LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA AGNĖ POCIŪTĖ LIETUVOJE

Transkriptas

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA AGNĖ POCIŪTĖ LIETUVOJE AUGANČIŲ DVISKIAUČIŲ GINKMEDŽIŲ (GINKGO BILOBA L.) LAPUOSE KAUPIAMŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES ĮVERTINIMAS PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS METODU Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas Doc. dr. Rūta Marksienė KAUNAS, 2015

2 2 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA TVIRTINU: Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis Data LIETUVOJE AUGANČIŲ DVISKIAUČIŲ GINKMEDŽIŲ (GINKGO BILOBA L.) LAPUOSE KAUPIAMŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES ĮVERTINIMAS PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS METODU Magistro baigiamasis darbas Recenzentas Data Darbo vadovas Doc. dr. Rūta Marksienė Data Darbą atliko Magistrantė Agnė Pociūtė Data KAUNAS, 2015

3 3 TURINYS SANTRAUKA... 5 SUMMARY SANTRUMPOS... 8 ĮVADAS... 9 DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI LITERATŪROS APŽVALGA Dviskiaučio ginkmedžio (Ginkgo biloba L.) apibūdinimas Augalo apibūdinimas Augalo morfologinis aprašymas Augalo paplitimas ir kultivavimas Vaistinė augalinė žaliava, jos paruošimas ir laikymas Dviskiaučio ginkmedžio (Ginkgo biloba L.) lapų cheminė sudėtis Terpenai Flavonoidai ir jų klasifikacija Kiti Ginkgo biloba L. lapuose randami fenoliniai dariniai ir jų klasifikacija Gydomosios Ginkgo biloba L. savybės Šalutinis Ginkgo biloba L. poveikis, toksiškumas, sąveikos ir dozavimas Ginkgo biloba L. lapuose esančių fenolinių junginių analizė Ekstrakto paruošimas Mėginio išvalymas Išskyrimas ir aptikimas TYRIMO METODIKA Tyrimo objektas Naudoti reagentai Naudota aparatūra ir priemonės... 28

4 Tyrimų metodai Nuodžiūvio nustatymas Ginkgo biloba L. vaistinėje augalinėje žaliavoje Tiriamojo mėginio paruošimas Etaloninių tirpalų paruošimas ir kalibracinių kreivių sudarymas Fenolinių junginių nustatymas plonasluoksne chromatografija Duomenų statistinis įvertinimas TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS Drėgmės kiekio skaičiavimas Fenolinių junginių tapatybės nustatymas plonasluoksnės chromatografijos metodu Standartinių tirpalų kalibracinių kreivių sudarymas Kiekybinis fenolinių junginių nustatymas Ginkgo biloba L. lapų ekstraktuose plonasluoksnės chromatografijos metodu Ginkgo biloba L. lapuose identifikuotų junginių kiekis ir medžio amžius Gautų rezultatų statistinis įvertinimas IŠVADOS REKOMENDACIJOS LITERATŪRA PRIEDAI... 55

5 5 SANTRAUKA LIETUVOJE AUGANČIŲ DVISKIAUČIŲ GINKMEDŽIŲ (GINGKO BILOBA L.) LAPUOSE KAUPIAMŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES ĮVERTINIMAS PLONASLUOKSNĖS CHROMATOGRAFIJOS METODU A. Pociūtės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė Doc. Dr. R. Marksienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra Kaunas, Tikslas: Įvertinti skirtingose Lietuvos vietose augančių dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapuose kaupiamų fenolinių junginių kokybinius ir kiekybinius parametrus pritaikant plonasluoksnės chromatografijos metodą. Darbo uždaviniai: 1. Atlikti mokslinių literatūros šaltinių analizę, siekiant išsiaiškinti Ginkgo biloba L. cheminę sudėtį, farmakologines savybes ir analizės metodus, naudojamus fenolinių junginių išskyrimui, identifikavimui ir nustatymui. 2. Atlikti identifikuotų fenolinių junginių kokybinę analizę. 3. Įvertinti identifikuotų junginių kiekinės sudėties dinamiką skirtingais mėnesiais ir skirtingose augavietėse surinktuose ginkmedžio lapų ėminiuose. 4. Nustatyti, ar augalo amžius turi įtakos kaupiamų veikliųjų junginių kiekiui. Tyrimo metodika: Ginkgo biloba L. lapuose kaupiamų fenolinių junginių ekstrakcijai ir identifikavimui pritaikyta plonasluoksnės chromatografinės analizės metodika, atitinkanti Europos farmakopėjos 01/2008:1828 straipsnį. Tiriamųjų junginių identifikavimas atliktas naudojant rutino, izokvercitrino ir chlorogeno rūgšties etaloninių junginių metanolinius tirpalus. Kiekybinis identifikuotų junginių nustatymas atliktas remiantis kalibracinės kreivės sudarymo metodu, kurio dėka apskaičiuoti veikliųjų medžiagų kiekiai tiriamųjų lapų mėginiuose. Rezultatai ir išvados: Ginkgo biloba L. lapų ėminiuose identifikuoti šie junginiai: rutinas, izokvercitrinas ir chlorogeno rūgštis. Vidutinės R f skirtumų skaitinės vertės parodė metodikos tinkamumą analizei, todėl pasirinkta tirpiklių sistema taikyta tolimesniam kiekybiniam identifikuotų junginių nustatymui. Didžiausias rutino (1,55 ± 0,1 mg/10g) kiekis nustatytas lapų ėminiuose, surinktuose rugpjūčio mėnesį, izokvercitrino (1,67 ± 0,01 mg/10g) ir chlorogeno rūgšties (26,60 ± 1,06 mg/10g) - surinktuose liepos mėnesį Vilkaviškio augavietėje. Tyrimo metu nustatyta, jog amžius įtakoja ginkmedžio lapuose kaupiamų fenolinių junginių kiekį (p < 0,05). Pastebima tendencija, kad fenolinių junginių kiekis mažėja didėjant augalo amžiui.

6 6 SUMMARY THE EVALUATION OF PHENOLIC COMPOUNDS COMPOSITION IN GINKGO BILOBA L. LEAVES GROWING IN LITHUANIA USING THIN LAYER CHROMATOGRAPHY A. Pociutė master s thesis/ supervised by Doc.Dr. R. Marksienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analitic and Toxicological chemistry - Kaunas, Objective: To assess qualitative and quantitative parameters of phenolic compounds in Ginkgo biloba L. leaves growing in different places of Lithuania, using thin layer chromatography. Objectives: 1. To perform analysis of scientific literature to determine Ginkgo biloba L. chemical composition, pharmacological properties and analysis methods of phenolic compounds isolation, identification and detection. 2. To perform qualitative analysis of identified phenolic compounds. 3. To assess the dynamics of quantitive composition of compounds that were identified in Ginkgo biloba L. leaves samples collected in different places during different months. 4. To evaluate the influence of age on amount of phenolic compounds in Ginkgo biloba L. leaves. Methods: Methods of extraction and identification of phenolic compounds in Ginkgo biloba L. leaves were based on European Pharmacopoeia (01/2008:1828). The phenolic compounds were identified by reference standarts (rutin, chlorogenic acid and isoquercitrin in methanol). Quantitative determination of identified compounds were based on calibration curve method. Results and conclusions: Rutin, chlorogenic acid and isoquercitrin were identificated in Ginkgo biloba L. leaves. The distinction values of average retention rates validated the used methodology. The highest amount of rutin (1,55 ± 0,1 mg/10g) was determined in leaves, collected in August, and the highest amounts of isoquercitrin (1,67 ± 0,01 mg/10g) and chlorogenic acid (26,6 ± 1,06 mg/10g) were determined in leaves collected in July in Vilkaviškis area. We have found that age has an impact on the quantitive composition of phenolic compounds in Ginkgo biloba L. leaves (p < 0,05). Also the quantity of phenolic compounds decrease with increasing age of the plant.

7 7 PADĖKA Nuoširdžiai dėkoju už pagalbą ir patarimus mokslinio darbo vadovei doc. dr. R. Marksienei.

8 8 1. SANTRUMPOS CYP 450 DC ESC GABA A KE LD 50 LJD MEKC MS PAL PC PVP p53 R f ROS SSE TAF UV ŽIV citochromo sistema dujų chromatografija efektyvioji skysčių chromatografija gama - aminosviesto rūgštis kapiliarinė elektroforezė mirtina dozė, nuo kurios miršta 50% populiacijos narių liepsnos jonizacijos detektorius micelinė elektrokinetinė chromatografija masių spektrometras periferinės arterijų ligos plonasluoksnė chromatografija polivilivperidonas transkripcijos faktorius, reguliuojantis ląstelės ciklą sulaikymo rodiklis reaktyvios deguonies formos superkritinio skysčio ekstrakcija trombocitus aktyvuojantis faktorius ultravioletinė spinduliuotė žmogaus imunodeficito virusas

9 9 ĮVADAS Intensyviai vystantis farmacijos pramonei, didelis dėmesys skiriamas ne tik cheminės sudėties, bet ir augalinės kilmės vaistiniams preparatams. Remiantis Pasaulinės sveikatos organizacijos duomenimis, fitopreparatų rinka sudaro apie 62 milijonus dolerių ir prognozuojama, kad iki 2050 m. gali pasiekti penkis trilijonus dolerių [1]. Šis didėjantis susidomėjimas augaliniais vaistiniais preparatais susijęs su ilgamete jų vartojimo patirtimi, kuri leido nusistovėti tinkamoms preparatų indikacijoms ir dozėms išvengiant dažnai pasitaikančių nepageidaujamų reakcijų atvejų. Šiuo metu fitopreparatų rinkos lyderiu laikomi dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) augaliniai preparatai. Remiantis valstybinės vaistų kontrolės duomenimis, Lietuvoje registruoti devyni augaliniai vaistiniai preparatai, sudėtyje turintys Ginkgo biloba L. lapų. Tai yra filogeniškai unikalus augalas, išsiskiriantis savo biocheminėmis savybėmis. Praturtintas ginkolidais, bilobalidais ir fenoliniais junginiais, pasižymi antioksidacinėmis, laisvuosius radikalus surišančiomis, antiapoptotinėmis savybėmis, geba sumažinti daugelio patologinių būklių ir sutrikimų riziką, todėl dažnai naudojamas ne tik liaudies, bet ir šiuolaikinėje medicinoje [2]. Vaistinių augalinių žaliavų kokybę lemia biologiškai aktyvių junginių kokybiniai ir kiekybiniai rodikliai. Apžvelgus mokslinės literatūros duomenis, Lietuvoje ruošiamoje dviskiaučių ginkmedžių žaliavoje esantys fenoliniai junginiai yra mažai ištirti, todėl tikslinga būtų atlikti skirtinguose Lietuvos regionuose surinktų ginkmedžio lapų fitocheminę analizę, nustatant vienus iš aktyviausių fenolinių junginių kiekius ir jų įvairavimo tendencijas skirtingais dviskiaučio ginkmedžio lapų surinkimo tarpsniais [3]. Fenolinių junginių kiekio įvairavimo nustatymas skirtingose Lietuvos vietose yra svarbus siekiant racionaliai vykdyti ginkmedžio lapų rinkimą. Tam pasitelktas patogus ir patikimas plonasluoksnės chromatografijos metodas. Automatizuoti plonasluoksnės chromatografijos žingsniai padidina analizės patikimumą, padeda išvengti klaidų, įvertinti skirtingų junginių kokybinius ir kiekybinius parametrus.

10 10 DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI Darbo tikslas: Įvertinti skirtingose Lietuvos vietose augančių dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapuose kaupiamų fenolinių junginių kokybinius ir kiekybinius parametrus pritaikant plonasluoksnės chromatografijos metodą. Darbo uždaviniai: 1. Atlikti mokslinių literatūros šaltinių analizę, siekiant išsiaiškinti Ginkgo biloba L. cheminę sudėtį, farmakologines savybes ir analizės metodus, naudojamus fenolinių junginių išskyrimui, identifikavimui ir nustatymui. 2. Atlikti identifikuotų fenolinių junginių kokybinę analizę. 3. Įvertinti identifikuotų junginių kiekinės sudėties dinamiką skirtingais mėnesiais ir skirtingose augavietėse surinktuose ginkmedžio lapų ėminiuose. 4. Nustatyti, ar augalo amžius turi įtakos kaupiamų veikliųjų junginių kiekiui.

11 2. LITERATŪROS APŽVALGA 2.1. Dviskiaučio ginkmedžio (Ginkgo biloba L.) apibūdinimas Augalo apibūdinimas 11 Dviskiautis ginkmedis (Ginkgo biloba L.) priklauso ginkmedainių (Ginkgoopsida) klasei ginkmedinių (Ginkgoaceae) šeimai [4, 5, 6, 7, 8] m. Engelberto Kamferio pasiūlytas Ginkgo pavadinimas pasirodė priimtinas binarės nomenklatūros kūrėjui Karlui Linėjui, kuris 1771 m. prie Ginkgo prijungė rūšies pavadinimą biloba, nurodantį, kad augalo lapalakščiui būdinga pleišto forma [5, 6]. Tai vienintelis išlikęs šios klasės ir šeimos atstovas [5]. Ginkmedis yra seniausiai žinoma medžių rūšis, miškuose klestėjusi prieš daugiau kaip 250 mln. metų, todėl pelnytai vadinama gyvąja iškasena [5, 6] Augalo morfologinis aprašymas Ginkgo biloba L. yra vasaržalis, dažniausiai dvinamis, siekiantis 30 metrų aukštį medis, gyvenantys apie 1000 metų [6]. Tai lapuotis medis, turintis šviesiai pilką arba pilkai rudos spalvos žievę. Senų medžių skersmuo siekia tris metrus, o šaknų sistema plastiška ir gili. Vyriškosios lyties medžiai yra siauromis lajomis, o moteriškosios lyties - nedidelio aukščio ir plačiai išsikerojusiomis, laužytomis šakomis. Medis turi dviejų rūšių ūglius: ilgaūglių lapai yra pavieniai, prisitvirtinę padrikai, o trumpaūglių - viršūnėse išaugę kuokštais po 5-7 lapus [4, 8]. Viršutinė lapo pusė yra šiek tiek tamsesnė nei apatinė; lapkočio ilgis svyruoja nuo 4 cm iki 9 cm. Lapalakštis yra vėduoklės formos (4-10 cm ilgio), dažniausiai padalytas. Viršutinis ir apatinis paviršiai yra glotnūs, būdingas primityvus, dichotominis gyslotumas. Distaliniai kraštai yra netaisyklingai įpjauti, nevienodu laipsniu, netaisyklingomis skiltimis. Šoniniai kraštai yra ištisi, siaurėjantys pagrindo link [9]. Vyriškosios lyties medžių lapai yra padalinti į dvi dalis, o moteriškosios - vientisiniai [6].Ginkmedis lytiškai subręsta tik pasiekęs gyvenimo metus. Moteriškieji ir vyriškieji lytiniai organai yra ant trumpų ūglių, lapų ir pumpuro skraistlapių makštyse [5]. Vyriškieji žirgynai užauga anksčiau nei lapai, išbarsto žiedadulkes ir nukrenta. Augalo apdulkinimas vyksta nuo balandžio pradžios iki gegužės pabaigos, o tikrasis apvaisinimas įvyksta tik praėjus keletui mėnesių nuo apdulkinimo. Suaugusi sėkla yra didelė, apsupta storu dangalo sluoksniu. Ginkmedžio sėklų dangalui būdingas nemalonus kvapas, dėl butano ir heksano rūgščių buvimo, kuris dingsta vaisiui galutinai subrendus [8].

12 Augalo paplitimas ir kultivavimas Didžiausias dviskiaučio ginkmedžio paplitimas buvo juros ir kreidos periodo metu. Jo tėvyne laikoma Rytų Kinija, kurioje šis medis nebuvo žinomas iki pat XI a. Į Japoniją iš Kinijos atvežtas XII a, o Europą pasiekė 1730 metais [4]. Lietuvoje aptinkamas labai retai. Stambiausias ir seniausias medis - Švėkšnos parke (17 m aukščio ir 50 cm skersmens). Auginamas ir Vytauto Didžiojo universiteto Kauno botanikos sode, Dubravos miškų tyrimo stoties arboretume, Obelynėje, Šiaulių botanikos sode ir privačiose kolekcijose [4]. Dviskiaučiui ginkmedžiui yra tinkama augti vidutinio klimato juosta [8]. Augančiam medžiui reikalinga saulėta aplinka [5]. Jis auga plačialapių miškuose ir slėniuose iki 2000 m virš jūros lygio. Geriausiai auga rūgščiame (ph=5-5.5), gerai laistomame, geltoname, liosiniame dirvožemyje [8]. Ginkmedžiai dažniausiai dauginami sėklomis, tačiau Lietuvoje dviskiautis ginkmedis jų nesubrandina ir sėklos gaunamos iš kitų šalių (pvz., Kinijos, Japonijos, Vakarų Europos ir JAV). Rudenį sėklos sodinamos į vazonėlius, kurie paliekami nešildomose patalpose (-3-5 o C) [4] Vaistinė augalinė žaliava, jos paruošimas ir laikymas Kaip vaistinė medžiaga buvo naudojami lapai ir sėklos, tačiau sėklose nustačius didelį 4-Ometilpiridoksino kiekį, naudojami tik lapai. 4-O-metilpiridoksinas pasižymi stipriu vitamino B 6 antagonistiniu poveikiu ir gali sukelti traukulius ar net staigią mirtį, tuo tarpu lapuose esantis labai mažas šio junginio kiekis nepasižymi organizmui toksišku poveikiu [10, 11]. Dviskiaučio ginkmedžio lapai skinami rudenį arba renkami nukritę. Džiovinami paskleidus pavėsyje arba džiovykloje o C temperatūroje. Išdžiuvę lapai būna šviesiai geltonos spalvos ir nepažeisti. Pakuojama į storus popierinius maišus ar dėžes, kad kuo mažiau trupėtų. Tokių lapų tinkamumo laikas - vieneri metai [4] Dviskiaučio ginkmedžio (Ginkgo biloba L.) lapų cheminė sudėtis Dviskiaučio ginkmedžio lapai pasižymi didele biologiškai aktyvių junginių gausa. Pagrindiniai komponentai, lemiantys Ginkgo biloba L. ekstrakto farmakologinį aktyvumą - terpenai ir fenoliniai junginiai. Be pastarųjų, randami organiniai (glicerolio derivatai, 1-hidroksipireno konjugatai, amino

13 13 rūgštys ir citokininai bei heksaminai, 6-hidroksikinureninė rūgštis (6-HKA), cukrūs, vaškai, peptidai) bei neorganiniai (kalcio oksalatas, selenas, varis, cinkas, chromas, geležis, manganas) junginiai [12] Terpenai Ginkmedžio lapuose aptinkami terpenolaktonai, kurie skirstomi į diterpenus ir seskviterpenus (bilobalidas), triterpenai (steroidų, fitosterolių), karotenoidų, poliprenoliai ir lakieji terpenai (monoterpenų ir seksviterpenų) [6, 13]. Svarbiausiais šios grupės atstovais laikomi terpenolaktonai ginkolidai ir bilobalidai, kurie randami tik šiame augale. Ginkolidai yra diterpenai (C 20 ), sudaryti iš šešių penkianarių žiedų: spiro[4,4]nonano žiedo, trijų laktono žiedų ir tetrahidrofurano žiedo, prie B žiedo prisijungusio tretinio butilo grupę (žr. 1 lentelė). Ginkolidai vienas nuo kito skiriasi hidroksigrupių skaičiumi ir jų padėtimi spirononano žiede. Šie junginiai pasižymi neuroprotekciniu, priešuždegiminiu, trombocitus aktyvuojančio faktoriaus (TAF) antagonistiniu poveikiu. Ginkolidai, veikdami kaip TAF inhibitoriai, gali padėti apsisaugoti nuo trombozės, širdies ir kraujagyslių ligų, širdies aritmijų, astmos, trombozės ar alerginių reakcijų [14]. Bilobalido struktūra panaši į ginkolidų, tačiau joje tetrahidrofurano žiedas pakeistas laktonu ir nėra A ir F žiedų. Tai dominuojantis triterpenolaktonas Ginkgo biloba L. ekstrakte, kurio neuroprotekcinį poveikį pagrindę didelė dalis atliktų mokslinių tyrimų. Nustatyta, kad pastarasis poveikis susijęs su fosfolipazės A 2 aktyvumo ir glutamato išsiskyrimo slopinimu. Fosfolipazė inicijuoja arahidoninės rūgšties atsipalaidavimą iš ląstelės membranos fosfolipidų, kas gali sukelti laisvųjų radikalų formavimąsi ir destabilizuoti ar sunaikinti ląsteles. Glutamatas veikdamas N-metil-D-aspartato (NMDA) receptorius, sukelia kalcio patekimą į ląsteles ir jų destrukciją. Minima, kad bilobalidas, kuris randamas ne tik lapų žaliavoje, bet ir standartizuotame dviskiaučio ginkmedžio ekstrakte, gali padidinti epilepsijos priepuolių dažnį, nes bilobalidui būdingas GABA A receptorių inhibavimas [15]. Ginkolidų ir bilobalido koncentracija priklauso nuo lapų rinkimo laikotarpio: didžiausia šių junginių koncentracija nustatyta vasaros viduryje surinktuose lapuose, o jiems geltonuojant, terpenolaktonų kiekis ima mažėti [13]. Pagrindinių terpenų, aptinkamų dviskiaučio ginkmedžio lapuose, klasifikacija ir poveikis pateikti 1 lentelėje.

14 1 lentelė. Pagrindinių terpenų, aptinkamų dviskiaučio ginkmedžio lapuose, klasifikacija ir poveikis 14 Klasės pavadinimas Cheminė struktūra Atstovų, sutinkamų Ginkgo biloba L. lapuose, pavydžiai Poveikis Literatūra I Terpenų trilaktonai Ginkolidai: A B C J K* L* Neuroprotekcinis Sedatyvinis Antitrombozinis Imunoprotekcinis Anksiolitinis Antioksidacinis [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [19] Bilobalidas Neuroprotekcinis [23] [24] Mažina cholesterolio II Triterpenai Kampesterolis β-sitosterolis Stigmasterolis kiekį kraujyje; Mažina likopeno ir β karoteno kiekį; [25] [26] [27] [28] Antioksidacinis Priešvėžinis III Karotenoidai α-karotenas γ-karotenas liuteinas zeaksantinas Antioksidacinis Kardioprotekcinis Priešvėžinis Angioprotekcinis [29] [30] [31] *- išskirta iš Ginkgo biloba L. lapų 2010 m.[8]

15 Flavonoidai ir jų klasifikacija Flavonoidai yra polifenoliniai, mažos molekulinės masės junginiai, randami beveik visuose žaliuose augaluose [13]. Jų randama vaisiuose, daržovėse, riešutuose, sėklose. Gelėse esantys flavonoidai suteikia joms spalvą, saugo nuo grybelinių ligų sukėlėjų, dalyvauja augalo vystymosi ir augimo procese, fotosintezės reakcijose [32]. Mokslinių tyrimų duomenimis, dviskiaučio ginkmedžio lapuose esantys fenoliniai junginiai pasižymi priešuždegiminiu, antibakteriniu, priešvirusiniu, priešvėžiniu, priešmikrobiniu aktyvumu [10, 33, 34, 35, 36]. Flavonoidų struktūros pagrindą sudaro benzo γ žiedas (flavanas), kuriame yra du benzeno žiedai (žr. 1 pav. A ir B) susijungę per heterociklinį pirano ar pirono žiedą (žr. 1 pav. C) [32, 34, 35]. Šiai struktūrai būdinga C 6 -C 3 -C 6 molekulinė grupė [32] Ginkmedyje randama daugiau kaip trisdešimt autentiškų flavonoidų rūšių. Jų gausą lemia ne fenilchromano struktūros variacijos, o prie flavano struktūros prisijungę skirtingi glikozidai [13]. 1 pav. Flavonoidų struktūra (žiedai: A, B- benzeno, C- pirano) Žinoma ne viena flavonoidų klasifikacija. Flavonoidai gali būti klasifikuojami pagal cheminę struktūrą ar heterociklo dydį, pagal šoninių radikalų padėtį, cukrų molekulių kiekį bei cheminę sandarą [36]. Daugelyje literatūros šaltinių pažymima, kad Ginkgo biloba L. lapuose randami flavonoidai, priklausomai nuo centrinio pirano žiedo oksidacijos laipsnio, yra skirstomi į keturias klases: flavanoliai, flavonoliai, flavonai ir izoflavonai [37]. Flavanoliai yra flavano dariniai ir, kitaip nei flavonoliai, neturi ketono grupės. Monomeriniai flavanoliai, kitaip vadinami katechinais, yra proantocianidinų prekursoriai, turintys būdingą flavonoidams C 6 -C 3 -C 6 struktūrą ir trečioje C žiedo pozicijoje prisijungę hidroksilo grupę. Dviskiaučio ginkmedžio lapuose be glikozilinto katechino randamas epikatechinas, epigalokatechinas ir galokatechinas. Be monomerų, Ginkgo biloba L. lapuose sutinkami ir polimeriniai katechinų dariniai [38].

16 16 Flavonai benzopirano dariniai, dviskiaučio ginkmedžio lapuose egzistuojantys aglikonų ir glikozidų pavidaluose. Be dažniausiai augaluose randamų flavonų apigenino ir liuteolino, sutinkamas ir biflavonas gingetinas, kuris pirmą kartą buvo išskirtas iš ginkmedžio lapų. Biflavonų koncentracija didėja geltonuojant augalo lapams; jų kiekis varijuoja nuo 0,4 % iki 1,9% [11]. Flavonoliai 3-hidroksiflavono darinai, prie 3-hidroksi grupės prisijungiantys cukrų. Ginkgo biloba L. lapuose esantys flavonoliai, gali būti aglikonų (pvz., kemferolio, kvercitino, miricetino) arba glikozidų (monoglikozidų, diglikozidų ir triglikozidų) pavidaluose [13]. Flavonoliams būdingas stiprus virusų fermentus slopinantis poveikis; jie selektyviai slopina ŽIV-1 ir ŽIV-2 virusus, ir yra daug efektyvesni už kitų grupių flavonoidus [39]. Be pastarųjų, randama ir izoflavonų, iš kurių pagrindinis - genisteinas, pasižymintis stipriu estrogeniniu poveikiu [13]. Dviskiaučio ginkmedžio lapuose esančios pagrindinės flavonoidų grupės, bendros formulės ir atstovų pavyzdžiai pateikti 2 lentelėje (žr. 1 priedas) Kiti Ginkgo biloba L. lapuose randami fenoliniai dariniai ir jų klasifikacija Fenoliniams junginiams, be flavonoidų, priskiriamos ir fenolinės rūgštys, polifenoliniai stilbenai, kumarinai. Fenolinės rūgštys skirstomos į du pogrupius: hidroksibenzenkarboksirūgštys ir hidroksicinamato rūgštis. Šioms rūgštims būdingas antioksidacinis, hipolipideminis, antiagregacinis, imuninę sistemą stiprinantis, priešvėžinis aktyvumas [40]. Hidroksibenzenkarboksirūgštims būdinga C 6 -C 1 struktūra, o skirtumai tarp grupėje esančių rūgščių atsiranda dėl skirtingo hidroksilo (OH-) ir metoksi (-OCH 3 ) grupių skaičiaus ir prisijungimo prie bazinės struktūros. Hidroksibenzenkarboksirūgščių pogrupiui priskiriama šikimo rūgštis (angl. Shikimic acid) dalyvauja tirozino, fenilalanino, cianidino ir lignino biosintezėje. Pastarajam pogrupiui priskiriamos ir anakardinės rūgštys, kurios neretai vadinamos ginkolinėmis rūgštimis. Tai 6-alkilsalicilo rūgščių grupė su skirtingais alkilintais radikalais, turinti 13, 15, 17 anglies atomus su trimis dvigubosiomis jungtimis. Šios rūgštys pasižymi odą dirginančiu, virškinamojo trakto veiklą sutrikdančiu poveikiu, todėl yra pašalinamos prieš gaminant standartizuotą dviskiaučio ginkmedžio ekstraktą. Anakardžio rūgščių kiekis išdžiovintuose lapuose siekia 17,3 mg/g [13]. Hidroksicinamatai yra C 6 -C 3 struktūros dariniai, iš kurių dviskiaučio ginkmedžio lapuose galima rasti p-kumarino, laisvos hidroksicinamino kavos rūgšties ir chlorogeno rūgšties, kuri natūraliai susidaro

17 17 kavos ir kvino rūgšties esterifikacijos metu [36, 12, 41]. Chlorogeno rūgšties struktūra pavaizduota 2 paveiksle. Pagrindine fenoline rūgštimi laikoma p-kumarino rūgštis, kurios randama apie 0,25 mg/g [42]. 2 pav. Chlorogeno rūgšties struktūra [28] Polifenolinių junginių klasei priklausantys stilbenai turi C 6 -C 2 -C 6 struktūrą. Augalai juos gamina kaip apsauginę priemonę nuo grybų, bakterijų ir įvairių patogenų [12]. Be pastarųjų, Ginkgo biloba L. lapuose randami nedideli kiekiai 3,3-dimetoksi-4,4-dihidroksistilbeno [43]. Dviskiaučio ginkmedžio medienoje ieškodami alergenų, Choukchou-Braham ir kt. rado ir optiškai aktyvius kumarinus [13] Gydomosios Ginkgo biloba L. savybės Kancerogeniško mažinimas. Dviskiaučio ginkmedžio ekstraktas padidindamas p53 ekspresiją ir kaspazės-3 aktyvumą, sumažina vėžinių ląstelių proliferaciją [44]. Šis poveikis susijęs su flavonoidais, kurie veikdami vėžio supresorius (ypač p53), slopindami tirozino kinazę ir pakeisdami estrogeną, sumažina karcenogeniškumą [39]. Skrandžio opos. Dviskiaučio ginkmedžio ekstraktas, slopindamas lipidų peroksidaciją ir ląstelių apoptozę, apsaugo skrandžio gleivinę nuo išopėjimo [45]. Atminties sutrikimai. Teigiama, kad dviskiaučio ginkmedžio flavonoidų poveikis susijęs su gebėjimu padidinti absoliutųjį muskarininių ir α 2 adrenoreceptorių skaičių hipokampui priklausančioje limbinės žievinės sistemos struktūroje, ko pasekoje gerėja atmintis ir pažinimo funkcijos [46]. J. Birks ir kt. (2009) atliktoje straipsnių metanalizėje nustatytas Ginkgo biloba L. ekstrakto pranašumas prieš placebą esant įgytam pažinimo sutrikimui, įskaitant bet kokio sunkumo laipsnio demenciją ir Alzheimerio ligą [47] m. atliktoje sisteminėje dvigubai aklų placebo kontroliuojamų publikacijų metanalizėje taip pat nustatytas ženklus standartizuoto ginkmedžio ekstrakto efektyvumas, gerinant pažinimo sutrikimus visų amžiaus grupių pacientams, sergantiems Alzheimerio liga, kraujagysline ar mišria demencija [48]. M. Mazza ir kt. (2013) atliktas randomizuotas, placebo kontroliuojamas, dvigubai aklas tyrimas, kuriame palygintas standartizuoto ginkmedžio ekstrakto ir anticholinerginio vaisto donepezilo veiksmingumas,

18 18 gydant lengvo ir vidutinio sunkumo demenciją. Praėjus 6-iems gydymo mėnesiams gautas panašus pacientų dėmesio, atminties ir pažinimo sutrikimo pagerėjimas ginkmedžio ekstraktą ir donepezilą vartojančių pacientų grupėse [49]. Pastarojo tyrimo sėkmę patvirtino R. Ihl (2013). Vokietijoje atliktas atsitiktinių imčių, randomizuotas, placebo kontroliuojamas tyrimas, kuriame nustatyta žymiai pagerėjusi pažinimo funkcija, Alzheimeriu sergančių, tiek donepezilą, tiek ir ginkmedį vartojusių pacientų grupėje [50]. Tačiau nustatyta, kad metilfenildatas žymiai efektyvesnis už ginkmedžio ekstraktą esant dėmesio sutrikimui hiperaktyvumo metu [33]. Atsitiktinių imčių, dvigubai aklo tyrimo metu užfiksuotas statistiškai reikšmingas dėmesio, koncentracijos ir atminties pagerėjimas po trijų mėnesių gydymo standartizuoto ginkmedžio ekstraktu. Šio tyrimo metu pastebėtas ginkmedžio gebėjimas sumažinti ir diastolinį kraujospūdį [51]. Kraujotakos sutrikimai. Flavonoidai, veikdami kaip antioksidantai, geba apsaugoti kraujagyslių endotelį nuo laisvųjų radikalų poveikio ir taip sumažinti aterosklerozinių pakitimų riziką. J. Burns ir kt. (2000) nustatė fenolinių junginių, ypač antocianinų gebėjimą sumažinti arterinį kraujo spaudimą. Jau 1960 m. atliktų tyrimų duomenys patvirtina flavonoidų gebėjimą sumažinti trombocitų agregaciją, padidinti fibrolizę ir užkirsti kelią trombocitų sukibimui [52]. Dažniausias periferinių arterijų ligos (PAL) požymis - protarpinis šlubavimas. S. Horsch ir kt. (2004) atliktoje klinikinių tyrimų metaanalizėje nustatytas standartizuoto dviskiaučio ginkmedžio ekstrakto veiksmingumas gydant periferinių arterijų okliuzines ligas; 7-i iš 9-ių tyrimų parodė šio preparato gebėjimą padidinti vaikščiojimo be skausmo laiką, palyginus su placebu [53]. G. Valli ir kt. (2002) įvertino 11-a randomizuotų, placebu kontroliuojamų tyrimų rezultatus ir nustatė Ginkgo biloba L. ekstrakto gebėjimą padidinti pacientų vaikščiojimo be skausmo atstumą. Tačiau šis poveikis buvo nedidelis, palyginus su periferinio vazodilatatoriaus - pentoksifilino - poveikiu [54]. L. H. Kuller ir kt. (2010) atlikto randomizuotą, dvigubai aklą, placebo kontroliuojamą tyrimą, kurio metu nebuvo nustatytas Ginkgo biloba L. standartizuoto ekstrakto gebėjimas sumažinti mirtingumą nuo širdies ir kraujagyslių ligų. Neužfiksuotas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp koronarinės širdies, miokardo infarkto, hemoraginio šoko ir krūtinės anginos atvejų vartojant placebą ir dviskiaučio ginkmedžio ekstraktą. Tačiau periferinių kraujagyslių ligų atvejų placebo grupėje pasitaikė žymiai daugiau [55]. Astma. Y. Tang ir kt. (2007) atliktas tyrimą, kuriame nustatytas Ginkgo biloba L. ekstrakto efektyvumas uždegiminių reakcijų metu, vartojant ginkmedžio ekstraktą kartu su glukokortikoidais [56]. Puikų augalinio preparato toleravimą atskleidė S. Fonsecair kt. (2007) atliktas atsitiktinių imčių, dvigubai aklas, placebo kontroliuojamas tyrimas, kuriame pacientai vartojo placebą arba kombinuotą augalinį

19 19 preparatą, kurio sudėtyje be Ginkgo biloba L. buvo ir vaistinė aitrūnė bei tikrasis imbieras. Preparatas žymiai palengvino kosulį ir kitus astmai būdingus simptomus [57]. Tinitas (arba kitaip - ūžesys ausyse) yra diagnozuojamas labai dažnai, tačiau efektyvaus vaisto jį išgydyti nėra [58] m. atliktame tyrime nustatyta, kad beveik vienas iš penkių vyresnio amžiaus suaugusiųjų kenčia nuo tinito [59]. S. Drew ir kt. (2001) atlikto tyrimo metu nepastebėti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp Ginkgo biloba L. ir placebo, esant ūžesiui ausyse. Šiame tyrime dalyvavo didelis pacientų skaičius, todėl tyrimas pasižymėjo didesniu tikslumu lyginant su ankstesniais tyrimais, kuriuose buvo nustatytas ginkmedžio efektyvumas [58] m. atliktoje publikacijų metaanalizėje įvertinti 46-i randomizuotų, placebo kontroliuojamų tyrimų rezultatai. Šiuose tyrimuose Ginkgo biloba L. ekstraktas nebuvo efektyvus gydant tinitą, tačiau S.N. Park ir kt. (2013) atlikto tyrimo metu nustatyti geresni tinito gydymo rezultatai, kartu su alprazolamu vartojant Ginkgo biloba L. ekstraktą, nei gydantis monoterapija [59, 53, 60]. Diskinezija. Kinijoje, Zhang ir kt. (2011) atliktas randomizuotas, placebo kontroliuojamas tyrimas, kuriame nustatytas dviskiaučio ginkmedžio efektyvumas gydant judesio sutrikimus, atsiradusius sergant šizofrenija [61]. Premenstruacinio sindromo palengvinimas (bendras fizinis ir psichologinis pagerėjimas) vartojant ginkmedžio tabletes, nustatytas G. Ozgoli ir kt. (2009) atliktame placebo kontroliuojamame tyrime [62]. Kalnų liga. F.A. Moraga ir kt. (2007) atliko tyrimą, kuriame nustatė, kad ginkmedžio ekstraktas padeda sušvelninti simptomus, būdingus aukštumų ligai [63]. Kepenų ligos. Daugelis flavonoidų pasižymi hepatoprotekciniu poveikiu. W. Zhu ir kt. (2012) pabrėžė teigiamą antocianidinų poveikį; nustatyta, kad jie geba slopinti citokinų išsiskyrimą, skatina glutamato - cisteino ligazę aktyvinančio faktoriaus išsiskyrimą ir taip apsaugo kepenis nuo steatozės [64]. Be flavonoidų, nustatytas ir Ginkgo Biloba L. ekstrakte esančių poliprenolių aktyvumas prieš hepatito C virusą [65] Šalutinis Ginkgo biloba L. poveikis, toksiškumas, sąveikos ir dozavimas Nors daugelyje tyrimų nustatytas Ginkgo biloba L. preparatų saugumas, tačiau kartais susiduriama ir su šalutiniu ginkmedžio lapų preparatų poveikiu. Dažniausiai pasitaikantys nepageidaujami reiškiniai: galvos skausmas, pykinimas, vėmimas, rėmuo, viduriavimas, alerginės odos reakcijos, mėšlungis, kraujavimas [33, 66, 67].

20 20 Nustatytas labai mažas dviskiaučio ginkmedžio toksiškumas. Tyrimuose su žiurkėms, nustatyta medialinė mirtina dozė (LD50) yra net 2-10 g. J.K. Dunnick ir J.R. Haley (1985) pranešė, kad didelės ( mg/kg per parą) kvercetino dozės per keletą metų gali sukelti auglių susidarymą pelių organuose, tačiau tolimesni tyrimai jokio kacerogeniškumo neparodė [33]. Nustatyta, kad Ginkgo biloba L. gali įtakoti citochromo P450 sistemos ir kitų vaistus metabolizuojančių fermentų veiklą, o tai, kaip žinoma, gali turėti įtakos kitų vaistinių preparatų biotransformacijai [33]. Ginkgo biloba L. preparatai vartojami kartu su antikoaguliantais gali sukelti sinergistinį poveikį padidėja kraujavimo pavojus. Užfiksuota tiazidinių diuretikų ir dviskiaučio ginkmedžio sąveika, sukėlusi kraujospūdžio padidėjimą, tačiau racionalaus farmakologinio mechanizmo tam paaiškinti nėra. Patariama vengti ginkmedžio ekstraktą vartoti su česnaku, imbieru, dėl padidėjusios kraujavimo rizikos. M.C. Miman ir kt. (2002) atliktas tyrimas su žiurkėmis parodė amikacino ir standartizuoto Ginkgo biloba L. ekstrakto sąveiką, sukeliančią ototoksiškumą. Su žmonėmis šis tyrimas nebuvo atliktas, tačiau dėl galimos vaisto ir augalinio preparato sąveikos taip pat vertėtų vengti šio derinio [68]. Dviskiautis ginkmedis vartojamas tablečių, kapsulių, arbatų ir tinktūrų pavidaluose. Optimali dviskiaučio ginkmedžio paros dozė iki šiol nėra nustatyta [69], tačiau rekomenduojama vartoti po mg per parą [33], priklausomai nuo indikacijos: esant atminties sutrikimams mg/per dieną, aukštumų ligai - vienkartinė 120 mg dozė, migrenai - 60 mg du kartus per dieną [50, 51, 62]. Remiantis mokslinių tyrimų duomenimis, didinant ginkmedžio ekstrakto dozę, nuosekliai didėja ne tik efektyvumas, bet ir nepageidaujamų reakcijų dažnis [70] Ginkgo biloba L. lapuose esančių fenolinių junginių analizė Cheminę dviskiaučio ginkmedžio lapuose esančių biologiškai aktyvių fenolinių junginių analizę galima padalinti į tris etapus: ekstrakto paruošimą, mėginio išvalymą, junginių išskyrimą ir nustatymą Ekstrakto paruošimas Ginkgo biloba L. lapuose esantys fenoliniai junginiai dažniausiai ekstrahuojami maceracijos arba Soksleto ekstrakcijos metodais, naudojant įvairius tirpiklius [11]. Tirpiklių pasirinkimas priklauso nuo junginių poliškumo; mažo poliškumo flavonoidai (pvz., izoflavonai, flavanonai, metilinti flavonai ir

21 21 flavonoliai) ekstrahuojami chloroformu, dichlorometanu, dietileteriu ar etilo acetatu, tuo tarpu dideliu poliškumu pasižyminčios fenolinės rūgštys ir flavonoidų aglikonai bei glikozidai negali būti visiškai išekstrahuoti vien grynais organiniais tirpikliais, todėl rekomenduojami alkoholio - vandens arba acetono - vandens mišiniai. Vanduo padeda išvengti nepolinių priemaišų, o organiniai tirpikliai sutrumpina ekstrakcijos laiką [36]. Be minėtų fenolinių junginių ekstrahavimo metodų, taikomi ir modernesni: ekstrakcija mikrobangų arba ultragarso ir mikrobangų pagalba, superkritinio skysčio ekstrakcija ir aukšto hidrostatinio slėgio ekstrakcija. Šie metodai brangesni, tačiau išgaunamas švaresnis ekstraktas ir didesnė flavonoidų išeiga [71, 72].Superkritinio skysčio ekstrakcijos (SSE) metu gaunamas itin švarus ekstraktas, apsaugotas nuo degradacijos produktų, galinčių susidaryti dėl ilgo sąlyčio su aukšta temperatūra ir deguonimi. Ekstrakto sudėtyje nėra chlorofilo ir kitų nepolinių junginių, kurie netirpsta superkritiniame anglies diokside [36]. Polinių junginių išskyrimui naudoti vien anglies dioksidą nepakanka: kartu naudojant etanolį, metanolį, etilo acetatą ar kitą organinį modifikatorių, kontroliuojant slėgį ir susmulkinus Ginkgo biloba L. lapus iki 105µm dydžio miltelių, galima išskirti daugelį lapuose esančių fenolinių junginių. Didžiausias išekstrahuotų fenolinių junginių kiekis nustatytas esant bar slėgiui ir 35 o temperatūrai [73, 74, 71]. Didžiausia flavonoidų glikozidų išeiga nustatyta naudojant Soksleto aparatą ir vandens - etanolio mišinį. A. Hasler ir kt. atlikta flavonoidų glikozidų ektrakcija buvo pripažinta kaip viena iš lengviausių ir patogiausių : Ginkgo biloba L. lapų milteliai 60 min veikiami 10 ml vandenilio chlorido rūgšties (25%) ir metanolio tirpalu [11]. Flavan-3-oliai dažnai ekstrahuojami vandens pagalba, o proantocianidinai - naudojant šaltą metanolį [72]. Nauja proantocianidinų ektrakcijos alternatyva - išlydytos druskos, kurios yra chemiškai stabilios, lengvai perdirbamos ir nedegios. Jų naudojimas kartu su mikrobangų ekstrakcijos metodais, padeda išgauti didesnį kiekį proantocianidinų, lyginant su tradiciniais metodais, naudojant vien organinius tirpiklius [71]. Taipogi nustatyta, kad metodai, kuriuose gavybos ir hidrolizės etapai yra atskiri, duoda didesnes ekstrakcijos vertes, nei naudojant kombinuotą ekstrakcijos - hidrolizės procedūrą [11] Mėginio išvalymas Kietosios fazės ekstrakcija pasižymi dideliu efektyvumu ir geru balastinių medžiagų pašalinimu, bei yra tinkama tiek rūgštinių tiek bazinių analičių atskyrimui. Tai greitas ir produktyvus metodas, kurio metu naudojami poliamidiniai sorbentai ir išgaunami švarūs ekstraktai. Siekiant išvengti fenolinių junginių jonizacijos, mėginio tirpalas ir tirpikliai yra parūgštinami [36].

22 22 Ginkgo biloba L. lapų ekstraktai išvalomi nuo taninų ir chlorofilo naudojant sedimentaciją karšto vandens pagalba kartu su makrotinkliniu sorbentu ir poliamidu [11]. Z. Xu ir kt. (2005) modifikavo polivinildienfluorido (PVDF) membraną panaudodami polivinilpirolidoną (PVP), taip efektyviai išgrynindami fenolinius junginius [75]. Molekulinių įspaudų (ang. molecular imprinting) metodas yra dar vienas greitas, paprastas ir dideliu selektyvumu pasižymintis junginių atskyrimo metodas, kuris remiasi polimero sinteze su suformuotomis taikinio - molekulės sujungimo vietomis [76]. Fenolinių junginių atpažinimas yra įmanomas dėl hidroksilo grupių, kurios su taikinio molekulėmis sudaro nekovalentines tarpmolekulines sąveikas (vandenilinius ryšius ir nelokalizuotas elektrostatines sąveikas) [76, 36]. Priešpriešinė (angl. Counter current) chromatografija remiasi frakcionavimu be kietosios fazės, kai fenoliniai junginiai atskiriami naudojant du nesimaišančius tirpiklius. Vanduo iš kolonėlės išplauna ne fenolinės sudėties priemaišas, o fenoliniai junginiai palieka kolonėlę kartu su vandens - metanolio tirpalu (75% v/v) [36] Išskyrimas ir aptikimas Fenolinių junginių išskyrimui ir aptikimui dažniausiai naudojami šie metodai: efektyvioji skysčių chromatografija, dujų chromatografija ir plonasluoksnė chromatografija. Be minėtų metodų galima ir kapiliarinė elektroforezė, magnetinis rezonansas bei spektrofotometrinis nustatymas. Dujų chromatografija (DC) (angl. Gas chromatography) yra chromatografinis skirstymo metodas, pagrįstas skirtinga dujinės fazės sudedamųjų dalių adsorbcija ant sorbento paviršiaus ir vykstantis kolonėlėse. Prie dujų chromatografo prijungus masių spektrometrą (MS) arba liepsnos jonizacijos detektorių (LJD), tiksliai nustatomos net ir itin mažos biologiškai aktyvių junginių koncentracijos [77]. Pastaruoju metu dažniausiai naudojamas masių spektrometrinis detektorius, kuriame, iš chromatografinės kolonėlės patekę junginiai yra jonizuojami ir rūšiuojami pagal masės krūvio santykius, be struktūrinio junginių suardymo [11, 72]. Ginkgo biloba L. lapuose esantys fenoliniai junginiai gali būti identifikuojami ir įvertinami DC metodu, tačiau prieš vykdant fenolinių junginių analizę yra būtinas jų sililinimas. Sililinimo metu susidaro DC analizei tinkantys lakūs, mažesnio poliškumo ir termostabilūs, tačiau jautrūs drėgmei junginiai [78]. Po ginkmedžio lapuose esančių fenolinių junginių hidrolizės ir sonifikacijos atlikus sililinimą, junginiai įvedami į nepolinę kolonėlę (dažniausiai - iš dimetilpolisiloksano) ir atskiriami naudojant 300 o C temperatūrą. F. Deng ir S. W. J. Zito (2003) modifikavo minėtą metodiką naudodami dimetilpolisiloksano kolonėlę su temperatūriniu gradientu nuo 80 o C (0,1 min) iki 245 o C (laikoma 25,5

23 23 min) 25 o C/min, tada 270 o C (laikoma 8min) 60 o C/min. Naudodami MS ir LJD nustatė geresnį junginių atskyrimą, bet užimantį ilgą laiko tarpą. Nelakiųjų junginių tyrimas šiuo metodu vis dar išlieka sudėtingas, todėl Ginkgo biloba L. fenolinių junginių nustatymui dažniausiai pasirenkamas kitas metodas, nereikalaujantis papildomo cheminio junginių apdorojimo [36, 11]. Jau daugiau kaip 20 metų, efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) yra dominuojantis fenolinių junginių nustatymo metodas. Atvirkštinės fazės ESC puikiai tinka skirtingų dviskiaučio ginkmedžio fenolinių junginių atskyrimui. Beveik visada naudojamos trumpos ( mm) ir siauros (3,9-4,6 mm) plieno kolonėlės, pripildytos mažo skersmens (3-10 µm) nejudrios fazės dalelėmis. Analizės metu rekomenduojama o C temperatūra, o jos palaikymas padidina rezultatų atsikartojamumą. Fenolinių junginių analizei naudojamas tiek izokratinis, tiek gradientinis eliuavimas. Kai analizuojamos skirtingo poliškumo ir cheminių struktūrų Gingko biloba fenoliniai junginiai, yra būtinas gradientinis eliuavimas. Daugumos fenolinių rūgščių pk a yra apie 4, kai flavonoidų pk a didesnė. Siekiant išvengti analičių jonizacijos, rekomenduojama ESC metodo ph - 2-4, kuri palaikoma pridedant rūgšties. Fenolinės rūgštys, turinčios daugiau aromatinių žiedų pasižymi mažesniu poliškumu ir išplaunamos iš kolonėlės vėliau nei kitos medžiagos [36]. S. Ding ir kt. identifikavo 70 ginkmedžio fenolinių junginių, panaudoję Phenomenex (15x300µm) kolonėlę ir gradientinį eliuavimą: 90%(0,1% acto rūgštis vandenyje) pervedant į 98% (acetonitrilas-metanolis (1:1)) 125 min esant 4µl/min tekėjimo greičiui. X. Zhu ir kt. dviskiaučio ginkmedžio aglikonų nustatymui naudojo kolonėlę C 18 Capsell Pack (1,5 x 250 mm, 5µm), mobiliąją fazę, sudarytą iš 0,5% fosfatinio buferio ir metanolio (48:52), tekėjimo greitį - 0,2 ml/min ir UV detekcija (ƛ = 360 nm). Kemferolis, kvercetinas ir izohamnetinas buvo atskirti per 16 minučių [11].Kaip mobilioji fazė, dažniausiai naudojami metanolis ir acetonitrilas, kurie pasižymi geresne rezoliucija per trumpesnį laiko tarpą, bei ryškesnėmis smailių formomis ir lygesniu jų išsibarstymu, tačiau šiems tirpikliams būtingas didelis toksiškumas. Kito analizės metodo pasirinkimą įtakoja brangi ESC aparatūra ir dažnai sudėtinga mėginių analizė [36, 11]. Plonasluoksnė chromatografija (PC) (angl. Thin-layer chromatography) - plačiai naudojamas organinių ir neorganinių medžiagų identifikavimo ir kiekybinės analizės metodas [79]. Dažną šio metodo pasirinkimą nulemia jo paprastumas, atrankumas, mažas žaliavos sueikvojimas ir santykinai nebrangus prietaisas, kurio nuolatinis tobulinimas didina metodo jautrumą, greitina junginių atskyrimą. Didžioji dalis etapų yra automatizuoti, o moderni aukštos kokybės plonasluoksnė chromatografija leidžia nustatyti didelį mėginių kiekį vieno chromatografavimo metu. Plonasluoksnė chromatografija naudojama įvairiose srityse: farmacinių produktų analizėje ir gamyboje, chemijoje, aplinkos toksikologijoje, maisto, vandens, neorganinių junginių ir pesticidų analizės metu [80]. Naudojama 0,1-0,25 mm storio stiklo, aliuminio ar

24 24 plastiko plokštelė, padengta plonu (0,1-0,25 mm) sorbento sluoksniu [80]. Dažniausiai naudojamos stiklo arba plastiko plokštelės, padengtos silikageliu, kurio dalelių dydis svyruoja nuo 2 µm iki 25µm [79]. P.E. Wall (2005) pateikia pagrindinius PC metodikos principus: 1) Mėginys yra ištirpinamas atitinkamame tirpiklyje ir keli jo mikrolitrai (µl) užlašinami ant plokštelės starto linijos. 2) Apatinė 0,5 cm plokštelės dalis panardinama į chromatografijos kamerą, kuri užpildyta eliuentu. Plokštelės starto linija neturi liestis su judančiąja faze, kitaip tirpiklis gali išplauti tiriamąją medžiagą. Veikiant kapiliarinėms jėgoms, judančioji fazė kyla silikagelio plokštele aukštyn. 3) Tiriamosios medžiagos per sorbento sluoksnį juda skirtingu greičiu - kuo medžiagos poliškesnės, tuo jos praleidžia trumpesnį laiką judančioje fazėje ir nueina trumpesnį atstumą. 4) Išdžiovinus plokštelę, tiriamieji junginiai identifikuojami apšvietus UV spinduliuote arba ryškinant atitinkamais reagentais. Junginiai identifikuojami apskaičiuojant R f vertes ir lyginant jas su standartais [80]. Analizės metu gali būti naudojami dvidešimt penki skirtingi sorbentai. Prieš pasirenkant sorbentą, turi būti įvertinamos tiriamųjų junginių charakteristikos: poliškumas, tirpumas, gebėjimas jonizuotis, molekulinė masė [80]. Vienas iš dažniausiai naudojamų sorbentų silikagelis [80]. Tai amorfinė medžiaga, gaunama nusodinant silikatinį tirpalą ir pridedant rūgšties. Struktūros pagrindą sudaro susijungusios silicio ir deguonies molekulės. Paviršiuje esančios hidroksilo grupės silikageliui suteikia stiprias adsorbcines ir polines savybes. Šis sorbentas naudojamas mažiau polinių flavonoidų atskyrimui, tačiau naudojant polinius tirpiklius galimas ir flavonoidų glikozidų atskyrimas. Porų dydis turi įtakos selektyvumui ir mėginio komponentų skiriamajai gebai. Dažniausiai renkamasis silikagelis 60, dėl tinkamiausio (ne per greito ir ne per lėto) tirpiklio judėjimo sorbento sluoksniu. Į tirpiklį įterptas rūgštinis modifikatorius, padidina fenolinių junginių skiriamąją gebą. Be silikagelio, adsorbentais naudojami poliamidas, Sephadex, celiuliozė. Mikrokristalinę celiuliozę dažniausiai renkamasi siekiant atskirti poliškus junginius - antocianinus ir antocianidinus, tačiau jai būdinga ribota skiriamoji geba. Sephadex LH-20 yra hidroksipropilinto dekstrano gelis, kuris kombinuojamas su atitinkamu organiniu tirpikliu ar vandens/tirpiklio mišiniu. Tačiau jo vartojimą apriboja rūgštinių tirpiklių naudojimas [92]. Renkantis mobiliąją fazę, svarbu atsiminti, kad poliniams junginiams reikalingas polinis eliuentas, o nepoliniams nepolinis. Tiriamojo junginio tirpalas turi stipriai sąveikauti su sorbentu, kad vyktų junginio adsorbcija ir ant plokštelės išryškėtų tiriamojo junginio dėmė. [80] Tirpikliai, suskirstyti pagal didėjantį poliškumą, pavaizduoti 3 lentelėje (žr. 2 priedas). Labiau polinis tirpiklis ar tirpiklių mišinys priverčia aukščiau ir toliau PC plokštele judėti polinius junginius. Nepoliniai junginiai keliauja aukštyn su tirpikliu, bet nėra absorbuojami ant sorbento sluoksnio. Keičiant judančiosios fazės tirpiklių mišinio sudėtį, galimi

25 25 atskyrimo pokyčiai, kurie svarbūs, norint gauti skirtingas tiriamųjų junginių R f vertes [79]. Kadangi ginkmedžio lapuose randami fenoliniai junginiai pasižymi tiek polinėmis tiek ir nepolinėmis savybėmis, reikalinga tirpiklių sistema su analogiškomis savybėmis. Labai metilinti ar acetilinti flavonai ir flavonoliai reikalauja nepolinių tirpiklių, tokių kaip chloroformo - metanolio mišinys (15:1). Ginkgo biloba L. lapuose sutinkamų flavonoidų aglikonų atskyrimui naudojamas chloroformo - metanolio (96:4) mišinys, arba į juos panašaus poliškumo tirpikliai. Plačiai paplitusią fenolinių junginių atskyrimui naudojamą tirpiklių sistemą sudaro etilo acetatas, skruzdžių rūgštis, ledinė acto rūgštis ir vanduo [72]. Ši sistema dažniausiai naudojama dėl skirtingo poliškumo reagentų, todėl tinka tiek fenolinių rūgščių tiek flavonoidų atskyrimui. Chloroformo, acetono, skruzdžių rūgšties sistema, tinka Ginkgo biloba L. biflavonoidų nustatymui, o tolueno ir acetono sistema (70:30) flavan-3-olių nustatymui [81]. Junginius atskyrus plonaluoksnės chromatografijos metodu, galimas ir kiekybinis jų nustatymas. Plonasluosnės chromatografijos būdu atliktas kiekybinis nustatymas gali būti trejopas. Pats paprasčiausias, bet pasižymintis mažiausiu tikslumu vizualinis įvertinimas. Daug tikslesnis, bet užimantis daugiau laiko chromatografinės zonos nugramdymas nuo sorbento ir jos koncentracijos apskaičiavimais įvairias instrumentiniais metodais. Nuograndos perkeliamos į indą su ekstrakcijai naudojamu tirpikliu, maišoma, kol ištirpsta analitė, o sorbentas pašalinamas centrifugavimu arba filtruojant. Tačiau čia taipogi galimi nukrypimai: sunku užtikrinti visišką chromatografinės zonos pašalinimą nuo sorbento ir galimo užteršimo su kitoje zonose esančiais junginiais. Dėl šių trūkumų densitometrija tapo populiariausiu, tiksliausiu ir patikimiausiu plonasluoksnės chromatografijos kiekybinio nustatymo metodu [80]. Densitometras prietaisas, skirtas išryškinto fotografinio sluoksnio optiniam tankiui matuoti. Sujungtas su kompiuteriu pasižymi aukštu atkuriamumu ir tiksliais rezultatais. Šio metodo pagrindas yra elektromagnetinė spinduliuotė, pagal iš anksto nustatytą šviesos bangos ilgį ( nm). Spektrodensitometrijoje būdingas tiesioginis ryšys tarp optinio tankio ir analitės koncentracijos tirpale. Skenavimas vyksta labai greitai (apie 100 mm s -1 ), su µ erdvine skiriamąja geba. Tais atvejais, kai medžiaga geba fluorescencijuoti arba kai fluorescenciją sukelia cheminis medžiagos apdorojimas, detekcijos jautrumas yra daug geresnis padidėja apie kartų. Apšviesta chromatografinė plokštelė yra nufotografuojama, o gauti duomenys yra perkeliami į personalinį kompiuterį. Visi parametrai (pvz., ryškumas, kontrastas, spalvų balansas, intensyvumas) keičiami programinės įrangos pagalba [80]. Kapiliarinė elektroforezė (KE) - modernus mikroanalizės metodas, ESC ir elektroforezės derinys. Fenolinių junginių atskyrimas vyksta siaurame (50-100µm vidinio skersmens) silikagelio kapiliaro viduje, naudojant aukšto elektrinio lauko stiprio (10-30 kw) reikšmes, mažo dydžio mėginius (10-50 nl) ir fosforo ar borato buferius. Detekcija atliekama naudojant UV arba MS, kurių dėka gaunamos elektroferogramos. Lyginant ESC ir KE, pastaroji pasižymi 3 kartus trumpesne analizės trukme, bet 5

26 26 kartus mažesniu analizės jautrumu. Micelinėje elektrokinetinėje chromatografijoje (MEKC) naudojami detergentai, sudarantys miceles [36]. Flavonoidai stipriai sąveikauja su micelėmis, todėl jų selektyvumas gali varijuoti modifikuotant micelinę fazę [11]. Dažniausiai ginkmedžio fenolinių junginių analizei pasirenkamas detergentas - natrio dodecilsulfatas, pagerinantis polinių ir nepolinių analičių skiriamąją gebą. KE analizė trunka trumpai, naudojama nesudėtinga aparatūra ir maži kiekiai reagentų, tačiau tiksliam kiekybinės analizės operacijų atkartojamumui būtinas proceso automatizavimas [36]. Spektofotometrinė fenolinių junginių analizė, gali būti atliekama nustatant kiekybinius ir kokybinius parametrus. Fenoliniai junginiai turi absorbcijos maksimumus tarp nm, tačiau ją gali paveikti tirpalo ph ir tirpiklio prigimtis. Absorbcijai gali trukdyti baltymai, nukleino ir amino rūgštys. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymui taikomi Folin-Denis ir Folin-Ciocalteu kolorimetriniai metodai, kurie pagrįsti fenolinių junginių komplekso susidarymu šarminiame tirpale su molibdeno ir volframo fosforo rūgštimis. Šis kompleksas aptinkamas ties 760 nm bangos ilgiu. Tačiau minėti reagentai neaptinka visų fenolinių junginių ir analizei gali trukdyti pašalinės redukuojančios medžiagos, pvz. askorbo rūgštis. Vanilino metodas yra specifiškas flavan-3-oliams ir proantocianidinams, o bendras flavonoidų, kofeino ir taninų kiekis nustatomas su aliuminio jonais [36]. Ginkgo biloba L. lapuose esančių fenolinių junginių stereostruktūros identifikavimui, kiekybiniam nustatymui įmanomas branduolių magnetinio rezonanso tyrimas. Šio metodo taikymą riboja brangi aparatūra, eksperto įgūdžiai, savitųjų tirpiklių ir reagentų poveikis. Viename iš tyrimų, kaip tirpiklio sistema Ginkgo biloba L. lapuose esančių flavonoidų kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui naudotas metanolis ir benzenas (65:35), tačiau didžiausias šio metodo trūkumas - ribotas jautrumas (izohamnetino kiekybinė analizė išlieka labai problematiška). Artimųjų infraraudonųjų spindulių spektrometrija naudojama efektyviam, greitam ir paprastam fenolinių junginių, esančių ginkmedžio lapuose, nustatymui, be jų suardymo. Tačiau reikia daug laiko, kad metodas būtų patvirtintas, be to, būtinas etaloninių medžiagų naudojimas [11].