B grupės vitaminų kokybinis ir kiekybinis tyrimas vitaminizuotuose gėrimuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA Milda Lukošaitytė B grupės vitaminų kokybinis ir kiekybinis tyrimas vitaminizuotuose gėrimuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas: doc. K. Vitkevičius Kaunas, 2019

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA TVIRTINU: Farmacijos fakulteto dekanas Data: Vitaminų B6 ir B12 kokybinis tyrimas vitaminizuotuose gėrimuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas Konradas Viktevičius Data Darbą atliko Magistrantė Milda Lukošaitytė Data Recenzentas Vardas pavardė parašas Data Kaunas, 2019

1 TURINYS SANTRAUKA... 3 SUMMARY... 4 1. ĮVADAS... 6 2. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI... 7 3. LITERATŪROS APŽVALGA... 8 3.1. Vitamino B3 literatūros apžvalga... 8 3.3.1 Vitamino B3 cheminė struktūra ir fizikinės savybės... 8 3.1.2.Vitamino B3 bsorbcija žarnyne ir metabolizmas.... 9 3.1.3.Vitamino B3 vaidmuo medžiagų apykaitoje.... 10 3.1.4.Vitamino B3 trūkumas ir rekomenduojamos paros normos, pagrindiniai niacino šaltiniai.... 11 3.1.5. Klinikiniai tyrimai atlikti tiriant vitamino B3 suvartojimo įtaką įvairiems sutrikimams.... 12 3.2. Vitamino B6 literatūros apžvalga... 13 3.2.1 Vitamino B6 cheminė struktūra ir fizikinės savybės... 13 3.2.2. Vitamino B6 absorbcija žarnyne ir metabolizmas... 14 3.2.3. Vitamino B6 atliekamos funkcijos organizme... 14 3.2.4. Vitamino B6 trūkumas ir rekomenduojamos paros normos, pagrindiniai šaltiniai.... 15 3.3. Vitamino B12 literatūros apžvalga... 15 3.3.1. Vitamino B12 cheminė struktūra ir fizikinės savybės... 15 3.3.2. Vitamino B12 absorbcija žarnyne... 16 3.3.3. Vitamino B12 atliekamos funkcijos organizme... 17 3.3.4. Vitamino B12 trūkumas ir rekomenduojamos paros normos, pagrindiniai šaltiniai.... 17 3.4. Vitaminizuotų gėrimų svarba ir klasifikacija... 18 3.5. B grupės vitaminų kokybiniai įvertinimo metodai... 18 3.5.1 Vitaminų analizė naudojant kapiliarinę elektoforezę... 19 3.5.2 Vitaminų tyrimas naudojant spektrofluorimetrinį metodą... 20 3.5.3. Vitaminų tyrimas naudojant efektyviąją skysčių chromatografiją... 21 3.5.4. B grupės vitaminų tyrimas multivitaminų tabletėse taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą... 22 4. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKA... 25 4.1 Tyrimo objektas... 25 4.2 Kokybinis ir kiekybinis vertinimas skysčių chromatografijos metodu... 25 5. REZULTATAI... 27 5.1 Metodo validacija... 27 5.1.1 Metodikos specifiškumas... 27

2 5.1.2 Metodo atkartojamumas... 29 5.1.3 Metodo tiesiškumas... 31 5.2 B grupės vitaminų preparatų analizės rezultatai... 32 5.2.1 Vitamino B3 analizė ir rezultatai... 34 5.2.2 Vitamino B6 analizė ir rezultatai... 35 5.2.3 Vitamino B12 analizė ir rezultatai... 36 5.3 Kiekybinė vitaminizuotų gėrimų analizė bei palyginimas... 37 6. IŠVADOS... 39 LITERATŪROS SĄRAŠAS... 40

3 SANTRAUKA B grupės vitaminų kokybinis ir kiekybinis tyrimas vitaminizuotuose gėrimuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu M. Lukošaitytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas doc. K. Vitkevičius; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2019. Tyrimo tikslas - atlikti kokybinį ir kiekybinį B3, B6 ir B12 vitaminų nustatymą vitaminizuotuose gėrimuose pritaikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą bei palyginti tų pačių gėrimų, parduodamų skirtingose šalyse (Lietuva ir Lenkija) sudėtį. Tyrimo uždaviniai: parinkti, pritaikyti ir validuoti pasirinkta efektyciosios skysčių chromatografijos (ESC) metodiką vitaminų B3, B6 ir B12 analizei vitaminizuotuose gėrimuose. Identifikuoti B3, B6 ir B12 vitaminus šiuose gėrimuose. Kiekybiškai įvertinti vitaminų B3, B6 ir B12 kiekį vitaminizuotuose gėrimuose bei palyginti Lietuvoje ir Lenkijoje parduodamų gėrimų sudėtį. Darbo metu vitaminizuoti gėrimai buvo koncentruojami garinant rotaciniu garintuvu, parinkta efektyvioji skysčių metodika analizei. Tinkanti metodika buvo validuota ir pritaikyta vitaminų B3, B6 ir B12 nustatymui vitaminizuotuose gėrimuose. Rezultatai: pritaikyta ESC metodika, kurioje eliuentas yra acetonitrilas bei 0,1% trifluoracto (TFA) rūgšties vandeninis tirpalas (50:50, v/v). Metodika buvo validuota ir sėkmingai pritaikyta vitaminų B3 ir B6 kokybiniam bei kiekybiniam nustatymui, tačiau ši metodika netiko vitamino B12 nustatymui mišinyje, kai vitamino B6 koncentracija viršijo B12 kiekį tūkstančiais kartų. Išvados: taikyta metodika tinka vitaminams B3 ir B6 nustatyti kokybiškai ir kiekybiškai vitaminizuotuose gėrimuose. Visuose gėrimuose pastebimi panašūs nuokrypiai nuo etiketėje nurodyto kiekio: vitamino B3 kiekis niekur nesiekia nurodytos ribos, o vitamino B6 visur viršija. Abiejų šalių rinkų vitaminizuotų gėrimų sudėtis yra panaši, skirtumai nedideli, varijuoja skirtinguose gėrimuose.

4 SUMMARY Analysis of B group vitamins in vitamin drinks by high-performance liquid chromatography Milda Lukošaitytė. Master's thesis/scientific supervisor doc. K. Vitkevičius. Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Analytical and Toxicological Chemistry Departament. Kaunas, 2019 The aim of this work is to perform qualitative and quantitative determination of B3, B6, and B12 vitamins in vitaminized beverages by means of high-performance liquid chromatography and to compare the composition of the same drinks sold in different countries (Lithuania and Poland). In order to achieve our goal we have set ourselves tasks: to collect and summarize information about B group vitamins, the effect vitamins B3, B6, and B12 have on the body and general information on vitaminized drinks and their possible analysis. To validate the qualitative and quantitative evaluation of the mixture of B group vitamins. To apply a validated HPLC method for the qualitative and quantitative assessment of B3, B6, and B12 vitamins. To summarize the results, compare the results with the information on the manufacturer's label and to compare the quantitative composition of the same drinks sold in Lithuania and Poland. During the work, the vitaminized drinks were concentrated by evaporation with a rotary evaporator, and the effective liquid methodology was selected for analysis. The appropriate methodology has been validated and adapted for the detection of vitamins B3, B6 and B12 in vitaminized drinks. Results: An ESC methodology was developed, in which the eluent is acetonitrile and an aqueous solution of 0.1% trifluoroacetate (TFA) acid (50:50, v / v). The methodology was validated and successfully applied for the quantitative and qualitative determination of vitamins B3 and B6. However, this method was not suitable for the determination of vitamin B12 in a mixture when the concentration of vitamin B6 exceeded B12 in thousands of times. Conclusions: The applied ESC method is suitable for the detection of vitamins B3 and B6 in vitaminized drinks. There are similar deviations from composition given on the label in all drinks: the amount of vitamin B3 is below the limit and vitamin B6 is above the limit. In both markets, the composition of vitamin drinks is similar, the differences are small, varying in different beverages.

5 SANTRUMPOS ESC - efektyvioji skysčių chromatografija. PDA - fotodiodų matricos detektorius. UV - ultravioletinė spinduliuotė. NAD - Nnikotinamido adenino dinukleotidas. PLP - piridoksalio-5'-fosfatas. MTL - mažo tankio lipoproteinai. HDL - didelio tankio lipoproteinai. RPN - rekomenduojama paros norma. KE - kapiliarinė elektroforezė. PC - plonasluoksnė chromatografija.

6 1. ĮVADAS Šiuolaikinėje visuomenėje žmonės gyvena ypatingai dideliu tempu, todėl rinkoje yra atsiradęs didelis pasirinkimas produktų, kurie galimai kompensuoja vitaminų bei maistinių medžiagų stygių organizme. Maisto papildai, į kurių sudėtį įeina įvairūs vitaminai, yra viena didžiausių ir plačiausiai vartojamų farmacinių produktų kategorijų, tačiau dar didesnį prieinamumą pasiekė vitaminizuotų gėrimų grupė. Šių produktų galima įsigyti bet kurioje maisto parduotuvėje ar degalinėje, dėmesį patraukia įvairiaspalviai gėrimai, kurių etiketėse - įvairiausių vitaminų simboliai. Dažnai vitaminų tarpe pasitaikanti - B vitaminų grupė. B vitaminai yra vandenyje tirpių vitaminų klasė, kuri atlieka svarbų vaidmenį ląstelių apykaitoje. Nors šie vitaminai turi panašų pavadinimą, jie yra chemiškai skirtingi junginiai, kurie dažnai egzistuoja tuose pačiuose maisto produktuose. Kiekvienas B vitaminas yra kofaktorius (paprastai - koenzimas) pagrindiniams medžiagų apykaitos procesams. Didžiausia B grupės vitaminų koncentracija randama mėsoje. Jie taip pat randami nedideliais kiekiais visuose neperdirbtuose angliavandenių turinčiuose maisto produktuose. Perdirbti angliavandeniai, tokie kaip cukrus ir balti miltai, paprastai turi mažesnį B vitamino kiekį [1]. Vitaminas B3 yra labai svarbus NAD gamyboje. Žmogaus organizmas nesugeba gaminti NAD ar triptofano be vitamino B3. NAD, kartu su fosforilintu nikotinamido adenino dinukleotido fosfato (NADP) variantu, yra naudojami pernešimo reakcijose DNR atstatymo ir kalcio mobilizavimo metu [2]. Piridoksalio-5'-fosfatas, metaboliškai aktyvi vitamino B6 forma, dalyvauja daugelyje makroelementų metabolizmo, neurotransmiterių sintezės, histamino sintezės, hemoglobino sintezėje ir funkcijoje bei genų ekspresijoje. PLP paprastai veikia kaip koenzimas (kofaktorius) daugeliui reakcijų, įskaitant dekarboksilinimą, transaminaciją, racemizaciją, pašalinimą, pakeitimą ir beta grupės interkonversiją. Kepenys yra vitamino B6 metabolizmo vieta [3]. Vitaminas B12, dar žinomas kaip kobalaminas, svarbus genetinės medžiagos struktūros formavimui užtikrinant DNR metilinimą, raudonųjų kraujo kūnelių susidarymui, ląstelių dalijimuisi.taip pat reguliuoja maisto energijos kaupimą raumenų audiniuose ir kraujodarą, aktyvina folio rūgštį, mažina cholesterolio koncentraciją kraujo plazmoje, yra svarbus nervų sistemai[4]. Norint įsitikinti ar vitaminizuoti gėrimai yra veiksmingi vitamino B šaltiniai, būtina nustatyti geriausią jų analizės būdą ir ištirti sudėtį.

7 2. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI Darbo tikslas Tyrimo tikslas - atlikti kokybinį vitaminų B3, B6 ir B12 nustatymą vitamininiuose gėrimuose pritaikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą bei palyginti Lietuvos ir Lenkijos rinkų vitaminizuotų gėrimų sudėtį. Darbo uždaviniai 1. Parinkti, pritaikyti ir validuoti pasirinktą efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodiką vitaminų B3, B6 ir B12 analizei vitaminizuotų gėrimų analizei. 2. Identifikuoti B3, B6 ir B12 vitaminus vitaminizuotuose gėrimuose. 3. Kiekybiškai įvertinti vitaminų B3, B6 ir B12 kiekį vitaminizuotuose gėrimuose. 4. Palyginti Lietuvoje ir Lenkijoje parduodamų vitaminizuotų gėrimų sudėtį.

8 3. LITERATŪROS APŽVALGA 3.1. Vitamino B3 literatūros apžvalga 3.3.1 Vitamino B3 cheminė struktūra ir fizikinės savybės Vitaminas B3 susideda iš dviejų molekulių: nikotinamido ir nikotino rūgšties. Literatūroje jie bendrai kartu vadinami niacinu, tačiau šis terminas yra naudojamas ir tik nikotino r. atskirai. Organizme šios molekulės, kartu ir amino rūgšties triptofanu, yra verčiamos į nikotinamido adenino dinukleotidą (NAD) ir nikotinamido adenino dinukleotido fosfatą - kofermentus, būtinus daugeliui cheminių reakcijų lastelėje.[5] 2 pav. vitamino B3 formos:niacinamidas, niacinas. Nikotino rūgštis ir nikotinamidas yra vandenyje tirpūs vitaminai. Nikotino rūgštis yra amfoteriška, tad sudaro druskas ir su rūgštimis, ir su šarmais, gali sudaryti esterius ir anhidridus per karboksilinę grupę. Abu junginiai yra labai stabilūs sausoje formoje, tačiau tirpale nikotinamidas yra hidrolizuojamas rūgščių ir bazių, pasekoje virsta nikotino rūgštimi. [6] Niacino kofermentų formos yra piridino nukleotidai: NAD(H) ir NADP(H). Abiejuose junginiuose elektronus pritraukiantis N-1 atomo ir amidinės grupės efektas leidžia piridino C-4 atomui reaguoti su nukleofiliniais junginiais: sulfitais, cianido ir hidrido jonais.

3.1.2.Vitamino B3 bsorbcija žarnyne ir metabolizmas. 9 Vandenyje tirpūs vitaminai daugiausia rezorbuojami plonojoje žarnoje, tuo tarpu tie, kurie sintetinami mikrobų storojoje žarnoje, yra absorbuojami. Daugeliui šių vitaminų buvo nustatytos specifinės nešiklio perdavimo sistemos, leidžiančios įsisavinti iš žarnyno liumenų į enterocitą ir eksportuoti iš bazolitinio paviršiaus. Kai kurie iš šių vežėjų yra priklausomi nuo natrio, o kiti - ne.[7] Nikotino rūgšties ir nikotinamido absorbcija iš skrandžio ir žarnyno yra greita ir mažomis koncentracijomisbei yra priklausoma nuo natrio jonų palengvintos difuzijos. Didesnės koncentracijos atveju vyrauja pasyvioji difuzija, kai 3 4 g niacino dozės yra beveik visiškai absorbuojamos.[8] Niacino koenzimai NAD ir NADP sintezuojami visuose kūno audiniuose iš nikotino rūgšties arba nikotinamido. NAD audinių koncentraciją reguliuoja ekstraląstelinio nikotinamido koncentracija, kuri savo ruožtu yra kontroliuojama kepenyse ir veikia hormoniškai. Kepenų NAD hidrolizė leidžia išskirti nikotinamidą transportavimui į audinius, kurie neturi gebėjimo sintezuoti NAD ir NADP koenzimus iš triptofano. Kepenyse dalis nikotinamido pertekliaus plazmoje paverčiamas į saugomąjį NAD (t.y. NAD, kuris nėra prisijungęs prie fermentų). Skylant NAD, nikotinamidas gali būti konvertuojamas į NAD per nikotinamido ribonukleotidą. Nikotinamidą deaminizuoja žarnyno mikroflora [9]. Kūno niacino poreikį tenkina ne tik maiste esantys nikotino rūgštis ir nikotinamindas, bet ir konversija iš maistinio baltymo, kurio sudėtyje yra triptofano. Santykinis triptofano indėlis yra apskaičiuotas taip: 60 mg triptofano = 1 mg niacino = 1 mg niacino ekvivalentų [2]. Niacino perteklius kepenyse yra metilinamas į N1-metil-nikotinamidą, kuris išsiskiria su šlapimu kartu su N1-metil-nikotinamido 2- ir 4-piridono oksidacijos produktais. Du pagrindiniai išskyrimo produktai yra N1-metil-nikotinamidas ir jo piridono darinys. Šios proporcijos šiek tiek skiriasi priklausomai nuo į žarnyną patekusio niacino kiekio ir formos bei individualaus niacino statuso [9].

10 3.1.3.Vitamino B3 vaidmuo medžiagų apykaitoje. Niacinas, kaip kofermentas NAD ir NADP, veikia daugelyje organizmo redokso reakcijų. NAD veikia intraląsteiniame kvėpavime ir kaip kodehidrogenazė su fermentais, susijusiais su įvairių molekulių oksidacija, pavyzdžiui, gliceraldehido 3-fostato, laktato, alkoholio, 3-hidroksibutirato, piruvato ir α-ketoglutarato. NADP veikia redukcinėse biosintezėse, tokiose kaip riebalų rūgščių ir steroidų sintezėje ir, kaip NAD, kaip kodehidrogenazė gliukozės-6-fosfato ir ribozės 5-fosfato oksidacijoje [2]. Kad atliktų savo vaidmenį medžiagų apykaitoje, niacinas iš pradžių yra įtraukiamas į NAD+, kuris vėliau galimai fosforilinamas į NAD(P)+ formą, kas sudaro sąlygas fermentų selektyvumui. Abiejais atvejais vyksta elektronų oksidacijos-redukcijos reakcijos ir sugeneruojamos redokso poros metabolizme (NAD + /NAD(H), NAD(P) + /NAD(P)H). Sveikose ląstelėse NAD baseinas palaikomas labai oksiduotoje būsenoje ( 90% NAD +), daugiausia veikiant elektronų transportavimo grandinei. Ir atvirkščiai, NAD (P) baseinas išlieka labai sumažėjęs, daugiausia veikiant pentozės fosfato reakcijoms. Rezultatas yra toks, kad kiti fermentai, susieti su NAD redokso pora, stipriai oksiduojasi, tuo tarpu tie, kurie susiję su NAD(P) redokso pora, stipriai redukuojasi. Pažymėtina, kad NAD redokso pora dalyvauja 400 reakcijų, daugiausia kataboliniame metabolizme, glikolizėje, Krebso cikle, etanolio oksidacijoje ir pan. ir citochromo P450 metabolizmas endobiotikams ir ksenobiotikams. NAD(P) redokso pora dalyvauja 30 reakcijų, daugiausia anabolinio metabolizmo, oksidantų apsaugos ir citochromo P450 endobiotikų ir ksenobiotikų metabolizme. Be to, yra apie 50 ADP-ribosilo transferazių, kurios kaip substratą naudoja NAD +, todėl jis skaidosi. Kai kurie iš šių fermentų prideda mono(adp-ribozės) vienetus į G baltymus arba poli(adp-ribozės) grandines prie DNR atstatymo fermentų, kad reguliuotų jų aktyvumą. Nuo NAD priklausomos deacetilazės naudoja ADP-ribozę kaip akceptorių deacetilinant substratus, tokius kaip sirtuino baltymai. Galiausiai cadp-ribozė ir nikotino rūgštis ADP veikia kontroliuodamos intraceliulinį kalcio signalizavimą, kuris yra labai svarbus nervų sistemos veikimui. Didelė šių vaidmenų svarba atsispindi niacino trūkumo patologijose [10],[2].

11 3.1.4.Vitamino B3 trūkumas ir rekomenduojamos paros normos, pagrindiniai niacino šaltiniai. Sunkus niacino trūkumas žmonėms pasireiškia liga pelagra, kuriai būdingi "4D" simptomai: dermatitas, demencija, viduriavimas ir mirtis (dermatitis, dementia, diarrhea, death)[11].dermatitas yra unikalus, nes jis atsiranda dėl saulės poveikio, o tai rodo, kad yra DNR atstatymo defektas. Manoma, kad šis defektas atsiranda dėl pablogėjusios poli(adp-ribozės) sintezės atsakant į UV spindulių sukeltą DNR pažeidimą.eksperimentiniai modeliai parodė genominį nestabilumą, reaguojant į niacino trūkumą[12]. Nors dar trūksta informacijos, tačiau žmogaus epidemiologija indikuoja, jog niacino trūkumas didina vėžio riziką.manoma, kad simptomus sukelia sumažėjęs cadp-ribozės ir nikotino rūgšties ADP susidarymas, todėl pasikeičia nervų kalcio signalizacija. Niacino papildų nauda buvo stebima eksperimentiniuose vėžio, širdies ir kraujagyslių ligų, odos sveikatos, psichinės sveikatos ir oksidantų plaučių pažeidimo tyrimuose. Amerikos maisto ir mitybos tarnyba įvertino rekomenduojamas suvartoti niacino normas atsižvelgiant į pagrindinį nustatymo kriterijų - niacino metabolitų išsiskyrimą su šlapimu. Biologinis prieinamumas nekeičiamas, tačiau reikalavimas yra išreiškiamas niacino ekvivalentais (NE), todėl aminorūgščių triptofanas gali būti konvertuojamas į niaciną (1 niacino ekvivalentas = 1 mg niacino arba 60 mg triptofano). Suaugusiems žmonėms RPN yra 16 mg/dieną NE vyrams ir 14 mg/dieną NE moterims [1]. Vitamino B3 yra daugelyje maisto produktų, ypač liesoje mėsoje (veršienos nugarinėje 5,1 mg), kepenyse (15,5 mg), žuvies produktuose (lašišoje 7,5 mg; skumbrėje 6,5 mg), žirniuose (2,5 mg), pupelėse (2,4 mg), grikių kruopose (3,5 mg), rupioje duonoje (0,7 mg), riešutuose (žemės riešutuose 15,5 mg; lazdynų riešutuose 1,2 mg; migdolų riešutuose 3,5 mg). Šie produktai turi nemažai aminorūgšties triptofano, reikalingo niacinui gaminti [13].

12 3.1.5. Klinikiniai tyrimai atlikti tiriant vitamino B3 suvartojimo įtaką įvairiems sutrikimams. Farmakologinės nikotino rūgšties dozės (1 3 g / d) mažina MTL cholesterolio kiekį kraujyje ir padidina cholesterolio kiekį kraujyje, todėl galimas klinikinis poveikis širdies ir kraujagyslių ligų (CVD) profilaktikai ir gydymui [14]. Buvo pastebėta, jog niacino suvartojimas, tiek monoterapijoje, tiek derinant su statinais ir (arba) tulžies rūgščių sekvestrantais, koreguoja HDL: LDL cholesterolio santykį pacientams, sergantiems dislipidemija, ir žymiai pagerina aterosklerozės žymenis. Tačiau neseniai atliktais klinikiniais tyrimais, kuriuose buvo analizuojama ilgalaikė niacinu papildyta statinų terapija, pacientams, kurių kraujo lipidai buvo optimaliai kontroliuojami, nenustatyta sumažėjusių širdies ir kraujagyslių sutrikimų dažnumo.tačiau jie nustatė didesnę rimtų nepageidaujamų reiškinių riziką naujai išsivysčiusio diabeto atvjeu. Trumpalaikių biomarkerių ir ilgalaikių rezultatų nesutapimas greičiausiai atsiranda dėl didelio statinų vartojimo ilgalaikio tyrimo metu, o niacinas vis tiek gali būti svarbus gydyme pacientams, kurie netoleruoja statinų ar sekvestrantų bei siekia pasiekti savo tikslinę HDL ir MTL cholesterolio vertę. Klinikinių tyrimų metu pastebėtas nepageidaujamas poveikis buvo tipiškas odos paraudimas ir niežėjimas, taip pat sunkesnės būklės, įskaitant virškinimo trakto ir raumenų bei kaulų sistemos sutrikimus, širdies nepakankamumą, diabetines komplikacijas ir naujai atsiradusį diabetą [15].

13 3.2. Vitamino B6 literatūros apžvalga 3.2.1 Vitamino B6 cheminė struktūra ir fizikinės savybės Vitaminas B6 yra vandenyje tirpus vitaminas, kuris pirmą kartą buvo izoliuotas 1930 m. Terminas B6 reiškia šešias bendras formas, t.y. piridoksalą, piridoksiną (piridoksolį), piridoksaminą ir jų fosforilintas formas. Fosfato esterio darinio piridokso 5'-fosfatas (PLP) yra bioaktyvi koenzimo forma, dalyvaujanti daugiau kaip 4% visų fermentinių reakcijų [10]. 1 pav. 3 nefosforilintos vitamino B6 formos: piridoksinas, piridoksalis ir piridoksaminas ir piridoksalio fosfato esterio darinys. Visi trys nefosforilinti junginiai biologinėse sistemose yra konvertuojami tarpusavyje. Vitaminas B6 yra ganėtinai stabilus - veikiant stipria rūgštimi ar šarmais nepraranda biologinių savybių net kaitinant. Tačiau veikiant šviesa ar oksidacija vitaminas greitai nyksta.

3.2.2. Vitamino B6 absorbcija žarnyne ir metabolizmas 14 Vitamino B6 absorbcija organizme prasideda nuo fosforilintų vitamino formų hidrolizės. Tuomet laisvasias B6 formas absorbuoja efektyvus, specializuotas nešiklis, kuris yra labai priklausomas nuo rūgštinio ekstraląstelinio ph. Be to, šio vitamino įsisavinimo sistema yra jautri veikiama amilorido. Niacino absorbcija vyksta similiariai per nešiklius, priklausomus nuo rūgštinio ekstraląstelinio ph. Abu šie procesai yra nepriklausomi nuo natrio [16]. Gyvūnų audiniuose pagrindinė vitamino B6 forma yra PLP; toliau yra PMP. Absorbcija į žarnyną apima fosfatazės sukeltą hidrolizę, po kurios nefosforilinta forma patenka į gleivinės ląstelę. Transportas vykdomaspasyviosios difuzijos mechanizmu. Net labai didelės dozės gerai absorbuojamos [17]. Dauguma absorbuoto nefosforilinto B6 patenka į kepenis. Piridoksinas (PN), piridoksalis (PL) ir piridoksaminas (PM) konvertuojami į fosfatus atitinkamai: PNP, PLP ir PMP. PNP, kuris paprastai randamas tik labai mažomis koncentracijomis, ir PMP oksiduojami į PLP PNP oksidaze. PMP taip pat gaunamas iš PLP per aminotransferazių reakcijas. Piridoksalio fosfatas yra susietas su įvairiais baltymais audiniuose; tai apsaugo jį nuo fosfatazių poveikio. Galimybė prisijungti prie baltymų riboja PLP kaupimąsi audiniuose esant labai dideliam B6 suvartojimui.kai šis pajėgumas viršijamas, laisvas PLP greitai hidrolizuojamas, o nefosforilintos B6 formos išsiskiria kepenyse ir kituose audiniuose [18]. 3.2.3. Vitamino B6 atliekamos funkcijos organizme Piridoksalio fosfatas yra koenzimas daugiau nei 100 fermentų, dalyvaujančių aminorūgščių metabolizme, įskaitant aminotransferazes, dekarboksilazes ir dehidratazes.tai yra kofermentas δ- aminolevulinazės sintazei, kuris katalizuoja pirmąjį žingsnį hemo biosintezėje ir cistationino β-sintazės metu.plp karbonilo grupė prisijungia prie baltymų kaip Šifo bazės su lizino ɛ-aminu. Praktiškai visiems PLP fermentams pradinis katalizės etapas apima Schifto bazės formavimąsi tarp gaunamos aminorūgšties, per jos a-amino grupę ir PLP karbonilo grupę.didžioji dalis viso organizmo PLP randama raumenyse susijungęssu fosforilaze. PLP yra kofermentas fosforilazės reakcijoje ir yra tiesiogiai įtrauktas į katalizę [3].

15 3.2.4. Vitamino B6 trūkumas ir rekomenduojamos paros normos, pagrindiniai šaltiniai. B6 vitamino trūkumas gali pasireikšti jauniems žmonėms traukuliams. Esant dideliam nepakankamumui suaugusiems paprastai pasireiškia bėrimas ir psichinės būklės pokyčiai. Papildomi klinikiniai požymiai gali būti normocitinė anemija, nespecifinis niežulys, įtrūkimai burnos kampe ir glositas (liežuvio patinimas). Depresija taip pat susijusi su sunkiu B6 trūkumu [3]. RPN arba rekomenduojama paros norma suaugusiems B6 yra nuo 1 iki 1,7 mg per dieną. Vaikams nuo 1 iki 3 metų rekomenduojama vartoti 0,5 mg per parą, o nuo 3 iki 13 metų rekomenduojama suvartoti 1 mg per parą. Nėštumo ir žindymo laikotarpiu rekomendacijos yra 1,9 mg ir 2 mg per parą [1]. Vitamino B6 yra ir gyvūniniuose produktuose: kepenyse (0,45 mg), mėsoje (veršienos nugarinėje 0,31 mg), žuvyje (lašišoje 0,98 mg, skumbrėje 0,65 mg, tune 0,46 mg), pieno produktuose (0,05 mg), kiaušiniuose (0,14 mg). Taip pat jo yra ir augaliniuose maisto produktuose: pupelėse (0,42 mg), kruopose (perlinėse 0,33 mg, nepoliruotuose ryžiuose 0,55 mg), miltuose (0,26 mg), daržovėse (bulvėse 0,20 mg, paprikoje 0,45 mg, krapuose 0,3 mg, brokoliuose 0,17 mg, špinatuose 0,34 mg), mielėse (0,60 mg). Termiškai apdorojant maistą, apie 20-35% šio vitamino suyra [1]. 3.3. Vitamino B12 literatūros apžvalga 3.3.1. Vitamino B12 cheminė struktūra ir fizikinės savybės Kobalaminas yra bendras terminas, naudojamas apibūdinti kobalto turinčių junginių grupę (korinoidai), tam tikros struktūros, kurioje yra cukraus ribozės, fosfatas ir bazė (5, 6- dimetilbenzimidazolo) yra pritvirtinti prie korpuso žiedo[19]. Vitaminas B12 dar gali būti vadinamas kobalominu. Tai vitamino ir organometalo junginys. Jis buvo atrastas 1849m. tiriant kepenis ir ieškant faktoriaus, kuris gali išgydyti anemiją. Pirmąkart struktūrizuotas 1954m. kaip fermento kofaktorius DNA sintezėje. Kobalomino molekulė gali būti randama keliose formose, priklausomai su kuo jungiasi: cianidu (cianokobalominas), metilo grupe

16 (metilkobalaminas), deoksiadenosinu (deoksiadenosilkobalaminas) ar hidroksilo grupe (hidroksikobalaminas) [19]. Vitaminas B12 skiriasi nuo kitų korinoidinių junginių, nes nukleotidinės grandinės pusėje vitaminas B12 baigiasi dimetilbenzimidazolu. Kobalaminas yra organinis organinis junginys, galintis sudaryti kompleksus su metaliniais jonais, kaip šiuo atveju - kobaltu [20]. Vitaminas B12 yra tirpus vandenyje ir ganėtinai stabilus veikiant aukšta temperatūra, bet suyra pasiekus 210 laipsnių temperatūrą be tirpimo. Šis junginys reaguoja su askorbo rūgštimi ir redukuojasi, paleisdamas kobaltą kaip laisvą joną. Kobalaminai su stipriai prisijungusiais ligandais (ciano-, metil, adenosilkobalaminai) yra amžiau reaktyvūs ir stabilesni veikiant askorbo rūgštimi[20]. 3.3.2. Vitamino B12 absorbcija žarnyne Vitamino B12 arba cianokobalamino (Cbl) absorbcija yra unikali, nes reikialingi įvairūs procesai vykstantys nuo skrandžio iki ileumo, dalyvauja bent keturi skirtingi rišamieji baltymai [21]. Nedideli B12 kiekiai absorbuojami per aktyvų procesą, kuriam reikalingas nepažeistas skrandis, vidinis faktorius (glikoproteinas, kurį išskiria parietalinės skrandžio ląstelės po to, kai stimuliuoja maistas), kasos pakankamumas ir normaliai veikiantis terminalinis ileumas. Skrandyje su maistu susietas B12 yra atskiriamas nuo baltymų, veikiant rūgščiai ir pepsinui. Atpalaiduotas B12 tada prisijungia prie R baltymų (haptokorinų), kurie tra išskiriami seilių liaukų ir skrandžio gleivinės. Plonojoje žarnoje kasos proteazės iš dalies suskaido R baltymus, atleidžiant B12, kad prisijungtų prie vidinio faktoriaus. Gautas vidinio faktoriaus ir B12kompleksas jungiasi prie specifinių receptorių ileeumo gleivinės; po komplekso internalizavimo B12 patenka į enterocitą. Maždaug po 3 4 valandų B12 patenka į cirkuliaciją.visas cirkuliuojantis B12 yra prijungiamas prie plazmos surišančių baltymų

17 - transkobalamino I, II arba III (TCI, TCII arba TCIII). Nors TCI jungiasi maždaug su 80% kraujo turimų B12, TCII yra forma, kuri nuneša B12 į audinius per specifinius TCII receptorius [19]. 3.3.3. Vitamino B12 atliekamos funkcijos organizme Cianokobalaminas yra dviejų fermentų kofaktorius: metionino sintazės ir l-metilmalonil-coa mutazės. Metionino sintazei reikia metilkobalamino kaip kofaktoriaus, skirto metilo perdavimui iš metiltetrahidrofolato į homocisteiną, kad susidarytų metioninas ir tetrahidrofolatas.l-metilmetalonil- CoA mutazei reikia adenozilkobalamino l-metimetalonil-coa paversti į sukcinil-coa izomerizacijos reakcijoje. B12 trūkumo atveju folio rūgštis gali susikaupti serume, nes sulėtėja B12 priklausomas metiltransferazė. Tinkamas B12 kiekis yra būtinas normaliam kraujo formavimui ir neurologinei funkcijai [4]. 3.3.4. Vitamino B12 trūkumas ir rekomenduojamos paros normos, pagrindiniai šaltiniai. Pagrindinė kliniškai pastebima vitamino B12 trūkumo priežastis yra sunki anemija. Hematologiniai B12 trūkumo požymiai yra neatskiriami nuo folato trūkumo požymių. Tai yra odos dėmės, susijusios su laipsnišku bendrų anemijos simptomų atsiradimu, pvz., sumažėjusi energija ir fizinio krūvio tolerancija, nuovargis, dusulys ir širdies plakimas [4]. Neurologiniai trūkumo požymiai pasireiškia jutimo sutrikimu galūnėse (dilgčiojimas ir tirpimas), ryškiau jaučiasi apatinėse galūnėse. Taip pat atsiranda motorinių sutrikimų, įskaitant judėjimo sutrikimus. Gali atsirasti kognityviniai pokyčiai, pradedant koncentracijos sutrikimu iki atminties praradimo, dezorientacijos ir atviros demencijos, su nuotaikos pokyčiais arba be jų. Be to, gali pasireikšti regos sutrikimai, nemiga, impotencija, pažeista žarnyno ir šlapimo pūslės kontrolė [1]. RPN arba rekomenduojama paros norma suaugusiems B12 yra 3 μg (1-2,4 μg). Nėščioms ir maitinančioms moterims vitamino reikia 4 μg per parą [1]. Šio vitamino augaliniuose produktuose beveik nėra, jo yra gyvūniniuose maisto produktuose: kepenyse (32 μg), mėsoje (4 μg), žuvyje (skumbrėje 9 μg, lašišoje 6 μg, tune 2 μg), piene ir jo produktuose (0,4 μg), taip pat kiaušiniuose (2 μg) [13]. Vegetarams šio vitamino būtina vartoti papildomai.

18 3.4. Vitaminizuotų gėrimų svarba ir klasifikacija Rehidratacija yra esminis reikalavimas treniruočių metu, nes rezultatai gali smarkiai suprastėti net ir nuo nedidelio dehidratacijos lygio. Treniruotės metu prarastų elektrolitų atstatymas skatina tinkamą rehidrataciją, o tai leidžia atitolinti nuovargį. Šie gėrimai praturtinti vitaminais, kurie atlieka svarbų vaidmenį žmogaus organizme bei ląstelių apykaitoje. B vitaminų kompleksas ypatingai svarbus nervų regeneracijai ir raumenų funkcijai. Sportiniai vitaminizuoti gėrimai būna trijų tipų, kurie skiriasi skysčių, elektrolitų ir angliavandenių kiekiu: Hipotininiai - skirti greitai atstatyti treniruotės metu prarastus skysčius. Hipotoniniai gėrimai turi labai mažą angliavandenių kiekį ir didesnę nei žmogaus kūne druskos bei cukraus koncentraciją. Izotoniniai - turi tokią pačią druskaus ir cukraus koncentraciją kaip ir žmogaus kūnas. Jie skirti greitai atstatyti treniruotės metu prarastus skysčius, tuo pačiu padidindami angliavandenių kiekį. Hipertoniniai - Skirti papildyti žmogaus kūno kasdieną gaunamą angliavandenių kiekį. Jų sudėtyje yra daug angliavandenių, kad suteiktų maksimaliai energijos. Geriausia gerti po treniruotės, nes po jos svarbu greitai atstatyti glikogeno lygį. Jie turi mažesnę nei žmogaus kūne druskos bei cukraus koncentraciją. Šiuo metu rinkoje šių gėrimų yra labai mažai. Šie gėrimai yra praktiški, specialiai sukurti aktyviems žmonėms, kad padėtų palaikyti skysčių balansą, mineralų ir vitaminų balansą 3.5. B grupės vitaminų kokybiniai įvertinimo metodai Terminas B grupės vitaminai paprastai reiškia tiaminą, riboflaviną, piridoksiną, nikotino rūgštį, pantoteno rūgštį, biotiną, cianokobalaminą ir folio rūgštį. Kadangi cheminių medžiagų struktūra nesusijusi, buvo paskelbta nemažai dokumentų, kuriuose aprašyti įvairūs fiziniai, cheminiai ir biologiniai tyrimo metodai [22].Kartu sunku nustatyti keletą vandenyje tirpių vitaminų ir dažnai reikia atlikti daug skirtingų analizių. B grupės vitaminų nustatymui naudojami įvairūs instrumentiniai metodai, įskaitant elektrocheminius metodus, spektrofotometriją, išvestinę UV spektrofotometriją, spektrofluorimetriją, normalios fazės ir atvirkštinės fazės PC ir ESC procedūras ir kapiliarines elektroforezes.

19 Dažniausiai naudojamas B grupės vitaminų nustatymo metodas yra atvirkštinės fazės ESC, naudojant C18 kolonėlę ir vandenines-organines mobilias fazes rūgščioje terpėje. Kitos chromatografijos sistemos atskiria B1, B6 ir B12, kai jos yra toje pačioje koncentracijos diapazone, bet trukdo, kai B1 ir B6 kiekis viršija šimtą ar net tūkstantį kartų didesnį kiekį B12 komplekse [23]. 3.5.1 Vitaminų analizė naudojant kapiliarinę elektoforezę Gėrimai su vitaminais yra labai populiarūs šiuolaikinėje maisto pramonėje. Todėl svarbu turėti jiems greitus ir pigius kokybės kontrolės metodus. Kapiliarinė elektroforezė (KE) pasižymi aukštu atskyrimo efektyvumu ir mažomis sąnaudomis. Nuo pat jos išradimo 1980-ųjų pradžioje [22] buvo keli skirtingi bandymai, kaip pritaikyti KE vandenyje tirpių vitaminų analizei, siekiant maksimalaus efektyvumo [24].Nors šiuo metu vandenyje tirpių vitaminų analizei dažniausiai taikomas efektyviosios skysčių chomatografijos metodas, tačiau yra viena pagrindinė šio būdo problema - vitaminai nėra kilę iš vienos bendros molekulinės klasės, todėl neįmanoma juos paruošti viename mėginio valymo etape. 1998m. Buskow ir kitisukūrė micelinį elektrokinetinį kapiliarinės chromatografijos metodą, skirtą įvairiems vitaminams iš džiovintų apelsinų sulčių nustatyti, naudojant natrio cholatą kaip micelio fazę naudojo natrio dodecilsulfatą bei septynis vandenyje tirpius vitaminus atskyrė tik per 6min [25]. Savo darbe Schreiner ir kiti nustatė, kad norint atskirti ankstyvai eliuojantį nikotinamidą nuo smailės, kurią sukelia elektroosmotinis srautas, reikėjo padidinti atlikimo laiką iki 20 min. Norint tiksliai nustatyti kiekybiškai, būtina visiškai atskirti jį nuo pagrindinės smailės.visos analizės buvo atliktos Beckman P / ACE 5000 KE sistema su UV detektoriumi ir standartiniu kapiliaru (50cm 675 lm; nepadengtas silicio dioksidas), automatiniu purkštuvu ir temperatūros kontrolės sistema. Duomenų įrašymas ir apdorojimas buvo atliktas naudojant Millennium 2.10m programinę įrangą. Statistika buvo atlikta Microsoft Excelm [26]. Vitaminų standartai buvo ištirpinti vandenyje atskirai. Tiamino hidrochlorido, piridoksino hidrochlorido, pantoteno rūgšties ir nikotinamido koncentracijos tirpaluose buvo 300mcg/ml ir 30mcg/ml kobalaminui ir riboflavinui. Standartai buvo atskiesti į 30 ir 3mcg/ml atitinkamai analizei. Pažymėtina, kad paprastai neįmanoma nustatyti vitamino B12 kartu su kitais vitaminais, nes biologiniuose mėginiuose vitamino B12 koncentracija yra tik 1/1000 daugelio kitų vitaminų. Šiame darbe į vertinimą buvo įtrauktas vitaminas B12, nes galima išgauti rezultatus išskirtinais atvejais su tam tikrais farmaciniais preparatais. Tyrimo metu vitaminizuoti gėrimai buvo supurtomi, kad pasišalintų CO2 ir praskiedžiami 1:1 su vidiniu etalonu (40mg/l Na-sacharinu) [26].

20 Vitaminų identifikavimas vitaminizuotų gėrimų mėginiuose buvo atliekamas lyginant standartų smailes su mėginio smailėmis. Visuose mėginiuose nikotinamidas ir piridoksinas gali būti tiksliai išmatuotas, nustatant beveik 100%. Tačiau kitų vitaminų identifikavimas nebuvo sėkmingas visuose ištirtuose mėginiuose. Pavyzdžiui, riboflavinas buvo patenkinamai nustatytas viename mėginyje, tačiau kitame buvo silpnas matomumas. Pantotenato ir tiamino rezultatai neatitiko tikslumo reikalavimų visuose mėginiuose, nustatant tik 57% matomumą. Kitaip tariant, šis metodas sėkmingas piridoksinui ir nikotinamidui, nes jie gerai absorbuojami 214 nm, ir jų koncentracija visuose mėginiuose buvo ganėtinai didelė [26]. 3.5.2 Vitaminų tyrimas naudojant spektrofluorimetrinį metodą Buvo pritaikyti du paprasti ir jautrūs spektrofluorimetriniai metodai trijų vandenyje tirpių vitaminų (B1, B2 ir B6) nustatymui mišiniuose, kuriuose yra cianokobalamino.pirmasis buvo skirtas tiamino nustatymui, kuris priklauso nuo tiamino HCl oksidacijos tiochromu, naudojant jodą šarminėje terpėje.šis metodas buvo tiksliai pritaikytas tiamino nustatymui antriniuose, tretiniuose ir ketvirtiniuose mišiniuose su piridoksino HCl, riboflavinu ir cianokobalaminu be trukdžių. Antruoju metodu riboflavinas ir piridoksino HCl buvo nustatyti fluorimetriškai acetato buferyje, ph 6.Trys vandenyje tirpūs vitaminai (B1, B2 ir B6) buvo nustatyti spektrofluorimetriškai antriniuose, tretiniuose ir ketvirtiniuose mišiniuose, kuriuose buvo cianokobalamino. Buvo naudotas spektrofluorimetras SFM 23/B; UV-1601 PC; UV-Vis spektrofotometras ir ph matuoklis [26]. Siekiant optimizuoti reakcijos sąlygas, buvo tiriami visi kintamieji.tiesinės kalibravimo kreivės buvo gautos nuo 10 iki 500 ng/ml; koreliacija svyravo nuo 0,9991 iki 0,9999.Siūlomos procedūros buvo taikomos tiriant ištirtus vitaminus jų laboratorijose paruoštuose mišiniuose ir skirtingų gamintojų farmacinėse dozavimo formose.rsd diapazonas buvo 0,46-1,02%, o tai rodo gerą tikslumą.gautasgeras atitikmuo (97,6 +/-0,7-101,2 +/-0,8%) [26].

3.5.3. Vitaminų tyrimas naudojant efektyviąją skysčių chromatografiją 21 Nors literatūroje pateikiama daug skirtingaų vandenyje tirpių vitaminų analizės būdų, efektyvioji skysčių chromatografija pasižymi plačiu taikymu dėl savo jautrumo, selektyvumo ir efektyvumo. Nepaisant to, yra toliau dedamos pastangos tobulinant ESC procedūrų metodiką siekiant didesnio efektyvumo. E. E. Abano ir R. G. Dadzie kritiškai įvertino mokslininkų parengtas ESC procedūras nustatant vandenyje tirpių vitaminų tapatybę maisto produktuose bei farmaciniuose produktuose bei šių metodų patogumą ruošiant standartus, mėginius, taip pat metodo jautrumą [27]. Analizės metodas turi būti patikimas ir nekintatis tam, kad būtų naudingas [26].Analitinis procesas turi būti stabilus; tiek ekstrakcijos, tiek chromatografijos procedūros turi būti atkuriamos; rezultatai turėtų būti tikslūs ir netikrumas turėtų būti mažas; detektorius turi būti selektyvus interesų analizei; kiekvieno dominančio analito signalas neturėtų turėti reikšmingų trukdžių ir metodas neturėtų turėti matricos efektų [27]. Standartinis tirpalas paprastai pasveriamas 100 ml matavimo kolboje.imamas atitinkamas standartinio mėginio kiekis arba tūris ir ištirpinamas labai gryname vandenyje. Kartais pridedamas buferis, pvz., 1M fosfatas, kad būtų išgautas reikiamas ph [28]. Įvairios sudedamosios dalys gali būti sumaišytos prieš galutinai pripildant vandens iki 100 ml žymės. Dėl daugumos medžiagų nestabilumo šviesoje, temperatūroje, standartinis tirpalas turi būti laikomas tamsoje 4 C temperatūroje ir kiek įmanoma paruošiamas šviežas kasdien. Veiksmingi standartai buvo intervale 19-53 µg/ml vitamino B1 koncentracijos, 8-24 µg/ml vitamino B2, 6-18 µg/ml vitamino B6, 120-360 µg/ml vitamino B3 ir 50-150 µg/ml vitamino B5 [28]. Dažniausiai vandenyje tirpių vitaminų analizei tiriamojo mėginio preparatai atliekami paprasčiausiai ištirpinant tirpalą itin grynu vandeniu arba maišytuvais. Naudojant ESC nustatant vandenyje tirpius vitaminus, reikėtų pažymėti, kad pastarieji paprastai yra nestabilūs, todėl etaloniniai ir mėginių protokolai turi būti tvarkomi labai atsargiai. Atskyrimas ir kiekybinis nustatymas turėtų būti atliekamas taikant aukštą tikslumo lygį ir tinkamus metodus. ESC metodas analizuojant vieną ar du vitaminus yra įprastas, tačiau vienalaikis ESC metodas visiems vandenyje tirpiems vitaminams yra neaprašytas. Trumpiausias eliuavimo laikas, apie kurį buvo pranešta vienu metu atliekant mažiausiai penkis vandenyje tirpius vitaminus, buvo 17 min [27].

22 3.5.4. B grupės vitaminų tyrimas multivitaminų tabletėse taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą Multivitamininiai farmaciniai preparatai yra labai įdomūs analizei ir dauguma jų apima vandenyje tirpią B grupę. Terminas B grupės vitaminai paprastai reiškia tiaminą, riboflaviną, piridoksiną, nikotino rūgštį, pantoteno rūgštį, biotiną, cianokobalaminą ir folio rūgštį. Kadangi šių cheminių medžiagų struktūra nesusijusi, buvo paskelbta nemažai tyrimų, kuriuose aprašyti įvairūs fiziniai, cheminiai ir biologiniai analizės metodai, R. Amidžic ir kiti naudojo ESC metodą vitaminams multivitaminų tabletėse nustatyti [29]. Visi chemikalai ir reagentai buvo analitinio lygio, vanduo distiliuotas ir filtruojamas per membraninį filtrą. Kaip standartai buvo naudojami tiamino chlorido hidrochloridas, piridoksino hidrochloridas, nikotinamidas, folio rūgštis ir cianokobalamina. Heptansulfoninės rūgšties natrio druska, trietilaminas ir TEA buvo naudojami paruošti mobiliai fazei ir ortofosforo rūgštis ph reguliacijai [29]. Standartiniai vitamino B3, B6 ir folio rūgšties tirpalai buvo ruošiami ištirpinus 25,0mg nikotinamido, piridoksino hidrochlorido ir folio rūgšties 50,0ml vandens atitinkamai. 1ml folio rūgšties tirpalo buvo po to atskiestas iki 50,0ml 15% metanolio tirpalu. Standartinis vitamino B12 tirpalas buvo paruošiamas ištirpinus 10,0mg cianokoabalamino 100,0ml vandens. Mėginių paruošimas vyko pasveriant 20 tablečių ir trituruojant iki analizei tinkamų miltelių. Vidutinė vienos tabletės masė tada perkeliama į 50,0ml kolbą ir pilamas 15% metanolio tirpalas. Mišinys buvo ultragarsuojamas (20 min.), Praskiedžiamas iki žymės tuo pačiu tirpikliu ir filtruojamas per 0,2 m Millipore filtrą [29]. Buvo naudojama chromografinė LKB 2150 ESC sistema, įrengta su Waters M 484 UV / VIS detektoriumi, sujungta su apskaičiuotu integratoriumi Maxima 820 Work Station. Buvo nustatytas 290nm šviesos bangos ilgis aptinkant B1, B3, B6 ir folio rūgštį ir 550nm nustatinėjant vitaminą B12. B1, B3, B6 vitaminų ir folio rūgšties nustatymui buvo naudojama Supelcosil ABZ + kolonėlė (15 cm 4,6 mm; 5 µm dalelių dydis). Eksperimentai buvo atlikti 35 C temperatūroje B1, B3, B6 vitaminų ir folio rūgšties nustatymui ir 25 C temperatūrai, kad būtų nustatytas vitaminas B12. B1, B3, B6 vitaminų ir folio rūgšties nustatymo judrioji fazė buvo metanolio - 5 mm heptansulfonrūgšties natrio druska/0,1% TEA (25:75 V/V). PH 2,8 buvo koreguojamas ortofosforo rūgštimi. Eliuento tekėjimo greitis - 1 ml/min., o įpurškiamas tūris - 10µl. Judanti fazė vitamino B12 nustatymui buvo metanolis vanduo (22:78 V / V). Srauto greitis buvo 0,8 ml/min., o įpurškiamas tūris - 100µl. Paruoštos mobiliosios buvo filtruojamos per 0,2µm Anotop filtrą ir degazuotos ultragarso vonia [29].

23 Prieš įšvirkščiant į chromatografinę sistemą visi analitiniai tirpalai buvo degazuojami ultragarsu. Visi paruošti mėginių tirpalai pirmą kartą buvo chromatografuoti, siekiant užtikrinti, kad nebūtų trukdančių smailių. Įšvirkšta 10µl ir 100µl standartinių tirpalų ir mėginių tirpalų. Kiekvienam tirpalui buvo atliktos trys injekcijos[29]. Tyrimas buvo selektyvus, nes reikšmingų trukdančių smailių nepastebėta vitaminų sulaikymo laikais. Visos pagalbinės medžiagos išsiskyrė skirtingu laiku ir netrukdė analizuojamiems junginiams. Pav. B3 (1), B6 (2), folio rūgšties (3), B1 (4) standartų ir mėginio tirpalųchromatograma [29]. Pav. B12 mėginio ir standaro tirpalų chromatograma [29].

24 Gauti rezultatai patvirtino, kad siūlomas metodas yra paprastas, tikslus ir gali būti sėkmingai taikomas atliekant įprastą B1, B3, B6, folio rūgšties ir B12 analizę B-kompleksinėse tabletėse. Tirti vitaminai buvo visiškai atskirti, o dozavimo formose esančios pagalbinės medžiagos netrukdė dominančių smailių. Įvertinus visus tris išnagrinėtus B grupės vitaminų tyrimo metodus, savo darbui pasirinkau efektyviosios skysčių chromatografijos metodą dėl jo tikslumo, paprastumo ir tinkamumo tirti mano pasirinktiems vitaminams mišinyje.

25 4. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKA 4.1 Tyrimo objektas Tyrimo metu buvo tiriami vitaminizuoti gėrimai "Oshee", parduodami skirtingose Lietuvos ir Lenkijos rinkose: Gėrimas nr. 1 Gėrimas nr. 2 Gėrimas nr. 3 Gėrimas nr. 4 Buvo tiriami iš viso 8 gėrimai - po du iš skirtingų šalių. Vitaminizuoti gėrimai gaminami OSHEE Polska Sp. z. o. o., Krokuva, Lenkija. 4.2 Kokybinis ir kiekybinis vertinimas skysčių chromatografijos metodu Įranga ir reagentai Kiekybiškai bei kokybiškai vertinant standartines medžiagas bei tablečių tirpalus buvo naudojami chromatografai Waters 2695 ir Waters e2695 su fotodiodų matricos detektoriais (Waters 996 ir Waters 2998). Tyrimo metu buvo naudojama kolonėlė ACE 5 C18 (250 x 4,6 mm), kurios sorbento dalelių dydis 5 µm. Tyrimui buvo pasirinktas fosfolipidų matricos detektorius (PDA). Šio detektoriaus pagalba galima nustatyti mėginio ultravioletinės šviesos absorbcijos maksimumus visame UV šviesos diapazone. Tai lemia tikslų analičių identifikavimą, ypač jei vertinamas ne tik UV spektras, bet ir sulaikymo laikas. Tyrimui naudoti chemiškai švarūs ir standartinius reikalavimus atitinkantys reagentai: Acetonitrilas 99,9 proc. (Sigma Aldrich, Vokietija), Trifluoracto rūgštis 98 proc. (Sigma Aldrich, Šveicarija), Tyrimui naudotas dejonizuotas vanduo, kuris išgrynintas Millipore vandens ruošimo sistema (Millipore, Bedford, JAV).

26 Standartiniai tirpalai Visi standartiniai tirpalai buvo ruošiami tirpinant medžiagas vandenyje. Analizei buvo gaminami 3 standartiniai tirpalai: B3, kurio koncentracija 5,78-92,5 mkg/ml ribose, darant 5 skiedimus; B6, kurio koncentracija 0,17-22,5 mkg/ml ribose, darant 8 skiedimus; B12, kurio koncentracija 0,26-32,5 mkg/ml, darant 8 skiedimus. Tiriamieji tirpalai Tiriamieji tirpalai buvo koncentruojami rotacinį garintuvą. Rotaciniai garintuvai naudojami efektyviam tirpiklių išgarinimui ir regeneravimui švelniomis sąlygomis. Aukštas šių garintuvų našumas išgaunamas žemo slėgio ir kolbos sukimo dėka. Kolbos sukimasis dirbtinai padidina garuojančio skysčio paviršiaus plotą ir nuslopina kunkuliavimą, tuo tarpu žemas slėgis ženkliai sumažina skysčio virimo temperatūrą. 20ml tiriamojo tirpalo buvo išgarinama ir tuomet likutis tirpinamas 2ml vandens. Gautas tirpalas toliau tiriamas kiekybiškai bei kokybiškai chromatografu. Metodika Paruoštieji tirpalai buvo tiriami aukščiau aprašyta iranga. Tyrimo metu naudojami eliuentai - acetonitrilas bei 0,1% trifluoracto (TFA) rūgšties vandeninis tirpalas (0,5ml:500ml). Naudojamas gradientinis eliuavimas. Eliuento tekėjimo greitis 1 ml/min. 1 lentelė. Eliuento sudėties kitimas laiko atžvilgiu. Bendra chromatografavimo trukmė - 24 minutės.

27 5. REZULTATAI 5.1 Metodo validacija Validacija atlikta pagal šiuos parametrus: Specifiškumą Atkartojamumas Tiesiškumas Metodo validacija atlikta remiantis Tarptautinės konferencijos techninių reikalavimų, dėl žmonėms skirtų vaistinių preparatų registravimo, suderinamumo klausimais parengtomis gairėmis [30]. 5.1.1 Metodikos specifiškumas Šis parametras parodo, jog metodika galima vienareikšmiškai įrodyti analitės buvimą. Parametrui įvertinti lyginamos tiriamųjų mėginių ir etalonų chromatogramos, įvertinami spektrai ir sulaikymo laikai. 1. Pateikiama vitamino B3 standarto chromatograma (3pav.). Vitamino B3 sulaikymo laikas - 4,088 min. Šalia pateikiamas vitamino B3 UV spektras. 3pav. vitamino B3 standarto chromatograma ir UV spektras

28 2. Pateikiama vitamino B6 standarto chromatograma (4pav.). Vitamino B6 sulaikymo laikas - 6,627 min. Šalia pateikiamas vitamino B6 UV spektras. 4pav. vitamino B6 standarto chromatograma ir UV spektras 3. Pateikiama vitamino B12 standarto chromatograma (5pav.). Vitamino B12 sulaikymo laikas - 8,518. Šalia pateikaimas vitamino B12 UV spektras. 5pav. vitamino B12 standarto chromatograma ir UV spektras

29 1 lentelė. Vitaminų B3, B6 ir B12 standartų sulaikymo trukmė Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Vitaminas B3 4,088 Vitaminas B6 6,627 Vitaminas B12 8,518 Remiantis pateiktais duomenimis galima teigti, kad metodas yra specifiškas nustatomoms medžiagoms ir yra tinkamas kokybiškai nustatyti B grupės vitaminus. 5.1.2 Metodo atkartojamumas Pakartojamumas (angl. Repeatability) apibūdina rezultatų tikslumą analizuojant mėginį tą pačią dieną, nekeičiant chromatografavimo sąlygų. Šio rodiklio įvertinimui analizė buvo pakartota 5 kartus tą pačią dieną. Pateikiamos atkartojamumo tyrimo metu gautos chromatogramos: 1. Vitaminų B6 ir B12 chromatograma (6pav). 6 pav. Atkartojamumo tyrimo metu gauta chromatograma (B6 ir B12)

30 2. Vitamino B3 chromatograma (7pav). 7 pav. Atkartojamumo tyrimo metu gauta chromatograma (B3) Chromatogramos buvo įvertintos pagal variacijos koeficientą (angl. RSD) sulaikymo laikui, smailės plotui ir aukščiui. Įvertinimo rezultatai pateikiami lentelėje (2 lentelė). Tiriamoji medžiaga RSD dydis (%) Sulaikymo laikui Smailės plotui Smailės aukščiui Vitaminas B3 0.3 1.6 1.5 Vitaminas B6 0.1 1.1 1.7 Vitaminas B12 0.1 1.2 1.5 Lentelėje matyti, kad variacijos koeficientas neviršija 5%, todėl chromatografavimo rezultatų atkartojamumas yra priimtinas.

31 5.1.3 Metodo tiesiškumas Darbo metu buvo kurta metodika tinkanti ne tik tiriamųjų medžiagų identifikavimui, bet ir jų koncentracijos nustatymui, todėl buvo vertinamas metodikos tiesiškumas (angl. Linearity). Tiesiškumo vertinimui buvo sudarytos tiriamų vitaminų kalibracinės kreivės, kurios buvo įvertintos pagal koreliacijos koeficientą (8, 9, 10 pav.). 8 pav. Vitamino B3kalibracinė kreivė 9 pav. Vitamino B6 kalibracinė kreivė

32 10 pav. Vitamino B12 kalibracinė kreivė Kaip matyti iš pateiktų kalibracinių kreivių, visoms analizuojamoms medžiagoms yra tiesinė analitės koncentracijos ir kreivės ploto priklausomybė, tinkama kiekybiniam nustatymui. Pateikiamos kalibracinių kreivių charakteristikos: (3 lentelė) 3 lentelė. Analizuojamų medžiagų kalibracinių kreivių charakteristikos. Analizuojama medžiaga Koreliacijos koeficientas Kalibracinės kreivės lygtis Vitaminas B3 0.9999 Y = 3.86e+004 X + 6.44e+003 Vitaminas B6 0.9999 Y = 2.35e+004 X - 3.35e+002 Vitaminas B12 0.9999 Y =5.80e+004 X + 9.62e+002 Visų analičių koreliacijos koeficientai yra didesni nei 0,999, todėl metodika yra tinkama kiekybiniam nustatymui. 5.2 B grupės vitaminų preparatų analizės rezultatai Darbo metu buvo siekiama įvertinti B grupės vitaminų kiekybę vitaminizuotuose gėrimuose, buvo apžvelgta mokslinė literatūra šia tema ir pasirinktas optimaliausias mėginių paruošimo ir analizės būdas. Iš gautų rezultatų galima bus įvertinti vitaminų kiekį gėrimuose, palyginti su kiekiais nurodytais etiketėse bei palyginti Lietuvos ir Lenkijos rinkoms skirtus gėrimus pagal vitaminų kiekį juose.

33 Visos mūsų tiriamos medžiagos buvo identifikuojamos pagal sulaikymo laiką, lyginant jį su atitinkamų standartinių medžiagų sulaikymo laiku bei pagal UV absorbcijos spektrus. Pateikiama tiriamojo tirpalo chromatograma (11 pav.) 11 pav. Tiriamojo tirpalo chromatograma. Identifikuoti vitaminai B3 ir B6. Tiriamųjų medžiagų pikai nesusilieja, jų atsiskyrimas geras. Chromatogramoje galime matyti priemaišų, kurios sulaikymo laikas apie 8, 9 ir 10 min, tačiau jos tiriamųjų medžiagų nustatymui netrukdo. Tyrimo metu buvo tiriami iš viso 8 gėrimai, 4 skirtingi to pačio gamintojo, tačiau iš skirtingų šalių rinkų - Lietuvos ir Lenkijos. Toliau bus pateikiami rezultatai tiriant atskirai kiekvieną vitaminą.