LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETO VETERINARIJOS AKADEMIJA Veterinarijos fakultetas MIKOLOGINIAI IR MIKOTOKSIKOLOGINIAI TYRIMAI EKOLOGIŠKOJE IR ĮP

Transkriptas

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETO VETERINARIJOS AKADEMIJA Veterinarijos fakultetas MIKOLOGINIAI IR MIKOTOKSIKOLOGINIAI TYRIMAI EKOLOGIŠKOJE IR ĮPRASTINĖJE DUONOS GAMYBOS GRANDINĖJE PANAUDOJANT PIENARŪGŠTES BAKTERIJAS DEOKSINIVALENOLIO DETOKSIKACIJAI FUNGICAL AND TOXICOLOGICAL RESEARCH IN ORGANIC AND TRADICIONAL BREAD PRODUCTION CHAIN USING LACTIC ACID BACTERIA FOR DEOXYNIVALENOL DETOXIFICATION MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS KAUNAS 2014

2 PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas Mikologiniai ir mikotoksikologiniai tyrimai ekologiškoje ir įprastinėje duonos gamybos grandinėje panaudojant pienarūgštes bakterijas deoksinivalenolio detoksikacijai 1. Yra atliktas mano paties/pačios; 2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir uţsienyje; 3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą. (data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŢ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. (data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO (data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE (aprobacijos data) (katedros/instituto vedėjo/jos vardas, pavardė) (parašas) Magistro baigiamojo darbo recenzentas 2

3 (vardas, pavardė) (parašas) Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) parašas) 3

4 TURINYS SANTRAUKA... 6 SUMMARY... 8 SANTRUMPOS ĮVADAS LITERATŪROS APŢVALGA Mikroorganizmų paplitimas grūduose Daţniausiai grūduose aptinkami mikromicetai Mikroskopiniai grybai grūduose mikotoksinų producentai Svarbiausi grūduose aptinkami mikotoksinai Aflatoksinai Ochratoksinai Zearalenonas Deoksinivalenolis (DON) Mikotoksinų detoksikavimo būdai Chemininė detoksikacija Fizikinė detoksikacija Biologinė detoksikacija DARBO ATLIKIMO SĄLYGOS IR METODIKA TYRIMŲ CHEMA TYRIMŲ REZULTATAI MIKOLOGINIAI IR MIKOTOKSIKOLOGINIAI TYRIMAI GRŪDŲ MĖGINIUOSE Bendras mikroskopinių grybų sporų skaičius grūduose iš ekologinių ir įprastinių ūkių Mikroskopinių grybų genčių pasiskirstymas MIKOLOGINIAI IR MIKOTOKSIKOLOGINIAI TYRIMAI MILTŲ MĖGINIUOSE

5 4.2.1 Mikroskopinių grybų sporų skaičius kvietiniuose ir ruginiuose miltuose Deoksinivalenolio koncentracija kvietiniuose ir ruginiuose miltuose (µg/kg) FERMENTACIJOS PROCESAI DUONOS GAMYBOS GRANDINĖJE Fermentacijos įtaka DON kiekio sumaţinimui kvietiniuose ir ruginiuose miltuose TYRIMŲ REZULTATŲ APTARIMAS IŠVADOS LITERATŪROS SĄRAŠAS PADĖKA

6 SANTRAUKA MIKOLOGINIAI IR MIKOTOKSIKOLOGINIAI TYRIMAI EKOLOGIŠKOJE IR ĮPRASTINĖJE DUONOS GAMYBOS GRANDINĖJE PANAUDOJANT PIENARŪGŠTES BAKTERIJAS DEOKSINIVALENOLIO DETOKSIKACIJAI Darbą atliko: xxxxx Darbo vadovas: xxxxxx Magistro baigiamojo darbo moksliniai tyrimai buvo atlikti Lietuvos Sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos xxxxxxxx katedroje metais. Magistro darbas yra: 51 psl. 2 lentelės, 20 paveikslų. Šio darbo tikslas: Nustatyti, įvertinti ir palyginti ekologiškoje ir įprastinėje grūdinėje ţaliavoje mikologinį ir mikotoksikologinį uţterštumą, panaudojant pienarūgštes bakterijas deoksinivalenolio detoksikacijai. Darbo uţdaviniai: Ištirti, įvertinti ir palyginti ekologiniuose ir įpratiniuose ūkiuose surinktų grūdų mikologinį ir mikotoksikologinį uţterštumą. Įvertinti ir palyginti kvietinių ir ruginių miltų mikotoksikologinį uţretštumą. Įvertinti fermentacinių procesų įtaką DON kiekiui duonos gamybos grandinėje Naudota metodika: Mikromicetų skaičius įvertintas pagal LST ISO 6611:2004. Mikromicetų rūšys identifikuotos vadovaujantis apibūdintojais (Samson et al., 2000; Lugauskas ir kt., 2002). Mikotoksinų koncentracija nustatyta imunofermentinės analizės metodu (IFA), panaudojus komercinius VERATOX DON 5/5, (Neogen, JAV) rinkinį. Fermentacija atlikta panaudojus pieno rūgšties bakterijų kultūrą L. sakei. Tyrimų rezultatai pateikti panaudojus R statistinį paketą. Išvados: Ištyrūs kviečius ir rugius surinktus iš ekologinių ir iprastinių ūkių daugiausia dominavo Fusarium spp. genties mikromicetai. Potencialūs deoksinivalenolio producentai. Gyvybingų sporų skaičius 33 proc. didesnis nustatytas kviečiuose surinktuose iš ekologinių ūkių (p<0,05). Lyginant rugių mėginius, gyvybingų sporų skaičius 29,5 proc. didesnis nustatytas taip pat ekologiniuose ūkiuose surinktuose rugiuose 44±2,1x10 2 KSV/g (p<0,05). Palyginus gyvybingų sporų skaičių kvietiniuose ir ruginiuose miltuose 5 proc. didenis gyvybingų sporų skaičius buvo aptiktas kvietiniuose miltuose 19±1,3x10 2 KSV/g (p>0,05). DON koncentracija kvietiniuose miltuose buvo aptikta 318 µg/kg, tai 17 proc. didesnė nei ruginiuose miltuose, 6

7 kuriuose DON kiekis buvo 263 µg/kg (p<0,01). Nustatytas stiprus koreliacinis ryšys tarp DON koncentracijos µg/kg kiekio ir sporų skaičiaus KSV/g kvietiniuose miltuose (R 2 =0,9092), ruginiuose miltuose (R 2 =0,8837). Nustatyta, kad fermentuojant kvietinius ir ruginius miltus didţiausias DON koncentracijos sumaţėjimas nustatytas kvietiniuose miltuose kietoje fazėje 52 proc. (p<0,001). Ruginiuose miltuose DON kiekis kietoje fazėje sumaţėjo 39 proc. (p<0,001) Raktaţodţiai: ekologinis, deoksinivalenolis, pienarūgštės bakterijos, detoksikacija, fermentacija. 7

8 SUMMARY FUNGICAL AND TOXICOLOGICAL RESEARCH IN ORGANIC AND TRADICIONAL BREAD PRODUCTION CHAIN USING LACTIC ACID BACTERIA FOR DEOXYNIVALENOL DETOXIFICATION Master student: xxxxxxx The organiser of the final work xxxxxx Keywords: mycotoxins, concentration, feed materials, contamination. Master work was accomplished in period of in the Lithuanian Health Sciences University Veterinary Academy, xxxxxxxxxxxxxxx Structure: 51 pages. There are 2 tables and 20 figures in the thesis. Objective of the thesis: To identify, evaluate and compare mycological and mycotoxicological contamination in ecological and standard grains by using lactic acid bacteria for deoxynivalenol detoxification. Tasks: Investigate, evaluate and compare mycological and mycotoxicological contamination of grains collected in ecological and standard farms. Evaluate and compare mycotoxicological contamination of wheat and rye flour. Evaluate influence of fermentation processes on DON level in bread production chain. Research methodology: The total count of microorganisms (CFU/g -1 ) in the analysed sample was determined by way of dilution using the nutrient agar. LST ISO 6611:2004. Micromycete content was determined according to the method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) by using the commercial VERATOX DON 5/5, (Neogen, JAV). Fermentation processes using latic acid bacteria L. sakei. The results of the data analysis and research presented using the R statistical package. Results and discussion: After examining wheat and rye that were collected from ecological and standard farms, it was noticed that mycromycetes of Fusarium spp. genus dominated mostly. Potential Deoxynivalenol Prudecents. Wheat that was collected from ecological farms had 33 proc. higher number of viable spores, i.e. (p<0,05). Similarly, the number of viable spores of rye was 29.5 proc. higher in the rye that was collected in the ecological farms, i.e. 44±2,1x10 2 CFU/g (p<0,05). (CFU-Colony forming unit). After comparing the number of viable spores in wheat flour and rye flour, the number of viable spores was 5 proc. higher in wheat flour 19±1,3x10 2 CFU/g 8

9 (p>0,05). DON concentration was equal to 318 µg/kg (p<0,01) in wheat flour, that is 17 proc. higher than in rye flour, where DON concentration was equal to 263 µg/kg (p<0,01). A strong correlative bond was determined between the amount of DON concentration µg/kg and the number of spores CFU/g in wheat flour (R 2 =0.9092), rye flour (R 2 =0.8837). When fermenting wheat flour and rye flour, the largest decrease of DON concentration noticed in wheat flour when it is in hard phase was 52 proc. (p<0,001). DON concentration in hard phase decreased by 39 proc. (p<0,001) in rye flour. Keywords: ecological, deoxynivalenol, latic acid bacteria, detoxification, fermentacion. 9

10 SANTRUMPOS DON deoksinivalenolis ZON zearalenonas AFB1 aflatoksinas B1 AFM1 aflatoksinas M1 OTA ochratoksinas A R 2 regresinės lygties koficientas KSV kolonijas sudarantys vienetai ng/kg - nanogramai kilograme p - patikimumo kriterijus µg/kg mikrogramai kilograme HSCAS hidratuotas natrio kalcio aliumosilikatas (O 3) - ozonas PRB pienarūgštės bakterijos spp rūšis, įeinanti į aukštesnį taksoną 10

11 ĮVADAS Pastaruoju laikotarpiu ekonomiškai išsivysčiusių pasaulio šalių gyventojų pasitikėjimą maisto produktų kokybę bei sauga sukrėtė su maistu susijusios sveikatos problemos. Lietuvoje kaip ir visame pasaulyje daugėja ţmonių kurie rūpinimasi sveika gyvensena, maisto produktų kokybe ir aplinkos apsauga, tai skatina ţmonių domėjimąsi ekologiniu ūkininkavimu. Šiuo laikotarpiu ekologinis ūkis yra didelė alternatyva tradiciniui ūkiui, kuris labai sparčiai vystosi. Pagrindinis jo tikslas - išauginti geros kokybės sveiką produkciją (Uţpurvis, 2010). Ekologinė gamyba tai naujos kokybės produktai bei aplinkosauginis ūkininkavimas, sukuriantis pusiausvyrą tarp ţemės ūkio produkcijos gamybos, aplinkos apsaugos ir kaimiškosios aplinkos išsaugojimo (Skurdenienė, Ribikauskas, Bakutis, 2007). Vienas pagrindinių kasdienai suvartojamų maisto produktų yra grūdai. Grūdai yra labai vertingas produktas iš jų pagaminti produktai sudaro 60 procentų ţmogaus mitybos raciono. Grūdų produktai laikomi pagrinde ţaliava tiek ţmogaus, tiek pašarų gamyboje. Gerai grūdų kokybei uţtikrinti privalo būti kontroliuojami visi grūdų gamybos procesai. Pradedant nuo pirminio grūdų gamybos etapo iki grūdų ir jų produktų realizavimo vartotojui. Uţauginti grūdai ne visada atitinka maistinių grūdų kokybės reikalavimus. Dėl mikroskopinių grybų veiklos daugumoje maisto produktų maţėja maistinė vertė ir jie tampa nebetinkami vartoti. Mikromicetai augdami ant grūdų, juos uţteršia mikotoksinais. Mikotoksinai tai chemiškai įvairialypės medţiagų grupės. Jie įvardijami kaip antriniai mikroskopinių grybų apykaitos produktai (Bakutis, 2007). Mikotoksinai pasireiškia neigiamu poveikiu gyviems organizmams taip sukeldami rimtų sveikatos sutrikimų. Sveikatos sutrikimai gali pasireikšti staiga arba po ilgo laiko, taip pat gali būti perduoti kitai kartai. Šios iškylančios problemos skatina atlikti: mikologinius ir mikotoksikologinius tyrimus, taip pat kurti paţangias biotechnologines priemones mikotoksinams detoksikuoti. Šiuo metu yra identifikuota daugiau nei 20 bakterijų rūšių, pasiţyminčių detoksikuojančiomis savybėmis. Literatūros duomenimis mikotoksinams detoksikuoti iš maisto produktų vis plačiau taikoma biologinė detoksikacija. Šios detoksikacijos pagrindinis tikslas mikroorganizmų panaudojimas mikotoksinams slopinti ar transformuoti į maţiau toksiškus ar visai nebetoksiškus junginius (Bartkienė, Bakutis, Baliukonienė, 2012). 11

12 Šio darbo tikslas: Nustatyti, įvertinti ir palyginti ekologiškoje ir įprastinėje grūdinėje ţaliavoje mikologinį ir mikotoksikologinį uţterštumą, panaudojant pienarūgštes bakterijas deoksinivalenolio detoksikacijai. Darbo uţdaviniai: 1. Ištirti, įvertinti ir palyginti ekologiniuose ir įpratiniuose ūkiuose surinktų grūdų mikologinį ir mikotoksikologinį uţterštumą. 2. Įvertinti ir palyginti kvietinių ir ruginių miltų mikotoksikologinį uţretštumą. 3. Įvertinti fermentacinių procesų įtaką DON kiekiui duonos gamybos grandinėje. 12

13 1. LITERATŪROS APŢVALGA 1.1 Grūdų augimino technologijos ekologiniuose ir įprastiniuose ūkiuose Grūdų auginimas mūsų šalyje yra viena iš pelningiausių ţemės ūkio šakų. Remiantis stastistikos departamento duomenimis 2012 metais, Lietuvoje buvo prikulta 3,3 mln. tonų grūdų. Daugiausia yra išauginama kviečių apie 2 mln.t, apie 0,5 mln.t mieţių ir rapsų, ir dar 0,5 mln. tonų kitų grūdinių kultūrų. Išauginti geros kokybės grūdus labai sunku be tinkamai paruošto tręšimo, augalų aprūpinimo maisto medţiagomis. Ekologinis ţemės ūkis ţemės ūkio sistema, pagrįsta ekologinių, socialinių ir ekonominių principų, uţtikrinančių stabilią aukštos kokybės produktų gamybą, visuma, palaikanti gamtos pusiausvyrą, taupiai naudojanti gamtos resursus (Skurdenienė, Ribikauskas, Bakutis, 2007). Įprastinis ţemės ūkis - ţemės ūkio sistema, kurioje yra leidţiama naudoti pesticidus, chemines trąšas. Ekologiniuose ūkiuose uţaugintų grūdų kokybė yra kontroliuojama nuo pirminio gamybos proceso: aplinkos salygų iki perdirbimo ir pateikimo galutiniam vartotojui (Pekarskas ir kt., 2006). Ekologinėje ţemdirbystėje, nenaudojant cheminių medţiagų, pesticidų fungicidų, pagrindiniai apsaugos būdai remiasi agrotechniniais, mechaniniais, biologiniais metodais. Pvz: apsaugoti grūdus nuo ligų reikia auginti atsparesnes veisles. Pagrindinis ir pigiausias ligų naikinmo metodas yra sėjomainos taikymas. Laikantis specialių sėjomainų, gerinamos dirvos agrocheminės savybės taip pat maisto medţiagų balansas. Ekologiniuose ūkiuose piktţolių naikinimui vienintelė priemonė - ţemės dirbimas (Uţpurvis, 2010). Įprastinės ţemdirbystės sistemoje palaikyti teigiamą maisto medţiagų balansą yra lengviau, nes leidţiama naudoti sintetines mineralines trąšas, o ekologiniuose ūkiuose yra grieţtai draudţiama, todėl daţnai nustatomas maisto medţiagų disbalansas. Ekologiniuose ūkiuose tręšiama: mėšlu, ţaliąja trąša, kompostais, natūralios kilmės medţiagomis. Mėšlas laikomas vienas iš daţniausiai naudojamų trąšų, padedančių uţtikrinti maisto medţiagų balansą, padidindamas dirvoţemio azoto kiekį. Ţaliąjai trąšai naudojami: lubinai, pupos, vikiai, įvairių augalų mišiniai (Pilipavičius, 2009). 2.1 Mikroorganizmų paplitimas grūduose Pats grūdas yra gyvas organizmas. Prieš patekdami į saugojimo patalpą grūdai praeina ilgą kelią: pradedant nuo auginimo proceso, derliaus nuėmimo, ir dţiovinimo. Kiekviename iš šių etapų galimas mikrobiologinis, mikotoksikologinis uţterštumas (Arbullah et al., 2000). Mikrobiologinis uţterštumas galimas nuo įvairių šaltinių: trąšų, dulkių, vandens, įvairių kenkėjų, sergančių augalų. K. Kaleta (2013) 13

14 teigia, kad grūdų kokybė blogėja dėl sąveikos tarp cheminių, biologinių ir fizikinių veiksnių su aplinka. Mikroorganizmai prasiskverbdami į augalo vidinius sluoksnius maitinasi jų medţiagų apykaitos produktais. Grūduose esančių mikroorganizmų rūšinė įvairovė labai įvairi, tačiau diţiausią ţalą grūdų kokybei ir masei padaro mikroskopiniai grybai ir bakterijos. Daţniausiai grūduose aptinkamos bakterijos priklauso: Bacillaceae, Lactobacillaceae, Micrococcaceae, Pseudomonadaceae gentims (Kaleta et al., 2013). Nukūltų grūdų masėje proc. sudaro bakterijos, jos apima didţiausią mikroorganizmų dalį, kitą dalį sudaro mikroskopiniai grybai. Daţniausiai iš gramneigiamių bakterijų, dominuoja Erwinia, Flavobacterium, Pseudomonas, Xanthomonas, randamos augalo antţemininėse dalyse. Atsiţvelgiant į tai, kokia ţala yra padaroma grūdų kokybei ir masei mikroorganizmai skirstomi į tris grupes: saprofitinius, kurie sudaro didţiausią dalį, fitopatogeninius ir patogeninius. Saprofitinias mikroorganizmams priskiriamos: bakterijos, mielės, mikromicetai, aktinomicetai. Didelė dalis saprofitų yra nekenksmingi grūdams, tačiau yra ir tokių, kurie maitinasi augalo organinėmis medţiagomis. Švieţiuose grūduose proc. sudaro epifitai viena iš labiausiai paplitusių rūšių E. herbicola. Fitopatogeniniai mikroorganizmai labai pablogina grūdų kokybę sukeldami ligas. Pvz: bakterijos sukelia ligas - bakteriozes, grybai - mikozes. Iš parazitinių grybų labiausiai vyrauja: skalsės, kūlės, fuzariozės sukelėjai, tačiau fitopatogenai skirtingai nei fuzariozės sukelėjai laikomuose grūduose nesidaugina. Patogeninių mikroorganizmų grūduose aptinkama atsitiktinai, kur jie patenka iš aplinkos nuo patogenų nešiotojų pvz: segančių gyvulių, grauţikų. ( prieiga per internetą ). 2.2 Daţniausiai grūduose aptinkami mikromicetai Mikromicetai aktyvi, gyvybinga mikroorganizmų grupė, gebanti sintetinti ir į aplinką išskirti cheminės prigimties toksiškus junginius (Lugauskas, 2006). Grūduose aptinkamus mikroskopinius grybus sąlyginai galima suskirstyti į dvi grupes: lauko ir sandėlių. Toks sąlyginis skirstymas grindţiamas drėgmės poreikiu. Hidrofilams priskiriami lauko mikromicetai. Šių mikromicetų grupei priklauso: Alternaria, Cladosporium, Fusarium ir kitų genčių grybai Alternaria ir Fusarium genčių grybai grūdus paţeidţia dar jiems nesubrendus. Įvairiuose grūdų rūšyse daţniausiai aptinkami Fusarium genties mikromicetai: F.avenaceum, F.culmorum, F.graminearum, F.moniliforme, F.equiseti. Sausringaisiais metais ant laukuose bręstančių grūdų aptinkama: Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Bipolaris, Botrytis, Phoma, Myrothecium, Acremonium ir kai kurių kitų genčių mikromicetų. Pvz: Cladosporium genties mikroskopiniai grybai paţeidţia grūdų luobelę. Fusarium nukeliauja iki 14

15 endospermos, Aspergillus ir Penicillium sparčiau vystosi apmirusiuose audiniuose. Tačiau visos šios gentys paţeidţia grūdus (Lugauskas ir kt., 2004). Pasak D. Diaz (2008) augat grūdams vienu metu gali vystytis kelių rūšių mikroskopiniai grybai Grūdai sandėlyje sudaro savarankišką ekologinę sistemą, kurioje gyvieji organizmai ir negyvoji supanti aplinka veikia vienas kitą (Lugauskas ir kt., 2004). Sandėliuojant grūdus, atsiranda sandėlių mikroflora. Ima vyrauti Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Mucor genčių mikroskopiniai grybai. Kanados mokslininkų duomenimis didţiausią dalį grūdų sandėliuose aptinkamų rūšių mikromicetų tenka priskirti Aspergillus ir Penicillium genčių anamorfoms (Lugauskas, Krasauskas, Repečkienė, 2004). K. Trojanowska (1991) teigia, kad nuo sandėliuojamų grūdų yra išskirta apie 26 Aspergillus ir 137 Penicillium rūšies mikromicetų. Perpilant ir transportuojant grūdus, juos malant ir pakuojant, dalis pabirų susimaišo su aplinkoje esančiomis dulkėmis ir tampa aplinkos mikobiotinės taršos dalimi. Pagausėja Aspergillus, Penicillium genčių, sumaţėja Alternaria, Fusarium genčių (Lugauskas ir kt., 2004). Lietuvoje vyraujantis klimatas yra labai palankus mikromicetams daugintis. Mūsų šalyje labiausiai paplitę Fusarium, Penicillium, Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, ir kitų genčių mikroskopiniai grybai (Lugauskas, 2006). Vystymosi metu mikromicetai į aplinką išskiria įvairius metabolitus: fermentus, organines rūgštis, lakiuosius alkoholius, ketonus, esterius, angliavandenius ir kitus toksiškus junginius (Krikštaponis, 2000). 1 pav. Vyraujančių genčių mikromicetai ant Lietuvos javų laukuose subrendusių grūdų (Krasauskas, 2002). 15

16 2.3 Mikroskopiniai grybai grūduose mikotoksinų producentai Remiantis literatūros duomenimis yra ištirta daugiau kaip 400 mikotoksinų rūšių, kurių poveikis sveikatai yra įvairus. Jie laikomi vienu iš svarbiausių rizikos veiksnių sukeliančių sveikatos sutrikimus (Bennett et al., 2003). Mikotoksinai yra maţos molekulinės masės junginiai, jie yra antriniai siūlinių mikromicetų medţiagų apykaitos produktai (Bakutis, 2007). Visi mikotoksinai turi skirtingą cheminę struktūrą. Maisto ir ţemės ūkio organizacijos apksaičiuotais duomenimis net iki 25 proc. visų pasaulyje gaminamų maisto produktų yra uţteršti mikotoksinais (Whitlow, Hagler, 2005). Daţniausiai jie aptinkami grūdinėse kultūrose: kviečiuose, mieţiuose, kukurūzuose, aviţose, rugiuose. Tačiau toksinų kiekiai skiriasi pvz: rūšiuotuose, valytuose grūduose toksinų kiekis būna net iki 84 proc. maţesnis nei nerūšiuotoje produkcijoje (EFSA, 2011). Mikotoksinais uţteršti būna ne tik grūdai, bet ir daugelis kitų produktų: dţiovinti tropiniai vaisiai, riešutai, pienas, kava, kakava. Kenkdami gyvuliams, mikotoksinai persiduoda į produkciją, kurią mes vartojame (Griessler et al, 2010). Daţniausiai grūduose aptinkami trichotecenai: DON, DAS, T-2, HT-2, NIV. Kiti daţniausiai aptinkami toksinai : OTA ir AFL, AFL B1 ir FUM B1, ZON (Lugauskas ir kt., 2002). Remiantis naujais atliktais tyrimais grūduose DON kiekio aptinkama nuo 26 proc. iki 67 proc. (Mruczyk, Jeszka, 2013). Toksinai ţmonių ir gyvulių organizme veikdami skirtingai, sukelia įvairius sveikatos sutrikimus. Moksliškai įrodyta, kad mikotoksinai pasiţymi: hepatoksiniu, nefratoksiniu, kancerogeniniu, mutageniniu, teratogeniniu ir imunosupresiniu, dermatotoksiniu, reprodukcines savybes maţinančiu poveikiu (Sarter et al., 2004). Mikotoksinų toksiškumas priklauso nuo daugelio faktorių, tokių kaip: gyvulio rūšis, veislė, amţius, lytis, sveikatos būklė, bei kt. parametrų (Whitlow, Hagler, 2005). 1 lentelė. Mikotoksinų poveikis organizmui (Katalenić, 2004). Sistema Poţymiai Mikotoksinai Kraujotakos sistema Kvėpavimo sistema Nervų sistemos Sumaţėjas kraujagyslių elastingumas, vidinis kraujavimas. Sunkus kvėpavimas, kraujavimas iš plaučių. Drebulys, nekoordinuoti judesiai, depresija, galvos skausmai. Aflatoksinai Trichotecenai, DON, ZEN Trichotecenai, ZEN 16

17 Oda Išbėrimas, jautrumas šviesai. Trichotecenai, DON Šlapimo sistemos Lytinės sistemos Imūninės sistemos Inkstų paţeidimai. Nevaisingumas, lytinės sistemos sutrikimai. Galimi imūninės sistemos pakitimai, arba visiškas jos sunaikinimas. Ohratoksinas A T-2 toksinas, zearalenonas, Daugelis mikotoksinų. 2.4 Svarbiausi grūduose aptinkami mikotoksinai Aflatoksinai Aflatoksinus daţiausiai produkuoja šios mikroskopinių grybų rūšys: Aspergillus flavus, A. parasiticus, rūšis. (Dykstehin s et al., 2007). Yra išsirtos šios aflatoksinų grupės B1 ( AB1 ), B2 ( AB2 ) G1 ( AG1 ), G2 ( AG2 ) M1 ( AM1 ) ir M2 ( AM2 ) (Samson, Hoekstra, Frisvad, 2004). Aflatoksinai aptinkami: aliejinių augalų sėklose, medvilnės, saulėgrąţų sėklose, daug energijos turinčiuose augaluose, javų grūduose (sorgose, ryţiuose, kukurūzuose, kviečiuose), ankštiniuose sojos produktuose, palmių branduoliuose, grūdų glitime, prieskoniuose, sūryje, piene, kiaušiniuose, vaisiuose ir uogose (Fink-Gremmels, 2008). Dauguma riešutų taip pat sudaro palankias sąlygas vystytis mikromicetams. A. flavus vystymąsi, labai įtakoja javai, tačiau toksinis poveikis priklauso nuo derliaus nuėmimo sąlygų, javų apdorojimo priemonių. Priešingai nei aliejinių augalų sėklų ir riešutų. Pavyzdţiui, maţo drėgnio grūduose aflatoksino kiekiai maţseni (Frisvad et al., 2005). Iš aflatoksinų grupės B1 yra toksiškiausias ţmogui, būdamas stiprus kancerogenas, ţaloja audinių ląsteles, sukelia mutageninius ir teratogeninius poţymius (Mendonca et al., 2005). AB1 Aflatoksinas taip pat pasiţymi stipriu kancerogeniniu poveikiu, sukelia aflatoksikozes, kurios pasireiškia: inkstų, bluţnies, plaučių paţeidimais, kepenų funkcijos susirgimais (Fink-Gremmels, 2008). Aflatoksinai slopina baltymų sintezę, ko pasekoje sumaţėja albumino ir kraujo plazmos baltymų, alfa ir beta globulinų lygis (Mateo et al., 2011). Mirtina dozė (LD 50), gyvūnams svyruoja 0,3-10 mg / kg kūno svorio (Duraković, Duraković., 2003). Indijoje buvo ištirti 647 pacientai iš 150 skirtingų miestų, kurie vartojo supelijusius kukurūzus, vidutinė nustatyta AB1 koncentracija 0,25-5,6 mg / kg (Sunčica et al., 2013). 17

18 2.4.2 Ochratoksinai Daţniausiai ochratoksinus išskiria Aspergillus ochraceus, A. melleus, A. sulphurues ir Penicillium verrucosum genčių grybai. Šiuo metu iš ochratoksinų geriausiai ţinomi A, B, C, D. Iš kurių pavojingiausias yra ochratoksinas A (Sunčica et al., 2013). Ochratoksinai aptinkami maisto produktuose ryţiuose, aluje, alyvogėse, riešutuose, vyne, sūryje, razinose, kavoje. Pagrindinis ochratoksino A šaltinis yra grūdai ir jų produktai. Taip pat toksinai aptinkami ir naminių gyvulių mėsoje, piene, inkstuose, kepenyse, per toksinais apkrėstus pašarus (Matic et al., 2009). Europos teisės aktuose nustatyta didţiausia leistina OTA koncentracija 5,8ng /kg -1 per dieną (Lalini, Bhoola, 2011). Atlikti tyrimai maiste ir ţmogaus kraujo megėniuose rodo didelį ochratoksino A aptikimo daţnį maisto produktuose. Atliktais tyrimais nustatyta jog grūdų saugyklose dirbusios moterys susirgo ūminėmis inkstų ligomis, kvėpuodamos Aspergillus ochraceus mikromicetų dalelėmis uţterštu saugyklų oru (Spankie et al., 2012). Ochratoksinas A laikomas viena iš ţmonių endeminės nefropatijos prieţasčių, pasireiškiančių šalinimo organų sistemų augliais, lėtinėmis inkstų ligomis (Pfohl-Leszkowicz, 2009). Pasak Pfohl-Leszkowicz (2009) atliko tyrimo su pelėmis nustatyta, kad OTA gali būti sėklidţių vėţio atsiradimo prieţastimi. Dėl ochratoksinų poveikio atsiranda inkstų ir kepenų piktybinių navikų (Chopra et al., 2010). Ochratoksinams būdingas kancerogeninis, nefratoksinis, neurotoksinis, imounotoksinis, hepatotoksinis, ir genotoksinis poveikis (Denli et al., 2010) Zearalenonas Mikotoksiną zearalenoną išskiria Fusarium genties mikroskopiniai grybai. Yra išskirta 18 Fusarium rušių: F. graminearum, F. sporotrichioides, F. semitectum, F. equiseti, F. crookwellense, F. culmorum ir kt. Fusarium genties mikroskopiniai grybai išskiria metabolitus: α-zearalenolį, β-zearalenolį, kurie yra giminingi zaeralenoliui (EFSA, 2011). Šiam toksinui palankios visos klimatinės sąlygos: taip pat ţema ir kintanti temperatūra (Bakutis, 2007). Zearalenonas aptinkamas visame pasaulyje ypač grūduose ir jų produktuose (Sunčica et al., 2013). Taip pat daţnai randamas sezamo sėklose, kukurūzuose ir kukurūzų produktuose, maţiau aviţose, sorguose, ryţiuose, rugiuose ir iš jų gautuose produktuose (Zinedine et al., 2007). Fusarium genties mikromicetai daţnai sukelia kukurūzų stiebo puvinį (Whitlow, Hagler, 2005). Zearalenono metabolitai susijungę su estrogeno receptoriais sudaro mišinį antagonistų/agonistų ir sukeldami gyvuliams sindromą, kuris vadinamas hiperoestrogenizmas (Zinedine et al., 2007). Taip pat ZEN pasiţymi estrogeniniu poveikiu. Manoma, kad jautriausios šiam toksinui yra kiaulės, tačiau šis mikotoksinas pavojingas visoms gyvūlių rūšims (EFSA, 2011). Europoje uţauginamuose pašaruose jo koncentracija daţnai viršija leistinas normas. Galvijams pasireiškia, abortai, kaip ZEN kiekis viršyja 1-1,5 mg/kg, esant galvijų 18

19 racionuose apie 750 Dg/kg -1 blogėja gyvulių reprodukciniai rodikliai (Minervini et al., 2001). Maţiau jautrūs zearalenonui yra paukščiai, atlikus tyrimą lesinant juos lesalais, turinčiais mg/kg mikotoksino, pastebėtas kiaušintakių, kloakos pabrinkimas po 4 paros (Malekinejad et al., 2003). Pasak Garalevičienė (2005), zearalenonas ir jo metabolitai α ir β-zearalenoliai konkurentiškai jungiasi prie ţmogaus estrogeninių receptorių ir veikia estrogeniškai Deoksinivalenolis (DON) Deoksinivalenolis (DON) vienas iš labiausiai paplitusių trichotecenų, daţniausiai randamas augaliniuose produktuose. Šio mikotoksino acetilo dariniai acetildeoksinivalenolis (3-AcDON), 15-acetildeoksinivalenolis (15-AcDON) ir nivalenolis (NIV) (Sunčica, 2013). Jis aptinkamas visame pasaulyje, todėl laikomas vienu iš plačiausiai paplitusių mikotoksinų. Mokslininkų atliktais tyrimais kukurūzuose ir kviečiuose daţnai randamos labai didelės DON koncentracijos (Bhat, 2010). Didţiausia DON koncentracija grūduose radama Lenkijoje, Vokietijoje, Japonijoje, Naujojoje Zelandijoje ir Pietų Amerikoje (Mirabolfathy, Karami osboo, 2013 ). T. Borjesson ir J. Olsson (2004) atliktais tyrimais, kuriuose buvo tirti ţieminiai kviečiai, nustatyta, kad daugumujo išaugintų kviečių DON koncentracija viršijo1250 μg/kg. Deoksinivalenolio paplitimui didţiausią įtaką daro Fusarium graminearum ir F. culmorum rūšių mikromicetai. Jie įvardijami kaip svarbiausi patogenai, kurie sukelia ligas kviečiuose ir kukurūzuose (Harkema et al., 2006). DON daro neigiamą poveikį gyvūnų ir ţmonių sveikatai, sukeldamas vėmimą, pykinimą, viduriavimą, pilvo skausmus, galvos skausmus, galvos svaigimus, karščiavimą (Sobrova et al., 2010). Taip pat yra ištirta, kad sukelia įvairius organizmo uţdegimus ir nekrozes (Pazzi et al., 2006). Daţniausiai pašaruose DON aptinkamas kartu su zearalenoliu. Ţmonėms, kurie su maistu suvartoja didelius kiekius DON, pasireiškia įvairūs simptomai tokie kaip: pykinimas, vėmimas, skrandţio ir ţarnyno skausmai, kai kurie tuštindavosi kruvinomis išmatomis, ţmones išberdavo Jis taip pat ţinomas kaip vomitoksinas dėl savo stipaus poveikio yra transportuojamas į smegenis kurio pasekoje sukeliams stiprus vėmimas. Vėmimo poveikį šio mikotoksio pirmą kartą aprašė Japonijoje. Ten gyvenantys vyrai vartojo supelijusius mieţius (Kushiro, 2008; Sobrova et al., 2010). Ţinant, kad DON daugiausiai yra grūduose, o jie sudaro apie 60 proc. ţmogaus ir gyvūnų suvartojamo maisto 2006 metų liepos 1d. ES išleido naują reglamentą Nr. 1881/2006., kuriame nustatytos didţiausios leistinos DON koncentracijos grūduose ir grūdų produktuose, kurios pateiktos 2 lentelėje. 19

20 2 lentelė. Maksimali DON koncentracija grūduose ir grūdų produktuose Nr. DON grūduose ir grūdų produktuose, išskyrus ryţius ir ryţių produktus Maksimali koncentracija µg/kg 1 Neperdirbti grūdai išskyrus durum kviečius, aviţas ir kukurūzus Neperdirbti durum kviečiai, aviţos, kukurūzai Grūdų miltai, jų tarpe kukurūzų miltai, kukurūzų kruopos ir kiti panašūs produktai Duona, tortai, sausainiai, uţkandţiai ir grūdų pusryčiai Makaronai (sausi) Grūdų pagrindu pagamintas kūdikių ir maţų vaikų maistas Mikotoksinų detoksikavimo būdai Lietuvoje iš mikroskopinių grybų genčių didţiausią ţalą padaro Fusarium genties mikromicetai, todėl jų keliamai ţalai uţkirsti kelią reikia jau grūdus sėjant. Dar lauko sąlygomis galima mikroskopinių grybų sumaţinimo galimybė, panaudojan tokius veiksnius: tinkamą dirvos įdirbimo technologiją, efektyvių fungicidų panaudojimą, subalansuotą sėjimą ir efektyvų sėjomainų taikymą taip pat sėjimo tankio sureguliavimą, tinkamą parinkimą atsparių veislių (Venskutonis, 2002). Remiantis daugumos mokslininkų atliktais tyrimais, išvengti derliaus uţteršimo yra labai sunku, todėl mus pasiekiantys produktai taip pat būna uţteršti. Daţnai maisto produktai buna uţteršti ne vienu, o keliais mikotoksinais, nes įvairios mikromicetų rūšys tuo pačiu metu išskiria skirtingus toksinus. Taip pat mikotoksinams būdinga grandininė reakcija: per uţterštus pašarus apsikrėčia gyvūliai, vėliau toksinai persiduoda į gyvūlių mėsa, kurią suvartoja ţmogus (Griessler et al., 2010). Moksliškai yra įrodyta, kad toksinus galima pašalinti. Toks procesas - vadinamas detoksikavimu. Detoksikacija pasireiškia toksinio junginio poveikio sumaţinimu, sunaikinimu ir pašalinimu. Nors tai padaryti yra sudėtinga, nes mikotoksinų molekulės tiek fiziniu tiek cheminiu poţiūriu yra patvarios ir jas suardyti sunku (Whitlow, Hagler, 2005). Šiuo metu yra isšskiriami trys detoksikavimo būdai: cheminis, fizikinis ir biologinis. 20

21 2.5.1 Chemininė detoksikacija Cheminiams metodams priskiriamas bet koks cheminio apdorojimo būdas, kuriuo pagalba sunaikinami ir inaktyvuojami mikotoksinai. Chemininės medţiagos vertinamos pagal jų galimybes struktūriškai skilti sumaţinant mikotoksinų toksiškumą. Propiono rūgštis, sorbo rūgštis, amoniakas, organinių rūgščių druskos, fermentiniai priedai yra veiksmingi, prieš mikromicetų dauginimąsi. Daţnai rūgščių formos yra aktyvesnės, nei jas atitinkančios druskos. Pvz: Iš tiriamų cheminių medţiagų rūgščių, aldehidų ir dujų, sumaţėjusį aflatoksinų kiekį grūduose, lėmė amonizacija (Diekman, Green, 2010). Kitas labai veiksmingas detoksikavimo būdas prieš aflatoksinus ir fumozimus yra apdorojimas amoniaku, kartu veikiant slėgiui ir aukštai temperatūrai. Prieš deoksinivalenolį veiksmingos sieros dioksido dujos, prieš zearalenoną, formaldehidas (Whitlow, Hagler, 2005). Veikiant natrio chloridui sumaţėja laisvo vandens kiekis, nes natrio chloridas veikia ląstelių osmosinį lygį. Propiono rūgštis maţina substrato ph taip slopindama mikroskopinių grybų augimą. Moksliniais tyrimais nustatyta, kad hidratuotas natrio kalcio aliumosilikatas (HSCAS) yra veiksmingas prieš aflatoksino B1 toksiškumą (Vanderborght, 2009). Manoma, kad amoniakas gali naikinti mikoflorą (Yiannikouris, Jouany, 2002). Tačiau jis yra patvirtintas kaip efektyvi detoksikavino priemonė. Pasak Venskutonis (2002) Prancūzijoje ir Senegale toksinais uţterštus riešutus, kukurūzus ir medvilnę detoksikuoti naudojamas amoniakas. Kitas labai efektyvus metodas - ozonavimas; tai labai sudėtingas elektrocheminis metodas leidţiantis panaudoti ozono (O 3 ) taikymą. Ozonas (O 3 ), tai dujų pavidalo medţiaga, pasiţyminti dideliu rūgštingumu ir toksiškumu. Jis yra labai vertinnmas dėl savo didelio efektyvumo, technologinio paprastumo, irdamas nepalieka kenksmingų medţiagų. Mokslininkai atliko tyrimus su kviečiais paveikiant juos ozonu, gauti rezultatai parodė 58,3 66,6 proc. maţesnį kviečių uţtertumą mikromicetais (Tapuškin et al., 2001). Esant ozono koncentracijai 5 ppb galima prislopinti Aspergillus flavus veiklą gaminti Aflatoksiną. Paţymėtina, kad ozonas taip pat efektyviai dirba detoksikacijos procese su mikotoksinų infekuotus produktus. Buvo nustatyta, kad ozonas palengvina grūdų dţiovinimo procesą, todėl jo taikymas galėtų sumaţinti grūdų dţiovinimo trukmę 21

22 2.5.2 Fizikinė detoksikacija Fizikinis mikotoksinų nukenksminimas yra svarbus veiksnys, kuris gali efektyviai sumaţinti į maisto produktus patenkančius mikotoksinus. Fizikiniams detoksikavimo metodams priskiriamas toksinais uţkrėstų ţaliavų valymas, termiškas apdorojimas, mechaninis rūšiavimas. Moksliniais tyrimais nustatyta, kad grūduose DON kiekį galima sumaţinti 7 23 proc. grūdus valant. Pašalintas viršutinis grūdų sluoksnis (iki 19 proc. bendrojo svorio) sumaţina ZON ir DON kiekį proc. Daţniausiai mikotoksinai kaupiasi grūdo paviršiuje, toksinai įsiskverbia į grūdo endospermą. Gylis priklauso nuo produkuojančio mikroskopinio grybo gebėjimo prasiskverbti į gilesnius sluoksnius. Dėl to daţnai padidėjusi mikotoksinų koncentracija gali būti randama grūdo luobelėje, o taip pat sėlenose, net iki 40 proc. bendro toksino kiekio. Pašalintas viršutinis grūdų sluoksnis (iki 19 proc. bendrojo svorio ) sumaţina ZON ir DON kiekį proc. Apipelijusiuose kukurūzuose DON sumaţėjo 33 proc. (Bakutis, 2006). Kitas fizikinis detoksikacijos būdas mikotoksinų suardymas: kaitinant saulės kaitroje, termiškas apdorojimas, švitinimas UV, apdorojimas panaudojant ultragarsą. Šitų metodų tikslas keičiant toksinų cheminę struktūrą, sumaţinamas molekulių nuodingumas (Venskutonis, 2002). Terminis apdorojimas yra vienas iš plačiausiai naudojamų metodų. Moksliškai yra įrodyta mikotoksinus gaminančios mikromicetų konidijas galima sunaikinti jas veikiant temperatūrų rėţino kaita, UV ir gama spinduliuotės naudojimu (Varga et al., 2010) Biologinė detoksikacija Pastaruoju laikotarpiu skiriamas didelis dėmėsys toksinų pašalinui iš maisto produktų. Todėl vis plačiau pradėta taikyti biologinė detoksikacija. Šios detoksikacijos esmė yra mikro organizmų panaudojimas mikotoksinams biologiškai izoliuoti ( surišti ), slopinti ar transformuoti į netoksiškus ar maţiau toksiškus junginius. Išskirta ir identifikuota daugiau kaip 20 bakterijų ir mielių rūšių, pasiţyminčių detoksikuojančiomis savybėmis (Bartkienė ir kt., 2012). Apie mikotoksinų ir mielių sąveikia ţinoma jau kelis dešimtmečius. Moksliniais tyrimais nustatyta, kad nemaţus aflatoksino B1 ir ochratoksinus sujungia dauguma mielių genčių (Shetty, Hald, Jespersen, 2007; Bejaouii et al., 2004). Taip pat yra nustatyta, kad termiškai apdorotos mielių ląstelės palyginus su gyvybingomis ląstelėmis, didesniu mikotoksinų absorbcijos pajėgumu pasiţymi termiškai apdorotos net 90 proc. (Shetty, Hald, Jespersen, 2007). Kitas biologinės detoksikacijos metodas fermentacija panaudojant penarūgštes bakterijas. Remiantis literatūros duomenimis yra nustatyta, kad fermentacijos metu galima sumaţinti DON kiekį. Fermentacijos metu gaminant duoną, kuri buvo kepta iš uţzikrėtusių grūdų, mikotoksinų kiekis po fermentacijos sumaţejo. Pvz; pienarūgščių bakterijų ir bifido bakterijų padermės sumaţina aflatoksino B kiekį maisto produktuose (Lahtinen 22

23 et al., 2004). Moksliniais tyrimais nustatyta, kad 50 o C temperatūroje fermentuojant kvietinę tešlą DON kiekis nustatytas proc. maţesnis nei pradinėje ţaliavoje (Samar et al., 2001). Mūsų atlikti tyrimai parodė, kad fermentuojant kvietinius, ruginius miltus su PRB kultūra L.sakei DON koncentracija kvietiniuose miltuose sumaţino 52 proc., o ruginiuose miltuose 39 proc. Manoma, kad Lactobacillus sakei gamina į bakteriocinus panašius junginius, kurie stabdo kai kurių bakterinių padermių augimą (Bartkienė ir kt., 2012). Taip pat yra ţinių apie gyvulių virškinamojo trakto mikrobinę floura, kuri pasireiškia mikotoksinų ardomajuoju poveikiu. Buvo įrodyta, kad kasa, dvylikapirštė, ir klubinė ţarna ţiurkių organizme atlieka mikotoksinų detoksikavimo reakciją (Varga et al., 2010). 23

24 3. DARBO ATLIKIMO SĄLYGOS IR METODIKA Mokslinis tiriamasis darbas atliktas metais LSMU Maisto saugos ir kokybės katedroje, gyvūnų gerovės tyrimų laboratorijoje. Tyrimo objektas: grūdai ir miltai. Grūdai gauti iš ekologinių ir įprastinių ūkių. Iš viso gauta 12 mėginių iš kurių 3 mėginius sudarė kviečiai ir 3 rugiai, gauti iš ekologinio ūkio. Analogiškai iš įprastinio ūkio buvo gauti trys rugių mėginiai ir trys kviečių mėginiai. Miltai buvo įsigyti prekybos centruose. Gauta 15 mėginių iš skirtingų gamintojų. Iš kurių devynis mėginius sudarė skirtingų gamintojų kvietiniai miltai ir šeši ruginių miltų mėginiai. Kiekybinis kviečių ir rugių uţkrėstumas mikromicetų pradais KSV/g nustatytas skiedimo būdu. Atsveriama 10g kviečių ir rugių, sumalama, talpinama į 90 ml distiliuoto vandens kolbutę ir maišoma 20 min. Atliekami mėginio skiedimai iki 1:10-3. Gavus reikiamą praskiedimą, imamas 1 ml ekstrakto ir sėjama į Petri lėkštelę ant Čapeko agarizuotos terpės įtrynimo būdu. Petri lėkštelės inkubuojamos 26±2 o C temperatūroje 7-10 parų. Augančios mikromicetų kolonijos vertinamos 7, 10 vystimosi parą. Po to apskaičiuojama mikromicetų gyvybingų sporų skaičius grame grūdų (Smirnova ir kt., 1989). Mikromicetų skaičius įvertintas pagal LST ISO 6611:2004. Nustatant mėginio tiesioginį uţkrėstumą mikromicetais, kurie aptinkami ant išorinio mėginio dalelių paviršiaus, įvertintas procentinis išorinis uţsikrėtimas gyvybingu mikromicetų miceliu. Išorinis procentinis grūdų uţsikrėtimas mikromicetais: grūdų išorinio uţsikrėtimo mikromicetų gentimis nustatymui naudota tiesioginio sėjimo metodas. Dešimt grūdų steriliu pincetu tolygiai buvo išdėstyti Petri lėkštelėse (9 grūdai aplink lėkštelę ir 1 viduryje) ant ČA terpės su chloramfenikoliu. Petri lėkštelės su grūdais dėtos į termostatą ir inkubuotos 26±2 o C temperatūroje 7 10 parų. Grybų morfologiniai poţymiai tirti šviesiniu mikroskopu 7, 10 vystymosi parą. Mikromicetų rūšys identifikuotos vadovaujantis apibūdintojais (Samson et al., 2000; Lugauskas ir kt., 2002). Mikotoksinų koncentracija nustatyta imunofermentinės analizės metodu (IFA), panaudojus komercinį VERATOX DON 5/5, (Neogen, JAV) rinkinį, pagal pateiktą gamintojo metodiką. Pieno rūgšties bakterijos ir jų paruošimas. Bakteriocinus produkuojančios L. sakei KTU05- išskirtos iš ruginių duonos raugų gautos iš KTU Maisto produktų technologijos katedros, buvo panaudotos ruginių ir kvietinių miltų fermentavimui. Mikroorganizmai iki eksperimento laikyti -70 C temperatūroje MRS sultinyje (Oxoid, Milan, Italy), papildytame 20 proc. glicerolio, o prieš naudojimą kultivuoti MRS terpėje ir pagausinti 24

25 išlaikius termostate: L. sakei, 30 C temperatūroje 24 h. I ruginių ir kvietinių miltų mėginius įnešta PRB kultūra L. sakei fermentacija alikta 30 C temperatūroje 48 h. Duomenų analizės ir tyrimų rezultatai pateikti panaudojus R statistinį paketą. Statistinis duomenų įvertinimas. Tyrimų duomenys įvertinti statistiniu,,r ir,,microsoft Excel programa. Buvo apskaičiuoti gautų duomenų aritmetiniai vidurkiai (x), standartinis nuokrypis (δ) ir regresinės lygties koeficientas (R 2 ). Aritmetinių vidurkių skirtumo patikimumas (P) nustatytas pagal Stjudentą. Rezultatai laikomi patikimais, kai p<0,001, p<0,01, p<0,05, rezultatai nepatikimi, kai p>0, TYRIMŲ CHEMA Grūdų mėginiai Ekologiški grūdai Įprastiniai grūdai Miltų mėginiai Fermentacija kietoje ir tradicinėje fazėje su PRB L.sakei Mikologiniai tyrimai Mikromicetų pradų skaičius Deoksinivalenolio nustatymas Pienarūgščių bakterijų nustatymas L.sakei Mikotoksikologiniai tyrimai ph nustatymas Procentinis uţterštumas mikromicetų gentimis 25

26 Sporų skaičius KSV/g 4. TYRIMŲ REZULTATAI 4.1 MIKOLOGINIAI IR MIKOTOKSIKOLOGINIAI TYRIMAI GRŪDŲ MĖGINIUOSE Bendras mikroskopinių grybų sporų skaičius grūduose iš ekologinių ir įprastinių ūkių Pats grūdas yra gyvas organizmas. Prieš patekdami į saugojimo patalpą grūdai praeina ilgą kelią: pradedant nuo auginimo proceso, derliaus nuėmimo, ir dţiovinimo. Kiekviename iš šių etapų galimas mikrobiologinis ir mikologinis uţterštumas. Pagrindinis ekologinio ūkininkavimo tikslas yra išauginti sveiką ir aukštos kokybės produkciją. Ją išauginti be tinkamo ir subalansuoto augalų tręšimo labai sunku. Ekologinės gamybos ūkiuose uţdrausta naudoti sintetines mineralines trąšas, o leidţiamos tik natūralios kilmės trąšos (Uţpurvis, 2010) Kviečiai surinkti iš ekologinių ūkių Kviečiai surinkti iš įprastinių ūkių 2 pav. Bendras gyvybingų sporų skaičius kviečiuose Palyginus surinktus kviečių mėginius iš ekologinių ir įprastinių ūkių matyti, kad didesnis mikroskopinių grybų skaičius vyrauja ekologiniuose ūkiuose surinktuose kviečių mėginiuose, kuriuose nustatytas vidurkis 45±3,9x10 2 KSV/g. Tai 33 proc. (p<0,05) didesnis nei įprastiniuose ūkiuose surinktuose kviečių mėginiuose, kuriuose nustatytas vidurkis 30±3,2x10 2 KSV/g. Todėl galima teigti, kad remiantis literatūros duomenimis, ekologiškai uţaugintuose rugiuose mikromicetų skaičius didesnis, nes yra ne naudojami fungicidai, taip pat sintetinės trąšos. 26

27 Sporų skaičius KSV/g Rugiai surinkti iš ekologinių ūkių Rugiai surinkti iš įprastinių ūkių 3 pav. Bendras gyvybingų sporų skaičius rugiuose Palyginus surinktus rugių mėginius iš ekologinių ir įprastinių ūkių matyti, kad didesnis mikroskopinių grybų skaičius vyrauja ekologiniuose ūkiuose surinktuose rugių mėginiuose, kuriuose bendras gyvybingų sporų skaičius 44±2,1x10 2 KSV/g, tai 29,5 proc. (p<0,05) didesnis nei įprastinių rugių mėginiuose, kuriuose (kolonijas sudarančių vienetų skaičius 10g mėginio) 31±3,9x10 2 KSV/g. Todėl galima teigti, kad ekologiškai uţaugintuose rugiuose mikromicetų skaičius didesnis, dėl tų pačių prieţasčių kaip ir kviečiuose Mikroskopinių grybų genčių pasiskirstymas Grūdų uţterštumas mikroskopinių grybų pradais priklauso nuo daugybės veiksnių: augalo genotipo, vietos sėjomainoje, dirvoţemio, naudojamų agrotechninių bei agrocheminių priemonių (Lugauskas ir kt., 2004). Tai sudaro skirtingas sąlygas įvairioms mikroorganizmų grupėms vystytis jų augimo aplinkoje ir kontaminuoti grūdus dar jų augimo, brendimo bei derliaus nuėmimo metu.grūdų paviršiuje aptinkamus mikromicetus sąlyginai galima suskirstyti į dvi grupes: lauko ir sandėlių (Lugauskas ir kt., 2004; Santin, 2005). 27

28 Cladosporium spp. 6% Kiti. 2% Fusarium spp. 21% Rhizopus spp. 11% Alternaria spp. 22% Aspergillus spp. 14% Mucor spp. 14% Penicillium spp. 10% 4 pav. Vyraujantys mikromicetai kviečių mėginiuose surinktuose iš ekologinių ūkių Pateiktame 4 paveiksle matyti, kad kviečių mėginiuose surinktuose iš ekologinių ūkių labiausiai vyravo Alterenaria spp. 22 proc. ir Fusarium spp. 21 proc. genčių mikromicetai. Šios mikroskopinių grybų gentys sudarė 43 proc. visų vyravusių mikromicetų. Fusarium spp. laikomas pagrindiniu galimu mikotoksino DON produkuotoju. Kitos galimai toksiškos gentys Aspergillus spp. sudarė 14 proc. Penicillium spp. sudarė 10 procentų visų vyravusių genčių. Šių genčių mikromicetai laikomi pagrindiniais ochratoksinų ir aflatoksinų producentų. Rhizopus spp. sudarė 11 procentų. Maţiausiai buvo aptikta Cladosporium spp. 6 proc. ir kitos gentys sudarė 2 procentus. Cladosporium spp. 3% kiti. 8% Fusarium spp. 20% Mucor spp. 14% Alternaria spp. 24% Aspergillus spp. 20% Penicillium spp. 11% 5 pav. Vyraujantys mikromicetai kviečių mėginiuose surinktuose iš įprastinių ūkių 28

29 Tiriant kviečius surinktus iš įprastinių ūkių matyti, kad labiausiai vyravo Alternaria spp. gentis 24 proc. Aspergillus spp. ir Fusarium spp. gentys sudarė po 20 procentų. Mucor spp. gentis sudarė 14 proc., maţiausiai vyravo Cladosporium spp. getis 3 proc. kitos gentys sudarė 8 procentus. Palyginus kviečių mėginus gautus iš ekologinių ir įprastinių ūkių matyti, kad labiausiai vyravo Alternaria spp. ir Fusarium spp. genčių mikromicetai. Aspergillus spp. genties mikromicetų 30 proc. daugiau rasta kviečiuose gautuose iš įprastinių ūkių. Fusarium spp. genties mikroskopinių grybų 5 proc. daugiau buvo rasta ekologiniame ūkyje surinktuose grūduose. Kviečiuose gautuose iš ekologinių ūkių aptikta Rhizopus spp. gentis, kuri sudarė 11 proc. visų vyravusių genčių, o kviečiuose gautuose iš įprastinių ūkių šios genties neaptikta. Kviečiuose gautuose iš ekologinių ūkių Cladosporium spp. genties 50 proc. aptikta daugiau nei kviečiuose iš įpratinių ūkių. Penicillium spp. genties mikromicetai pasiskirstė panašiai kviečiuose iš ekologinių ūkių aptikta 10 proc., o kviečiuose iš iprastinių ūkių 11 proc. Kviečių mėginiuose iš ekologinių ūkių nustatyta daugiau vyravusių genčių. Cladosporium spp. 7% Trichoderma spp. 5% Rhizopus spp. 15% Fusarium spp. 15% Mucor spp. 9% Kiti. 3% Alternaria spp. 28% Aspergillus spp. 12% Penicillium spp. 6% 6 pav. Vyraujantys mikromicetai rugių mėginiuose surinktuose iš ekologinių ūkių Rugiuose surinktuose iš ekologinių ūkių labiausiai vyravo Alternaria spp. genties mikromicetai jie sudarė 28 proc. Fusarium spp. ir Rhizopus spp. genčių mikromicetų rasta po 15 proc. Kiek maţiau aptikta Aspergillus spp genties mikromicetų jie sudarė 12 proc. ir Mucor spp. 9 proc. taip pat Clodosporium spp. 7 proc. Maţiausiai rasta Trichoderma spp. 5 proc. ir kitos gentys sudarė 3 procentus. 29

30 Mucor spp. 6% Rhizopus spp. 4% kiti. 12% Fusarium spp. 21% Penicillium spp. 11% Alternaria spp. 27% Aspergillus spp. 19% 7 pav. Vyraujantys mikromicetai rugių mėginiuose surinktuose iš įprastinių ūkių Pateiktame 7 paveiksle matyti, kad rugiuose surinktuose iš įprastinių ūkių labiausiai vyravo Alternaria spp. genties mikromicetai jie sudarė 27 proc. visų vyravusių genčių. Kita labiausiai vyravusi gentis Fusarium spp. 21 proc. Aspergillus spp. genties mikromicetai sudarė 19 procentų, o Penicillium spp. 11 proc. Maţiausiai rugiuose surinktuose iš įprastinių ūkių vyravo Mucor spp. 6 proc. ir Rhizopus spp. 4 proc. Kitos mikromicetų gentys sudarė 12 procentų. Palyginus rugių mėginius gautus iš ekologinių ir įprastinių ūkių matyti, kad labiausiai vyravo Alternaria spp. genties mikromicetai jų procentinis pasiskirstymas buvo didţiausias. Kita labiausiai vyravusi gentis Fusarium spp., rugiuose gautuose iš įprastinių ukių 28,5 proc. aptikta daugiau nei rugiuose iš ekologinių ūkių. Aspergillus spp. genties 37 proc. taip pat daugiau aptikta rugiuose iš įprastinių ūkių. Rugiuose surinktuose iš ekologinių ūkių aptiktos Cladosporium spp. ir Trichoderma spp. gentys, kurių neaptikta rugiuose gautuose iš įprastinių ūkių. Mucor spp. ir Rhizopus spp. genčių mikromicetų daugiau aptikta rugių mėginiuose iš ekologinių ūkių. Nustačius deoksinivalenolio kiekį kviečių ir rugių mėginiuose surinkutuose iš ekologinių ir įprastinių ūkių gauti rezultatai: kviečiuose iš ekologinių ūkių 328 µg/kg, kviečiuose iš įprastinių ūkių 324 µg/kg. Rugių mėginiuose iš ekologinių ūkių 269 µg/kg, o rugiuose iš įprastių ūkių 264 µg/kg. Remiantis gautais rezultatais matyti, kad lyginant DON kiekį kviečiuose gautuose iš ekologinio ir įprastinio ūkių pastebėtas tik neţymus skirtumas. Palyginus gautus rezultatus su vyravusiomis mikroskopinių grybų gentim matyti, kad Fusarium spp. genties 5 proc. daugiau aptikta kviečiuose iš ekologinio ūkio taip pat ir DON koncentracijos daugiau nustatyta kviečiuose iš ekologinio ūkio. Analogiškai rugių mėginiuose. 30

31 Sporų skaičius KSV/g 4.2 MIKOLOGINIAI IR MIKOTOKSIKOLOGINIAI TYRIMAI MILTŲ MĖGINIUOSE Mikroskopinių grybų sporų skaičius kvietiniuose ir ruginiuose miltuose Atlikus mikologinius ir mikotoksikologinius tyrimus grūdų mėginiuose surinktuose iš ekologinių ir įprastinių ūkių didelio skirtumo tarp ekologiniuose ir įprastiniuose ūkiuose uţaugintų grūdų nenustatyta. Todėl tolesniems tyrimams pasirinkome miltų mėginius pagamintus iš įprastiniuose ūkiuose uţaugintų grūdų Kvietiniai miltai Ruginiai miltai 8 pav. Bendras gyvybingų sporų skaičius kvietiniuose ir ruginiuose miltuose Šiame paveiksle matyti, kad 5 proc. (p>0,05) didesnis gyvybingų sporų skaičius buvo aptiktas kvietiniuose miltuose, 19±1,3x10 2 KSV/g, ruginiuose miltuose 18±0,8x10 2 KSV/g. Remiantis literatūros duomenimis yra nustatyta tiesioginė priklausomybė tarp miltuose esančių mikroskopinių grybų sporų skaičiaus ir duonos pelėjimo kuo didesnis miltuose gyvybingų sporų skaičius, tuo maţesnis duonos mikrobiologinis stabilumas. Pvz.: kvietiniuose miltuose esant 100 KSV g -1 sporų skaičiui, gaminiai pradeda pelėti 5 laikymo parą, o 1000 KSV g laikymo parą. Šiuo metu galiojančioje higienos normoje HN 26:2006 mikroskopinių grybų skaičius miltuose nėra reglamentuojamas (Jakubausienė, Šalomskienė, 2007). 31

32 DON koncentracija µg/kg Deoksinivalenolio koncentracija kvietiniuose ir ruginiuose miltuose (µg/kg) Kvietiniai miltai Ruginiai miltai 9 pav. DON koncentracija µg/kg kvietiniuose ir ruginiuose miltuose Mikotoksinų koncentraciją įtakoja daugelis veiksnių: drėgnis, aplinkos temperatūros, kenkėjai, mechaninis paţeidimas derliaus nuėmimo ir sandėliavimo metu, grybų toksiškumo lygis (Dapkevičius ir kt., 2005; Mankevičienė ir kt., 2007). Iš pateiktų duomenų matyti, kad didesnė DON koncentracija buvo aptikta kvietiniuose miltuose 318±27 µg/kg, tai 17 procentų (p<0,01) daugiau nei ruginiuose miltuose, kuriuose DON koncentracija 263±24µg/kg. Pagal 2006 metų liepos 1d. ES priimtą naują reglamentą Nr. 1881/2006. Didţiausią leistiną deoksinivalenolio DON kiekį grūduose ir grūdiniuose produktuose, diţiausias DON kiekis neperdirbtuose grūduose negali viršyti 1250 µg/kg, miltuose neturi viršyti 750 µg/kg. Lyginant su mūsų atlikto tyrimo duomenis matyti, kad kvietinių ir ruginių miltų mėginiuose DON koncentracija neviršyja nustatytos maksimalios leistinos koncentracijos. Tačiau nemaţiau svarbios yra ir nedidelės koncentracijos, nes ţmonių sveikatai svarbiau ne tai, kiek mikotoksinų yra maiste, o kiek jų gaunama su maistu iš viso. Todėl svarbu įvetinti net ir nedidelę taršą mikotoksinais. 32

33 DON koncentracija µg/kg DON koncentracija µg/kg y = 0.09x R² = Sporų skaičius x10 9 KSV/g 10 pav. DON koncentracijos priklausomybė nuo sporų skaičiaus KSV/g kvietiniuose miltuose 10 pav. parodo DON koncentracijos priklausomybę µg/kg nuo sporų skaičiaus KSV/g. Apskaičiuotas regresinės lygties koeficientas (R 2 =0,9092) rodo, kad analizuojant kvietinius miltus egzistuoja stiprus koreliacinis ryšys tarp DON koncentracijos µg/kg kiekio ir sporų skaičiaus KSV/g. Išanalizavus kvietinių miltų mėginius nustatyta, kad didėjant mikroskopinių grybų sporų skaičiui didėja DON koncentracija. Sporų skaičiui padidėjus 1 KSV/kg DON koncentracija padidėja 0,09 µg/kg y = 0,1596x - 7,2871 R² = 0, Sporų skaičius x10 9 KSV/g 11 pav. DON koncentracijos priklausomybė nuo sporų skaičiaus KSV/g ruginiuose miltuose 33

34 PRB x10 9 KSV/g Iš 11 pav. matyti DON koncentracijos priklausomybę µg/kg nuo sporų skaičiaus KSV/g. Apskaičiuotas regresinės lygties koeficientas (R 2 = 0,8837), kuris parodo, kad analizuojant ruginius miltus egzistuoja stiprus koreliacinis ryšys tarp DON koncentracijos µg/kg kiekio ir sporų skaičiaus KSV/g. Išanalizavus ruginių miltų mėginius nustatyta, kad didėjant mikroskopinių grybų sporų skaičiui didėja DON koncentracija µg/kg. Sporų skaičiui padidėjus 1 KSV/g DON koncentracija padidėja 0,08 µg/kg. Palyginus kvietių ir ruginių miltų mėginius, stipresnis koreliacinis ryšys nustatytas kvietinių miltų mėginiuose (R 2 = 0,9092). 4.3 FERMENTACIJOS PROCESAI DUONOS GAMYBOS GRANDINĖJE Fermentacijos įtaka DON kiekio sumaţinimui kvietiniuose ir ruginiuose miltuose Vystantis mokslui, pieno rūgšties bakterijos nagrinėjamos vis plačiau. Pagrindinės pieno rūgšties bakterijų gentys: Carnobacterium, Enterococcus, Melissococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus ir Weissella. Vien Laktobacilų genčiai priklauso 148 rūšys. Mes atlikom fermentaciją su viena iš PRB rušių Lactobacillus Sakei. Kuri pagal susidariusius fermentacijos produktus priskiriama fakultatyvams heterofermentams (Parada et al., 2007) Kvietiniai miltai Ruginiai miltai Tradicinė fazė Kieta fazė 12 pav. Pienarūgščių bakterijų skaičius fermentuotuose kvietiniuose ir ruginiuose miltuose 34

35 DON koncentracija µg/kg Iš tyrimų rezultatų matyti, kad fermentuotuose kvietiniuose miltuose PRB skaičius didesnis aptiktas kietoje fazėje 100±0,13x10 9 KSV/g, tradicinėje fazėje aptikta 65±0,08x10 9 KSV/g, tai 35 procentais maţesnis nei kietoje fazėje (p<0,05). Fermentuotų ruginių miltų mėginyje pienarūgščių bakterijų skaičius taip pat didesnis aptiktas kietoje fazėje 79±0,08x10 9 KSV/g, tai 14 proc. didesnis nei tradicinėje fazėje kuris siekė 68±0,08x10 9 KSV/g (p>0,05). Lyginant fermentuotus kvietinius ir ruginius miltus, gauti rezultai rodo, kad kvietiniuose miltuose kietoje fazėje PRB skaičius 21 proc. buvo didesnis, nei ruginiuose miltuose (p<0,05). Tradicinėje fazėje 4 proc. PRB daugiau aptikta ruginiuose miltuose (p>0,05). Kietafazė fermentacija procesas, kurio metu naudojamas labai maţas kiekis vandens. Todėl ji laikoma saugesne, lyginant ją su tradicine fermentacija, nes esant maţam vandens aktyvumui fermentacijos metu sumaţėja mikrobiologinė tarša (Martins et al., 2011). Vykstant fermentacijai ţemas drėgmės kiekis parodo, kad fermentacija gali vykti naudojant mikroorganizmus, mieles, grybus, bakterijas (Franco et al., 2011) Prieš fermentacija Fermentacijos tradicinė fazė Fermentacijos kieta fazė 13 pav. Fermentacijos įtaka DON koncentracijai µg/kg kvietiniuose ruginiuose miltuose Iš pateiktų duomenų matyti, kad kvietinių miltų mėginiuose DON koncentracija µg/kg didţiausia nustatyta mėginiuose prieš fermentaciją 318±24µg/kg, kiek maţiau tradicinėje fazėje 201±21 µg/kg, maţiausiai aptikta kietoje fazėje 154±17 µg/kg. Lyginant DON koncentraciją prieš fermentaciją ir po fermentacijos tradicinėje fazėje nustatyta, kad DON koncentracija sumaţėjo 37 proc. (p<0,001). Palyginus DON koncentraciją prieš 35