137 Vaistų mišinio UV-spektrofotometrinis tyrimas ūminių apsinuodijimų atvejais Kauno medicinos universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra Raktažodžiai: ultravioletinė spektrofotometrija, amitriptilinas, kodeinas, fluoksetinas. Santrauka. Darbo tikslas. Sukurti amitriptilino, fluoksetino ir kodeino mišinio cheminiotoksikologinio tyrimo metodiką ūminio apsinuodijimo šiuo mišiniu atveju. Rezultatai. Nustatytos amitriptilino, fluoksetino ir kodeino mišinio komponentų identifikavimo bei kiekybinio nustatymo sąlygos ultravioletinės spektrofotometrijos metodu. Eksperimentiškai nustatyta, kad ultravioletinės spektroskopijos metodu galima identifikuoti nuo 0,5 µg/ml amitriptilino, nuo 1,5 µg/ml fluoksetino ir nuo 1,0 µg/ml kodeino. Tiesiogiai mišinio komponentų atskirti negalima, nes medžiagų spektrų smailės dengia viena kitą. Amitriptilino, fluoksetino ir kodeino mišinio kiekybinę sudėtį galima nustatyti ultravioletinės spektrofotometrijos metodu pagal sudarytas kalibracijos kreives, prieš tai mišinio komponentus atskyrus plonasluoksnės chromatografijos metodu. Kiekybinio nustatymo intervalai yra nuo 5 iki 25 µg/ml amitriptilino, nuo 5 iki 30 µg/ml fluoksetino ir nuo iki 300 µg/ml kodeino; metodikos vidutinio rezultato santykinė paklaida neviršija 5 proc., kai pasikliautinasis lygmuo 95 proc. Amitriptilino santykinė paklaida svyruoja nuo 0,66 iki 1,2 proc.; fluoksetino nuo 0,66 iki 1,45 proc.; kodeino nuo 0,33 iki 0,88 proc. Amitriptilino vidutinis kvadratinis nuokrypis - nuo 1,15 iki 2,08 proc.; fluoksetino nuo 1,15 iki 2,52 proc.; kodeino nuo 0,57 iki 1,53 proc. Apskaičiuoti preparatų molinės absorbcijos gebos distiliuotame vandenyje koeficientai. Vaistų mišinio ultravioletinės spektrofotometrijos metodas yra tinkamas identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti amitriptiliną, fluoksetiną ir kodeiną mišinyje, išskirtame iš biologinių skysčių (kraujo arba šlapimo) ūminių apsinuodijimų atvejais. Įvadas Sparčiai augant chemijos ir farmacijos pramonei, nuolat plečiasi įvairių vaistų, pramonės, žemės ūkio ir buitinių chemikalų asortimentas. Apie šeši milijonai įvairiausių cheminių junginių, susikaupusių mus supančioje aplinkoje, turi didelę įtaką žmonių sveikatai. Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis, augantis ūminių apsinuodijimų skaičius užfiksuotas XX a. penktajame dešimtmetyje. Vilniaus toksikologijos centro duomenimis, dažniausiai apsinuodijama CNS slopinančiais vaistais ir alkoholiniais gėrimais (1). Vieni iš dažniau apsinuodijimą sukeliančių psichotropinių preparatų amitriptilinas, kodeinas (2 4). Fluoksetinas vienas naujesnių antidepresantų, vartojamas klinikinėje praktikoje. Esant įvairioms aplinkybėms, pvz., perdozavus, vartojant ilgą laiką arba savižudybės tikslu šie preparatai gali būti netgi mirties priežastis (1). Tokiais atvejais amitriptilinas, fluoksetinas ir kodeinas tampa cheminio-toksikologinio tyrimo objektu. Išanalizavus literatūros šaltinius, nustatyta, kad amitriptilino, fluoksetino ir kodeino mišinio atskirus komponentus galima identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti įvairiais metodais, tačiau metodo, kaip būtų galima atskirti ir identifikuoti šias medžiagas, kuomet jų yra mišinyje, literatūros šaltiniuose nerasta. Šio darbo tikslas sukurti greitą ir patikimą metodiką identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti išskirtus iš biologinių skysčių vaistinius preparatus: amitriptiliną, fluoksetiną ir kodeiną, kai jų esama mišinyje. Tyrimo metodu pasirinkta spektrinė analizė, kuri jau seniai naudojama medžiagų sandarai bei cheminių medžiagų pokyčiams nustatyti. Šio analizės metodo pranašumas yra tas, kad tiriamoji medžiaga nesuardoma, o tyrimo metodikos lengvai modifikuojamos ir automatizuojamos. Be to, spektrine analize galima nustatyti nedidelius medžiagų kiekius netgi pakankamai sudėtingose sistemose (5, 6, 8 12). Tyrimo medžiaga ir metodai Tyrimai buvo atliekami keliais etapais: grynųjų medžiagų absorbcijos maksimumų įvairiuose tirpikliuose nustatymas; kokybinis spektroskopinis mišinio tyrimas, ištraukų iš biologinių skysčių (kraujo ir šlapimo) valymas ir mišinio komponentų atskyrimas, kiekybinis Adresas susirašinėjimui: D. Kazlauskienė, KMU Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra, A. Mickevičiaus 9, 3000 Kaunas. El. paštas: daivakazlauskiene@centras.lt
138 spektrofotometrinis preparatų nustatymas. Darbui naudotas spektrometras Heλios α UNICAM UVA 052802 ; stačiakampė kvarcinio stiklo kiuvetė; kiuvetės absorbuojančiojo sluoksnio storis 1 cm; UV šviesos bangos ilgio intervalas nuo 200 iki 320 nm; bangos ilgio matavimo intervalas 1 nm. Amitriptilino, fluoksetino ir kodeino atskyrimui mišinyje prieš UV spektroskopavimą naudojama mūsų pasiūlyta plonasluoksnės chromatografijos tirpiklių-nešėjų sistema: dietilacetatas-metanolis- koncentruotas amonio hidroksidas (85:10:5) arba cikloheksanas-dietilacetatasdietilaminas (70:15:15), ryškalas Dragendorfo reagentas, modifikuotas pagal Munjė (13). Plonasluoksnės chromatografijos metodui reikalinga įranga: stiklo chromatografinės plokštelės (20 20 cm), stiklo kameros su pritrinamais dangčiais, stiklo kapiliarai, kurių tūris 5 10 µl, bei sorbcinė masė, paruošiama iš 16 g silikagelio LS 5/40 µm (Čekija), 0,64 g gipso (kalcio sulfatas) ir 32 ml distiliuoto vandens vienai plokštelei. Sorbento sluoksnio storis 0,25 mm. Šia sorbcine mase stiklo plokštelės padengiamos specialiu prietaisu ir horizontalioje padėtyje paliekamos džiūti kambario temperatūroje. Prieš naudojimą plokštelės aktyvuojamos kaitinant džiovinimo spintoje 110 o C temperatūroje vieną valandą. Tiriamieji preparatai tirpinti šiuose tirpikliuose: distiliuotame vandenyje, 0,1 N sulfato rūgšties tirpale, 0,1 N natrio hidroksido tirpale, 70 proc. etanolyje ir metanolyje. Pradiniai standartiniai tirpalai buvo gaminami 0,1 mg/ml koncentracijos. Iš pradinių tirpalų, atskiedus juos atitinkamais tirpikliais, prieš pat matavimus buvo gaminami darbiniai tirpalai tokios koncentracijos, kad gautas didžiausias optinis tankis būtų nuo 0,3 iki 0,6 absorbcijos vienetų (optimaliausia absorbavimo amplitudė) (7). Užrašius šio mišinio tirpalų UV šviesos absorbcijos spektrus, matyti, kad medžiagų smailės dengia viena kitą. Komponentų atskyrimui mišinyje naudojamas plonasluoksnės chromatografijos metodas kartu atliekant ištraukos iš biologinių skysčių valymą. Pašalinamos biologinės priemaišos, vaistinės medžiagos išgryninamos ir atskiriamos viena nuo kitos. Ištraukos išvalymas ir mišinio komponentų atskyrimas plonasluoksnės chromatografijos metodu. Ant stiklo chromatografinės plokštelės, padengtos sorbcine mase, 2 cm atstumu nuo apatinio krašto pažymima starto linija. Trichlormetaninė ištrauka iš biologinių skysčių lašinama ant chromatografinės plokštelės 10 cm ilgio (pradedant nuo kairiojo krašto) kuo siauresne juostele. Plokštelė džiovinama, po to lašinama pakartotinė ištraukos porcija. Taip kartojama tol, kol ištrauka baigiasi. Prie dešiniojo plokštelės krašto lašinama po 0,01 ml kontrolinių amitriptilino, fluoksetino ir kodeino metanolinių tirpalų (1 mg/ml). Tirpalų dėmės džiovinamos ore. Plokštelė įstatoma į chromatografavimo kamerą, įsotintą tirpiklių sistemos garų, ir laikoma, kol eliuentas, veikiamas adsorbcijos jėgų, pakils 10 cm nuo starto linijos. Plokštelė džiovinama traukos spintoje. Uždengus kairę plokštelės pusę (10 cm), dešinioji pusė apipurškiama Dragendorfo reagentu. Chromatogramoje išryškėja preparatų dėmės. Pagal išryškintas standartinių tirpalų dėmes ir apskaičiuotus R f koeficientus neryškintoje plokštelės dalyje surandamos zonos, atitinkančios amitriptilino, fluoksetino ir kodeino R f, vadinasi, tose zonose yra pakilusios sorbento sluoksniu bei atsiskyrusios medžiagos. Šios zonos tiksliai apibrėžiamos ir nugrandomos kartu su sorbento sluoksniu nuo chromatografinės plokštelės į atskiras porceliano lėkšteles, užpilama po 15 ml etanolio. Lėkštelių turinys gerai išmaišomas, o skystis nufiltruojamas. Likusios sorbento nuosėdos vėl užpilamos po 15 ml etanolio ir filtruojamos dar du kartus. Surinkti trys (amitriptilino, fluoksetino ir kodeino) etanoliniai filtratai išgarinami iki sausų likučių, kurie tirpinami po 1 ml distiliuoto vandens. Gauti vandeniniai tirpalai pilami į kiuvetes, kurios įstatomos į spektrofotometro matavimo kamerą. Šalia statoma kiuvetė su lyginamuoju tirpalu distiliuotu vandeniu. Matuojamas tirpalų optinis tankis ir nubraižomos amitriptilino, fluoksetino ir kodeino tirpalų ultravioletinės šviesos absorbcijos spektro kreivės. Gautos preparatų vandeninių tirpalų šviesos absorbcijos maksimumų reikšmės lyginamos su standartinių amitriptilino, fluoksetino ir kodeino tirpalų UV šviesos absorbcijos maksimumų reikšmėmis. Rezultatai ir jų aptarimas Užrašius vaistinių medžiagų UV spektrus įvairiuose tirpikliuose, nustatyta, kad amitriptilino UV spektrai turi du šviesos absorbcijos maksimumus neutralioje, rūgščioje aplinkoje ir etilo bei metilo alkoholiuose, kai bangos ilgis 217 220 ir 238 240 nm. Fluoksetino UV šviesos absorbcijos spektrai visuose tirpikliuose neutralioje, rūgščioje terpėje ir etilo bei metilo alkoholiuose turi vieną smailę ties 226 228 nm. Įvairiuose žinynuose bei Europos, Didžiosios Britanijos farmakopėjose rašoma, kad kodeino UV šviesos absorbcijos spektras turi tik vieną jo tapatybę patvirtinančią smailę ties 285 nm, tačiau pirmoji smailė literatūroje taip pat pavaizduota, bet apie ją neužsimenama. Eksperimentų metu nustatyta, kad kodeinas visuose tirpikliuose: neutralioje, rūgščioje, šarminėje terpėse ir etilo bei metilo alkoholiuose turi du UV šviesos absorbcijos maksimumus ties 224 248 ir 284
Vaistų mišinio UV-spektrofotometrinis tyrimas ūminių apsinuodijimų atvejais 139 286 nm. Kadangi pirmasis šviesos absorbcijos maksimumas yra plačiame šviesos bangos ilgio reikšmių intervale (±12 nm), jis nereikšmingas nustatant kodeino tapatybę arba kiekį. Tačiau pirmoji smailė, kuri yra daug didesnė už antrąją, trukdo mišinio analizei, nes uždengia ir fluoksetino, ir amitriptilino šviesos absorbcijos smailes. Nustatyta, kad tirpiklio prigimtis ir terpės ph didesnės įtakos preparatų šviesos absorbcijos maksimumų padėčiai UV spektre neturi. Eksperimentiškai nustatyta, kad UV spektroskopijos metodu galima identifikuoti nuo 0,5 µg/ml amitriptilino, nuo 1,5 µg/ml fluoksetino ir nuo 1,0 µg/ml kodeino. Išmatavus amitriptilino, fluoksetino ir kodeino tirpalų įvairiuose tirpikliuose optinį tankį, galima teigti, kad tiesioginė mišinio tirpalo UV spektrofotometrinė analizė negalima, nes medžiagų UV šviesos absorbcijos maksimumai yra prie mažai nutolusių viena nuo kitos šviesos bangos ilgio reikšmių (nm), todėl smailės dengia viena kitą (pav.). Stengiantis kodeino tirpalo koncentraciją sumažinti tiek, kad antroji smailė būtų optimalios absorbcijos intervale, pirmoji kodeino smailė yra daug didesnė už antrąją ir dengia fluoksetino bei amitriptilino smailes. Be to, amitriptilino ir fluoksetino smailės taip pat dengia viena kitą. Kadangi negalima tiesiogiai UV spektroskopiškai ištirti grynųjų medžiagų mišinio tirpalo kokybinės sudėties, nes medžiagų smailės visuose tirpikliuose dengia viena kitą, tai ir mišinio ištraukų iš biologinių skysčių tiesioginė UV spektroskopinė kokybinė analizė negalima. Norint identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti amitriptiliną, fluoksetiną ir kodeiną mišinyje UV spektrofotometrijos metodu, pirmiausia mišinio komponentus reikia atskirti plonasluoksnės chromatografijos metodu pagal anksčiau aprašytą metodiką. Kiekybinis amitriptilino, fluoksetino ir kodeino nustatymas ultravioletinės spektrofotometrijos metodu. Šiam tyrimui naudota ta pati aparatūra ir tos pačios matavimo sąlygos kaip ir kokybiniam medžiagų nustatymui. Gaminami pradiniai standartiniai amitriptilino, fluoksetino ir kodeino tirpalai distiliuotame vandenyje, kurių koncentracija 0,1 mg/ml. Iš jų prieš pat tyrimą pagaminti darbiniai tirpalai. Išmatuotas amitriptilino, fluoksetino ir kodeino tirpalų optinis tankis, esant tokiems bangos ilgiams, kai tiriamų medžiagų tirpalų šviesos absorbcija maksimali. Po to, žinant optinį tankį, medžiagos kiekį tirpale ir kiuvetės absorbuojančiojo sluoksnio storį, apskaičiuota amitriptilino, fluoksetino ir kodeino molinė absorbcijos geba distiliuotame vandenyje mūsų pasirinktomis sąlygomis. Skaičiavimo tikslumui padidinti buvo matuota kelių skirtingos koncentracijos tirpalų optinis tankis, apskaičiuoti koeficientai ir apskaičiuotas jų vidurkis (1 lentelė). Taip pat atliktas amitriptilino, fluoksetino ir kodeino kiekybinis nustatymas kitu būdu, t. y. sudarant kalibracijos kreives (6). Renkantis tirpiklį, atsižvelgta į tai, kad tirpiklio prigimtis bei terpės ph neturi didesnės įtakos preparatų smailių padėčiai spektruose, todėl buvo pasirinktas distiliuotas vanduo, nes jis yra visiškai saugus, lengvai prieinamas ir pigus. Gaminta keletas skirtingų koncentracijų amitriptilino, fluoksetino ir kodeino tirpalų. Pasirinktas toks koncentracijų intervalas, kad būtų kuo mažiau nukrypstama nuo tiesės, einančios per koordinačių pradžią koordinatėse koncentracija optinis tankis (6). Matavimams pasirinktas tas bangos ilgis, kai, užrašant tiriamų medžiagų UV šviesos absorbcijos spektrus, gautas didžiausias optinis tankis. Amitriptilino tirpalų optinis tankis buvo matuojamas esant 239 nm bangos ilgiui. Amitriptilino tirpalų optinis tankis turi tiesinę priklausomybę nuo koncentracijos ir tenkina Bugero-Lamberto-Bero dėsnio reikalavimus koncentracijų intervale nuo 0,005 iki 0,025 mg/ml amitriptilino. Fluoksetino tirpalų optinis tankis buvo matuojamas esant 227 nm bangos ilgiui. Jis turi tiesinę priklau- Optinis tankis 1,4000 1,2000 1,0000 0,8000 0,6000 0,4000 0,2000 0,0000 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 Bangos ilgis, nm Amitriptilinas a Fluoksetinas f Kodeinas k 1 pav. Amitriptilino, fluoksetino ir kodeino UV spektrai distiliuotame vandenyje
140 1 lentelė. Amitriptilino, fluoksetino ir kodeino molinė absorbcijos geba distiliuotame vandenyje Preparatas Koncentracija, mol/l ελ ελ vid. 1,593 10 5 1,3352 10 4 Amitriptilinas 4,779 10 5 1,4477 10 4 1,4219 10 4 7,964 10 5 1,4829 10 4 1,446 10 5 1,4716 10 4 Fluoksetinas 5,784 10 5 1,2787 10 4 1,3086 10 4 8,676 10 5 1,1755 10 4 3,151 10 5 1,0473 10 3 Kodeinas 6,301 10 5 1,2796 10 3 1,2195 10 3 9,452 10 5 1,3315 10 3 somybę nuo koncentracijos intervale nuo 0,005 iki 0,03 mg/ml fluoksetino. Kodeino tirpalų optinis tankis buvo matuojamas esant 285 nm bangos ilgiui. Jis tenkina Bugero-Lamberto-Bero dėsnio reikalavimus koncentracijų intervale nuo 0,1 iki 0,3 mg/ml kodeino. Statistinis rezultatų įvertinimas. Pagal sudarytus amitriptilino, fluoksetino ir kodeino kalibravimo grafikus nustatytas šių medžiagų kiekis (mg/ml ir proc.) ir palygintas su matavimams paimtos medžiagos kiekiu (2 lentelė). Apskaičiuoti statistiniai metodikos parametrai (3 lentelė). 2 lentelė. Amitriptilino, fluoksetino, kodeino kiekybinis nustatymas UV spektrofotometrijos metodu Preparatas Paimtas kiekis, mg/ml Optinis tankis mg/ml Rasta preparato proc. 0,005 0,1280 0,1292 0,005 0,00505 101 0,1243 0,0048 97 Amitriptilinas 0,015 0,6919 0,7064 0,015 0,0153 102 0,6919 0,015 1,1810 0,025 0,025 1,1971 1,1837 0,0253 0,02506 102 0,2131 0,005 0,005 0,2128 0,2159 0,005 0,0051 102 0,7280 0,0196 98 Fluoksetinas 0,02 0,7396 0,7606 0,02 0,0206 103 1,0551 0,03 0,03 1,0437 1,0609 0,0296 0,0302 98 101 0,3300 0,1 0,1 0,3208 0,097 97 0,3272 0,099 99 0,8063 0,2 Kodeinas 0,2 0,8012 0,1987 99 0,8113 0,2012 101 1,2522 0,2985 99 0,3 1,2585 0,3 1,2518 0,2984 99
Vaistų mišinio UV-spektrofotometrinis tyrimas ūminių apsinuodijimų atvejais 141 3 lentelė. Preparatų kiekybinio nustatymo UV spektrofotometrijos metodu rezultatų statistinis įvertinimas Rasto kiekio vidurkis X Vidutinis Santykinė Pasikliautinasis Preparatas Paimtas kiekis, kvadratinis paklaida intervalas mg/ml mg proc. nuokrypis SE (proc.) SD 0,005 0,00495 99,33 2,08 1,2 94,16 104,51 Amitriptilinas 0,015 0,0151,66 1,15 0,66 97,8 103,54 0,025 0,02512,66 1,15 0,66 97,8 103,54 0,005 0,00503,66 1,15 0,66 97,8 103,54 Fluoksetinas 0,02 0,0201,33 2,52 1,45 94,08 106,58 0,03 0,0299 99,66 1,53 0,88 95,87 103,46 0,1 0,0986 98,66 1,53 0,88 94,87 102,48 Kodeinas 0,2 0,1999 99,98 1,00 0,57 97,52 102,48 0,3 0,2989 99,33 0,57 0,33 97,89,77 Esant skirtingoms pradinėms medžiagų tirpalų koncentracijoms, rasti medžiagų kiekio vidurkiai statistiškai patikimai nesiskiria. Kiekybinio amitriptilino, fluoksetino ir kodeino UV spektrofometrinio nustatymo metodikos vidutinio rezultato santykinė paklaida neviršija 5 proc., kai pasikliautinasis lygmuo 95 proc. Amitriptilino, fluoksetino ir kodeino mišinio kiekybinę sudėtį galima nustatyti UV spektrofotometrijos metodu pagal sudarytas kalibracijos kreives, prieš tai mišinio komponentus atskyrus plonasluoksnės chromatografijos metodu pagal anksčiau aprašytą metodiką. Išvados 1. Tiesiogiai ultravioletinės spektroskopijos metodu amitriptilino, fluoksetino ir kodeino mišinio komponentų atskirti negalima, nes medžiagų spektrų smailės dengia viena kitą. 2. Norint identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti amitriptiliną, fluoksetiną ir kodeiną mišinyje ultravioletinės spektrofotometrijos metodu, pirmiausia mišinio komponentus reikia atskirti plonasluoksnės chromatografijos metodu. 3. Nustatyta vaistinių medžiagų identifikavimo ultravioletinės spektroskopijos metodu minimali riba 0,5 µg/ml amitriptilino, 1,5 µg/ml fluoksetino ir 1,0 µg/ml kodeino. 4. Pagal nubraižytas kalibracijos kreives rasti vaistinių medžiagų kiekybinio nustatymo intervalai ultravioletinės spektrofotometrijos metodu: 5 25 µg/ml amitriptilino; 5 30 µg/ml fluoksetino ir 300 µg/ml kodeino. 5. Kiekybinio amitriptilino nustatymo ultravioletinės spektrofotometrijos metodu vidutinio rezultato santykinė paklaida neviršija 1,2 proc., fluoksetino 1,45 proc., kodeino 0,88 proc., kai pasikliautinasis lygmuo 95 proc. Vidutinis amitriptilino kvadratinis nuokrypis nuo 1,15 iki 2,08 proc.; fluoksetino nuo 1,15 iki 2,52 proc.; kodeino nuo 0,57 iki 1,53 proc. 6. Nustatyta amitriptilino, fluoksetino ir kodeino molinė absorbcijos geba distiliuotame vandenyje, pagal kurią galima apskaičiuoti preparatų vandeninių tirpalų koncentraciją. 7. Vaistų mišinio ultravioletinės spektrofotometrijos tyrimo metodika yra tinkama identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti amitriptiliną, fluoksetiną ir kodeiną mišinyje, išskirtame iš biologinių skysčių (kraujo arba šlapimo) ūminių apsinuodijimų atvejais. UV spectrophotometric research of drug mixture in sudden poisoning cases Department of Analytical and Toxicological Chemistry, Faculty of Pharmacy, Kaunas University of Medicine, Lithuania Key words: ultraviolet spectrophotometry, amitriptyline, codeine, fluoxetine. Summary. The objective of this research to develop the methodics for analysis of amitriptyline, fluoxetine
142 and codeine in the mixture. Results. The analytical method of amitriptyline, codeine and fluoxetine in the mixture identification and quantitative determination using ultraviolet spectrophotometry was established. Preparations in the mixture can t be separated, because material ultraviolet light peaks are in insufficient distance and therefore cover one another. The maximum of ultraviolet light absorption for amitriptyline is at 217 220 and 238 240 nm; fluoxetine at 226 228 nm; codeine at 224 248 and 284 286 nm. Using ultraviolet spectroscopy it s possible to identify amitriptyline, fluoxetine and codeine only after separating mixture components by thinlayer chromatography, the same time executing cleaning of extracts from blood and urine. Using ultraviolet spectroscopy can be identificated at least 0.5 µg/ml amitriptyline, 1.5 µg/ml fluoxetine and 1.0 µg/ml codeine. The intervals of the quantitative determination: 5 25 µg/ml amitriptyline; 5 30 µg/ml fluoxetine; 300 µg/ml codeine; relative error of the measurement, when confidence level is 95%, is from 0.66 to 1.2% for amitriptyline; from 0.66 to 1.45% for fluoxetine; from 0.33 to 0.88% for codeine. Standard deviation is from 1.15 to 2.08% for amitriptyline; from 1.15 to 2.52% for fluoxetine; from 0.57 to 1.53% for codeine. Molar absorption coefficients for all three preparations in distillated water were determinated. Conclusions: recommended methodology suits for mixture, extracted from biological liquids, components separation, identification and quantitative determination. Correspondence to D. Kazlauskienė, Department of Analytical and Toxicological Chemistry, Faculty of Pharmacy, Kaunas University of Medicine, A. Mickevičiaus 9, 3000 Kaunas Lithuania. E-mail: daivakazlauskiene@centras.lt Literatūra 1. Stonys A, Šurkus J, et al. Klinikinė toksikologija. (Clinical toxicology.) Kaunas: KMA leidykla; 1998. p. 126. 2. Vainauskas P, Bitautas R, Mikeliūnas V, Ivanauskas L. Apsinuodijimai vaistais Kaune ir Kauno krašte. (Poisoning cases in Kaunas and Kaunas area.) Medicina (Kaunas) 1996;32: 797-800. 3. Kazlauskas S, Vainauskas P, Mikeliūnas V, Kazlauskienė D. Apsinuodijimai vaistais Kauno apskrityje 1996 1998 metais. (Poisoning cases in Kaunas and Kaunas area in years 1996 1998). Medicina Kaunas) 1999;35:1231-4. 4. Kazlauskienė D,Vainauskas P, Kazlauskas S. Amitriptilino, kodeino ir fluoksetino mišinio analizė didelio slėgio skysčių chromatografijos būdu ūmių apsinuodijimų atvejais. (Research of the mixture amitriptiline, codeine and fluoxetine using HPLC in poisoning cases.) Medicina Kaunas) 2002;38:1014-7. 5. Curry AS. Analytical methods in human toxicology. Weinheim: Verl. Chemie; 1985. vol. 2. p. 139-42. 6. Mickevičius D. Cheminės analizės metodai. (Chemical analytical methods.) Vilnius: Žiburio leidykla; 1998. vol. 1. p. 408. 7. Clark EGC. Clarke s isolation and identification of drugs. 2 nd ed. London: The Pharmaceuticals Press; 1986. p. 1223. 8. Rücker G. Spektroskopische Methoden in der Pharmazie. (Spectrophotometric methods in pharmacy.) Stuttgart: Wiss. Verl.; 1976. vol. 1. p. 69. 9. Williams DH, Fleming J. Spektroskopische Methoden zur Strukturaufklärung. (Spectrophotometric methods of substances structure analysis.) Thieme Verlag; 1975. 10. Smith I, Seakins JVT. Chromatographic and electrophoretic techniques. London: W. Heinemann medical books LTD; 1976. vol. 1. p. 465. 11. Arzhamasiev AP, Senov PL. Standartnyje obrazy lekarstvenykh veshchestv. (Standards of medical substances.) Moskva: Medicina; 1978. p. 124-6, 148-9. 12. Mazor A. Metody organicheskogo analiza. (Methods of organic analysis.) Moskva: Mir; 1986. p. 272. 13. Auterhoff H, Kovar KA. Identifizierung von Arzneistoffen. (Identification of medicinal substances.) Stuttgart: Wiss. Verl. Ges.; 1985. p. 346. Straipsnis gautas 2003 06 09, priimtas 2003 09 08 Received 9 June 2003, accepted 8 September 2003