LIETUVOS AGRARINIŲ IR MIŠKŲ MOKSLŲ CENTRO FILIALO SODININKYSTĖS IR DARŽININKYSTĖS INSTITUTO IR ALEKSANDRO STULGINSKIO UNIVERSITETO MOKSLO DARBAI SCIEN

LIETUVOS AGRARINIŲ IR MIŠKŲ MOKSLŲ CENTRO FILIALO SODININKYSTĖS IR DARŽININKYSTĖS INSTITUTO IR ALEKSANDRO STULGINSKIO UNIVERSITETO MOKSLO DARBAI SCIENTIFIC WORKS OF THE INSTITUTE OF HORTICULTURE, LITHUANIAN RESEARCH CENTRE FOR AGRICULTURE AND FORESTRY AND ALEKSANDRAS STULGINSKIS UNIVERSITY SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ 35(3 4) Leidžiamas nuo 1983 m. Published since 1983 Babtai 2016

UDK 634/635 (06) Redaktorių kolegija Editorial Board dr. Audrius SASNAUSKAS (LAMMC SDI, žemės ūkio mokslai, agronomija) prof. habil. dr. Pavelas DUCHOVSKIS (LAMMC SDI, žemės ūkio mokslai, agronomija) dr. Edite KAUFMANE (Latvija, Latvijos valstybinis sodininkystės institutas, biomedicinos mokslai, biologija) dr. Aleksandras KMITAS (ASU, žemės ūkio mokslai, agronomija) dr. Pranas VIŠKELIS (LAMMC SDI, žemės ūkio mokslai, agronomija) dr. Giedrė SAMUOLIENĖ (LAMMC SDI, žemės ūkio mokslai, agronomija) prof. habil. dr. Vidmantas STANYS (LAMMC SDI, žemės ūkio mokslai, agronomija) prof. habil. dr. Algirdas SLIESARAVIČIUS (ASU, žemės ūkio mokslai, agronomija) Redakcinė mokslinė taryba Editorial Scientific Council dr. Audrius SASNAUSKAS pirmininkas (Lietuva), prof. habil. dr. Pavelas DUCHOVSKIS (Lietuva), dr. Kalju KASK (Estija), dr. Edite KAUFMANE (Latvija), prof. habil. dr. Zdzisław KAWECKI (Lenkija), dr. Giedrė SAMUOLIENĖ (Lietuva), prof. habil.dr. Albinas LUGAUSKAS (Lietuva), habil. dr. Maria LEJA (Lenkija), prof. habil. dr. Lech MICHALCZUK (Lenkija), prof. dr. Ala SILAJEVA (Ukraina), prof. habil. dr. Algirdas SLIESARAVIČIUS (Lietuva), prof. habil. dr. Vidmantas STANYS (Lietuva), prof. dr. Viktor TRAJKOVSKI (Švedija) Redakcijos adresas: Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialas Sodininkystės ir daržininkystės institutas LT-54333 Babtai, Kauno r. Tel. (8 37) 55 52 10 Faksas (8 37) 55 51 76 El. paštas: institutas@lsdi.lt Address of the Editorial Office: Institute of Horticulture, Lithuanian Research Centre for Agriculture and Forestry LT-54333 Babtai, Kaunas district, Lithuania Phone +370 37 55 52 10 Fax. +370 37 55 51 76 E-mail: institutas@lsdi.lt Leidinio adresas internete http://sodininkyste-darzininkyste.lsdi.lt/pages/default.aspx Leidinys cituojamas CAB Abstracts, EBSCO Publishing, VINITI duomenų bazėse e-issn 2424-5771 Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialas Sodininkystės ir daržininkystės institutas, 2016 Aleksandro Stulginskio universitetas, 2016 2

LIETUVOS AGRARINIŲ IR MIŠKŲ MOKSLŲ CENTRO FILIALO SODININKYSTĖS IR DARŽININKYSTĖS INSTITUTO IR ALEKSANDRO STULGINSKIO UNIVERSITETO MOKSLO DARBAI. SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ. 2016. 35(3 4). Slyvų virusologinės būklės vertinimas genetinių išteklių sode ir slyvų raupų viruso genetinė charakteristika Ingrida Mažeikienė, Jūratė Bronė Šikšnianienė, Vidmantas Stanys Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialas Sodininkystės ir daržininkystės institutas, Kauno g. 30, LT-54333 Babtai, Kauno r., el. paštas: i.mazeikiene@lsdi.lt Polimerazės grandininės reakcijos metodu ištirtos 125 slyvų veislės, auginamos Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialo Sodininkystės ir daržininkystės instituto (toliau LAMMC SDI) genetinių išteklių sode. Identifikuoti keturi slyvas infekuojantys virusai: slyvų žiediškosios nekrotinės dėmėtligės virusas (PNRSV); slyvų žemaūgiškumo virusas (PDV); obelų chlorotinės dėmėtligės virusas (ACLSV) ir karantininis mikroorganizmas slyvų raupligės virusas (PPV). Rasta 30,40 % virusais infekuotų slyvų veislių: PNRSV 16,80 %, PDV 10,40 %, ACLSV 4,80 % ir PPV 0,80 %. Monogeninė infekcija nustatyta 26,40 % ištirtų slyvų. Kompleksinė dviejų virusų infekcija rasta 4,00 % tirtų genotipų. Pembinos veislės slyvose rastas karantininis virusas PPV. Atlikta genetinė analizė viruso atmainai identifikuoti. Pagal nuskaitytą viruso genomo dalį nustatyta, kad tai PPV-D atmaina (Nr. KY056615 NCBI duomenų bazė). Nustatyta didžiausia Lietuvoje aptikto viruso PPV-D genetinė homologija nukleino rūgšių sekoje (99,45 %) su Vokietijoje (X81079) identifikuotu PPV-D viruso izoliatu. LAMMC SDI genetinių išteklių slyvų sodo virusologinis tyrimas parodė, kad būtina devirusuoti slyvų kolekciją ir vykdyti griežtesnę virusologinę kontrolę introdukuojant augalus. Reikšminiai žodžiai: ACLSV, PDV, PNRSV, PPV polimorfizmas. Įvadas. Sodo augalų genetinių išteklių kolekcija pradėta kaupti LAMMC SDI nuo 1949 m. Joje auginami iš skirtingų žemynų ir įvairių Lietuvos vietovių introdukuoti augalai. Šiuo metu yra kultivuojamos 125 slyvų veislės. Kolekcija nuolat pildoma ir atnaujinama. Kaupiant genetinius išteklius pirmumas teikiamas genetinei įvairovei. Tai dažnai būna nesertifikuota ir dėl virusų netirta dauginamoji medžiaga. Vegetatyvinis slyvų dauginimas, klimato kaita ir didėjanti kenkėjų (virusinių ligų platintojų) populiacija sudaro palankias sąlygas virusams plisti sode (Whitfield ir kt., 2015). Kol kas pasaulyje nėra veiksmingų apsaugos priemonių nuo virusinių ligų, todėl slyvos gali normaliai augti ir vystytis ilgesnį laiką, jeigu devirusuotiems augalams yra taikoma intensyvi grybinių ligų ir kenkėjų kontrolė. Virusams nustatyti pasaulyje plačiai taikoma keletas metodikų: inokuliacija į biologinius testerius, 3

imunofermentiniai ir molekulinės biologijos metodai. Polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra jautriausias laboratorijoje taikomas patogenų nustatymo metodas (López ir kt., 2008; Çevik ir kt., 2011). D. J. MacKenzie (1997) ir N. Pūpola su kolegomis (2011) nustatė, kad plačiai taikomas rutininis imunofermentinis metodas (ELISA) turi trūkumų ir mažai efektyvus nustatant virusus sodo augaluose. Dėl didelės virusinių ligų daromos žalos svarbu identifikuoti virusines infekcijas sode, ištirti jų kilmę ir virulentiškumą. Plečiantis genų duomenų bazėje pateikiamų sekų gausai, galima sekti patogenų migraciją tarptautiniu mastu. Soduose aptinkama per 40 virusinių ligų sukėlėjų, dauguma jų priklauso latentinių virusų grupei (Nemeth, 1986; Cieszlińska, Malinowski, 2002). Kaulavaisius, palyginti su sėklavaisiais, pažeidžia daugiau virusų, o patiriami nuostoliai sode priklauso nuo viruso kilmės (Hadidi, Barba, 2011). Specifiniai slyvas infekuojantys virusai yra PNRSV, sukeliantis slyvų žiediškąją nekrotinę dėmėtligę, PDV slyvų žemaūgiškumo virusas, ACLSV obelų chlorotinės dėmėtligės virusas ir PPV karantininis slyvų raupligės virusas. Šių virusų infekcijos po vieną ar kompleksiškai daro neigiamą įtaką slyvų derliaus kokybei, medžių vystymuisi ir augimui (Desvignes, 1999). Virusinių ligų padaryti nuostoliai gali skirtis priklausomai nuo slyvų veislės, viruso bei aplinkos veiksnių. Labai patogeniška yra PPV infekcija, dėl keliamo pavojaus ir kaulavaisiams daromos žalos ji yra įtraukta į karantininių organizmų sąrašą Europos Sąjungoje. Žinomos šešios PPV atmainos, PPV-D (Dideron) paplitusi Vakarų Europos dalyje, PPV-M (Markus) dažniau aptinkama Pietų, Rytų ir Centrinėje Europoje. Pasaulyje atlikti tyrimai parodė, kad PPV atmainos skiriasi genetika, agresyvumu, galimybe plisti su amarais ir sukeliamais simptomais (EPPO 2004). Nustatyta, kad PPV-D atmaina neplinta per sėklas, neefektyviai plintanti su amarais, komplikuota jos inokuliacija į eksperimentinius augalus. Ši viruso atmaina, SharCo projekto duomenimis (www.sharco.com), yra įvardijama kaip ne epideminė slyvų raupligės viruso forma. Darbo tikslas įvertinti slyvų genetinių išteklių kolekcijos virusologinę būklę naudojant specifinius virusams oligonukleotidinius pradmenis ir vykdant virusinių ligų prevenciją sode atrinkti slyvų veisles devirusuoti, įvertinti karantininių patogenų paplitimą ir kilmę. Tyrimo objektas ir metodai. Tyrimo vieta ir objektas. Tyrimai atlikti Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialo Sodininkystės ir daržininkystės instituto (toliau LAMMC SDI) Sodo augalų genetikos ir biotechnologijos skyriuje. Dėl pagrindinių slyvose paplitusių 4 virusų (1 lentelė) tirtos genetinių išteklių sode augančios 125 Prunus domestica 4

Viruso pavadinimas Virus name* Specifinės oligonukleotidų sekos Specifico ligonucleotide primers Pradmenų hibridizacijos T, o C T for primers hybridization, o C Pagausinto fragmento dydis, bp Lenght of amplified fragment, bp veislės. Virusinių patogenų paieškai taikytas polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodas, pagrįstas viruso apvalkalo baltymo geno sekų pagausinimu iš augalo bendrosios ribonukleino rūgšties (RNR). 1 lentelė. Virusams tinkamos specifinės oligonukleotidų sekos, pradmenų hibridizacijos temperatūra ir pagausinto fragmento ilgis Table 1. Specific oligonucleotide primers for virus detection, hybridization temperature and length of amplified fragment ACLSV F-5'TTCATGGAAAGACAGGGGCAA3' 62 667bp R-5'AAGTCTACAGGCTATTTATTATAAGTCTAA3' PDV F-5'TAGTGCAGGTTAACCAAAAGGAT3' 57 172 bp R-5'ATGGATGGGATGGATAAAATAAT3 PNRSV F-5'GAACCTCCTTCCGATTTAG'3 59 346 bp R-5'GCTTCCCTAACGGGGCATCCAC'3 PPV F-5'GTAGTGGTCTCGGTATCTATCATA3' 62 220 bp R-5'GTCTCTTGCACAAGAACTATAACC3' PPV_Seq1 F-5'TCTTGAACAAGCACCATACAATG3' 61 R-5'AGCCAAATAAACGATTTTGAACA3' PPV_Seq2 F-5'TTCAAAATCGTTTATTTGGCTTG3' 61 1028 bp R-5'CACAAGAACTATAACCCGAATGG3' Notes / Pastabos: ACLSV obelų chlorotinės dėmėtligės virusas / apple chlorotic leaf spot virus; PDV slyvų žemaūgiškumo virusas / prune dwarf virus; PNRSV slyvų žiediškosios nekrotinės dėmėtligės virusas / prunus necrotic ringspot ilarvirus; PPV slyvų raupligės virusas / plum pox potyvirus; Slyvų sode aptinkamų virusinių patogenų diagnostikai atlikti lapų ėminiai buvo imti 2013 2015 m. birželio mėn. Lapų audinių bandiniai iki tol, kol buvo išskirta RNR, laikyti -70 C temperatūroje, siekiant išvengti RNR degradacijos. Virusų diagnostika. RNR išskyrimas ir kdnr sintezė. RNR iš augalų lapų išskirta naudojant NucleoSpin RNA Plant (Macherey Nagel) rinkinį pagal gamintojo protokolą. Išskirta RNR naudota komplementariai 5

DNR (kdnr) sintetinti. kdnr sintezė atlikta naudojant RevertAid First Strand cdna Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Baltics, Lietuva) rinkinį pagal gamintojo protokolą. PGR metodas. Virusų paieškai naudoti viruso baltymui tinkami specifiniai oligonukleotidiniai pradmenys (1 lentelė). kdnr amplifikavimo reakcija buvo atliekama 20 μl mišinyje, sudarytame iš 2,50 μl 10 Taq DNR polimerazės buferio, 2 μl 25 mm MgCl2, 0,40 μl 10 mmdntp mišinio, 2 20 pmol viruso genomui tinkamų specifinių pradmenų, 1 U Taq DNR polimerazės ir po 500 ngkdnr. Bandiniai amplifikuoti termocikleryje Mastercycler (Eppendorf, Vokietija) tokiu režimu: pirminė dvigrandės kdnr denatūracija 95 C temperatūroje 5 min.; 35 ciklai fragmentui gausinti dvigrandės kdnr pradmenų prisijungimas 94 C temperatūroje po 30 sek., pradmenų hibridizacija po 40 sek. (temperatūra kiekvienai pradmenų porai buvo parinkta individualiai (1 lentelė), fragmentų sintezė 72 C temperatūroje po 40 sek., galutinė sintezė 72 C temperatūroje 5 min. Elektroforezė atlikta 1,50 % agarozės gelyje. Fragmento valymas, klonavimas ir sekvenavimas. Amplifikuoti PPV baltyminio apvalkalo kdnr fragmentai frakcionuoti 1,00 % agarozės gelyje. Fragmentai iš gelio iškirpti ir išgryninti su GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific Baltics, Lietuva) pagal gamintojo protokolą. Fragmentai liguoti į pjet 1,2 klonavimo vektorius, naudojant CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Fisher Scientific Baltics, Lietuva) rinkinį pagal standartinį protokolą. Vektorius įkeltas į E. coli bakterijų kloną JM107 naudojant rinkinį TransformAid Bacterial Transformation Kit (Thermo Fisher Scientific Baltics, Lietuva) pagal gamintojo protokolą. Atskirta nuo bakterinės DNR plazmidinė DNR su PPV viruso kdnr intarpu paruošta sekvenuoti su BigDye Terminator 1.3 (Applied Biosystems, JAV) rinkiniu. Amplifikuoti fragmentai įvertinti Herolab UV kameroje naudojant E.A.S.Y Win 32 dokumentavimo programą. kdnr fragmentas sekvenuotas genų analizatoriuje LAMMC SDI Sodo augalų genetikos ir biotechnologijos skyriuje. Nuskaitytų nukleotidų seka versta į aminorūgščių seką ExPASy vertimo programa. Nukleotidų ir aminorūgščių sekos palygintos ir analizuotos Biotechnologijos informacijos nacionalinio centro (NCBI) duomenų bazėje. Homologinės sekos, esančios NCBI, palygintos su nuskaityta viruso seka. Filogenetinė dendrograma konstruota ClustalW programa. Bandymų duomenų statistinė analizė atlikta programomis STAT_ENG ir ANOVA (Tarakanovas, 1999). Rezultatai. LAMMC SDI Sodo augalų genetikos ir biotechnologijos skyriuje, kuriame kuriamos naujos veislės, moksliniams tikslams sukaupta 6

slyvų kolekcija iki šiol nebuvo tirta molekuliniais diagnostikos metodais. Teigiamas rezultatas vertintas pagal amplifikuotus specifinius virusams kdnr fragmentus, išryškintus agarozės gelyje: 172 bp ilgio fragmentas būdingas PDV, 346 bp ilgio PNRSV, 220 bp ilgio PPV ir 667 bp ilgio ACLSV viruso apvalkalo baltymo geno fragmentui. Apibendrinti ir statistiškai įvertinti 125 veislių slyvų genetinių išteklių sodo virusologinės būklės duomenys pateikti 2 ir 3 lentelėse. 2 lentelė. Kompleksinis virusų ACLSV, PPV, PDV ir PNRV paplitimas įvairių veislių slyvyne LAMMC SDI genetinių išteklių kolekcijoje Table 2. The prevalence of viruses ACLSV, PPV, PDV and PNRV in plum genetic resources collection of IH, LRCAF Tirta slyvų veislių, vnt. Tested plum varieties, number Be virusų, vnt. / % Virus free, number / %* Vienu virusu infekuotų veislių, vnt. / % Varieties with one virus, number / %* Dviem virusais infekuotų veislių, vnt. / % Varieties with two virus, number / %* 125 87 / 69,60 33 / 26,40 5 / 4,00 Note / Pastaba. * reikšmingas vidurkių skirtumas kai P 0,05 / significant differences of means at P 0.05. 3 lentelė. Virusų paplitimas įvairių veislių slyvyne LAMMC SDI genetinių išteklių kolekcijoje Table 3. The prevalence of viruses in genetic resources collection of plum varieties of LAMMC IH Tirta slyvų veislių, vnt. Total tested of Plum genotypes, number Infekuotų PNRSV, vnt. / % Infected PNRSV, number / %* Infekuotų PDV, vnt. / % Infected PDV, number / %* Infekuotų ACLSV, vnt. / % Infected ACLSV, number / %* Infekuotų PPV, vnt. / % Infected PPV, number / %* 125 21 / 16,80 13 / 10,40 6 / 4,80 1 / 0,80 Note / Pastaba. * reikšmingas vidurkių skirtumas kai P 0,05 / significant differences of means at P 0.05. Nustatyta, kad 69,60 % slyvų veislių genetinių išteklių sode buvo sveikos neinfekuotos tirtais virusais (2 lentelė). Vienu iš keturių virusų buvo infekuota 26,40 % tirtų slyvų veislių. Kompleksinė dviejų virusų infekcija ACLSV ir PNRSV, ASCLV ir PDV, PDV ir PNRSV, PPV ir PNRV nustatyta penkiose slyvų veislėse. 7

Rūšinio virusų paplitimo įvertinimo duomenys pateikti 3 lentelėje. PNRSV viruso, kuris gali plisti ir su žiedadulkėmis, paplitimas įvairių veislių slyvyne genetinių išteklių sode buvo didžiausias. Šio viruso infekcija nustatyta 21 augale, t. y. 16,80 % visų tirtų slyvų veislių. PDV infekcija nustatyta 13 slyvų (10,40 %), o ACLSV 6 slyvose (4,80 %). Karantininis patogenas PPV rastas vienoje Pembinos veislės slyvoje. Ši veislė instituto kolekcijoje auginama nuo 1977 m., kai buvo atvežta iš JAV per Kazachstano Talgaro karantino stotį. PPV virusui identifikuoti parinkome dvi pradmenų poras: PPV_CP1 ir PPV_CP2 (1 lentelė), kuriomis amplifikuoti du persidengiantys 1028 bp ir 339 bp ilgio fragmentai. Sujungus sekas gauta 1354 bp ilgio genomo dalis, kuri kodavo 378 aminorūgštis (1 pav.). Seka buvo homologiška NCBI banke esančioms PPV-D atmainos 3' galo nukleotidų sekoms nuo 2 763 aminorūgšties. Pirmieji 144 nukleotidai (48 aminorūgštys) homologiški daliai replikazės (NIb) geno, 993 nukleotidai (331 aminorūgštis ir stop kodonas) atitinka baltyminio apvalkalo (CP) geną ir 196 nukleotidai yra netransliuojama (UTR3') genomo dalis. Rėmelyje pilkai pažymėtas 233 aminorūgščių fragmentas yra būdingas tik Potyvirus apvalkalo baltymo sekai. 1 pav. Lietuvoje rasto PPV izoliato 1354 bp ilgio genomo dalis: dalis replikazės (NIb) geno 48 aminorūgštys, viruso baltyminio apvalkalo (CP) genas 331 aminorūgštis ir netransliuojama (UTR3') genomo dalis 196 nukleotidai. Pilku fonu pažymėtas genomo fragmentas būdingas Potyvirus apvalkalo baltymo sekai Fig. 1. Nucleotide and amino acid sequence 1354 bp in length of PPV genome of Lithuanian isolate: 48 amino acids of the part replicase gene (NIb), 331 amino acids of the virus coat protein gene (CP and 196 nucleotides of untranslated region (UTR3'). Genomic fragment characterized Potyvirus coat protein sequence is in gray background 8

2 pav. PPV filogenetinė dendrograma sukonstruota, palyginus Lietuvoje rasta izoliatą su NCBI banke esančiomis 24 virusų homologinėmis nukleotidų sekomis. Dendrograma sukonstruota naudojant ClustalW programą pagal Neihgbor Joining metodą Fig. 2. Dendrogram constructed for alignment the nuclein acid sequence of Lithuanian isolate of PPV and others 24 virus homologs from the NCBI data. Dendrogram constructed with ClustalW programme, according to Neighbor Joining method Filogenetinė dendrograma sukonstruota atrinkus iš NCBI duomenų bazės 24 PPV viruso sekas iš įvairių šalių (2 pav.). LV_2010_HQ670748, BY_2010_HQ840518 ir PL_2007_EU117116 yra patogeniškesnės viruso atmainos PPV-W, PPV-C ir PPV-Recrastos kaimyninėse valstybėse. Dendrogramoje PPV-W ir PPV-C statistiškai patikimai atsiskyrė nuo PPV-Rec ir PPV-D atmainos esant 100,00 % patikimumo ribai. PPV-Rec yra mutavusi PPV-D atmaina, tai matosi dendrogramoje, kur atmainos viena nuo kitos nutolusios esant 100,00 % patikimumo ribai. Esant mažesnei nei 50,00 % patikimumo ribai atsiskyrusios PPV-D viruso atmainos šakos dendrogramoje yra sujungtos. Lietuvoje nustatytas PPV-D virusas iš nuskaitytų nukleotidų sekų didžiausią genetinę homologiją 9

(99,45 %) turėjo su 1994 m. Vokietijoje nuskaitytu slyvų raupligės virusu X81079 (Deborré ir kt. 1995). Abu šie izoliatai turi genomo mutacijas, kurios, esant 88,00 % patikimumo ribai, dendrogramoje atskyrė juos nuo 16 kitų PPV-D izoliatų (2 pav.). Lietuvoje rastas izoliatas labiausiai genetiškai nutolęs nuo Juodkalnijoje 2010 m. rasto PPV-D viruso izoliato HQ452356, genetinė homologija tarp nuskaitytų nukleotidų sekų 97,93 %. Aptarimas. Slyva yra švelnesnio klimato juostų sodo augalas, jautrus ligoms ir kenkėjams (Galvydis, Valiuškaitė, 2002). Kartu su kenkėjais, grybais ir bakterijomis slyvas infekuoja ir virusinės ligos. Į LAMMC SDI genetinių išteklių sodą dažniausiai introdukuojama CAC (Conformitas Agraria Communitatis) kokybės sodinamoji medžiaga. Atrenkant sodinamąją medžiagą, labiausiai atsižvelgiama į genetinę kilmę, o ligos ir kenkėjai vertinami tik vizualiai. Instituto sode molekuliniais metodais atlikta slyvų virusologinė diagnostika parodė, kad 30,40 % slyvų veislių yra infekuota vienu ar dviem virusiais. Atlikę virusų diagnostiką Latvijos kaulavaisių soduose A. Gospodaryk su kolegomis (2013) nustatė 38,30 % virusais infekuotų augalų. Kompleksinė virusų infekcija kaulavaisiuose aptinkama rečiau nei sėklavaisiuose (Pūpala ir kt., 2011; Gospodaryk ir kt., 2013), tačiau virusinių ligų slyvoms daroma žala yra didesnė, ypač kai tuo pačiu metu augalą infekuoja keli virusai. Nustatyta, kad mūsų kolekcijoje tuo pačiu metu dviem virusais buvo infekuota 4,00 % augalų. Didesnio masto (13,80 % kaulavaisių) kompleksines virusų infekcijas slyvų sode yra nustatę ir Latvijos tyrėjai (Gospodaryk ir kt., 2013). Atlikdami tyrimą radome dviejų virusų kompleksinės infekcijos derinius: ACLSV ir PNRV, ASCLV ir PDV, PDV ir PNRSV, PPV ir PNRV. Pažymėtina, kad PDV ir PNRSV priklauso tai pačiai Ilarvirus virusų genčiai. PPV priskiriamas Potyvirus, o ACLSV Trichovirus genčiai. Patogeninių virusų PNRSV, PDV, ACLSV ir PPV paplitimas instituto slyvų kolekcijoje buvo skirtingo dažnio. PNRSV ir PDV virusų paplitimas įvairių veislių slyvyne genetinių išteklių sode buvo didžiausias atitinkamai 16,80 ir 10,40 %. Rytinės Latvijos teritorijos soduose šiais virusais buvo infekuota atitinkamai 51,00 ir 43,60 % ten augančių slyvų (Gospodaryk ir kt., 2013). PDV ir PNRSV virusų sukeltus požymius yra sunku vizualiai atskirti ir identifikuoti. Abu šie virusai plinta mechaniškai pažeidus augalą, per skiepijamąją medžiagą, su žiedadulkėmis ir sėklomis (Milusheva, Borisova, 2005). Atsižvelgiant į tai, kad PNRSV ir PDV plinta ne tik skiepijant ar genint, bet ir su žiedadulkėmis bei sėklomis (Desvignes, 1999), labai svarbu šiuos virusus nustatyti ir laiku pašalinti augalus iš kaulavaisių sodų. Nustatyta, kad iš nesertifikuotų sėklų užauga 16,00 % PNRSV ir 10,00 % PDV virusais infekuotų kaulavaisių sėjinukų 10

(Scott, 2001). Šių virusų infekcija gali turėti neigiamos įtakos selekcinio darbo rezultatams, į tai reikia atsižvelgti parenkant kryžminimams motininius augalus. Būtina atlikti motininių augalų, skirtų sėkliniams poskiepiams, diagnostiką dėl šių virusų. ACLSV patogenas, galintis infekuoti visus Rosaceae šeimos augalus, instituto slyvų kolekcijoje nėra plačiai paplitęs (4,80 %). Tai yra daugiau, nei nurodo Latvijos tyrėjai (Gospodaryk ir kt., 2013): ten ACLSV virusu yra infekuota iki 2,60 % slyvų šalies soduose. Šis virusas neturi biologinių vektorių ir gali būti pernešamas tik skiepijant ar plisti per agrotechnines priemones, todėl jo kontrolė sode yra paprastesnė nei PNRSV, PDV ir PPV. ACLSV yra latentinio pobūdžio, nesukelia aiškių infekcijos požymių, didesnę žalą augalams daro kartu su kitomis virusinėmis infekcijomis. PPV patogenas Europos Sąjungoje yra laikomas karantininiu. Šiltėjant klimatui su biologiniais vektoriais (amarais) (Levy ir kt., 2000) ir sodinamąja medžiaga jis atkeliavo iš šiltesnio klimato šalių (Bulgarijos, Italijos, Vokietijos, Prancūzijos ir kt.). LAMMC SDI kolekcijoje buvo identifikuotas vienos veislės augalas, infekuotas PPV virusu (augalai sunaikinti). Pirmą kartą PPV infekcija Lietuvoje nustatyta 1996 m., izoliatas saugomas Nr. X81081 NCBI duomenų bazėje (Staniulis ir kt., 1998). Dėl amarų migracijos šio karantininio patogeno nedideliu mastu vis iš naujo aptinkama Lietuvoje ir kaimyninėse valstybėse: Latvijoje (Glasa ir kt., 2011; Gospodaryk ir kt., 2013), Lenkijoje (Malinovski, 2004), Baltarusijoje, Rusijoje (Glasa ir kt., 2014). Pasaulyje užregistruotos aštuonios PPV atmainos: D, M, EA, C, CR, W, T ir Rec (Garcia ir kt., 2014). Mūsų atlikta filogenetinė PPV viruso analizė parodė, kad kolekcijoje identifikuota viruso atmaina yra PPV-D. Kol kas ši atmaina yra nustatyta tik Lietuvoje (Staniulis ir kt., 1998; Norkus ir kt., 2008). Ji neplinta su sėklomis, sunkiai inokuliuojama į eksperimentinius augalus ir silpnai plinta su amarais. PPV-D atmaina yra apibūdinama kaip ne epideminė slyvų raupligės viruso forma (www.sharco.com). RNR tipo virusams būdinga genetinė įvairovė, dėl viruso RNR polimerazės atsakingos už viruso replikaciją daromų klaidų. Tiek patogenui plintant skirtinguose to paties augalo audiniuose, tiek perkeliant virusą į naują šeimininką vyksta PPV genomo mutacijos (Vozárová ir kt., 2013; Rodamilans ir kt., 2014). Filogenetinės analizės duomenys parodė, kad 1995 ir 2014 m. LAMMC SDI kolekcijoje nustatyti izoliatai (NCBI duomenų bazė Nr. X81081 ir KY056615) statistiškai patikimai genetiškai nutolę, tai rodo skirtingus infekcijos šaltinius. Aptiktos nukleotidų mutacijos rodo, kad instituto slyvų kolekcijoje naujai identifikuotas PPV-D virusas genetiškai patikimai giminingas Vokietijoje rastai viruso 11

atmainai. Atsižvelgiant į nustatytą didelį Lietuvoje ir Vokietijoje rastų izoliatų genetinį tapatumą (99,45 %) galima daryti prielaidą, kad abiejų izoliatų infekcinio šaltinio kilmė vienoda. Genetinių išteklių slyvų sodo virusologinis tyrimas parodė, kad norint efektyviau atlikti selekcinį darbą, reikia nuolat devirusuoti kaulavaisių kolekciją. Kadangi kaimyninėse šalyse rasta patogeniškesnių viruso atmainų: PPV-Rec Lenkijoje, PPV-W Latvijoje, PPV-C Baltarusijoje, PPV-M Vokietijoje ir Slovakijoje (NCBI duomenys), būtina nuolatinė slyvų raupligės viruso kontrolė auginant ir introdukuojant kaulavaisių genetinę sodinamąją medžiagą. Išvados. LAMMC SDI genetinių išteklių slyvų sode nustatyta 30,40 % virusais infekuotų slyvų veislių: PNRSV 16,80 %, PDV 10,40 %, ACLSV 4,80 % ir PPV 0,80 %. 4,00 % slyvų veislių yra infekuota kompleksine dviejų virusų infekcija. LAMMC SDI genetinių išteklių slyvų sode nustatytas slyvų raupligės virusas yra ne epideminė PPV-D atmaina. Padėka. Autoriai dėkoja LR žemės ūkio ministerijai už finansinę paramą. Literatūra Gauta 2016-10-28 Parengta spausdinti 2016-11-17 1. Çevik B., Yardimci N., Çulal-Klllç H. 2011. Detection of viruses infecting stone fruits in Western Mediterranean region of Turkey. Plant Pathology Journal, 27 (1): 44 52. 2. Cieszlińska M., Malinowski T. 2002. Virus and virus-like diseases of fruit trees and small fruits. Zeszyty Naukowe Instytuta Sadownictwa,10: 197 206. 3. Deborré G., Jelkman W., Maiss E. 1995. Biological and molecular biological investigations of several Plum pox virus (PPV) isolates. Acta Horticulturae (ISHS), 386: 253 262. 4. Desvignes J. C. 1999. Virus Diseases of Fruit trees. CTIFL, Paris. 5. EPPO. 2004. Diagnostic protocols for regulated pests. Plum pox virus PM 7/32(1). OEPP/EPPO Bulletin, 34(2): 247-256. DOI:10.1111/j.1365-2338.2004.00726.x. 6. Galvydis J., Valiuškaitė A. 2002. Pavojingesnės slyvų ligos Lietuvoje. Dendrologia Lithuaniae, 6: 29 35. 12

7. García J. A., Glasa M., Cambra M., Candresse T. 2014. Plum pox virus and sharka: a model potyvirus and a major disease. Molecular Plant Pathology, 15: 226 241. 8. Glasa M., Malinowski T., Predajňa L., Pupola N., Dekena D., Michalczuk L., Candresse T. 2011. Sequence variability, recombination analysis, and specific detection of the W strain of Plum pox virus. Phytopathology, 101(8): 980 985. 9. Glasa M., Shneyder Y., Predajna L., Zhivaeva T., Prikhodko Y. 2014. Characterization of Russian Plum pox virus isolates provides further evidence of a low molecular heterogeneity within the PPV-C strain. Journal of Plant Pathology, 96 (3): 597 601. 10. Gospodaryk A., Moročko-Bičevska I., Pûpola N., Kâle A. 2013. Occurrence of stone fruit viruses in plum orchards in Latvia. Proceedings of the Latvian Academy of Sciences: Section B. Natural, Exact, and Applied Sciences, 67 (2) :116 123. DOI:10.2478/prolas- 2013-0018. 11. Hadidi A., Barba M. 2011. Economic Impact of Pome and Stone Fruit Viruses and Viroids. In: A. Hadidi, M. Barba, T. Candresse, W. Jelkmann (eds), Virus and virus-like diseases of pome and stone fruits. APS Press, St Paul, MN, USA. 12. Levy L., Damsteegt V., Scorza R., Kolber M. 2000. Plum pox potyvirus disease of stone fruits. APSnet Features. doi: 10.1094/APSnetFeature- 2000-0300. 13. López M., Llop P., Olmos A., Marco-Noales E., Cambra M., Bertolini E. 2008. Are molecular tools solving the challenges posed by detection of plant pathogenic bacteria and viruses? Current Issues Molecular Biology, 11: 13 46. 14. MacKenzie D. J., McLean M. A., Mukerji S., Green M. 1997. Improved RNA extraction from woody plants for the detection of viral pathogens by reverse transcription-polymerase chain reaction. Plant Disease, 81: 222 226. 15. Malinowski T. 2004. Serological characterisation of Plum pox virus (PPV) isolates found in Poland. European Meeting, 04 on Plum pox. Book of Abstracts. Rogów-Skierniewice, Poland, 51. 16. Milusheva S. A., Borisova A. Z. 2005. The incidence of Prunus necrotic ringspot and Prune dwarf viruses in prunus species in south Bulgaria. Biotechnology and Biotechnological Equipment, 19(2): 42 45. 17. Nemeth M. 1986. Virus. Mycoplazma, and Ricketsia Diseases of Fruit Trees. Academia Kiado, Budapest. 18. Norkus T., Staniulis J., Žižytė M., Melnyk M., Yusko L, Snihur H., Budzanivska I., Polischuk V. 2008. Molecular identification of Plum 13

pox virus isolates from Lithuania and Ukraine. Zemdirbyste- Agriculture, 95(3): 277 285. 19. Pūpola N., Moročko-Bičevska I., Kāle A., Zeltiaš A. 2011. Occurrence and diversity of pome fruit viruses in apple and pear orchards in Latvia. Journal of Phytopathology, 159(9): 597 605. 20. Rodamilans B., León D. S., Mühlberger L., Candresse T., Neumüller M., Oliveros J. C., García J. A. 2014. Transcriptomic analysis of Prunus domestica undergoing hypersensitive response to Plum pox virus infection. Plos One, 9(6): 1 12. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0100477 21. Scott S. W., Zimmerman M. T., Yilmas S., Bachman E. J., Zehr E. I. 2001. The interaction between Prunus necrotic ringspot virus and Prune dwarf virus in peach stunt disease. Acta Horticulturae, 550: 229 236. 22. Staniulis J., Stankiene J., Sasnauskas K., Dargeviciute A. 1998. First report of plum pox disease caused by Plum pox virus in Lithuania. Plant Disease, 82(12): 1405. 23. Tarakanovas P. 1999. Statistinių duomenų apdorojimo programos paketas Selekcija. Akademija. 24. Vozárová Z., Kamencayová M., Glasa M., Šubr Z. 2013. Plum pox virus accumulates mutations in different genome parts during a longterm maintenance in Prunus host plants and passage in Nicotiana benthamiana. Acta virologica, 57: 369 372. 25. Whitfield A. E., Falk B. W., Rotenberg D. 2015. Insect vector-mediated transmission of plant viruses. Virology, 479 480: 278 289. 14

SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ. SCIENTIFIC ARTICLES. 2016. 35(3-4). The virological state of plums in the genetic resource orchard and genetic characteristic of Plum pox virus I. Mažeikienė, J. B. Šikšnianienė, V. Stanys Summary 125 plum cultivars grown in the genetic resources orchard of IH LRCAF were tested for virus infection using PCR. Plum infecting viruses PNRSV, PDV, ACLSV and PPV (quarantine organism) were identified. 30.40 % of infected plum genotypes: PNRSV - 16.80 % PDV - 10.40 % ACLSV 4.80 % and PPV - 0.80 % (only 1 plant) were found. Single virus infection was identified in 26.40 % of the examined plums. The complex infection with two viral pathogens was found in 4.00 % of the tested genotypes. Quarantine virus PPV was identified in cultivar Pembina. The genetic analysis was performed in order to identify the PPV strain. PPV-D strain was determined according to the sequenced part of virus genome (NCBI accession No. KY056615). The largest virus genetic homology at nucleic acid level (99.45 %) was found among Lithuanian PPV-D isolate and Germanian PPV-D isolate. The virological study of plums in IH LRCAF genetic resources orchard show that virus elimination in plum collection and stricter virological control in introduction of plants is necessary. Keywords: ACLSV, PDV, PNRSV, PPV, polymorphism. 15

LIETUVOS AGRARINIŲ IR MIŠKŲ MOKSLŲ CENTRO FILIALO SODININKYSTĖS IR DARŽININKYSTĖS INSTITUTO IR ALEKSANDRO STULGINSKIO UNIVERSITETO MOKSLO DARBAI. SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ. 2016. 35(3 4). Cefotaksimo, kanamicino, manozės įtaka našlaitinės sanpaulijos (Saintpaulia ionantha) ūglių regeneracijai in vitro Jurgita Vinskienė, Gražina Stanienė, Vidmantas Stanys Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialas Sodininkystės ir daržininkystės institutas, Kauno g. 30, LT-54333 Babtai, Kauno r., el. paštas: j.vinskiene@lsdi.lt Agrobakterijos pašalinimas iš augalo audinių kultūros ir atrankos žymeklių parinkimas transgeniniams organizmams atrinkti yra vieni svarbesnių augalų genetinės transformacijos etapų. Šis darbas buvo atliktas siekiant įvertinti cefotaksimo, kanamicino ir manozės įtaką netransformuotų našlaitinės sanpaulijos ūglių regeneracijai iš lapų eksplantų in vitro sąlygomis. Eksplantų jautrumas antibiotikams įvertintas juos kultivuojant ant regeneracijai skirtos terpės, papildytos skirtingų koncentracijų cefotaksimu (250, 500, 750, 1 000 mg l -1 ) ir kanamicinu (20, 40, 60, 80, 100 mg l -1 ). Keičiant manozės ir sacharozės koncentracijų santykį maitinamojoje terpėje, įvertintas ekplantų jautrumas manozei. Nustatyta, kad atliekant sanpaulijos transformacijos eksperimentus panaudojant agrobakteriją, tikslingiausia naudoti 250 500 mg l -1 koncentracijos cefotaksimą ir 60 mg l -1 koncentracijos kanamiciną maitinamojoje terpėje. FMI/manozės atrankos sistema nėra tinkama sanpaulijos transformacijai. Reikalinga naujų, ekologiniu požiūriu saugių atrankos sistemų paieška. Reikšminiai žodžiai: cefotaksimas, kanamicinas, manozė, Saintpaulia ionantha, ūglių regeneracija. Įvadas. Naujai genetinei medžiagai perkelti į augalo genomą gali būti taikoma transformacija panaudojant patogeninę bakteriją Agrobacterium tumefaciens (Arshad ir kt., 2014; Wang ir kt., 2010). Tai alternatyva tradiciniams augalų selekcijos metodams. Ši technologija plačiai taikoma transformuojant ne tik agronomiškai svarbius sodo ir daržo, bet ir dekoratyvinius augalus (sanpaulijas, begonijas, petunijas, rožes), siekiant sukurti naujas veisles, atsparias aplinkos stresui, vabzdžiams ir ligoms (Rout ir kt., 2006). Bakterijoms pašalinti iš augalo audinių kultūros, ypač po transformacijos panaudojant agrobakteriją, yra naudojami antibiotikai: karbenicilinas (Holford, Newbury, 1992), cefotaksimas (Danilova, Dolgikh, 2004), timentinas (Nauerby ir kt., 1997). Yra žinoma, kad β-laktamas sąveikauja su peniciliną prisijungiančiu baltymu bakterijos periplazmoje ir inhibuoja peptidoglikano sintezę taip sukeldamas ląstelės 16

sienelės lizę ir bakterijos žūtį (Grzebelus, Skop, 2014). Cefotaksimas yra labai atsparus β-laktamazėms ir plačiausiai naudojamas agrobakterijai iš audinių kultūros pašalinti antibiotikas (Chevreau ir kt., 1997; Farzaneh ir kt., 2013). Augalų genetinėje inžinerijoje kaip atrankos žymeklis yra naudojamas kanamicinas. Jis slopina augalų ląstelių augimą prisijungdamas prie 30S ribosomos subvieneto ir inhibuodamas plastidžių transliacijos iniciaciją (Wilmink, Dons, 1993). E. coli nptii genas koduoja neomicino fosfotransferazę II, kuri geba fosforilinti aminoglikozidinius antibiotikus, pvz., kanamiciną, neomiciną ir geneticiną (Fraley ir kt., 1986). Jei transformuotos augalų ląstelės turi nptii geną, jos gali detoksikuoti terpėje esančius antibiotikus ir išlikti gyvos, o netransformuotos ląstelės žūsta. Agrobakterijų buvimas transgeniniuose augaluose gali sumažinti jų dauginimosi ir šaknijimosi dažnį ar net sąlygoti augalo žūtį (Grzebelus, Skop, 2014). Be to, kad transgenai nepatektų į aplinką (pvz., dirvožemį), yra būtina pašalinti agrobakteriją iš transgeninių augalų (Estopà ir kt., 2001). Augalų atsparumas antibiotikams yra specifinis, priklauso nuo rūšies, auginimo sąlygų, eksplanto tipo (Qin ir kt., 2011). Todėl taikant antibiotikus augalams in vitro kultūroje, yra būtina nustatyti mažiausią jų koncentraciją, kuri būtų veiksminga agrobakterijai pašalinti ir turėtų mažiausią fitotoksinį poveikį augalo audiniams ir ląstelėms. Kuriant modifikuotus organizmus naudojami antibiotikai kelia didelį susirūpinimą dėl galimo jų neigiamo poveikio žmonių, gyvūnų sveikatai ar aplinkai. Siekiant to išvengti, pastaruoju metu augalams transformuoti vis dažniau yra naudojami vektoriai, pernešantys E. coli fosfomanozės izomerazės fmi geną. Manozė toksiškai veikia augalo ląsteles, nes dėl heksokinazės iš manozės susidaręs manozės-6-fosfatas yra glikolizės kelio inhibitorius. Transformuotos ląstelės dėl fosfomanozės izomerazės (FMI) aktyvumo geba paversti manozės-6-fosfatą fruktozės-6-fosfatu ir išlikti gyvybingos (Lamblin ir kt., 2007). FMI/manozės atrankos sistema jau sėkmingai pritaikyta daugeliui augalų rūšių: kukurūzams, kviečiams (Wright ir kt., 2001), ryžiams (Lucca ir kt., 2001), papajoms (Zhu ir kt., 2005), agurkams (He ir kt., 2006), svogūnams (Aswath ir kt., 2006). Iki šiol manozės įtaka sanpaulijos pridėtinių ūglių regeneracijai izoliuotų lapų kultūroje in vitro nebuvo tirta. Darbo tikslas įvertinti cefotaksimo, kanamicino ir manozės įtaką netransformuotų sanpaulijos ūglių regeneracijai iš lapų eksplantų in vitro sąlygomis. Tyrimo objektas, metodai ir sąlygos. Tyrimams buvo naudota našlaitinės sanpaulijos mikroūglių kultūra, palaikoma in vitro. Mikroūgliai buvo subkultivuoti T. Murashige ir F. Skoog (1962) maitinamojoje terpėje, 17

papildomai dėta vitaminų (100,0 mg l -1 inozito, po 0,5 mg l -1 tiamino, piridoksino ir nikotino rūgšties, 1,0 mg l -1 askorbo rūgšties), 0,125 mg l -1 augimo reguliatoriaus (BAP). Mikroūgliai auginti fitotrone, kuriame palaikyta 21 25 C temperatūra ir 16 val. fotoperiodas per parą, liuminescencinėmis lempomis įšviečiant 50 μm m -2 s -1 tankio fotonų srautą. Cefotaksimo, kanamicino ir manozės įtaka ūglių regeneracijai. Siekiant pridėtinius ūglius indukuoti iš sanpaulijos lapų eksplantų, pastarieji buvo skersai įpjauti skalpeliu. Pažeisti lapų eksplantai buvo dėti adaksialine puse ant ūglių regeneracijai skirtos maitinamosios terpės (Vinskienė ir kt., 2008). Siekiant nustatyti eksplantų jautrumą antibiotikams, naudotos skirtingos cefotaksimo (250, 500, 750, 1 000 mg l -1 ) ir kanamicino (20, 40, 60, 80, 100 mg l -1 ) (Duchefa) koncentracijos. Manozės koncentracija maitinamojoje terpėje buvo didinama atitinkamai mažinant sacharozės koncentraciją 0,25 %. Kontrolės variante eksplantai buvo auginti ant terpės be antibiotikų ir manozės. Bandymai atlikti kartojant keturis kartus. Vienu pakartojimu tirta 12 eksplantų. Eksplantai auginti fitotrone 45 paras pirmiau nurodytomis sąlygomis. DNR išskyrimas, PGR, elektroforezė. Fosfomanozės izomerazės genui nustatyti genominė sanpaulijos DNR buvo išskirta iš in vitro augintų mikroūglių lapų (0,2 g) cetiltrimetilamonio bromido (CTAB) metodu (Doyle, Doyle, 1990). Fmi koduojančios sekos DNR fragmentui pagausinti buvo naudojami pmi-1 5 -ACAGCCACTCTCCATTCA-3 ir pmi-2 5 -GTTTGCCATTACTTCCAG-3 pradmenys (Lamblin ir kt., 2007). 20 μl PGR (polimerazės grandininės reakcijos) mišinį sudarė 1 Taq polimerazės buferis su KCl, 0,125 U Taq polimerazės, 2,5 mm MgCl2, 0,2 mm dntp (Thermo Fisher Scientific), po 1 μm pradmenų ir 0,4 μg DNR. Taikytas toks temperatūros režimas: 94 C temperatūroje 3 min., toliau 35 ciklai 94 C temperatūroje 1 min., temperatūros gradientas 56 60 C 30 sek. ir 72 C 30 sek., 72 C temperatūroje 5 min. Kaip teigiama kontrolė naudotas binarinis vektorius pnov2819 (Syngenta), turintis E. coli fmi geną. Tiriamos DNR molekulinės masės įvertinimui naudotas 1 kb dydžio DNR žymeklis (Thermo Fisher Scientific). Pagausinti DNR fragmentai analizuoti horizontaliame 1,00 % agarozės gelyje su etidžio bromidu (iki 0,5 μg ml -1 ). Gauti rezultatai vertinti UV šviesoje panaudojant Easy Win32 (Herolab) kompiuterio programą. Duomenų statistinis įvertinimas. Po 45 parų įvertintas regeneravusių eksplantų dažnis, išreikštas procentais nuo visų tirtų ir regeneravusių bent vieną ūglį eksplantų skaičiaus, ir regeneruojančio eksplanto vidutinis 18

regeneracijos židinių skaičius. Duomenų vidurkių skirtumų statistinis patikimumas įvertintas kompiuterio programomis ANOVA ir STAT_ENG iš programų paketo SELEKCIJA ir IRRISTAT (Tarakanovas, Raudonius, 2003). Esminiai reikšmių skirtumai apskaičiuoti pagal Dunkano kriterijų. Rezultatai. Nustatyta, kad cefotaksimo 250 1 000 mg l -1 koncentracija maitinamojoje terpėje iš esmės neturėjo įtakos sanpaulijos regeneruojančių eksplantų dažniui (1 lentelė). Regeneracijos židinių skaičius, didinant cefotaksimo koncentraciją iki 500 mg l -1, reikšmingai mažėjo nuo 82,94 (kontrolė) iki 27,43 vnt. Toliau didinant cefotaksimo koncentraciją maitinamojoje terpėje (750 ir 1 000 mg l -1 ), regeneracijos židinių skaičius esmingai nekito. 1 lentelė. Cefotaksimo įtaka sanpaulijos ūglių regeneracijai izoliuotų lapų kultūroje in vitro Table 1. Impact of cefotaxime on Saintpaulia shoot regeneration in isolated leave culture in vitro Cefotaksimo koncentracija, mg l -1 Concentration of cefotaxime, mg l -1 Regeneravusių eksplantų dažnis, % Frequency of regenerated explants, % 19 Regeneruojančio eksplanto regeneracijos židinių skaičius, vnt. Number of regeneration centers per regenerated explant, units 0 100,00 a 82,94±4,63 250 93,75 a 59,81±3,32 500 91,67 a 27,43±2,46 750 95,83 a 36,06±6,76 1000 100,00 a 35,73±7,08 R01 / LSD 01 4,50 Note / Pastaba. - tomis pačiomis raidėmis skiltyje pažymėtos reikšmės iš esmės nesiskiria kai P 0,01 / values followed by the same letters within the column are not statistically different at P 0.01. Tyrimų rezultatai parodė, kad kanamicino 60 100 mg l -1 koncentracija regeneracijai skirtoje maitinamojoje terpėje iš esmės slopino sanpaulijos eksplantų regeneraciją, palyginti su antibiotiku nepaveiktais eksplantais (2 lentelė). Regeneravusių eksplantų dažnis sumažėjo nuo 95,83 (kontrolė) iki 10,42 % (kanamicino koncentracija 100 mg l -1 ). Toksiškai veikė didesnės nei 40 mg l -1 antibiotiko koncentracijos. Vidutinį regeneruojančio eksplanto regeneracijos židinių skaičių statistiškai patikimai mažino 20 m l -1 ir didesnės koncentracijos kanamicinas. Židinių skaičius sumažėjo nuo 70,61 (kontolė) iki 5,92 vnt. (kanamicino koncentracija 100 mg l -1 ).

2 lentelė. Kanamicino įtaka sanpaulijos ūglių regeneracijai izoliuotų lapų kultūroje in vitro Table 2. Impact of kanamycin on Saintpaulia shoot regeneration in isolated leave culture in vitro Kanamicino koncentracija, mg l -1 Concentration of kanamycin, mg l -1 Regeneravusių eksplantų dažnis, % Frequency of regenerated explants, % Regeneruojančio eksplanto regeneracijos židinių skaičius, vnt. Number of regeneration centers per regenerated explant, units 0 95,83 a 70,61±4,77 20 87,50 a 36,67±4,93 40 72,91 a 17,37±2,23 60 16,67 b 7,83±4,86 80 10,42 b 6,94±6,29 100 10,42 b 5,92±2,40 R01 / LSD 01 7,34 Note / Pastaba. - tomis pačiomis raidėmis skiltyje pažymėtos reikšmės iš esmės nesiskiria kai P 0,01 / values followed by the same letters within the column are not statistically different at P 0.01. Nustatyta, kad 0,25 1,25 koncentracijos manozė neturėjo esminės įtakos sanpaulijos eksplantų regeneracijos dažniui (1A pav.). Toliau didinant manozės ir mažinant sacharozės koncentraciją, regeneruojančių eksplantų skaičius mažėjo netolygiai. Regeneracijos židinių skaičius, palyginti su eksplantais, augintais ant regeneracijos terpės be manozės, iš esmės sumažėjo (išskyrus 1,00 manozės koncentraciją) (1B pav.). Mažiausiai regeneracijos židinių gauta eksplantus auginant ant terpės su 1,50 koncentracijos manoze 32,34 vnt. Šiek tiek daugiau regeneracijos židinių 34,75 vnt. suformavo eksplantai, auginti ant terpės tik su manoze (3,00 ). Gauti rezultatai leidžia manyti, kad sanpaulija geba asimiliuoti terpėje esančią manozę ir galbūt be genetinės transformacijos turi fosfomanozės izomerazę ir ją koduojantį geną. Siekiant tai patvirtinti arba paneigti, buvo išskirta sanpaulijos genominė DNR ir, panaudojus fmi geno fragmento specifinius pradmenis, atlikta polimerazės grandininė reakcija. Po elektroforezės gautas 500 bp ilgio DNR fragmentas atitiko pnov2819 vektoriuje esančio fmi geno dalies dydį (2 pav.). 20

Regeneruojančio eksplanto regeneracijos židinių skaičius, vnt. Number of regeneration centers per regenerated explant, units Regeneravusių eksplantų dažnis, % Frequency of regenerated expants, % 100 100 100 100 93.75 100 95.83 R 01 = 4,09 91.67 89.58 90 85.42 85.42 81.25 79.17 81.25 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 2.5 2.75 3 A Manozės koncentracija, % / Mannose concentration, % 90 80 70 60 50 B 40 30 20 10 0 78.12 73.59 54.31 60.57 62.10 60.60 55.42 56.70 49.25 43.47 38.88 32.34 34.75 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 2.5 2.75 3 Manozės koncentracija, % / Mannose concentration, % 1 pav. Manozės įtaka sanpaulijos ūglių regeneracijai izoliuotų lapų kultūroje in vitro Fig. 1. Impact of mannose on Saintpaulia shoot regeneration in isolated leave culture in vitro 21

500 bp 2 pav. Sanpaulijos fmi geno elektroforegrama. 1, 2, 3, 4 sanpaulijos fmi geno dalis, pagausinta atitinkamai 56,0 C; 57,1 C; 59,1 C ir 59,9 C temperatūroje; 5 vektoriaus pnov2819 fmi geno dalis, pagausinta 57,1 C temperatūroje; 6 DNR dydžio žymeklis Fig. 2. Electrophoregram of Saintpaulia pmi gene. 1, 2, 3, 4 a part of Saintpaulia pmi gene, amplified at 56.0 C, 57.1 C, 59.1 C and 59.9 C temperature, respectively; 5 a part of pmi gene of pnov2819 vector, amplified at 57.1 C temperature; 6 DNA size marker Aptarimas. Be bakteriostatinio (bakterijos augimo slopinimo) ir baktericidinio (bakterijos žuvimo) poveikio, antibiotikai gali atlikti augalų augimo reguliatorių vaidmenį ir teigiamai arba neigiamai paveikti augalo morfogenezę (Qin ir kt., 2011), ūglių formavimąsi (Dai, Castillo, 2007), šaknijimąsi (Rahman ir kt., 2004). Žinoma, kad -laktamai daro specifinį poveikį bakterijų ląstelės sienelei (Ogawa, Mii, 2004), bet kai kuriais atvejais maitinamojoje terpėje susidarę jų irimo produktai gali nevienodai paveikti augalo ląstelės augimą. Taigi antibiotiko fitotoksiškumas gali stipriai varijuoti priklausomai nuo jo koncentracijos ir augalo rūšies (Tang ir kt., 2000). J. Ma su kolegomis (2015) nustatė, kad cefotaksimo 400 mg l -1 koncentracija terpėje ne tik efektyviai sustabdė agrobakterijos augimą, bet darė ir reikšmingai neigiamą poveikį pomidoro kaliaus indukcijai ir ūglių regeneracijai. Atlikdami sanpaulijos transformacijos bandymus agrobakterijos augimui sustabdyti M. S. N. Ram ir S. Mohandas (2003) naudojo 800 mg l -1, A. Mercuri ir kt. (2000) 250 mg l -1, o S. Kushikawa ir kt. (2001) 300 mg l -1 koncentracijos cefotaksimo priedą maitinamojoje terpėje. Atsižvelgdami į tai, atlikdami savo bandymą, pasirinkome nuo 250 iki 1 000 mg l -1 cefotaksimo koncentraciją ūglių regeneracijai skirtoje terpėje. Gauti rezultatai parodė, kad taikytos antibiotiko koncentracijos neturėjo įtakos sanpaulijos regeneruojančių eksplantų dažniui, tačiau iš esmės mažino regeneracijos židinių skaičių. Panašius rezultatus pateikė ir A. H. Naing su 22

bendraautoriais (2014), atlikę tyrimus su chrizantemomis. Atliekant mūsų tyrimą taip pat pastebėta šio antibiotiko (500 1 000 mg l -1 koncentracija) nežymi teigiamo poveikio sanpaulijos regeneracijos židinių skaičiui tendencija. Stimuliuojantis cefotaksimo poveikis augalų audinių kultūroje nustatytas tiriant cukranendrių ūglių dauginimąsi ir tįsimą (Mittal ir kt., 2009), kviečių ir kvietrugių mikrosporų embriogenezę (Asif ir kt., 2013), morkos protoplastų regeneraciją (Grzebelus, Skop, 2014). Pasak R. J. Mathias ir L. A. Boyd (1986), toks cefotaksimo veikimas yra susijęs su augalų esterazių gebėjimu jį suardyti ir panaudoti metabolitų, turinčių augimo reguliatorių savybių, gamybai. Todėl cefotaksimo 250 500 mg l -1 koncentracija yra tinkamiausia agrobakterijai pašalinti iš sanpaulijos audinių kultūros. Kanamicinas yra efektyvus aminoglikozidinis antibiotikas, plačiai naudojamas transformuotų mikroūglių atrankai. Z. Ghorbanzade ir M. Ahmadabadi (2015) po sanpaulijos transformacijos biolistiniu metodu eksplantus augino ant regeneracijai skirtos terpės su 50 mg l -1 kanamicino priedu. M. S. N. Ram ir S. Mohandas (2003) po sanpaulijos transformacijos A. tumefaciens transformantų atrankai naudojo 70 mg l -1, o A. Mercuri su kolegomis (2000) 100 mg l -1 koncentracijos kanamiciną. Mūsų tyrimo duomenimis, 60 mg l -1 ir didesnė kanamicino koncentracija gerokai sumažino regeneruojančių eksplantų dažnį ir regeneracijos židinių skaičių, eksplantų audiniai buvo stipriai pažeisti nekrozės. Todėl tokia antibiotiko koncentracija yra pakankama transgeninėms sanpaulijoms atrinkti. Alternatyva nptii/kanamicino atrankos sistemai ir ekologiniu požiūriu saugus atrankos žymeklis augalų biotechnologijoje yra manozė (Privalle ir kt., 2002). Nors fosfomanozės izomerazė yra plačiai paplitęs gamtoje fermentas, daugelis augalų jo neturi ir negali naudoti manozės kaip anglies šaltinio. Tokiu atveju po transformacijos išgyvena tik tos augalų ląstelės, kurios geba sintetinti šį fermentą. Mūsų atlikti tyrimai parodė, kad manozės priedas maitinamojoje terpėje neturėjo reikšmingos įtakos sanpaulijos regeneruojančių eksplantų dažniui, o regeneracijos židinių skaičius, palyginti su kontrole, iš esmės sumažėjo, bet visiško inhibuojančio poveikio sanpaulijos ūglių regeneracijai iš lapų eksplantų nenustatyta. Kitaip, nei atliekant bandymą su kanamicinu, regeneruojantys eksplantai viso bandymo metu išliko žalios spalvos, audiniai nebuvo pažeisti nekrozės. Y. C. Chiang ir Y. T. Kiang (1988) nustatė, kad ankštiniams augalams, tokiems kaip sojos, yra būdingas FMI aktyvumas. Mūsų tyrimo metu atlikta polimerazės grandininė reakcija taip pat patvirtino, kad sanpaulija turi fosfomanozės izomerazės geną, kurio DNR sekos dydis bent iš dalies atitinka vektoriaus pnov2819 fmi geno seką. 23

Dėl šio geno sanpaulija gali asimiliuoti maitinamojoje terpėje esančią manozę. Išvados. Atliekant sanpaulijos transformacijos eksperimentus panaudojant Agrobacterium tumefaciens, tikslingiausia naudoti 250 500 mg l -1 koncentracijos cefotaksimą ir 60 mg l -1 koncentracijos kanamiciną maitinamojoje terpėje. FMI/manozės atrankos sistema nėra tinkama sanpaulijos transformacijai. Reikalinga naujų, ekologiniu požiūriu saugių atrankos sistemų paieška. Literatūra Gauta 2016-10-24 Parengta spausdinti 2016-11-28 1. Arshad W., Haq I. U., Waheed M. T., Mysore K. S., Mirza B. 2014. Agrobacterium-mediated transformation of tomato with rolb gene results in enhancement of fruit quality and foliar resistance against fungal pathogens. PLOS ONE, 9(5): 1 11. 2. Asif M., Eudes F., Randhawa H., Amundsen E., Yanke J., Spaner D. 2013. Cefotaxime prevents microbial contamination and improves microspore embryogenesis in wheat and triticale. Plant Cell Reports, 32: 1637 1646. 3. Aswath C. R., Mo S. Y., Kim D. H., Park S. W. 2006. Agrobacterium and biolistic transformation of onion using non-antibiotic selection marker phosphomannose isomerase. Plant Cell Reports, 25: 92 99. 4. Chevreau E., Mourgues F., Neveu M., Chevalier M. 1997. Effect of gelling agents and antibiotics on adventitious bud regeneration from in vitro leaves of pear. In Vitro Cellular and Developmental Biology- Plant, 33: 173 179. 5. Chiang Y. C., KiangY. T. 1988. Genetic analysis of mannose-6- phosphate isomerase in soybeans. Genome, 30: 808 811. 6. Dai W., Castillo C. 2007. Factors affecting plant regeneration from leaf tissues of Buddleia species. Hortscience, 42: 1509 1517. 7. Danilova S. A., Dolgikh Y. I. 2004. The stimulatory effect of the antibiotic cefotaxime on plant regeneration in maize tissue culture. Russian Journal of Plant Physiology, 51: 621 625. 8. Doyle J. J., Doyle J. L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12(1): 13 15. 9. Estopà M., Marfà V., Melé E., Messeguer J. 2001. Study of different antibiotic combinations for use in the elimination of 24