumažėja. Dėl didelio imunoglobulinų koncentracijos padidėjimo staiga sumažėja kazeino kiekis periode po apsiveršiavimo (Ostersen et al.1997; Coulon et al., 1998). Pirmą laktacijos savaitę kazeino koncentracija didėja ir stabilizuojasi antrą savaitę po apsiveršiavimo (Remond et al., 1992). Mokslininkas D.M. Barbano (1991) su kitais bendraautoriais atlikę tyrimus pastebėjo, kad kazeino daugiausia pirmaveršių karvių piene penktą (83,08%) ir dešimtą (82,83%) laktacijos mėnesiais. Kai tuo tarpu antros ir trečios laktacijų karvių piene kazeino kiekis pakankamai stabilus iki 6,7 laktacijos mėnesio, o vėlesniais mėnesiais pastebimas 1,5% sumažėjimas. Be to, laktacijų skaičius, kuris siejamas su karvės amžiumi, taip pat gali įtakoti baltymų sudėtį. Pasak Ng-Kwai-Hang ir kitų bendraautorių (1987) kazeino pagrindinės sudedamosios dalys (α-, β- ir κ-kazeinas) mažėja karvei senstant. Iš kitos pusės, mokslininkas Schaar (1984) ištyręs kazeino koncentraciją infraraudonosios spektroskopijos (IR) metodu, koreliacijos tarp kazeino kiekio kitimo ir laktacijų skaičiaus nerado. Veikiausiai, Ng-Kwai-Hang ir kitų bendraautorių (1987) mažesnė kazeino koncentracija nustatyta dėl padidėjusios pieno proteolizės, kurios mokslininkas Schaar (1984) nepastebėjo tirdamas IR spektroskopijos metodu. Karvėms senstant proteolitinio fermento plazmino aktyvumas didėja, o tai įtakoja kazeino proteolizę (Schaar, 1985; Bastian et al., 1991). Mackle ir kitų mokslininkų (1999) nuomone, vyresnių karvių piene padidėjusių išrūgų baltymų koncentracija siejama su didesniu pieno liaukos epitelio pralaidumu dėl ankstesnių tešmens uždegimų. Šėrimas. Normalios sudėties pieną galima gauti tik šeriant karves pilnaverčiais pašarais. Jei karvių racione trūksta baltymų arba žema pašarų energinė vertė, sumažėja pieno primilžiai, riebalų, kazeino ir bendras baltymų kiekis piene, pailgėja fermentinės sutraukos susidarymo trukmė (Fox F. P. et al., 2000). Kitų mokslininkų nuomone šėrimas mažai įtakoja kazeino /baltymų santykį nebent parenkamas radikalus neįprastas raciono tipas (Coulon et al. 1995; Malossini et al. 1996). ~ 14 ~

15 DePeters ir Cant (1992) paskelbė, jog padidinus koncentratų kiekį racione, pastebima kazeino proporcijų pasikeitimas piene. Šie mokslininkai teigia, kad kazeino kiekis priklauso nuo energijos šaltinio t.y. raciono tipo. Sezonas. Tyrėjas Ng-Kwai-Hang (1993) ištyrė kazeino kiekio svyravimus dviejų metų eigoje. Daugiausiai baltymų ir kazeino nustatė žiemos mėnesiais, o mažiausiai vasaros mėnesiais. Lindmark-Månsson su bendraautoriais (2003) savo tyrimuose pateikė duomenis, kad kazeino koncentracija ir bendrų baltymų kiekis švediškų karvių piene kito dėl sezoninės ganiavos vasarą. Didžiausia baltymų koncentracija nustatyta ganiavos laikotarpio pabaigoje (spalio mėn.), o mažiausia tvartinio laikotarpio pabaigoje (kovo mėn.). Manoma, kad tokie baltymų kiekio svyravimai galimi dėl skirtingų šėrimų ir laktacijos tarpsnių, t.y. dauguma karvių metų pradžioje būna ankstyvos laktacijos. Tai leidžia daryti prielaidą, kad baltymų koncentracijos sezoninį kintamumą piene įtakoja kelių veiksnių kombinacija Tešmens uždegimo įtaka pieno kokybei Produkuojamo pieno kiekiui ir sudėčiai didelę įtaką turi karvių sveikata. Sergant užkrečiamosiomis ir neužkrečiamosiomis ligomis sutrinka organizmo normalios fiziologinės funkcijos, todėl sumažėja ar visai sutrinka pieno gamyba bei pakinta jo sudėtis. Uždegiminė reakcija tešmenyje lemia pieno kiekybinius ir kokybinius pokyčius (Kitchen,1981). Yra dvi tešmens uždegimo formos: slaptasis (subklinikinis) ir klinikinis. Kad karvė serga klinikiniu mastitu, galima įtarti iš pakilusios tešmens temperatūros. Be to, pažeistas tešmens ketvirtis parausta, patinsta, yra skausmingas, pakinta ir pieno išvaizda. Klinikinio mastito atveju nustatomi patogeniniai sukėlėjai ir ženkliai padidėjęs somatinių ląstelių skaičius. Karvei sergant slaptuoju tešmens uždegimu, piene ir tešmenyje iš pirmo žvilgsnio jokių pakitimų nematyti, tačiau pieno gamyba sumažėja ir pakinta jo sudėtis bei padidėja somatinių ląstelių skaičius, bet patogeninių mastito sukėlėjų nenustatoma (Barbano et al.,1991). Uždegimo metu padidėja kraujagyslių pralaidumas, dėl to kraujo baltymai, kitos sudėtinės dalys ir uždegiminės ląstelės iš kraujo patenka į pieną. Dėl ligos pieną gaminančios tešmens epitelio ląstelės tampa mažiau produktyvios, dėl to sumažėja ir primilžis. Ląstelėms suirus, į pieną patenka jų fermentai. Dėl proteolitinių fermentų karvių, sergančių slaptuoju mastitu, piene prasideda baltymų irimas. Sveikų karvių piene esantis plazminas yra svarbus proteolitinis fermentas (Saeman et al.,1988). Jo randama ir piene su padidėjusiu somatinių ląstelių skaičiumi. Dėl mastito šio fermento aktyvumas gali padidėti daugiau nei du kartus. Plazminas ir kiti fermentai, išsiskyrę iš ~ 15 ~

16 somatinių ląstelių, gali skaldyti kazeiną tešmenyje (Verdi et al., 1987). Keletas mokslininkų tyrimuose nustatė reikšmingą neigiamą koreliaciją tarp αs- ir β- kazeino frakcijų kiekio ir plasmino aktyvumo. β- kazeinas yra jautriausias šio fermento proteolitiniam skaldymui. Anot mokslininko Politis ir kitų (1989) tarp somatinių ląstelių skaičiaus ar plasmino ir κ-kazeino piene nereikšminga koreliacija, iš ko galima spręsti kad plazminas neskaldo κ-kazeino (Fox F.P., 1981; Politis et al.,1989). Nors plazmino sukeltas kazeino irimas sulėtėja žemoje temperatūroje, jis yra ypač atsparus kaitinimui. Normalios pieno pasterizacijos temperatūros nepakanka padidėjusiam plazmino aktyvumui sumažinti. Taigi dėl mastito atsiradęs plazminas skatina pieno baltymų gedimą, kuris gali tęstis pieno perdirbimo bei jo produktų laikymo metu (Vaitkus V., 2001; Aniulis ir kt., 2001). Stiprėjant uždegimui, cheminė pieno sudėtis panašėja į kraujo, nes sudėtinės dalys iš kraujo apytakos filtruojamos į pieno liauką. Pieno komponentų kiekis kinta įvairiai (2 priedas). Pagrindinių sudedamųjų dalių kiekis pieno sausosiose medžiagose sumažėja 5 15 proc. Labai pasikeičia riebalų sudėtis, padaugėja didelės molekulinės masės nesočiųjų riebalų rūgščių. Šie pokyčiai skatina lipolizę (riebalų skaidymą). Dėl to suprastėja pieno produktų kokybė. Uždegimo paveiktame piene net proc. mažiau bendrojo kazeino, o išrūginių baltymų daugiau negu įprasta. Sergančių slaptuoju mastitu karvių piene sumažėja riebalų, laktozės, kalcio, vitaminų (ypač vitamino C), pagausėja natrio, chloro, albuminų ir globulinų. Padidėja tokio pieno ph (net iki 6,9 ir daugiau) ir oksidacinis aktyvumas (Hurley, 2003; Rudejevienė, 2007). Vartotojai reikalauja geros kokybės pieno produktų. Geras kvapas ir skonis yra svarbiausias vartotojų reikalavimas. Taip pat labai svarbu, kad produktai ilgai išsilaikytų ir būtų saugūs. Iš mastitinio pieno kokybiškų ir saugių produktų neįmanoma pagaminti visų pirma dėl to, kad jame yra mažiau sausųjų medžiagų, blogai koaguliuoja kazeinas, mažesnis pieno stabilumas aukštoje temperatūroje. Gamybos procese ne visuomet pastebimi mastitinio pieno perdirbimo trūkumai, nes paprastai jis sumaišomas su dideliu normalaus pieno kiekiu. Iš gero ir mastitinio pieno mišinio pagaminti produktai gali būti blogesnio kvapo, jie greičiau genda. Be to, vartojant užterštus patogeninėmis tešmens bakterijomis ir jų toksinais pieno produktus, kyla pavojus žmogaus sveikatai. Pieno, turinčio daug somatinių ląstelių nesuperka perdirbėjai, todėl pasitaiko atvejai, kai somatinių ląstelių skaičius gamintojo ūkyje sumažinamas neįteisintais metodais ir priemonėmis (pavyzdžiui, pieno veikimas išcentrine jėga) tačiau pieno kokybė nepagerėja, o tik iškreipiama pieno sudėties informacija (tokiame piene lieka ligas sukeliančių mikroorganizmų ir toksinų). ~ 16 ~

17 Somatinės ląstelės piene Visose išvystytos pienininkystės šalyse, siekiant įvertinti, ar pienas gautas iš sveikų, nesergančių tešmens ligomis karvių, tiriamas somatinių ląstelių skaičius (SLS). Somatinės ląstelės, aptinkamos karvių piene, yra procesų, vykstančių pieno liaukoje, indikatorius. Somatinės ląstelės tai baltieji kraujo kūneliai (leukocitai), kūno bei sekrecijos epitelinės ląstelės (Bradley and Green, 2005). Tešmens epitelinės ląstelės, vykstant normaliems organizmo procesams, nuolat atskyla ir atsinaujina. Kai pieno liaukoje uždegimo nėra, somatinių ląstelių skaičius būna nuo 10 iki 200 tūkst./ml (vidutiniškai tūkst./ml), vyrauja epitelinės ląstelės. Natūraliai jų visada padaugėja prieš karvėms užtrūkstant, pradėjus jas melžti vieną kartą per dieną, taip pat pirmomis dienomis po veršiavimosi (Staniškienė ir kt., 2007). Karvei susirgus tešmens uždegimu bei kitomis ligomis, somatinių ląstelių padaugėja net iki kelių dešimčių milijonų. Remiantis žalio pieno pirminių kokybės rodiklių įvertinimo instrukcija, patvirtinta LR žemės ūkio ministro 2006 m. liepos 25 d. įsakymu Nr. 3D-303 (žin., 2006, Nr ), žaliame piene somatinių ląstelių skaičius negali viršyti 400 tūkst./ml. Pagal Tarptautinės pieninkystės federacijos (International Dairy Federation/IDF) apibrėžimus pienas kuriame somatinių ląstelių skaičius virš 501 tūkst./ml rodo subklinikinio ar klinikinio mastito požymius. Kazeino/baltymų santykį labai įtakoja somatinių ląstelių kiekis piene. Somatinių ląstelių skaičiui padaugėjus iki tūkst/ml kinta baltymų proporcijos t.y. mažėja kazeino daugėja bendrųjų ir išrūgų baltymų koncentracija piene (Barbano et al. 1991; Coulon et al. 1998; Tripaldi et al., 2003)(1pav.). Padaugėjus somatinių ląstelių didėja fermento plazmino aktyvumas kuris skaldo kazeiną. Didžioji dalis kazeino suskaldoma dar prieš išmelžiant pieną pačiame tešmenyje, dėl pakilusios aukštos temperatūros, kuri yra palanki plazmino fermentacijai (Politis et al., 1988). R* % B *- 3.3 % L* % R % B % L % ~ 17 ~

18 1 pav. Somatinių ląstelių skaičiaus įtaka pieno sudėties rodikliams (S.Savickis, 2011) *Paaiškinimas: R-riebalai; B-baltymai, L-laktozė Mokslininkų tyrimų duomenimis, somatinių ląstelių skaičius padidėja ne tiktai dėl infekcijos, įtakos turi daugelis veiksnių (Green et al., 2006; 2008): dėl karvės organizmo atsparumo, sugebėjimo kovoti su įvairiais dirgikliais (SLS piene didina bet kuri liga, ypač pasireiškianti sisteminiais simptomais) (Žakas, 2002; Paape et al., 2002); dėl streso ir traumų (skausmas ir išgąstis didina adrenalino kiekį kraujyje, kuris slopina hormono oksitocino veikimą, sąlygojantį normalų pieno atleidimą melžiant, o per žaizdas gali patekti mikrobinė infekcija; stresas dėl pasikeitusios aplinkos ar šėrimo sąlygų)(japertas, 1999; Rushen et al.; 1999; Skrypek et al., 2004); dėl laktacijos laikotarpio ir karvės amžiaus (SLS būna didelis pirmomis dienomis po veršiavimosi, mažiausias, esant didžiausiam produktyvumui iki laktacijos vidurio, o didžiausias - karvei užtrūkus; SLS laipsniškai auga po kiekvienos laktacijos) (Sheldrake et al.,1983; Skrypek et al., 2004); dėl metų laiko (SLS piene vasarą paprastai būna didesnis, nes šiluma ir drėgmė sukelia karvei papildomą stresą) (Žakas, 2002); dėl karvių bandos dydžio (pasauliniu masteliu lyginant, SLS piene mažesnis būna didelėse karvių bandose, kuriose galima užtikrinti gerą bandų valdymo kokybę. Lietuvoje SLS mažesnis mažose (iki 100 karvių) privačiose bandose (D.Urbšienė, Internetinė prieiga: Žiūrėta 2013 m. rugsėjo 11 d.); dėl medžiagų apykaitos sutrikimų, blogo šėrimo (SLS piene padidėja, šeriant karves nekokybiškais pašarais, nesubalansuotais racionais. Šiais atvejais somatinių ląstelių piene gali padidėti iki 1 mln/ml) (Skrypek et al., 2004); dėl melžimo (SLS piene didina melžimo higienos bei technologinių reikalavimų nesilaikymas) (Pečiulionienė ir kt., 2004); dėl laikymo sąlygų (SLS piene didina antisanitarinės karvių laikymo sąlygos, blogas karvidžių mikroklimatas, per žema tvartų temperatūra, šlapi pakratai, skersvėjai) (Haile- Mariam et al., 2003); ~ 18 ~

19 Todėl atsižvelgiant į įvairių veiksnių (sveikatos būklės, laktacijos periodo, šėrimo, amžiaus, veislės, metų laiko) įtaką karvės organizmui, ir nuo 2004 metų gegužės 1 d. superkamo pieno kokybei taikomus Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos nustatytus reikalavimus, sveikų karvių piene somatinių ląstelių skaičius turi neviršyti 400 tūkst/ml ( Reikalavimai žalio pieno, termiškai apdoroto geriamojo pieno ir pieno produktų gamybai ; Lukauskas ir kt., 2005; Pauliukas ir kt., 2005) Pieno natūralumo pakeitimas (falsifikavimas) Žalias pienas, į kurį sąmoningai pridėta pašalinių medžiagų ar kitaip pakeista jo pirminė sudėtis ir savybės, laikomas nenatūraliu (falsifikuotu). Dažniausiai jis falsifikuojamas norint padidinti kiekį arba pagerinti kokybę. Pieno sudėties ir savybių keitimas pieno perdirbimo įmonėse pagal galiojančius pieno produktų gamybos technologinius standartus nelaikomas pieno falsifikavimu. Pieno falsifikavimas gali būti fizinis ir cheminis. Yra daugybė potencialių pieno falsifikavimo medžiagų: pašalinis vanduo, valgomoji druska arba cukrus tokiam vandeniui maskuoti, plovimo ir dezinfekavimo medžiagos, neutralizuojančios ir konservuojančios medžiagos. Pieno natūralumas ir saugumas tiriami pieno supirkimo metu įvertinant pirminius kokybės rodiklius ir įgaliotoje laboratorijoje įvertinant pieno užšalimo temperatūrą, inhibitorinių ir kitokių kenksmingų medžiagų likučius (Staniškienė ir kt., 2007). Pagal superkamo pieno reikalavimus draudžiama prieš pardavimą pieną apdoroti išcentrinės jėgos įrengimais ( Reikalavimai žalio pieno, termiškai apdoroto geriamojo pieno ir pieno produktų gamybai, 2004). ~ 19 ~

20 metų tyrimai 2.1.Tyrimų objektas ir metodai Situacijos analizei atlikti buvo panaudota 2013 m. birželio mėnesio gyvulių produktyvumo kontrolės duomenų masyvas. Bendrą duomenų imtį sudarė įrašai. Duomenys apdoroti SQL duomenų bazių valdymo sistemoje LINUX operacinėje aplinkoje. Su SQL užklausų pagalba duomenų bazėje kontroliuojamų karvių duomenys buvo sugrupuoti pagal somatinių ląstelių skaičiaus (SLS) ribas. Viso suformuota 13 grupių. SLS grupėse svyravo nuo 40 tūkst./ml iki 5010 tūkst./ml (1 lentelė). 1 lentelė. Duomenų masyvo situacijos analizei atlikti struktūra Grupės nr. SLS tūkst./ml Karvių sk Viso įrašų: Praktiniams tyrimams atlikti, pasirinktame ūkyje, kuris dalyvauja gyvulių produktyvumo kontrolėje iš 110 karvių vakarinio melžimo metu buvo paimta po du pieno mėginius. Pieno sudėčiai (riebalai, baltymai, laktozė, urėja) ir kokybei (somatinių ląstelių skaičius) įvertinti ištirta 110 mėginių. Pagal įvertintų mėginių duomenis iš kitų 110 mėginių analogų buvo atrinkta 37 pieno mėginiai kazeino tyrimams pamatiniu metodu. Sudarytos 6 grupės pagal SLS ir kiekvienai grupei atrinkta po 6 mėginius, išskyrus pirmą grupę, kurioje ištirta 7 mėginiai (2 lentelė). ~ 20 ~

21 2 lentelė. SLS ribos Grupės nr. SLS tūkst/ml 1 < > 2.2. Mėginių ėmimas tyrimams Pasirinktoje pieno fermoje melžimas vyko du kartus per dieną 5:00 ir 17:00 val. Žalio pieno mėginiai tyrimams buvo imti vakarinio melžimo metu po 50 ml pagal pieno mėginių ėmimo taisykles (LST EN ISO 707:1999+P:2003 Pienas ir pieno produktai. Mėginių ėmimo taisyklės). Pieno sudėties ir kokybės tyrimai VĮ Pieno tyrimai laboratorijoje buvo atliekami 110 pieno mėginių, o jų analogai laikomi 2-4 C temperatūroje 2-3 dienas kazeino tyrimams pamatiniu metodu. Pieno sudėties ir kokybės įvertinimui mėginiai buvo surenkami iš specialios taros, kurioje surenkamas maišytas viso melžimo nustatytas pieno kiekis iš individualios karvės. Žalio pieno mėginiai konservuojami Sedupolo tabletėmis (kiekvienoje tabletėje yra 8 mg bronopolo ir 0,3 mg natamicino). Įdėjus konservanto, pienas gerai išmaišytas. Konservuoti pieno mėginiai specialiuose konteineriuose esant ne aukštesnei kaip 6-8 C temperatūrai dviejų valandų bėgyje pristatyti tyrimams į laboratoriją. 2.3.Tyrimų metodika Pieno sudėties tyrimai atlikti Valstybės įmonėje Pieno tyrimai, kur LactoScope FTIR (FT ; Delta Instruments, Olandija) įranga, infraraudonosios spinduliuotės vidurinės srities spindulių absorbsijos metodu, buvo tiriami karvių kontrolinio melžimo pieno mėginiai ir duomenų bazėje fiksuojami pieno sudėties duomenys. ~ 21 ~

22 Šis metodas buvo taikytas nustatyti riebalų, baltymų ir laktozės kiekį žaliame piene matuokliu Lactoscope, remiantis kiekvieno tiriamojo komponento specifinio vidutinių infraraudonųjų spindulių bangų ilgio absorbcijos matavimu (LST ISO 9622:2000). Riebalų, baltymų, laktozės ir kazeino kiekis piene išreiškiamas g /100 g pieno, o urėjos kiekis mg/ 100 ml (mg%). Somatinių ląstelių skaičius nustatytas tėkmės citometrijos metodu matuokliu Somascope pagal LST EN ISO :2006+AC:2007 Pienas. Somatinių ląstelių skaičiavimas. 2-oji dalis. Fluorooptoelektroninių skaitiklių naudojimo vadovas. Somatinių ląstelių skaičius piene išreiškiamas tūkst.ląst./ml. Pamatiniu metodu kazeino kiekis nustatytas naudojantis patvirtintu tarptautiniu standartu LST EN ISO :2002 skirtu nustatyti azoto kiekį piene. Jei reikia, mėginiai tyrimams atlikti gali būti konservuojami, 0,02 0,06 bronopolu (konservantais Broad Spectrum Microtabs arba Sedupol) Duomenų statistinis apdorojimas Biometrinei duomenų analizei buvo naudoti R statistinis paketas bei SQL duomenų bazių valdymo sistema. Variacinei statistikai išreikšti, buvo skaičiuojami karvių pieno sudėties rodiklių ir somatinių ląstelių skaičiaus aritmetiniai vidurkiai ( x ), vidutiniai kvadratiniai nuokrypiai (sd), įvairavimo koeficientai (Cv) bei nustatytos minimalios ir maksimalios reikšmės. Fenotipinių koreliacijų patikimumai paskaičiuoti naudojant Snedekoro lentelę Tyrimų rezultatai ir apibendrinimas Norint nustatyti kazeino piene kitimą pagal SLS ribas buvo atlikta analizė iš VĮ Pieno tyrimai kontroliuojamų karvių 2013 m. birželio mėn. imties, sudarančios apie 22,6 % visų Lietuvoje kontroliuojamų karvių duomenų. Kaip matome iš 3 lentelės ir 1 pav. duomenų, vidutinis kazeino procentas baltymuose pagal SLS ribas svyravo nuo 79,5 % iki 81,1 %. Šio rodiklio variacija Cv kito nuo 10,61 iki 19,08 %. Pateikta analizė rodo, kad pastebimas tik nežymus kazeino kitimas kontroliuojamų karvių piene pagal SLS ribas, o aukštas SLS skaičius kazeino pokyčiams įtakos neturi. ~ 22 ~

23 3 lentelė. Kazeino pasiskirstymo pagal SLS ribas variaciniai rodikliai Grupė SLS tūkst/ml Karvių sk. x Cas proc. σ Cv mx Cas vid. Cas proc SLS, tūkst./ml 1 pav. Kazeino procento kitimas pagal SLS ribas Atlikus kitų rodiklių analizę, kaip matome iš 4 lentelės ir 2 pav. duomenų, pieno rodiklių kitimui SLS didžiausią įtaką turėjo laktozei, o riebalų, baltymų ir urėjos kiekio neįtakojo. Vidutinis laktozės kiekis pirmoje grupėje, kur SLS svyravo tarp tūkst.ląst/ml buvo nustatytas didžiausias 4,55 %, o mažiausias 4,12 % 13 grupėje, kur SLS buvo ribose tarp tūkst.ląst/ml. Skirtumas tarp šių grupių gana ženklus ir sudaro 10 %. ~ 23 ~

24 4 lentelė. Kitų pieno rodiklių pasiskirstymo pagal SLS ribas variaciniai rodikliai Grupė SLS ribos Riebalų % Baltymų % Laktozės % Urėja mg% x σ Cv x σ Cv x σ Cv x σ Cv R vid. B vid. L vid SLS ribos 2 pav. Kitų pieno rodiklių pasiskirstymas pagal SLS ribas Paskaičiuoti fenotipinės koreliacijos koeficientai tarp SLS ir riebalų, baltymų, kazeino rodo nedidelę teigiamą koreliaciją, su urėja nedidelę neigiamą koreliaciją, o su laktozės kiekiu vidutinę neigiamą koreliaciją t.y. didėjant SLS laktozės kiekis mažėja (5 lentelė). Taip pat paskaičiavome fenotipinę koreliaciją tarp kazeino kiekio ir laktozės kiekio ir nustatėme tarp šių rodiklių nedidelę neigiamą koreliaciją -0,15 (P<0,01). ~ 24 ~

25 5 lentelė. Fenotipinės koreliacijos koeficientai (r p ) tarp SLS ir pieno sudėties rodiklių Riebalų kiekis Baltymų kiekis Laktozės kiekis Urėja mg% Kazeinas % % % % 0,06 0,14-0,28-0,02 0,14 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 P < 0,01 Antrajame etape norėdami išsiaiškinti skirtingų metodų įtaką baltymų ir kazeino kiekio nustatymui 18 mėginių su skirtingu SLS ištyrėme pamatiniu metodu. Kaip kito kazeino procentas išskaičiuotas iš pamatiniu būdu ištirto baltymo priklausomai nuo SLS skaičiaus matome iš 3 pav. duomenų. Kazeino % nuo pamatinio baltymo Prietaisas Pamatinis 3 pav. Pamatiniu metodu ištirto kazeino procento ir rutininiu metodu ištirto kazeino procento kitimas pagal skirtingą SLS Kaip matome iš duomenų kazeino procentas nustatytas pamatiniu metodu buvo 2-5 % didesnis už rutininiu metodu ištirto kazeino procentą kai SLS buvo mažas ir svyravo nuo 33 iki 293 tūkst.ląst/ml., o pradėjo mažėti kai SLS buvo didelis (nuo 2203 tūkst.ląst/ml) ir buvo mažesnis 4 5 %. ~ 25 ~

26 tūkst./ml SLS Kazeino % Procentai SLS Kazeino % Linear (Kazeino %) y = x R 2 = Mėginiai 70 4 pav. Kazeino procento ištirto pamatiniu metodu kitimas priklausomai nuo SLS (18 mėginių) 4 pav. gauti rezultatai įvertinti mažiausių kvadratų metodu, rodiklių kitimą aproksimavus į tiesę. Kaip rodo mūsų atlikti tyrimai, kas atitinka ir literatūros duomenis, pastebimas kazeino procento mažėjimas -0,27 % didėjant SLS po 80 tūkst.ląst/ml, bet tik tada kai tyrimai atlikti pamatiniu LST EN ISO :2002 metodu. Gauti duomenys yra statistiškai reikšmingi, nes nustatytas R 2 yra ne mažiau nei 0,25. Ištyrus 19 papildomų pieno mėginių pamatiniu metodu ir įvertinus kazeino kiekio kitimą priklausomą nuo somatinių ląstelių skaičiaus reikšmingo skirtumo nuo pirmo tyrimo nerasta (5 pav). SLS Kazeino % Linear (Kazeino %) y = x R 2 = pav. Kazeino procento ištirto pamatiniu metodu kitimas priklausomai nuo SLS (37 mėginiai) ~ 26 ~

27 2.6. Išvados metų ataskaitoje išanalizuoti moksliniai literatūriniai duomenys, įvertinant kazeino kiekio kitimo priklausomybę nuo somatinių ląstelių skaičiaus, pieno sudedamųjų dalių (riebalų, baltymų, laktozės, urėjos) ir kitų veiksnių (karvių amžiaus, veislės, laktacijos laikotarpio, šėrimo, pieno liaukos sveikatos būklės, laikymo sąlygų ir kt.); 2. Ištyrus pieno mėginius Lactoscope matuokliu pagal standartą LST ISO 9622:2000, aukštas somatinių ląstelių skaičius kazeino pokyčiams įtakos neturėjo; 3. Rezultatus įvertinus mažiausių kvadratų metodu ir rodiklių kitimą aproksimavus į tiesę, pastebimas kazeino procento mažėjimas -0,27 % didėjant SLS virš 80 tūkst.ląst/ml, bet tik tada kai tyrimai atlikti pamatiniu LST EN ISO :2002 metodu. 4. Didžiausia SLS įtaka nustatyta laktozei, o riebalų, baltymų ir urėjos kiekio neįtakojo. Vidutinis laktozės kiekis, kai SLS svyravo tarp tūkst.ląst/ml, buvo nustatytas didžiausias 4,55 %, o mažiausias 4,12 %, kai SLS buvo ribose tarp tūkst.ląst/ml 5. Paskaičiavus fenotipinės koreliacijos koeficientą tarp SLS ir laktozės nustatyta vidutinė neigiama koreliacija (-0,28; P < 0,01) t.y. didėjant SLS laktozės kiekis mažėja. 6. Įvertinus skirtingų metodų įtaką baltymų ir kazeino kiekio nustatymui, kazeino procentas nustatytas pamatiniu metodu 2-5 % buvo didesnis už rutininiu metodu ištirto kazeino procentą, kai SLS buvo mažas ir svyravo nuo 33 iki 293 tūkst.ląst/ml, o pradėjo mažėti kai SLS buvo didelis (nuo 2203 tūkst.ląst/ml) ir buvo mažesnis 4 5 %. ~ 27 ~

28 metų tyrimai Fizikinių veiksnių įtaka (centrifugavimo ir homogenizavimo) pieno sudėties ir kokybės rodikliams 3.1. Tyrimų objektas ir metodai Antrų metų projekto bandymams atlikti, pasirinktame ūkyje, iš 100 pieninių karvių, vakarinio melžimo metu, paimta po vieną pieno mėginį. Pieno sudėčiai (riebalai, baltymai, laktozė, urėja, kazeinas) ir kokybei (somatinių ląstelių skaičius) įvertinti ištirta 100 mėginių. Kadangi somatinės ląstelės aptinkamos karvių piene yra procesų, vykstančių pieno liaukoje, indikatorius pieno mėginius savo tyrimuose atrinkome pagal šį rodiklį. Įvertinę mėginių duomenis atrinkome 10 karvių, kurių piene nustatytas aukštas somatinių ląstelių skaičius pagal kurį sprendėme ar karvės serga mastitu. Vakarinio melžimo metu iš atrinktų karvių paimta po 500 ml pieno ekperimentiniam bandymui atlikti. Pieno mėginiuose ištirti pieno sudėties ir kokybės rodikliai. Įvertinus gautus duomenis atrinkti 6 pieno mėginiai, kurių somatinių ląstelių skaičius didesnis nei 400 tūkst./ml. Pirmame bandyme tyrėme, santykinės išcentrinės jėgos įtaka pieno sudėties komponentams. Pieno mėginai (po 50 ml) nucentrifuguoti veikiant išcentrinės jėgos 3000 apsukų skaičiui, 10 minučių laiko intervalu, prie 10 C temperatūros. Po centrifugavimo pieno mėginiai susisluoksniuodavo į tris fazes: riebalų paviršiaus, lieso pieno ir nuosėdų. Nucentrifuguoti mėginiai sukratyti purtyklės pagalba ir pristatyti į laboratoriją pieno baltymų, riebalų, laktozės, kazeino ir somatinių ląstelių skaičiaus tyrimams infraraudonųjų spindulių analizės metodu. Tyrimo duomenų patikslinimui somatinių ląstelių skaičius ištirtas dar ir pamatiniu mikroskopiniu metodu. Kontrolei naudoti natūralaus pieno necentrifuguoti ir nehomogenizuoti mėginiai (žr.1 pav.). Antrame etape norėdami išsiaiškinti mechaninio apdorojimo įtaką pieno sudėčiai atlikome sekančius bandymus. Duomenų bazėje pasirinkome melžiamų karvių ūkį ir pagal gyvulių produktyvumo kontrolės duomenis atrinkome 10 karvių, kurių piene nustatytas somatinių ląstelių skaičius didesnis nei 400 tūkst./ml. Vakarinio melžimo metu iš atrinktų karvių paimta po 500 ml pieno ekperimentiniams bandymams atlikti. Pieno mėginiuose ištirti pieno sudėties ir kokybės rodikliai. Pagal gautus duomenis atrinktos 6 karvės, kurių pieno mėginiuose nustatytas somatinių ląstelių skaičius didesnis nei 900 tūkst./ml. Įprastinių tyrimų metodų tikslumo užtikrinimui atliktas pamatinis kazeino tyrimas ir šie mėginiai fiksuoti kaip kontroliniai. Norėdami ištirti santykinės išcentrinės jėgos įtaką pieno sudėties ir kokybės komponentams, pasirinktus mėginius nucentrifugavome. Mėginių centrifugavimui pasirinktas skirtingas apsukų skaičius (RPM- ~ 28 ~

29 Revolutions per minute) ir 4500 (aps./min), 10 minučių laiko intervalu, prie 10 C temperatūros. Po centrifugavimo pieno mėginiai susisluoksniuodavo į tris fazes: riebalų paviršiaus, lieso pieno ir nuosėdų. Nucentrifuguoti mėginiai sukratyti purtyklės pagalba ir pristatyti į laboratoriją pieno baltymų, riebalų, laktozės, urėjos, kazeino ir somatinių ląstelių skaičiaus tyrimams atlikti. Kontrolei naudotas necentrifuguotas pieno mėginys. Pieno mechaninis apdorojimas atliktas homogenizuojant atrinktus karvių mėginius. Mėginių homogenizavimui pasirinktas 3500 ir apsukų skaičius per minutę, kambario temperatūroje. Homogenizuoti mėginiai pristatyti į laboratoriją pieno sudėties ir kokybės tyrimams atlikti. ~ 29 ~

30 Tyrimai atlikti pagal 1 paveiksle pateiktą schemą. Bandomųjų karvių atrinkimas 1 bandymas Pieno sudėties ir kokybės tyrimas, n=100 2 bandymas Karvių atranka pagal ūkio kontrolės duomenis Kontroliniai natūralaus pieno mėginiai kuriuose SLS > 400 tūkst./ml; n=10 Kontroliniai natūralaus pieno mėginiai kuriuose SLS > 900 tūkst./ml; n=10 Kazeino kiekio nustatymas pamatiniu metodu EKSPERIMENTINIAI TYRIMAI PM Centrifugavimas 3000 rpm 10 min 10 C; n=6 PM sudėties (R,B,L,U,K)tyrimas infraraudonosios spinduliuotės matuokliu,pm kokybės(sls)tyrim assrauto citometrijos metodu n=6 PM SLS tyrimas pamatiniu mikroskopiniu metodu n=6 PM Centrifugavimas 3000 rpm 10 min 10 C; n=6 PM Centrifugavimas 4500 rpm 10 min 10 C; n=6 PM sudėties (R,B,L,U,K) tyrimas infraraudonosios spinduliuotės matuokliu, PM kokybės (SLS) tyrimas srauto citometrijos metodu n=36 PM Homogenizavimas 3500 rpm/min; n=6 PM Homogenizavimas rpm/min; n=6 Kazeino kiekio nustatymas PM pamatiniu metodu n=12 1 pav. Fizikinių veiksnių įtakos pieno sudėties ir kokybės rodikliams darbų vykdymo schema ~ 30 ~

31 3.2. Tyrimų metodika Žalio pieno mėginiai tyrimams paimti vakarinio melžimo metu pagal pieno mėginių ėmimo taisykles (LST EN ISO 707:1999+P:2003 Pienas ir pieno produktai. Mėginių ėmimo taisyklės). Pieno sudėties ir kokybės tyrimai atlikti acredituotoje Valstybės įmonėje Pieno tyrimai, turinčioje šiuolaikišką rutininę įrangą, įteisintą nustatyta tvarka tirti superkamo pieno sudėties ir kokybės rodiklius. Rutininių pieno sudėties ir kokybės nustatymo metodų tikslumas laboratorijoje turi būti užtikrintas pamatiniais fizikiniais, cheminiais ir mikrobiologiniais metodais, paskelbtais tarptautiniuose standartuose. Riebalų, baltymų, laktozės kiekis ir somatinių ląstelių skaičius tiriami iš to paties pieno mėginio. Prieš tyrimą pieno mėginiai pašildomi vandens vonelėje iki 40 o C ir pavartomi, kad vienodai pasiskirstytų riebalai. Riebalų, baltymų ir laktozės kiekiai nustatomi rutininiu metodu infraraudonųjų spindulių prietaisu Lactoscopu LactoScope FTIR (FT ; Delta Instruments, Olandija). Tiriant matuojama kiekvieno komponento (riebalų, baltymų, laktozės) vidutinių infraraudonųjų spindulių specifinio bangų ilgio absorbcija. Pagal sugertos energijos kiekį ir yra skaičiuojamas šių pieno sudedamųjų dalių kiekis (LST ISO 9622:2000). Somatinės ląstelės tiriamos rutininiu metodu pramoniniu skaitikliu-matuokliu Somaskopu Somascope, kuris dirba fluorooptoelektroniniu metodu pagal LST EN ISO :2006+AC:2007 Pienas. Somatinių ląstelių skaičiavimas. 2-oji dalis. Fluorooptoelektroninių skaitiklių naudojimo vadovas. Tiriamas pienas pirmiausiai sumaišomas su dažančiu tirpalu. Šis mišinys patenka į prietaiso dalį - kiuvetę, kuri apšviečiama specialia ultravioletine lempa. Kiekviena nudažyta ląstelė švyti, o speciali kompiuterio programa suregistruoja gautus signalus ir taip suskaičiuoja somatines ląsteles. Įprastinių tyrimų metodų tikslumo užtikrinimui atliktas pamatinis kazeino tyrimas. Baltymų (kazeino) kiekis nustatytas Kjeldalio metodu. Metodo esmė - Kazeininio azoto kiekis nustatomas netiesioginiu pamatiniu metodu. Kazeininis ir nekazeininis azoto kiekis tiriamojo pieno mėginyje nustatomas pagal LST EN ISO :2014, išskyrus 9.1 punktą. Kazeinas nusodinamas į to paties pieno atskirą tiriamąjį mėginį pridedant acto rūgšties ir natrio acetato tirpalus. Nusodintas kazeinas nufiltruojamas, todėl filtrate lieka nekazeininis azotas. Azoto kiekis filtrate yra nustatomas pagal procedūrą, aprašytą standarte LST EN ISO :2014, išskyrus 9.1 punktą. Kazeininis azotas apskaičiuojamas iš bendro azoto kiekio atėmus gautą nekazeininį azoto kiekį piene. Norminės ~ 31 ~

32 nuorodos: ISO Milk Determination of casein-nitrogen content Part 1: Indirect method (Reference method). LST EN ISO :2014 Pienas ir pieno gaminiai. Azoto kiekio nustatymas. 1 dalis. Kjeldalio principas ir žalio baltymo skaičiavimas. Įprastinių tyrimų metodų tikslumo užtikrinimui atliktas somatinių ląstelių skaičiaus tyrimas pamatiniu mikroskopiniu metodu pagal procedūrą, aprašytą standarte LST EN ISO :2008/AC:2009. Mechaninis pieno apdorojimas atliktas centrifuga Falcon 6/300 (MSE (UK) Limited, United Kingdom) ir homogenizatoriumi IKA T18 basic (IKA ultra-turrax, Germany). Centrifugavimas ardo somatinių ląstelių struktūrą išcentrinės jėgos principu, o homogenizacija smulkina ir sutrina ląsteles ir audinius rotoriaus ir statoriaus pagalba. Tyrimų rezultatai ir statistiniai duomenys apskaičiuoti naudojant komiuterinę programą Microsoft Excel Skirtumams įvertinti naudotas Stjudento t-testas. Duomenys buvo laikomi statistiškai patikimi, kai p < 0, Tyrimų rezultatai ir apibendrinimas Manoma, kad pienas gali būti falsifikuojamas jį apdorojant išcentrinės jėgos įrengimais, norint pagerinti kokybę ir kad atitiktų superkamo pieno reikalavimus. Iškelta hipotezė, kad nucentrifugavus žalią pieną galima sumažinti somatinių ląstelių skaičių. Norėdami išsiaiškinti santykinės išcentrinės jėgos įtaką pieno sudėties ir kokybės komponentams pirmame ekperimente pieno mėginius nucentrifugavome 3000 aps./min, 10 minučių laiko intervalu, prie 10 C temperatūros. Pagal gautus rezultatus (1 pav.) matome, kad somatinių ląstelių skaičius po cenrifugavimo vidutiniškai sumažėjo 23 proc. (ribose nuo 5,6 iki 45,0 proc.). Tai rodo, kad centrifugavimas turi didelės įtakos somatinių ląstelių skaičiaus sumažėjimui, nes 2 ir 6 mėginiuose SLS sumažėjo iki 45 proc. ~ 32 ~

33 Proc. Prieš centrifugavimą Po centrifugavimo Mėginiai 1 pav. Somatinių ląstelių skaičiaus kitimas procentais atlikus cenrifugavimą Įprastinių tyrimų metodų tikslumo užtikrinimui atliktas somatinių ląstelių skaičiaus tyrimas pamatiniu mikroskopiniu metodu. 1 Lentelė. Somatinių ląstelių skaičiaus duomenys taikant rutininį ir pamatinį metodus Būsena Mėg. SLS tūkst./ml SLS tūkst./ml Skirtumas Prieš centrifugavimą Po centrifugavimo ~ 33 ~

34 Prieš centrifugavimą Po centrifugavimo Rutininis Pamatinis Skirtumas tarp tyrimo metodų 2 pav. Somatinių ląstelių skaičiaus skirtumas atlikus tyrimus rutininiu - fluorooptoelektroniniu ir pamatiniu - mikroskopiniu metodais Ištyrus pieno mėginius prieš cenrifugavimą rutininiu ir pamatiniu metodais ir įvertinus rezultatus (1 lentelė, 2 pav.), ženklaus somatinių ląstelių skaičiaus skirtumų tarp metodų nenustatyta (ribose nuo -12 iki 46 tūkst.ląst./ml). Pieno tyrimų duomenys po centrifugavimo parodė didesnius somatinių ląstelių skaičiaus skirtumus (ribose nuo -154 iki 236 tūkst./ml). Tai lėmė mechaninio apdorojimo (centrifugavimo) metu dalinai suardyta somatinių ląstelių branduolio struktūra. Atlikus pieno mėginių centrifugavimą ir pagal gautus rezultatus nustačius, kad somatinių ląstelių skaičius nesumažėja iki žalio pieno supirkimo kokybės reikalavimų (SLS < 400 tūkst./ml), kitame ekperimentų etape pasirinkome keturis mechaninio apdorojimo variantus: mėginių apdorojimas centrifūguojant 3000 ir 4500 (aps./min), 10 minučių laiko intervalu, prie 10 C temperatūros ir homogenizuojant 3500 ir apsukų skaičiui per minutę, kambario temperatūroje. ~ 34 ~

35 Proc Mėginiai Prieš C ir H C 3000 C 4500 H 3500 H pav. Somatinių ląstelių skaičiaus kitimas procentais po mechaninio apdorojimo C - centrifugavimas; H - homogenizavimas; duomenų patikimumas tarp skirtingų mechaninio apdorojimo būdų yra p < 0,05. Pagal tyrimo rezultatus (3 pav.) galime teigti, kad pieną homogenizuojant 3500 aps./min somatinių ląstelių skaičius nekito (vidutiniškai 5 proc.). Tačiau homogenizavimo apsukas padidinus iki aps./min, somatinių ląstelių skaičius žymiai pakito, t.y. sumažėjo vidutiniškai 79,8 procentais (ribose nuo 59,4 iki 88 proc.). Pieno mėginius nucentrifugavus prie skirtingų apsukų, somatinių ląstelių skaičiaus sumažėjimas buvo panašus (vidutiniškai 35,73 procentais). Vertinant šio tyrimo rezultatus galima teigti, kad somatinių ląstelių skaičiaus kintamumas priklauso nuo pieno mechaninio apdorojimo būdo ir centrifugos, homogenizatoriaus apsukų skaičiaus. Po centrifugavimo ir homogenizavimo nustatėme, kad mechaninis pieno apdorojimas pieno sudėties rodiklių kiekiui įtakos neturėjo, p > 0,05 (4 pav.). ~ 35 ~

36 Prieš C ir H C 3000 C 4500 H 3500 H Prieš C ir H C 3000 C 4500 H 3500 H Prieš C ir H C 3000 C 4500 H 3500 H Prieš C ir H C 3000 C 4500 H 3500 H Prieš C ir H C 3000 C 4500 H 3500 H Prieš C ir H C 3000 C 4500 H 3500 H Proc. Riebalai Baltymai Laktozė Mėginiai prie skirtingo mechaninio apdorojimo 4 pav. Pieno sudėties rodiklių (riebalų, baltymų, laktozės) kitimas apdorojant skirtingais mechanininiais būdais Rutininiu metodu ištirtų mėginių rezultatai (2 lentelė, 5 pav.) parodė, kad mechaninis pieno apdorojimas kazeino kiekio kitimui įtakos neturėjo. Tačiau homogenizuotame (24000 apsukų per minutę) piene nustatyta pieno supirkimo taisyklėse (PST) reikalaujama somatinių ląstelių skaičiaus riba (< 400 tūkst./ml)(3 lentelė). 2 lentelė. Mechninio apdorojimo įtaka kazeinui (proc.) taikant rutininį metodą Prieš C ir H C 3000 C 4500 H 3500 H ~ 36 ~

37 Proc. tūkst./ml Kazeinas proc. SLS tūkst./ml Prieš C ir H C 3000 C 4500 H 3500 H pav. Mechaninio apdorojimo įtaka kazeino kiekiui ir SLS piene C - centrifugavimas; H homogenizavimas 3 lentelė. Mechninio apdorojimo įtaka SLS (tūkst./ml) taikant rutininį metodą Prieš C ir H C 3000 C 4500 H 3500 H Pagal 6 paveikslo duomenis matome, kad kazeino kiekis po mechaninio pieno apdorojimo, ištirtas pamatiniu metodu, vidutiniškai 20 proc. mažesnis, nei kazeino kiekis ištirtas rutininiu metodu. Tai parodo tikrąjį kazeino kiekį esant aukštam somatinių ląstelių skaičiui. Kazeino kiekis piene nustatytas rutininiu metodu yra išskaičiuojamas iš baltymų procento: 20 proc. sudaro išrūgų baltymai, o 80 proc. kazeininiai baltymai. Todėl pokyčio negalima pastebėti. Jeigu pienas apdorojamas mechaniniu būdu, apie tikrąjį kazeino kiekį galima spręsti jį ištyrus pamatiniu metodu. ~ 37 ~

38 Kazeinas proc. SLS tūkst./ml SLS Kazeinas Pamatinis Kazeinas Rutininis Prieš C ir H Cenrifuga 3000 Cenrifuga 4500 Homog 3500 Homog Prieš C ir H Cenrifuga 3000 Cenrifuga 4500 Homog 3500 Homog pav. Mechninio apdorojimo įtaka kazeino kiekiui ir SLS piene taikant rutininį ir pamatinį metodus 3.4. Išvados 1) Įvertinus pieno mėginių rezultatus po skirtingų centrifugavimo apsukų, somatinių ląstelių skaičius sumažėjo vidutiniškai 36 %, o po homogenizavimo vidutiniškai 80 %. Pieno apdorojimas homogenizuojant aps./min ženkliai mažina somatinių ląstelių skaičių. 2) Kazeino kiekis po mechaninio pieno apdorojimo, ištirtas pamatiniu metodu, vidutiniškai 20 % mažesnis, nei kazeino kiekis ištirtas rutininiu metodu. Tai parodo, kad rutininiu metodu kazeino kiekis procentais yra išskaičiuojamas neįvertinant SLS. 3) Įvertinus pieno mėginių rezultatus po skirtingų mechaninių apdorojimo būdų pieno sudėties rodiklių (riebalų, baltymų, laktozės) kiekio pakitimų nerasta. ~ 38 ~

39 4. Rekomendacijos Literatūros duomenimis kazeino/baltymų santykį labai įtakoja somatinių ląstelių kiekis piene. Somatinių ląstelių skaičiui padaugėjus iki tūkst/ml kinta baltymų proporcijos t.y. mažėja kazeino daugėja bendrųjų ir išrūgų baltymų koncentracija piene (Barbano et al. 1991; Coulon et al. 1998; Tripaldi et al., 2003). Padaugėjus somatinių ląstelių skaičiui didėja fermento plazmino aktyvumas kuris skaldo kazeiną. Todėl naudojantis gyvulių produktyvumo kontrolės duomenimis ir nustačius, kad bandos somatinių ląstelių skaičiaus vidurkis > 800 tūkst./ml., tačiau atsiskaitymo tikslais pieno mėginių tyrimų duomenys rodo, kad SLS < 400 tūkst./ml galima įtarti, kad norint pagerinti kokybę ir sumažinti somatinių ląstelių skaičių, ūkyje naudojamos mechaninės apdorojimo priemonės pieno falsifikavimui. Kaip rodo tyrimų duomenys rezultatų patikimumą galima patikrinti pieno mėginį, skirtą atsiskaitymo tikslams, papildomai ištiriant pamatiniu kazeino metodu ir rezultatus lyginant su rutininiu metodu ištirtu kazeino kiekiu. ~ 39 ~

40 5. Projekto rezultatų sklaida Dalyvauta mokslinėse konferencijose: 1. Mokslinis pranešimas (posteris) Investigations of the casein level and somatic cells count dependence in cows milk, Musayeva Kristina; Sederevičius Antanas; Beliavska-Aleksiejūnė Danuta. 9th Baltic Conference on Food Science and Technology Food for Consumer Well-Being FOODBALT 2014; Latvijos Žemės ūkio universitetas; 2014-gegužės mėn Tezių knyga: Musayeva Kristina; Sederevičius Antanas; Beliavska-Aleksiejūnė Danuta. Investigations of the Casein Level and Somatic Cells Count Dependence in Cow s Milk. FOODBALT 2014: 9th Baltic Conference on Food Science and Technology "Food for consumer well-being : abstract book: May 8-9, 2014, Jelgava, Latvia / Latvia university of agriculture. Faculty of food technology; Editorial Board: Tatjana Rakcejeva, [et al.]. Editor-in-chief: Evita Straumite. Riga: LLU, Faculty of Food Technology. (Food Chemistry, Analysis and Quality Assessment). ISSN , p. 124, no. P64. Žiūrėti 3 priedą. 2. Mokslinis pranešimas (posteris) Correlations between somatic cell count and cow s milk casein ; Musayeva Kristina; Sederevičius Antanas; Beliavska-Aleksiejūnė Danuta. Tarptautinė mokslinė konferencija "Gyvūnų mityba, sveikata, produkcijos kokybė problemos ir sprendimai"; 2014 rugsėjo 25 d, LSMU veterinarijos akademija, Kaunas. Tezių knyga: Musayeva Kristina; Sederevičius Antanas; Beliavska-Aleksiejūnė Danuta. Correlations between somatic cell count and cow s milk casein. International Scientific Conference Nutrition, Health and Quality of Food of Animal Origin - Challenges and Opportunities, the conference is devoted to the 20th anniversary of Laboratory of Poultry Nutrition and Products Quality: Book of Proceedings: Kaunas, 25 September, Tarptautinė mokslinė konferencija "Gyvūnų mityba, sveikata, produkcijos kokybė problemos ir sprendimai": tezių knyga: 2014 rugsėjo 25 d, Kaunas, skirta Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Paukščių lesalų ir paukštininkystės produktų laboratorijos prie Gyvulininkystės katedros įkūrimo 20-čiui paminėti/lithuanian University of Health Sciences. Veterinary Academy. Hohenheim University, Germany. University of Veterinary Medicine, Vienna, Austria; [Scientific Committee: Rolandas Stankevičius, Antanas Sederevičius, Rainer Mosenthin, Michael A. Grashorn, Qendrim Zebeli, Romas Gružauskas]. Kaunas: Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, (Poster Sessions.). ISBN p Žiūrėti 4 priedą. ~ 40 ~

41 Literatūros šaltiniai 1. Aniulis E., Japertas S., Leiputė K. Karvių pieno kokybės analizė, atsižvelgiant į somatinių ląstelių skaičių. Veterinarija ir zootechnika T. 8 (30). P Auldist, M.J., Johnston, K.A., White, N.J., Fitzsimons, W.P. & Boland, M.J A comparison of the composition, coagulation characteristics and cheese making capacity of milk from Friesian and Jersey dairy cows. Journal of Dairy Research71, Auldist, M.J., Walsh, B.J.& Thomson, N.A Seasonal and lactational influences on bovine milk composition in New Zealand. Journal of Dairy Research 65, Bakutis B. Ekologinio ūkio gyvulininkystė. Kaunas, 2003, P Baltrėnaitė L., Kriauzienė J., Miceikienė I. Ožkų kapa kazeino geno polimorfizmas. Veterinarija ir zootechnika T. 38 (60). P Barbano D.M., Rasmussen R.R., Lynch J.M. Influence of milk somatic cell count and milk age on cheese yield. Journal of Dairy Science Vol.74.P Bastian, E.D., Brown, R.J. & Ernström, C.A Plasmin activity and milk coagulation. Journal of Dairy Science74, Bradley A. and Green M. Use and interpretation of somatic cell count data in dairy cows. Practice, 2005.Vol. 27.P Colin O., Laurent F. & Vignon B Relations between soft cheese yield variations and milk composition or coagulation parameter variations. Lait Vol.72 P Coulon J.B, Hurtaud C., Remond B & Verite R. Factors contributing to variation in the proportion of casein to cows milk true protein: a review of recent INRA experiments. Journal of Dairy Research Vol. 65.P Coulon JB, Pradel P & Verdier I. Effect of forage type on milk yield, chemical composition and clotting properties of milk. Lait Vol.75.P DePeters E.J. and Cant J.P.Nutritional factors influencing the nitrogen composition of bovine milk: a review, J.Dairy Sci., 1992.Vol.75. P Di Stasio L. and Mariani P. The role of protein polymorphism in the genetic improvement of milk production. Zootecnica Nutrizione Animali V. 26. P Erasmus L.J, Hermansen JE & Rulquin H. Nutritional and management factors affecting milk protein content and composition. Bulletin of the International Dairy Federation no V. 366.P Farrell H. M. et al. Nomenclature of the proteins of cows milk: six revision // Journal of Dairy Science Vol. 87. P Fox F. P. et al. Fundamentals of cheese science. Aspen Publishers, Gaithersburg, MD, P Fox F. P. Proteinases in dairy technology. Neth. Milk Dairy J Vol. 35.P Frank O'Mahony. Rural dairy technology. Experiences in Ethiopia. Dairy Technology Unit., Green M. J., Bradley A. J., Medley G.F. and Browne W.J. Cow, farm and herd management factors in the dry period associated with raised somatic cell counts in early lactation. J.Dairy Sci., Vol.91.P Green M. J., Bradley A. J., Newton H. and Browne W. J. Seasonal variation of bulk milk somatic cell counts in UK dairy herds: Investigations of the summer rise. Prev. Vet. Med Vol. 74.P Grosclaude F., Ricordeau G., Martin P., Remeuf F., Vassal L., Bouillon J. (From gene to cheese: the polymorphism of the caprin αs1-casein, its effects and evolution) INRA Productions Animales (7). P ~ 41 ~

42 22. Gudonis A. Pienas ir pieno produktai. Kaunas: Technologija, p. 23. Gudonis A. Pieno ir pieno produktų ekspertizė. Kaunas: Technologija, P Gudonis A. Pieno kokybė. Kaunas, P Haile-Mariam M., Bowman P. J., Goddard M. E. Genetic and environmental relationship among calving interval, survival, persistency of milk yield and somatic cell count in dairy cattle. Livestock Production Science Vol. 80. P Hamletas R., Minkevičius V. Ar pašarai gali nulemti pieno baltymingumą ar riebumą? Mano ūkis Nr. 9. P Hurley W. L. Lactation biology. Departament of Animal Science university of Illinois P Hurtaud C., Rulquin H., Delaite M. & Vérité R. Prediction of cheese yielding efficiency of individual milk of dairy cows. Correlation with coagulation parameters and laboratory curd yield. Annales de Zootechnie V.44.P Japertas S. Stresas ir pieno kokybė. Mano ūkis Nr. 6. P Jukna Č. Galvijininkystė. K. Egalda, P Kitchen B. J. Review of the progress of dairy science. Bovine. mastitis: milk composition chantes related to diagnostic tests. J. Dairy Res Vol. 48.P Korhonen, H. and L. Kaartinen. Changes in the composition of milk induced by mastitis, In: The Bovine Udder and Mastitis, Gum. Jyva. (eds.), Finland, 1995, P: Lawrence R. C., Thomas T. D., Terzaghi B. E. Reviews of the progress of dairy science: cheese starters // Journal of Dairy Research Vol. 43. P Lindmark-Månsson, H., Fondén, R. & Pettersson, H.E Composition of Swedish dairy milk. International Dairy Journal 13, Lucey J. A. & Fox P. F. Rennet coagulation properties of late-lactation milk. Effect of ph adjustment, addition of CaCl#, variation in rennet level and blending with mid-lactation milk. Irish Journal of Agricultural and Food Research Vol.31.P Lukauskas K., A. Sederevičius, S. Urbienė, J. Balsytė. Fermentų ir vitaminų priedų pašaruose įtaka pieno kokybei ir jo savybėms. Veterinarija ir zootechnika T. 31(53). P Mackle T.R., Bryant A.M., Petch S.F., Hill J.P. & Auldist M.J. Nutritional influences on the composition of milk from cows of different protein phenotypes in New Zealand. Journal of Dairy Science 1999.V.82. P Mackle, T.R., Bryant, A.M., Petch, S.F., Hooper, R.J. & Auldist, M. J Variation in the composition of milk protein from pasture-fed dairy cows in late lactation and the effect of grain and silage supplementation. New Zealand Journal of Agricultural Research 42, Malossini F, Bovolenta S, Piras C, Dalla Rosa M & Ventura W. Effect of diet and breed on milk composition and rennet coagulation properties. Annales de Zootechnie.1996.Vol. 45.P Mariani P., Summer A., Anghinetti A. et al. Effect of the α s1 -CN G allele on the percentage distribution of caseins α s1,α s2, β and κ in Italian Brown cows // L' Industria del Latte Vol. 31 (4). P Miceikienė I., Pečiulaitienė N. Genetinis pieno kokybės vertinimas. Kaunas Nr Narkevičius R. Fermentacijos proceso parametrų įtaka pieno baltymų stabilumui. ISSN Maisto chemija ir technologija T. 34. P Ng-Kwai Hang K.F. Genetic polymorphism of milk proteins: relationships with production traits, milk composition and technological properties. Canadian Journal oj'animal Science (supplement). P ~ 42 ~

43 44. Ng-Kwai-Hang K.F. A rapid determination of casein in milk and factors affecting casein proportion in milk.idf Seminar,Ireland, Ng-Kwai-Hang, K. F., C. Dodds, M. J. Boland, and M. J. Auldist The influence of genetic variants of β-lactoglobulin on gelation speed and firmness of rennet curd. Milchwissenshaft 57(Suppl. 5): Ng-Kwai-Hang, K.F. & Grosclaude, F Genetic polymorphism of milk proteins. In Advanced dairy chemistry-1: Proteins. Edited by P.F. Fox & P.L.H. McSweeney. Kluwer academic/plenum Publisher. New York pp. 47. Ng-Kwai-Hang, K.F., Hayes, J. F., Moxley, J.E. & Monardes, H. G. Variability of test-day milk production and composition and relation of somatic cell counts with yield and compositional changes of bovine milk. Journal of Dairy Science Vol. 67.P Ng-Kwai-Hang, K.F., Hayes, J.F., Moxley, J.E. & Monardes, H.G Variation in milk protein concentrations associated with genetic polymorphism and environmental factors. Journal of Dairy Science 70, O'Brien, B., Mehra, R., Connolly, J.F. & Harrington, D Seasonal variation in the composition of Irish manufacturing and retail milks 1. Chemical composition and renneting properties. Irish Journal of Agricultural and Food Research 38, Ostersen S, Foldager J & Hermansen JE. Effects of stage of lactation, milk protein genotype and body condition at calving on protein composition and renneting properties of bovine milk. Journal of Dairy Research V. 64.P Paape M.J., Mehrzad J., Zhao X., Detilleux J., Burvenich Ch.: Defence of the bovine mammary glanda by polimorphonuclear neutrophil leukocytes. J.Mamm. Gland. Biol. Neopl Vol. 7. P Pauliukas K., Šidiškis A. R., Urbonavičius A., Šerėnas K. Juodmargių karvių pieno sudėties ir kokybės rodiklių kaita veikiant laktacijai ir kitiems faktoriams. Veterinarija ir zootechnika T.30 (52). P Pečiulionienė I., Pauliukas K. Superkamo žaliavinio pieno kokybės dinamika ir ją įtakojantys veiksniai Lietuvos Respublikos pieno perdirbimo įmonėse. Magistro darbas. Kaunas P Politis I. and Ng-Kwai-Hang K.F. Effects Of somatic cell count and milk composition on cheese composition and cheese making efficiency. J. Dairy Sci Vol. 71.P Politis I., Ng-Kwai-Hang, Giroux R. N. Environmental Factors Affecting Plasmin Activity in Milk. J Dairy Sci Vol. 72.P Rahali V & Me nard JL. Influence of genetic variants of b-lactoglobilin and k-casein on milk composition and cheese-making capacity. Lait.1991.V. 71.P Raycheva E., Ivanova T., Kipriotis E., Kistanova E. The characteristic of control day milk and its properties in ewes from different breeds in Bulgaria. Biotechnology in Animal husbandry Vol. 23. P Ramanauskas R., Narkevičius R., Urbšienė D. Pieno tinkamumo sūriams gaminti moksliniai ir praktiniai aspektai. Maisto chemija ir technologija T.42.Nr.1.P Remond B., Ollier A. & Miranda G. Milking of cows in late pregnancy: milk production during this period and during the succeeding lactation. Journal of Dairy Research.1992.Vol. 59.P Rezamand P., Hoagland T. A., Moyes K. M., Silbart L. K., Andrew S. M. Energy status, lipid soluble vitamins, and acute phase proteins in periparturient Holstein and Jersey dairy cows with or without subclinical mastitis. J. Dairy Sci V. 90. P Rudejevienė J. Karvių slaptasis mastitas. Kaunas P ~ 43 ~

44 62. Rulquin H., Pisulewski P. M., Verite R. & Guinard J. Milk production and composition as a function of postruminal lysine and methionine supply: a nutrient-response approach. Livestock Production Science Vol. 37.P Rushen J., De Passille A.M.B., and Munksgaard L. Fear of People by Cows and Effects on Milk Yield, Behavior, and Heart Rate at Milking J Dairy Sci.Vol.82.P Saeman A. I., Verdi R. J., Galton D. M. and Barbano D. M. Effects of mastitis on proteolytic activity in bovine milk. I. Dairy Sci Vol.71.P Saulius Savickis, pranešimas, pieno komiteto posėdis, Schaar, J Effects of κ-casein genetic variants and lactation number on the renneting properties of individual milks. Journal of Dairy Research 51, Schaar, J Plasmin activity and proteose-peptone content of individual milks. Journal of Dairy Research 52, Sheldrake R.F., Hoare R.J.T., McGregor G.D. Lactation stage, parity and infection affecting somatic cells, electrical conductivity and serum albumin in milk. J. Dairy Sci Vol. 66.P Skrypek R., Wójtowski J., Fahr R.D. Factors affecting somatic cell count in cow bulk tank milk- a case study from Poland. J. Vet. Med Vol.51. P Staniškienė B., Šernienė L., Šiugždaitė J. Pieno ir jo produktų kokybės įvertinimas. Kaunas: Naujasis lankas P Strolys K. Pieno baltymingumas ir selekcija. Žemės ūkis Nr. 10. P Tripaldi C., S., Terramoccia S., Bartocci M., Angelucci and V. Danese. The effects of the somatic cell count on yield, composition and coagulation properties of mediterranean buffalo milk. Asian-Aust. J. Anim. Sci Vol.16.P Urbšienė Danguolė. Somatinių ląstelių skaičių (SLS) piene lemiantys veiksniai. Internetinė prieiga: Žiūrėta 2013 m. rugsėjo 11 d. 74. Vaitkus V., Vaitkienė A., Petruškevičius P., Urbšienė L. Žalio karvių pieno sudėties ir kokybės tyrimai (apžvalga). ISSN Maisto chemija ir technologija T. 35. P Verdi R J., Barbano D. M., DellaValle M. E. and Senyk G. F. Variabjlity in true protein. casein, nonprotein nitrogen, and proteolysis in high and low somatic cell milks. J. Dairy Sci Vol. 70.P Verdi, R.J. & Barbano, D.M Preliminary investigation of the properties of somatic cell proteases. Journal of Dairy Science 71, Walstra P., Geurts T. J., Noomen A., Jellema A., Van Boekel M. A. J. S. Dairy Technology. New York Basel, P Zootechniko žinynas. Kaunas P Žakas A. Genetinių ir aplinkos veiksnių įtaka karvių pieno kokybei pagal somatinių ląstelių skaičių. Daktaro disertacija. Biomedicininiai mokslai, zootechnika P Žitny J., Bujko J., Trakovicka A., Strapakova E., Tothova K. Evalutio of milk produktion of deiry cows of the slovak spotted breed according to selection for longevity and genetic variants of polymorphic proteins in milk. International Dairy Journal P Горбатовa К. К. Биоxимия молока и молочных продуктов. Cанкт-Петербург гиорд, S Гудков А. В. Сыроделие: технологические, биологические и физико-химические аспекты. М.: ДеЛи принт, с. 83. Кузнецов В. В., Шилер Г. Г. Справочник технолога молочного производства. Технология и рецептуры. Том 3, Сыры. Cанкт-Петербург гиорд, S. 103, 210. ~ 44 ~

45 SUDERINTA:...tyrimų priežiūros komisijos pirmininkas 2014 m. mėn...d. ~ 45 ~

46 1 priedas Proteinai g/l Bendrieji baltymai Fermentai Kazeinai (76-86%) α kazeinas (60%) β laktoglobulinai (7-12%) Išrūgų proteinai (14-24%) α s kazeinas 45-55% κ - kazeinas 8-15% β kazeinas 25-35% γ kazeinas 3-7% α laktoalbuminai (2-5%) Imunoglobulinai ( %) Kraujo serumo albuminai ( %) Protezo - peptonai (2-6%) Pieno baltymų klasifikacija (Frank O'Mahony,1988) Internetinė prieiga: žiūrėta 2013 m. rugsėjo 20d. ~ 46 ~

47 2 priedas Mastito poveikis pieno sudėčiai (Korhonen H. and Kaartinen L.,1995) Komponentai Pagrindiniai komponentai Normalus kiekis Pasikeitimo kryptis* Riebalai% Proteinai% Laktozė% Laisvosios riebiosios rūgštys (meqv/l) Proteinų frakcijos(mg/ml) Kazeinai(mg/ml) Bendras kazeinas Išrūgų baltymai α s1 -kazeinas β-kazeinas κ-kazeinas Išrūgų baltymai(mg/ml) β-laktoglobulinas α-laktoalbuminas Imunoglobulinai Serumo albuminas Laktoferinas Mineralinės medžiagos(μg/ml) Natris Fermentai Chloridas Kalis Kalcis Magnis Fosforas Geležis Varis Cinkas Katalazė(μmol O2/min/ml) Laktatdehidrogenazė (mu/ ml) ~ 47 ~

48 Laktoperoksidazė(μg/ml) Lipazė(μg/ml) Lizocimas(μg/ml) Plazminas(U/ml) Ornitinodekarboksilazė(U/ml) N-acetyl-β-Dglukosaminidase(NAGase) Vitaminai(μg/ml) vit.a /- B1(tiaminas) B2(riboflavinas) vit.c *Paaiškinimas: + = 10 x padaugėja; ++ = x padaugėja; +++ = x padaugėja; ++++ = >1000 x padaugėja; - = 10 % sumažėja; - - = % sumažėja; = % sumažėja; = >75 % sumažėja. ~ 48 ~

49 INVESTIGATIONS OF THE CASEIN LEVEL AND SOMATIC CELLS COUNT DEPENDENCE IN COW S MILK 3 priedas Kristina Musayeva, Antanas Sederevičius, Danuta Beliavska-Aleksiejūnė Department of Anatomy and Physiology, Faculty of Veterinary Medicine, Veterinary Academy Lithuanian University of Health Science, Tilzes st. 18, LT Kaunas, Lithuania The aim of this study was to investigate the impact of somatic cells count (SCC) on the content of milk casein as a percentage of true protein (C%TP) and to compare the casein level obtained with two different methods. Data array of the livestock control was used for situation analysis for the estimation of C%TP variation by SCC limits in milk. Milk samples (MS) were tested by infrared spectrophotometry. Total data sample record of the livestock control in Lithuania consisted of 22.6%. MS were classified according to the SCC level into 13 groups where SCC vary from cells/ml to cells/ml. The average percentage of C%TP ranged %. The present analysis shows only slight notable changes in casein of controlled cow s milk by somatic cells count limits. Eighteen sorted dairy samples have been investigated for C%TP ratio in milk with reference (Kjeldahl) and infrared spectrophotometry methods. C%TP estimated with the reference method, was by 2-5 % higher than casein percentage tested with the infrared spectrophotometry method when SCC was low and ranged from 33 to cell/ml. Though, when SCC was high and ranged from cell/ml to cell/ml casein percentage decreased to 5%, in comparison to casein level estimated by the infrared spectrophotometry method. Evaluated results obtained by the least squares method, linear approximation of variation indicators presented noticeable decline in casein percent , when SCC was increasing by cell/ml, but only when the studies was made with reference LST EN ISO :2002 method. Results where statistically significant when R 2 (R square) was not less than Key words: milk casein, somatic cell count, reference method, cow ~ 49 ~

50 4 priedas CORRELATIONS BETWEEN SOMATIC CELL COUNT AND COW S MILK CASEIN Kristina Musayeva, Antanas Sederevičius, Danuta Beliavska-Aleksiejūnė Department of Anatomy and Physiology, Faculty of Veterinary Medicine, Veterinary Academy Lithuanian University of Health Science, Tilzes st. 18, LT Kaunas, Lithuania INTRODUCTION Proteins are an important component parts in the nutritional value of milk, with liquid milk typically containing around 3.5% protein. Based on relative solubility, dairy proteins are divided into caseins (approximately 80 %) and whey proteins (20 %) (Walstra et al., 2006). Milk protein composition has long been a subject of interest for worldwide dairy researchers, although examples of practical implementations are scarce. Lack of simple routine analyses to measure casein content in milk, is one major factor limiting progress in this direction (Elin Hallén, 2008; Valentina Bonfatti, 2010). Milk caseins are fundamental in cheese making process because they form the gel network that entraps the other constituents of cheese (Ng-Kwai-Hang, 2002; Valentina Bonfatti, 2010). Highquality cheese can be made from milk with a protein concentration not less than 3.2 % and caseins ration not less than 2.5 % (Ramanauskas et al., 2008). In countries where large quantities of milk are processed to make cheese, it is crucial to assess the range of the casein proportion in milk true protein and the factors causing it to vary (Coulon et al., 1998). The health of the udder can have a profound effect on the quality and processing characteristics of milk. Many milk processing companies worldwide have incorporated somatic cells count (SCC) as a key parameter in schemes which reward producers for producing milk of the highest quality. An elevated SCC usually indicates the presence of mastitis and causes a range of physical, microbiological and chemical changes in the milk (Barbano et al., 1991; Tripaldi et al., 2003; Cunha et al., 2008; Barlowska et al., 2009). In Europe, according to the regulation of the European Parliament and cabinet (EU) No.853/2004 of 29 th April 2004, milk intended for human consumption shoud not contain more than 400,000 somatic cells/ml. This level will minimise the effects of mastitis on product quality, although negative effects on product quality have been reported for milk with a SCC as low as ~ 50 ~

51 100,000 cells/ml. Further, a bulk milk somatic cell count of 400,000 cells/ml indicates that around 40 % of cows in a herd are infected (Barlowska et al., 2009). The main purpose of the present work was to study effect of inflammation process in uder to caseins ratio. We also compared the casein level obtained with two different methods. MATERIALS AND METHODS Data array of the livestock control of 2013 June was used for situation analysis. Total data sample consist of record. On database management system of Linux operating environment were processed SQL Data. Milk samples were classified according to the SCC level into 13 groups where SCC vary from cells/ml to cells/ml. Collection of Milk Samples. The selected herd was participating in animal productivity control program. Overall 110 cows were randomly selected. All animals enrolled in the study were lactating cows of the Holsteinized black and white breed. The milk samples were collected during control evening milking time as total quarter milk from each cow in pairs. After cleaning and disinfection of the teats, 50 ml of milk was aseptically collected from 110 cows in sterile plastic tubes accoording to LST EN ISO 707:1999+P:2003 standard. Samples were kept under refrigeration until arrival to laboratory facilities. As a further step 36 sorted dairy samples have been investigated for casein ratio in milk with reference method (Kjeldahl). The groupings of the milk samples were performed on the basis of SCC. Milk samples were clustered into 6 groups included 6 samples in each group. Methods/technique. For determination of somatic cells count (SCC) milk samples were preserved and analysed with the flow cytometric analysis method using a Somascope cell counter (Foss, 3400 Hillerød, Denmark) accoording to LST EN ISO :2008+AC:2009 microscopic method standard. Milk protein/casein has been estimated by reference Kjeldahl method, which measures the total nitrogen content in milk accoording to LST EN ISO :2002 standard. Statistical Analysis. SQL (Structured Query Language) Data store and R statistical package were used for biometric data analysis. Arithmetic averages ( x ), medium standard deviations (sd), coefficients of variation (Cv), minimum and maximum values were counted of cows milk composition parameters and somatic cell count for variational statistics expression. ~ 51 ~

52 RESULTS In 2013, milk samples were analyzed from livestock of Lithuania. Total data sample record of the livestock control consisted of 22.6 %. MS were tested by infrared spectrophotometry. The average percentage of casein in proteins by somatic cells count limits ranged from 79.5 percent to 81.1 percent are reported in figure 1 and table 1. This variation indicator (Cv) ranged from to percent. The present analysis shows only a slight notable changes in casein of controlled cow s milk by somatic cells count limits. When MS were estimated by infrared spectrophotometry method a high number of SCC did not affect the casein change. Figure 1. Percent changes of casein by somatic cells count limits tested by infrared spectrophotometry method Table 1. Variational indicators of casein distribution by SCC limits SCC No of groups groups (thou/ml) Quantity of cows x Casein proc. σ Cv mx ~ 52 ~

53 To find out the influence of different methods on the amount of casein determination we investigated 18 milk samples by reference (Kjeldahl) method. As presented data in figure 2, we can see change of C%TP depending on the somatic cells count when it was deducted from the reference method. Figure 2. Percent changes of casein by SCC limits tested by reference and routine methods The percentage of casein estimated with the reference (Kjeldahl) method, was 2 5 % higher than casein percentage tested with the routine (infrared spectrophotometry) method when SCC was low and ranged from 33 to 293 thousand/ml. Casein content change was slight in SCC limits from 301 to 1785 thousand/ml. Though, when SCC was high and ranged from 2203 to 5395 thousand/ml casein percentage decreased to 5%, comparing it with casein received by routine method. ~ 53 ~

54 Evaluated results obtained by the least squares method, linear approximation of variation indicators presented in figure 3. As shown in our studies, which are consistent with literature data, it is noticeable decline in casein percent -0.17, when SCC was increasing by cells/ml, but only when the studies was made with reference LST EN ISO :2002 method. Results where statistically significant when R2 was not less than Figure 3. Linear regression model of the effect of somatic cell count on milk casein DISCUSSION Our objective in this investigation was to study effect of inflammation process in uder to protein ratio particularly casein. It has been suggested that a somatic cell count (SCC) in milk higher than cells/ml probably indicates that the cow suffers from udder inflammation (Akers, 2002). High SCC influences milk quality because it is associated with increased proteolytic degradation of caseins (Verdi et al.,1987). At the begining of this study it was hypothesized that the relationship between increasing milk SCC and decreasing casein would be linear. However the data collected in this study did not demonstrate a linear relationship between change in milk SCC and the contents of C%TP. At the first point for situation analysis for the estimation of casein/protein variation by SCC limits in milk we took data array of the livestock control. These milk samples were tested by routine infrared spectrophotometry method. The average percentage of casein as a present of protein on a total nitrogen basis by somatic cells count limits ranged from 79.5 to 81.1 percent and casein concentration from 2.47 to The present analysis shows only a slight notable changes in casein ~ 54 ~