Dekoratyviųjų ir sodo augalų sortimento, technologijų ir aplinkos optimizavimas Mokslo darbai. 2014 (5) 10. ISSN 2029-1906, ISSN 2335-7282 (online) Biomedicinos mokslai/ Biomedical sciences ŽIEDINUKŲ (Brassicogethes spp.) RŪŠIŲ NUSTATYMAS MOLEKULINIU (SEKOSKAITOS) METODU IR GENETINĖS ĮVAIROVĖS ĮVERTINIMAS Vaclovas Makūnas Kauno kolegijos Technologijų ir kraštotvarkos fakulteto Želdinių ir agrotechnologijų katedra Pramonės pr. 22, LT-50468 Kaunas, el. paštas vaclovas.makunas@go.kauko.lt Recenzentas: lekt. Jonas Vaidelys, Kauno kolegija Anotacija Žiedinukų (Brassicogethes spp. ) rūšinė sudėtis Kėdainių populiacijų, surinktų 2010 m. žieminiuose ir vasariniuose rapsuose nustatyta bei genetinė įvairovė įvertinta naudojant molekulinį sekoskaitos metodą. Nustatytos dvi rūšys vyraujanti (98,2 % ) Brassicogethes aeneus ir B. viridescens (1,8 %). Pagal mtdnr sekas nustatyti penki skirtingi B. aeneus rūšies vabalų haplotipai (Ked_A, Ked_B, Ked_C, Ked_D, Ked_E), didžiausias genetinis atstumas tarp jų 0,5%. Dažniausiai buvo aptinkamas haplotipas Ked_B (70,9%), kuris buvo nustatytas visuose ėminiuose iš žieminių ir vasarinių rapsų. B. viridescens rūšies (tiek iš Kėdainių populiacijos, tiek iš Alytaus, Prienų bei Tauragės populiacijų) nustatyti du haplotipai Ked_V ir Ked_V1. Haplotipas Ked_V buvo identiškas Genų banke deponuotam haplotipui (iš Suomijos), o haplotipas Ked_V1 nustatytas tik vienoje iš tirtų populiacijų (Alytaus). Pagal mtdnr COI genų sekas Kėdainių populiacijos tirti B. aeneus individai yra labai artimi iš Suomijos Genų banke deponuotiems šios rūšies vabalų duomenims, tačiau skiriasi nuo Jungtinėje Karalystėje ar Italijoje išplitusių individų. Raktiniai žodžiai: Brassicogethes aeneus, B. viridescens, molekulinis rūšių nustatymas, sekoskaita, genetinė įvairovė. Įvadas Rapsų svarba ir auginami jų plotai, mažėjant pasaulyje naftos atsargoms bei didėjant maisto poreikiui, nuolat didėja. Vien tik Lietuvoje, auginamų žieminių ir vasarinių rapsų plotai nuo 2000 iki 2013 metų padidėjo 4,7 karto ir siekė 264,2 tūkst. ha 2013 metais (Lietuvos statistikos departamentas, 2014). Didėjant rapsų pasėlių plotams bei jų daliai sėjomainose, susidaro palankios sąlygoms įvairiems rapsų kenkėjams plisti, Vien tik rapsinis žiedinukas (Brassicogethes aeneus Fabricius, sin. Meligethes aeneus) bei antroji pagal gausumą ir kenkimo pobūdį panaši rūšis B. viridescens Fabricius (sin. Meligethes viridescens) palankiais jų plitimui metais gali sunaikinti iki 50 % rapsų sėklų derliaus (Барташявичене, 1984). Kitų autorių duomenimis nurodoma, kad jų daroma žala taip pat yra gana didelė, nes priklausomai nuo sąlygų gali siekti 3,3 30,1 % (Petraitienė ir kt., 2008). Kaip lydimosios rūšys vasarinių rapsų pasėliuose Lietuvoje buvo aptiktos žiedinukų rūšys: Lamiogethes ochropus Sturm. (sin. Meligethes ochropus Sturm), Fabogethes nigrescens Stephens (sin. Meligethes nigrescens Stephens) ir Thymogethes egenus Erichson (sin. Meligethes egenus Erichson) (Tamutis, 1999). Vėliau atliktais tyrimais, be jau minėtų rūšių, rapsų pasėliuose buvo nustatytos Lamiogethes pedicularius (Gyllenhal, 1808) = viduatus (Heer, 1841), (syn. M. pedicularius (Gyllenhal) bei Brassicogethes coracinus (Sturm, 1845) (sin. Meligethes coracinus (Sturm)) (Makūnas, 2012). Atkreiptinas dėmesys į B. coracinus (Sturm) rūšį, kuri anksčiau rapsų pasėliuose Lietuvoje nebuvo nustatyta (Tamutis, 1999). B. coracinus vystimosi ciklas susijęs su bastutinių šeimos augalais (Nunberg, 1976). Vokietijoje B. coracinus nurodoma prie 94
Optimization of ornamental and garden plant assortment, technologies and environment. Scientific articles. 2014 (5) 10. ISSN 2029-1906, ISSN 2335-7282 (online) svarbiausių, rapsams didžiausią žalą darančių žiedinukų rūšių (Ulber, Thieme, 2007). Vengrijoje ši žiedinukų rūšis yra įvardijama taip pat kaip labai žalinga rapsams (Marczali, Keszthelyi, 2003). Rūšinė sudėtis ir kiekybinis atskirų rūšių individų santykis populiacijoje yra svarbus atliekant žiedinukų atsparumo insekticidams tyrimus, nes skirtingos žiedinukų rūšys yra nevienodai atsparios piretroidų klsės insekticidams (Derron ir kt., 2004, Thieme ir kt., 2010) bei kitus ūkinius ar biologinius tyrimus. Be plačiai gyvų organizmų rūšių identifikavimui naudojamo morfologinio metodo, pastaraisiais metais vis dažniau yra taikomi molekuliniai metodai, kurie gali būti taikomi ir Brassicogethess spp. genties rūšims, kaip ekonominiu požiūriu svarbiems vabzdžiams, identifikuoti (De Biase ir kt., 2003). Gyvuose organizmuose genetinė informacija užrašoma ir perduodama palikuonims nukleininių rūgščių (DNR, RNR) pagalba. Šis universalus kodas ir panaudojamas vienam tiksliausių rūšių nustatymui, taip vadinamu barkodingo metodu (De Salle, 2006). Paprastai didžioji dalis DNR yra ląstelės branduolyje, o mitochondrinė DNR DNR esanti ląstelių mitochondrijose. Mitochondrijų DNR (mtdnr) buvo atrasta M. Nass ir S. Nass (1963). Dėl specifinio mtdnr paveldėjimo bei dažnesnio nei branduolinės DNR mutacijų skaičiaus, būtent mtdnr dažniausiai naudojama filogenetiniuose ir filogeografiniuose tyrimuose. Ji taip pat naudojama genetinių ryšių tarp individų ir individų grupių tyrimams rūšies viduje ir evoliuciškai nedaug nutolusių rūšių ryšiams nustatyti (Brown ir kt., 1979). Molekuliniuose tyrimuose mtdnr Citochromoksidazės C subvieneto I (COI) sekos yra naudojamos rūšių nustatymui DNR barkodingo būdu. Remiantis DNR barkodingo pagrindine idėja, mtdnr, palyginti su branduolio DNR, būdingas spartus mutacijų susidarymo greitis, todėl susidaro ryškus mtdnr sekų skirtumai tarp skirtingų rūšių, o pagal mtdnr sekas galima tiksliai nustatyti organizmo priklausomybę tam tikrai rūšiai. Molekulinių duomenų apie Brassicogethes spp. genties vabalus yra nedaug. Tai negausūs duomenys apie mtdnr Citochromoksidazės C subvieneto I (COI) bei Kontrolinio regiono sekas, branduolio DNR ITS2 ir Fosfoenolpiruvato karboksikinazės geno (PEPCK) sekas (Audisio ir kt., 2009). Manoma, kad Brassicogethes spp. vabalų COI sekos nėra tinkamos filogenijos tyrimams aukštesniame nei rūšies lygmenyje (Audisio ir kt., 2009). DNR sekoskaita (nukleotidų sekų nustatymas) teikia išsamią ir ilgalaikę informaciją apie tam tikrų genų sandarą. Naudojant specifinius pradmenis PGR (polimerazinės grandininės reakcijos) proceso metu padauginamas tam tikras genas, vėliau nuskaitoma jį sudarančių nukleotidų seka. Šiuos duomenis galima palyginti, lyginamos skirtingų tyrimų metu nuskaitytos to paties geno sekos. DNR sekoskaita yra brangus procesas, o kai kuriuose DNR segmentuose yra gana sudėtinga nustatyti nukleotidų sekas (Kazachkova ir kt., 2007). Šiuo būdu gali būti tiriami tiek genetinė įvairovė, tiek genetinė populiacijų struktūra, genų mainai, filogenija bei filogeografija. Tyrimų metu svarbu, koks genas yra pasirenkamas. Metodika (metodai) Šiam tyrimui buvo panaudota dalis 2010 m. įvairiuose Lietuvos regionuose surinktų vabalų, naudotų jų atsparumo piretroidų klasės insekticidams, tyrimams. Vabalai buvo renkami rapsams žydint (BBCH 60 69, pagal Lancashire ir kt., 1991). Iš vieno lauko buvo surenkkamas vienas ėminys. Vabalai buvo renkami einant technologinėmis vėžėmis, iš viso lauko (pakraščių ir vidurio). Vabalų rinkimo vieta (rapsų laukas) buvo nustatoma mobiliąja GPS sistema Mobile Mapper, fiksuojant koordinates. Einant rapsų lauku, žiedinukai buvo krečiami nuo rapsų žiedynų į dėžutę, iš kurios surinkti vabalai buvo supilti į ventiliuojamus plastikinius konteinerius ir juose transportuojami į laboratoriją. 95
Dekoratyviųjų ir sodo augalų sortimento, technologijų ir aplinkos optimizavimas Mokslo darbai. 2014 (5) 10. ISSN 2029-1906, ISSN 2335-7282 (online) Surinkus ėminį, buvo užpildoma anketa, kurioje nurodoma surinkimo vieta, data, augalas nuo kurio rinkti vabalai, suteikiamas ėminiui numeris ir pavadinimas pagal administracinį rajoną: pvz. Joniškio populiacija, Kėdainių populiacija ir t.t. Terminas populiacija šiuo atveju biologine prasme nėra tikslus, nes rapsinis žiedinukas (B. aeneus) yra aktyviai migruojantis kenkėjas, o jo migracija priklauso nuo įvairų faktorių: oro temperatūros, vėjo krypties (Williams ir kt., 2007) ir kt., todėl yra teorinė galimybė, kad konkretaus lauko populiacijoje gali būti individų iš genetiškai skirtingų populiacijų. Kita vertus, toks terminas dažnai naudojamas tokio pobūdžio tyrimų rezultatų pateikime, suprantant tam tikros rūšies individų grupę konkrečiame lauke kaip to lauko populiaciją (Hansen,2003; Węgorek ir kt., 2009). Žiedinukų (Brassicogethes spp.) rūšinės sudėties molekuliniu metodu nustatymui bei genetinės įvairovės įvertinimui buvo naudojami Kėdainių rajone žieminiuose (Nr. 62) ir vasariniuose rapsuose (Nr.92) surinkti ir po atsparumo tyrimo likę gyvi bei žuvusieji vabalai. (Makūnas, 2012). Atlikus atsparumo įvertinimą, žuvę ir likę gyvi vabalai buvo fiksuojami (konservuojami) ir iki rūšių nustatymo molekuliniu metodu buvo laikomi 70 % spirite. Tyrimui vabalai buvo atrinkti iš žieminiuose rapsuose surinktų atsparių Brassicogethes spp, individų, kurie liko gyvi, paveikus 100 % rekomenduojama insekticido norma (toliau Nr.62 100 % G), ir iš individų, likusių gyvų, paveikus 20 % rekomenduojamos normos (toliau Nr.62 20 % G). Jautrūs insekticidams žieminiuose rapsuose surinkti vabalai tyrimui buvo atrinkti iš žuvusių nuo 20 % rekomenduojamos insekticidų normos individų (toliau Nr.62 20 % N) ir iš žuvusių nuo 100 % rekomenduojamos insekticido normos (toliau Nr.62 100 % N). Analogiškai buvo atrinkti individai tyrimui iš vasarinių rapsų: atsparūs Nr.92 100 % G ir Nr.92 20 % G, jautrūs Nr.92 20 % N ir Nr.92 100 % N. Buvo siekta ištirti po 30 individų iš keturių vabalų grupių (iš viso 120 individų iš ėminių Nr. 62 20 % N; Nr. 62 100 % G; Nr. 92 20 % N; Nr. 92 100 % G). Atsižvelgiant į tai, kad identifikuojant rūšis molekuliniu metodu Brassicogethes spp. ėminyje iš Kėdainių populiacijos po atsparumo tyrimo buvo nustatyti tik du individai, priklausantys B. viridescens rūšiai, išsamesniam filogenetiniam medžiui sudaryti buvo ištirti morfologiškai apibūdinti B. viridescens egzemplioriai iš kitų populiacijų. Tiriant morfologiniu metodu identifikuotus B. viridescens individus iš Kėdainių, Alytaus, Tauragės ir Prienų populiacijų surinktų ėminiuose iš žieminių (ŽR) ir vasarinių (VR) rapsų buvo išskirta DNR ir su C1-J-2183 / L2-N-3014 pradmenų pora amplifikuota: Kėdainių raj. (VR) 1vnt., Kėdainių raj (ŽR) 2 vnt., Alytaus raj. (VR) 3 vnt., Prienų raj. (ŽR) 1 vnt., Tauragės raj.(žr) 4 vnt (iš viso 11 vnt.). Žiedinukų rūšių identifikavimui molekuliniu metodu bei genetinės įvairovės analizei iš atrinktų individų buvo išskiriama DNR, atliekama polimerazės grandininė reakcija (PGR) ir atliekama gautų duomenų analizė. DNR išskyrimas ir PGR reakcijos buvo atliekamos Gamtos tyrimų Centro Ekologijos instituto P.Siviskio parazitologijos laboratorijoje. DNR sekoskaita buvo atliekamas kompanijoje Macrogen Inc (Pietų Korėjoje). DNR išskyrimas. DNR buvo skiriama dviem skirtingais būdais. DNR išskyrimui buvo naudotas pakoreguotas Robertson ir MacLeod (Sebastiani ir kt., 2001) DNR išskyrimo metodas. Šiuo būdu DNR buvo išskirta iš 265 Brassicogethes spp. individų. DNR taip pat buvo išskiriama naudojant DNR išskyrimui skirtą rinkinį ZR Tissue & Insect DNA MiniPrep (Catalog No D6016 ir No D6015) ir vadovaujantis gamintojų pateikta DNR išskyrimo instrukcija. Tokiu būdu buvo išskiriama DNR iš 43 Brassicogethes spp. vabalų. Polimerazės grandininė reakcija. Jai naudojome dvi poras mtdnr COI geno pradmenų: LCO1490 (5`- GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3`), HCO2198 (5`- TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3`) (Folmer ir kt., 1994) ir C1-J-2183 (5 - CAA CAT TTA TTT TGA TTT TTT GG-3 ) ir 5L2-N-3014 (5'-TCC AAT GCA CTA ATC TGC CAT ATT A-3') (Simon ir kt., 1994). 96
Optimization of ornamental and garden plant assortment, technologies and environment. Scientific articles. 2014 (5) 10. ISSN 2029-1906, ISSN 2335-7282 (online) Tyrimų pradžioje buvo naudoti vabzdžiams specifiniai pradmenys LCO1490 ir HCO2198. Šių pradmenų pagalba galima amplifikuoti 610 bazių ilgio COI geno fragmentą. Vėliau buvo pasirinkta kita pradmenų pora, C1-J-2183 ir L2-N-3014, kurios pagalba buvo amplifikuotas kitas, 626 bazių ilgio COI fragmentas. Antrąją pradmenų porą pasirinkome, nes būtent su šiais pradmenimis galėjome sintetinti DNR fragmentą, kurį galima buvo palyginti su Genų banke esančiomis Brassicogethes aeneus (F.) ir Brassicogethes viridescens (F.) COI fragmento sekomis. Atliekant PGR su pradmenimis LCO1490 ir HCO2198, reakcija buvo atliekama 50 μl tirpale. Kiekvienai reakcijai buvo naudota 5 μl 10xPCR Bufferio, 3 μl 25 mm MgCl 2, 5 μl 2 mm dntp, 1 μl kiekvieno pradmens, 0,5 μl Taq Polimerazės ir 2 μl genetinės medžiagos. PGR reakcijos buvo atliekamos šiomis terminėmis sąlygomis: 30 s 94 o C temperatūroje, 30 s 49 o C, 120 s 72 o C (35 ciklai). Prieš ciklines termines reakcijas mėginiai buvo inkubuojami 10 min. 94 o C, bei po reakcijų buvo elonguojami 10 min. 72 o C. PGR produktas buvo tikrinamas elektroforezės būdu, naudojant 1 % agarozės gelį su etidiumbromidu. Viso šiuo būdu buvo tirti 84 Brassicogethes spp. vabalai. Atliekant PGR su pradmenimis C1-J-2183 ir L2-N-3014, reakcija buvo atliekama 50 μl tirpale. Kiekvienai reakcijai buvo naudota 5 μl 10xPCR Bufferio, 4 μl 2 mm dntp, 1 μl kiekvieno pradmens, 0,5 μl DreamTaq Polimerazės ir 2 μl genetinės medžiagos. PGR reakcijos buvo atliekamos šiomis terminėmis sąlygomis: denatūracija 30 s 94 o C temperatūroje, 30 s 47 o C, 90 s 72 o C (36 ciklai). Prieš ciklines termines reakcijas mėginiai buvo inkubuojami 15 min. 95 o C, bei po reakcijų buvo elonguojami 10 min. 72 o C temperatūroje. PGR produktas buvo tikrinamas elektroforezės būdu, naudojant 1 % agarozės gelį su etidiumbromidu. Viso šiuo būdu buvo tirti 284 Brassicogethes spp. vabalai. Rezultatai Atliekant molekulinius žiedinukų tyrimus, sekvenuotų fragmentų chromatogramų įvertinimui ir lyginimui naudota kompiuterinė sekų analizės programa BioEdit 5.0.9 (BioEdit Sequence Alignment Editor). Filogenetinių ryšių nustatymui naudota kompiuterinė programa Mega 4 (Tamura ir kt., 2007). Sekvenuotų sekų nukleotidų analizė atlikta Neignbor-Joining metodu (Saitou, Nei, 1987). Filogenetinis medis su nukleotidais sudarytas remiantis Kimura 2-parameter modeliu (Kimura, 1980). Žiedinukų (Brassicogethes spp.) rūšinės sudėties nustatymas molekuliniu (DNR sekoskaitos) metodu, vidurūšinis Brassicogethes aeneus ir B. viridescens polimorfizmas. Tiriant žiedinukų vabalų, surinktų Kėdainių raj. žieminiuose (ėminys Nr 62) ir vasariniuose rapsuose (ėminys Nr. 92)(po rezistentiškumo įvertinimo, atrenkant vabalus iš žuvusių nuo insekticidų v.m. ir likusių gyvų) mtdnr COI geno sekas buvo tirti 277 vabalai: tarp jų 241 vabalo DNR buvo išskiriama naudojant koreguotą Robertson ir MacLeod (Sebastiani ir kt., 2001) DNR išskyrimo metodą, o 36 vabalų DNR buvo išskiriama naudojant DNR išskyrimo rinkinį ZR Tissue & Insect DNA MiniPrep (Catalog No 6016 ir No6015). Išskirtos DNR amplifikavimas buvo atliekamas naudojant LCO1490 / HCO2198 ir C1-J-2183 / L2-N-3014 pradmenų poras. Naudojant LCO1490 / HCO2198 pradmenų porą buvo sėkmingai amplifikuoti COI geno segmentai tik iš 8 Brassicogethes spp. vabalų, o naudojant C1-J-2183 / L2-N-3014 pradmenų porą buvo sėkmingai amplifikuoti COI geno segmentai iš 112 Brassicogethes spp. vabalų: 62 vabalai iš vasarinių rapsų (iš ėminio Nr 92) ir 50 vabalų iš žieminių rapsų (iš ėminio Nr. 62). Tikslus tirtų vabalų iš kiekvieno ėminio skaičius nurodytas 1 lentelėje. 97
Dekoratyviųjų ir sodo augalų sortimento, technologijų ir aplinkos optimizavimas Mokslo darbai. 2014 (5) 10. ISSN 2029-1906, ISSN 2335-7282 (online) 1 lentelė. Tirtų ir sėkmingai amplifikuotų, iš kiekvieno ėminio, Brassicogethes spp. individų skaičius Table 1. The number of tested and successfully amplified individuals Brassicogethes spp from each sample Ėminio Nr. Sample No Tirta iš viso vnt. Total of tested in units Iš jų DNR išskirta su rinkiniu From which DNA isolated with a set LCO1490 / HCO2198 LCO1490 / HCO2198 C1-J-2183 / L2-N- 3014 C1-J-2183 / L2-N- 3014 Nr. 92 20 % N 80 9 2 32 Nr. 92 100 % N 14 0 0 3 Nr. 92 100 % G 22 9 3 16 Nr. 92 20 % G 20 0 0 11 Nr. 62 20 % N 80 9 1 29 Nr. 62 100 % N 14 0 0 0 Nr. 62 100 % G 27 9 2 12 Nr. 62 20 % G 20 0 0 9 Iš viso: 277 36 8 112 Genų banke yra deponuotos 16-ka B. aeneus rūšies COI geno fragmento sekų (Cassel Lundhagen ir kt., 2009; De Bias ir kt., 2003) iš vabalų surinktų Italijoje, Švedijoje, Didžiojoje Britanijoje, o taip pat trys B. viridescens rūšies COI geno fragmentų sekos (Cassel Lundhagen ir kt., 2009). Genų banke taip pat yra deponuotos M. thalassophilus, M. erysimicola, M. coracinus, M. subaeneus, M. arankae, M. planiusculus, M. matronalis, M. fruticola, M. canariensis, M. isoplexidis, M. subglobosus, M. ovatus, M. asimilis, M. conformis, M. chevrolati, M. scotti, M. longulus, M. epeirosi, M. tristis ir M. gracilis COI geno fragmentų sekos. Palyginus tirtų Brassicogethes spp. vabalų mtdnr COI geno fragmentų sekas su Genų banke pateikta medžiaga, buvo nustatytos dvi vabalų rūšys. Visi ištirti 62 vabalai iš vasariniuose rapsuose surinkto ėminio (Nr. 92 20 % N, 100% N, 100 % G, 20 % G) priklausė vienai rūšiai B. aeneus (F.). Ėminyje Nr. 62 iš žieminių rapsų (tirta 50 individų), 48 vabalai priklausė B. aeneus rūšiai, o 2 vabalai B. viridescens (F.) rūšiai. Vidurūšinis B. aeneus (F.) polimorfizmas. Rapsinio žiedinuko (B. aeneus) mtdnr COI geną sudaro 1551 nukleotidų fragmentas, jis buvo tirtas panaudojus dvi pradmenų poras. Amplifikuojant šio geno DNR fragmentą su pradmenų pora LCO1490 ir HCO2198 padauginamas fragmentas nuo 112 iki 719 nukleotido, tuo tarpu amplifikuojant DNR fragmentą su pradmenų pora C1-J-2183 ir L2-N-3014 padauginamas DNR fragmentas nuo 847 iki 1472 nukleotido. Taigi, dviem skirtingomis pradmenų poromis amplifikuoti COI geno fragmentai nepersidengia ir negali būti palyginti. Dirbant su LCO1490 ir HCO2198 pradmenimis PGR išeiga buvo labai maža (iš tirtų 84 Meligethes vabalų PGR produktas sėkmingai buvo gautas tik 8 iose reakcijose), tuo tarpu dirbant su kita pradmenų pora, C1-J-2183 ir L2-N-3014, PGR produktas sėkmingai buvo gautas 125 iose reakcijose iš 269. Be to, Genų banke yra tik keturios sekos, kurias galima palyginti su fragmentu nuo 112 iki 719 nukleotido ir net 16 sekų, kurias galima palyginti su fragmentu nuo 847 iki 1472 nukleotido, todėl žemiau analizuosime tik su antrąja (C1-J-2183 ir L2-N-3014) pradmenų pora gautas DNR sekas. Vis dėlto, palyginus skirtingų fragmentų nukleotidų sudėtį ir konservatyvių bei variabilių nukleotidų santykį atrodytų, kad didesnį variabilumą parodo pirmasis (nuo 112 iki 719 nukleotido) COI geno fragmentas (2 lentelė), tačiau mūsų tyrimų metu, sėkmingai amplifikavus ir nuskaičius tik 8 sekas, buvo nustatytas tik vienas haplotipas t.y. visos sekos buvo identiškos. 98
Optimization of ornamental and garden plant assortment, technologies and environment. Scientific articles. 2014 (5) 10. ISSN 2029-1906, ISSN 2335-7282 (online) 2 lentelė. Dviejų mtdnr COI geno fragmentų palyginimas (remiantis tomis pačiomis sekomis (1551 nukleotido ilgio) iš Genų banko Table 2. Comparison of two mtdna COI gene fragments (based on the same sequences (length of 1551 nucleotide) from the Gene Bank COI fragmentų parametrai COI fragment parameters LCO1490 ir HCO2198 LCO1490 and HCO2198 Ilgis (nkl) 609 626 Timinas % 35 37,5 Adeninas % 30,5 32,3 Citozinas % 18 15,4 Guaninas % 16,4 14,7 Konservatyvūs nukleotidai % 96,7 98,1 Variabilūs nukleotidai % 3,3 1,9 Parsimoniškai informatyvūs nukleotidai % 1 0,2 Atstumas tarp sekų 0,018 0,010 C1-J-2183 ir L2-N-3014 C1-J-2183 and L2-N-3014 Tyrimų metu, nustačius 110-ies B. aeneus vabalų (iš 112 amplifikuotų) mt DNR COI geno fragmentų sekas (su C1-J-2183 ir L2-N-3014 pradmenimis) buvo nustatyti penki skirtingi haplotipai (Ked_A, Ked_B, Ked_C, Ked_D, Ked_E), vienas jų, Ked_A, buvo identiškas haplotipui deponuotam Genų banke. Vidutinis Jukes Cantor atstumas tarp penkių haplotipų buvo 0,3 %, panašiausi haplotipai Ked_A ir Ked_B, Ked_A ir Ked_C, Ked_A ir Ked_E bei Ked_C ir Ked_D, labiausiai skyrėsi (Jukes Cantor atstumas 0,5 %) haplotipai Ked_B ir Ked_D bei Ked_D ir Ked_E (3 lentelė). Kaip ir kitų tyrinėtų vabzdžių atveju (Simon ir kt., 1994) sekoje vyravo Timinas (37,5 %) ir Adeninas (31,8 %), gerokai mažiau buvo Citozino (15,6 %) ir Guanino (15,2 %). Iš visų saitų 622 buvo konservatyvūs, 4 variabilūs ir 1 parsimoniškai informatyvus. 3 lentelė. Jukes Cantor atstumai tarp skirtingų B. aeneus haplotipų Table 3. Jukes Cantor distance among different B. aeneus haplotypes Haplotipai Ked_A Ked_B Ked_C Ked_D Haplotypes Ked_B 0,2 Ked_C 0,2 0,3 Ked_D 0,3 0,5 0,2 Ked_E 0,2 0,3 0,3 0,5 Dažniausiai buvo aptinkamas haplotipas Ked_B (70,9 %), kuris buvo aptiktas visuose tirtuose ėminiuose, surinktuose tiek iš žieminių, tiek iš vasarinių rapsų (4 lentelė), o juose sudarė nuo 25,9 % (Nr. 62 20 % N, ėminiuose iš žieminių rapsų jautrių insekticidams) iki 100% (Nr. 92 100 % N, ėminiuose iš vasarinių rapsų, kuriuose vabalai žuvo nuo rekomenduojamos lauko normos) tirtų individų. Dažnas buvo Ked_C (10,9 %) haplotipas, sudaręs nuo 16,7 % (Nr. 62 100 % G ėminiuose iš žieminių rapsų, atsparių insekticidams) iki 29,6 % (Nr. 62 20 % N, ėminiuose iš žieminių rapsų, jautrių insekticidams) tirtų ėminiuose individų. Kiti haplotipai sudarė mažiau kaip 10 % visų tirtų individų. 99
Ėminys* Sample* Dekoratyviųjų ir sodo augalų sortimento, technologijų ir aplinkos optimizavimas Mokslo darbai. 2014 (5) 10. ISSN 2029-1906, ISSN 2335-7282 (online) 4 lentelė. Skirtingų haplotipų individų skaičius įvairiuose rapsinio žiedinuko (B. aeneus) ėminiuose Table 4. The number of individuals with different haplotypes in various samples of Pollen beetle (B. aeneus) Tirta individų Tested individuals B.aeneus individų, priskiriamų haplotipams Ked A Ked B Ked C Ked D Ked E vnt. units % vnt. units % vnt. units % vnt. units % vnt. units % N 20 % 59 7 11,9 39 66,1 8 13,6 5 8,5 0 0 G 100 % 28 3 10,7 19 67,9 2 7,1 3 10,7 1 3,6 G 20 % 20 0 0 17 85,0 2 10,0 1 5,0 0 0 N 100 % 3 0 0 3 100 0 0 0 0 0 0 Iš viso: 110 10 9,1 78 70,9 12 10,9 9 8,2 1 0,9 *N, G atitinkamai žuvę ar likę gyvi individai paveikus atitinkama insekticido norma Haplotipai Ked A, Ked B, Ked C ir Ked D buvo aptinkami tiek tarp insekticidams atsparių rapsinių žiedinukų (G išlikę gyvi individai, paveikus 100 % registruotos insekticido lauko normos), tiek tarp insekticidams jautrių rapsinių žiedinukų (N žuvę individai, paveikus 20 % registruotos insekticido lauko normos). Haplotipas Ked B vyravo tiek tarp jautrių tiek tarp atsparių insekticidams rapsinių žiedinukų ir sudarė atitinkamai 66,1 ir 67,9 % tarpe tirtų žiedinukų individų. Haplotipo Ked A proporcijos buvo panašios, tačiau haplotipų Ked C ir Ked D proporcijos jautrių ir atsparių insekticidams žiedinukų ėminiuose skyrėsi labiau atspariuose daugiau nustatyta haplotipui Ked D priskirtinų individų, o jautriuose haplotipui Ked C priskirtinų individų. Tarpe atsparių individų buvo aptiktas ir vienas individas, priskirtinas haplotipui Ked E. Remiantis šiais duomenimis manome, kad B. aeneus mtdnr COI geno sekų kintamumas (variability) neatskleidžia ryškių genetinių skirtumų tarp insekticidams atsparių ir jautrių rapsinių žiedinukų. Mūsų gauti duomenys neprieštarauja Švedijos mokslininkų atliktiems B. aeneus vabalų atsparių ir jautrių piretroidų klasės insekticidams tyrimams ir gautiems rezultatams, kurie taip pat neatskleidė ryšio tarp genetinės įvairovės ir atsparumo insekticidams (Kazachkova ir kt., 2007). Vidurūšinis B. viridescens (F.) polimorfizmas. Palyginus tyrimų metu amplifikuotas ir sekvenuotas sekas su Genų banke pateiktomis B. viridescens vabalų COI geno fragmentų sekomis buvo nustatyta, kad 13 tirtų individų, (2 ir 11 atrinktų pagal morfologinius požymius), atitiko B. viridescens rūšies sekas. Ištyrus 626 bazių ilgio sekas, buvo nustatyti du haplotipai pagal COI geno fragmento sekas: Ked_V ir Ked_V1. Jukes Cantor atstumas tarp jų 0,3 %, vienas jų (Ked_V) buvo identiškas Genų banke deponuotam B. viridescens haplotipui. Ked_V1 haplotipas buvo aptiktas tik Alytaus rajono populiacijoje, visi kiti tirti individai buvo priskirti haplotipui Ked_V. Iš tirtų saitų, 605 buvo konservatyvūs, 21 variabilus, o 2 parsimoniškai informatyvūs. Kaip ir B. aeneus bei kitų tyrinėtų vabzdžių atveju (Simon ir kt., 1994), COI fragmente dominavo nukleotidai Timinas (36 %) ir Adeninas (32,3 %), daug mažiau buvo Guanino (15,4 %) ir Citozino (16,2 %). Šių tyrimų metu gautų B. aeneus ir B. viridescens sekų palyginimas su Genų banke pateiktais duomenimis yra pavaizduotas 1-ame paveiksle. B. aeneus pagal mtdnr sekas aiškiai atsiskiria nuo B. viridescens. B. aeneus rūšies viduje visos sekos yra artimai susijusios, išsiskiria seka AM491335 ir sekų grupė AJ536171, AJ536172, AJ536173 ir AJ536176, kurios buvo nustatytos iš rapsinio žiedinuko vabalų, surinktų Italijoje (genų banko duomenys). Visos kitos sekos (tame tarpe ir iš Lietuvos) sudaro vieną didelę giminingą grupę, kurios viduje dar galima išskirti trijų tarpusavyje artimesnių sekų (DQ155865 (J.Karalystė), FJ025818, FJ025825 (Suomija) grupę. Matomai atstumai tarp 100
Optimization of ornamental and garden plant assortment, technologies and environment. Scientific articles. 2014 (5) 10. ISSN 2029-1906, ISSN 2335-7282 (online) rapsinio žiedinuko (B. aeneus) COI fragmento sekų atspindi jų geografinį paplitimą, jei tiriami vabzdžiai surinkti labai toli vienas nuo kito nutolusiuose regionuose, tačiau mūsų šalies teritorija yra per maža, kad joje surinkti vabzdžiai atspindėtų geografinį paplitimą pagal mtdnr sekas. Iš atlikto tyrimo matyti, kad Kėdainių rajone išimtinai vyravo rūšis B. aeneus (F.), o antroji nustatyta rūšis B. viridescens (F.) tesudarė 1,8 % nuo tirtų individų skaičiaus. Palyginus Lietuvoje nustatytas B. aeneus (F.) sekas su Genų banke pateiktomis B. aeneus sekomis galime daryti prielaidą, kad rūšies viduje visos sekos yra labai panašios. 99 62 32 53 80 51 FJ025819 Ked A FJ025824 FJ025820 24 FJ025817 FJ025822 FJ025823 34 FJ025816 47 55 24 48 Ked E Ked C Ked D FJ025821 Ked B FJ025818 DQ155865 FJ025825 AJ536171 AJ536172 99 AJ536176 AJ536173 FJ025826 AM491335 Ked V1 89 Ked V FJ025828 FJ025827 0.01 1 pav. Brassicogethes aeneus ir B. viridescens rūšių COI geno sekų nustatytų iš Lietuvoje surinktos medžiagos (haplotipai Ked_A, Ked_B, Ked_C, Ked_D, Ked_E ir Ked_V, Ked_V1) ir kitų autorių Genų banke deponuotų B. aeneus ir B. viridescens sekų (AM,AJ Italija, DQ J.Karalystė, FJ Suomija) panašumą iliustruojantis filogenetinis medis (neighborn - joining metodas, Kimura 2-parameter modelis, bootstrap replications 1000) Fig. 1. Phylogenetic tree (neighbor joining method, Kimura 2-parameter model, bootstrap replications 1000) illustrating similarities between Brassicogethes aeneus ir B. viridescens species COI gene sequences established in material collected in Lithuania (haplotypes Ked_A, Ked_B, Ked_C, Ked_D, Ked_E ir Ked_V, Ked_V1) and sequences of B. aeneus and B. viridescens deposited in Gene Bank by other authors (AM, AJ Italy, DQ UK, FJ Finland) Taigi, matomai, atstumai tarp B. aeneus (F.) COI fragmento sekų gali atspindėti jų geografinį paplitimą, jei tiriami vabzdžiai surinkti labai toli vienas nuo kito nutolusiuose regionuose. Visi tirti B. aeneus (F.) vabalai pagal COI sekas yra labai artimi tarpusavyje ir jų genetinė įvairovė yra labai maža, taigi, pagal COI sekas, Lietuvoje surinkti B. aeneus (F.) vabalai yra labai artimi Skandinavijos šalyse tirtiems šios rūšies vabalams. 101
Dekoratyviųjų ir sodo augalų sortimento, technologijų ir aplinkos optimizavimas Mokslo darbai. 2014 (5) 10. ISSN 2029-1906, ISSN 2335-7282 (online) Išvados 1. DNR sekoskaitos metodu nustatyta, kad Kėdainių Brassicogethes spp. populiacijoje buvo paplitusios dvi rūšys B. aeneus ir B. viridescens, dominuojanti rūšis B. aeneus (98,2 %). DNR sekoskaitos metodu patvirtinta, kad atrinkti ir morfologiniu metodu apibūdinti B. viridescens individai priklauso B. viridescens rūšiai. 2. Pagal mtdnr COI genų sekas nustatyti penki skirtingi B. aeneus rūšies vabalų haplotipai, didžiausias genetinis atstumas tarp jų 0,5 %. Dažniausiai buvo aptinkamas haplotipas Ked_B (70,9 %), kuris buvo aptiktas visuose ėminiuose tiek iš žieminių, tiek iš vasarinių rapsų. Haplotipas Ked_C buvo nustatytas tik B. aeneus ėminiuose iš žieminių rapsų pasėlių. B. viridescens rūšies nustatyti du haplotipai Ked_V ir Ked_ V1. Haplotipas Ked_ V buvo identiškas Genų banke deponuotam haplotipui (iš Suomijos). 3. Pagal mtdnr COI genų sekas, Lietuvoje paplitę B. aeneus individai yra labai artimi Skandinavijos šalyse paplitusiems šios rūšies vabalams, tačiau skiriasi nuo Jungtinėje Karalystėje ar Italijoje išplitusių individų. Literatūra 1. Audisio P., Cline A. R., De Biase A., Antonini G., ir kt. 2009. Preliminary re-examination of genus-level taxonomy of the pollen beetle subfamily Meligethinae (Coleoptera: Nitidulidae) // Acta Entomologica Musei Nationalis Pragae, vol.49, No.2, p. 341 504. 2. Brown W. M., George M. JR., Wilson A. C. 1979. Rapid evolution of mitochondrial DNA // Proceedings of National Academy of Sciences USA, vol. 76, No. 4, p. 1967 1971. 3. Cassel Lundhagen A., Oberg S., Hogfeldt C., Ekbom B. 2009. Species-specific primers for predation studies of the pollen beetle, Meligethes aeneus (Coleoptera, Nitidulidae) // Molecular Ecology Resources, No. 9, p. 1132 1134. 4. De Biase A., Antonini G., Mancini E., Audisio P. 2003. Molecular taxonomy of two sympatric sibling species of the pollen beetle genus Meligethes (Coleoptera: Nitidulidae) // Zootaxa, No. 190, p. 1-16. 5. De Salle R. 2006. Species discovery versus species identification in DNA barcoding efforts: response to Rubinoff // Conservation Biology, vol. 20, No. 5, p. 1545 7. 6. Derron J.O., Le Clech E., Bezencon N., Goy G. 2004. Resistance des meligethes du colza aux pyrethrinoides dans le basin lemaniue // Revue Suisse d agriculture, vol. 36, ISS. 6, p. 237-242. 7. Hansen L. M. 2003. Insecticide-resistant pollen beetles (Meligethes aeneus F) found in Danish oilseed rape (Brassica napus L) fields // Pest Management Science, vol. 59, p. 1057-1059. 8. Kazachkova N.I. 2007. Genotype analysis and studies of pyrethroid resistance of the oilseed rape (Brassica napus) insect pests - pollen beetle (Meligethes aeneus) // Doctoral thesis, Swedish University of Agricultural Sciences, Upsala, 56 p. 9. Kazachkova N., Meijer J., Ekbom B. 2007. Genetic diversity in pollen beetles (Meligethes aeneus) in Sweden: role of spatial, temporal and insecticide resistance factors // Agricultural and Forest Entomology, vol. 9, ISS. 4, p. 259 269. 10. Kimura M. 1980. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotidae sequences // Journal of Molecular Evolution, No. 16, p. 111-120. 11. Lancashire P.D., Bleiholder H., Van Dem Boom T., ir kt. 1991. A uniform decimal code for growth stages of crops and weeds // Annals of Applied Biology, vol. 119, p. 561-601. 12. Lietuvos statistikos departamentas. 2014. Prieiga per internetą: < http://db1.stat.gov. lt/statbank/default.asp?w=1152> [peržiūrėta 2014 01 10]. 13. Makūnas V. 2012. Žiedinukų (Meligethes s.l.: Coleoptera, Nitidulidae) rūšių įvairovė rapsuose ir rapsinio žiedinuko (Meligethes aeneus (F.) atsparumas piretroidams // daktaro disertacija, - Akademija, 103 p. 14. Marczali ZS., Keszthelyi S. 2003. A Study on Meligethes Species in Keszthely, 2002 // Journal of Central European Agriculture (online), vol. 4, No 3, p. 238-243. 15. Nass M.M.K., Nass S. 1963. Intramitochondrial fibers with DNA characteristics. I. Fixation and electron staining reactions // Journal of Cell Biology, No 19, p. 593-611. 16. Petraitienė B., Brazauskienė I., Šmatas R., Makūnas V. 2008. The spread of pollen beetle (Meligethes aeneus) in spring oilseed rape (Brassica napus) and the efficacy of pyrethroids // Žemdirbystė=Agriculture, vol. 95, No. 3, p. 344-352. 17. Saitou N., Nei M., 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Molecular Biology and Evolution, vol.4, No.4, p. 406-425. 102
Optimization of ornamental and garden plant assortment, technologies and environment. Scientific articles. 2014 (5) 10. ISSN 2029-1906, ISSN 2335-7282 (online) 18. Sebastiani F., Meiswinkel R., Gomulski L.M., Guglielmino C.R., Mellor P.S., Malacrida A.R., Gasperi G. 2001. Molecular differentiation of the Old World Culicoides imicola species complex (Diptera, Ceratopogonidae), inferred using random amplified polymorphic DNA markers // Molecular Ecology, No. 10, p. 1773 1786. 19. Tamura K., Dudley J., Masatoshi M., Kumar S. 2007. MEGA 4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. // Molecular Biology and Evolution, vol.24, No 8, p. 1596-1599. 20. Tamutis V. 1999. Dirvos paviršiaus entomofauna rapsų agrocenozėse // Ekologija, Nr. 1, p. 18 24. 21. Thieme T., Heimbach U. Muller A., 2010. Chemical Control of Insect Pests and Insecticide Resistance in Oilseed rape // In: Williams IH. Biocontrol-Based Integrated Management of Oilseed Rape Pests, Springer, 2010, p. 313-335. 22. Ulber B., Thieme T. 2007. Biology, life cycle and host preferences of pollen beetles (Meligethes spp.) // EPPO Workshop on insecticide resistance of Meligethes spp. (pollen beetle) onoilseed rape, Berlin, 2007-09- 03/05, abstracts, p.7. 23. Węgorek P., Mrowczynski M., Zamojska J. 2009. Resistance of pollen beetle (Meligethes aeneus F.) to selected active substances of insecticides in Poland // Journal of Plant Protection Research, vol.49, No. 1, p. 119-127. 24. Williams I. H., Frearson D., Barari H., Mccartney A. 2007. Migration to and dispersal from oilseed rape by the pollen beetle, Meligethes aeneus, in relation to wind direction // Agricultural and Forest Entomology, No. 9, p. 279-286. 25. Барташявичене Б. 1984. Основные вредители рапса и борьба с ними в Литовской ССР// автореф. дис. канд. с-х. наук, - Ленинград, с. 18-24. IDENTIFICATION OF POLLEN BEETLE (Brassicogethes spp.) SPECIES USING MOLECULAR (SEQUENCING) METHOD AND GENETIC DIVERSITY ASSESSMENT Vaclovas Makūnas Kauno kolegija/university of Applied Sciences, Technology and Landscaping faculty Pramonės str. 22, LT-50468 Kaunas, e-mail: vaclovas.makunas@go.kauko.lt Peer reviewer: Jonas Vaidelys, Kauno kolegija/university of Applied Sciences Summary Pollen beetle (Brassicogethes spp.) species composition in Kėdainiai populations collected in winter and spring oilseed rape in 2010 determined and the genetic diversity assessed using molecular sequencing method. There were two types determined, predominant Brassicogethes aeneus (98.2 %) and B. viridescens (1.8 %). According to the mtdna sequences five different B. aeneus types of beetle haplotypes (Ked_A, Ked_B, Ked_C, Ked_D, Ked_E) were identified with the largest genetic distance of 0.5 % between them. The most common haplotype was Ked_B ( 70.9 %), which was determined in all samples of winter and spring rape. In B. viridescens species two haplotypes Ked_V and Ked_V1 were detected (from populations of Kėdainiai Alytus, Prienai and Tauragė). Ked_V haplotype was identical to the haplotype (from Finland) deposited in the Genbank and haplotype Ked_V1 was found only in one of the populations (from Alytus). According to the mtdna COI gene sequences, B. aeneus individuals from Kėdainiai population are very similar to the data of this type of beetle deposited in Finnish GenBank, however different from the individuals spread in UK or Italy. Keywords: Brassicogethes aeneus, B. viridescens, molecular identification of species, sequencing, genetic diversity. 103