LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA Veterinarijos fakultetas DOVILĖ ŠILKUTĖ ETERINIŲ ALIEJŲ KOMPONENTŲ PANAUDOJIMAS VIŠTIE

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA Veterinarijos fakultetas DOVILĖ ŠILKUTĖ ETERINIŲ ALIEJŲ KOMPONENTŲ PANAUDOJIMAS VIŠTIENOS KOKYBĖS GERINIMUI Use of Essential Oils Components for Poultry Quality Improvement Veterinarinės maisto saugos nuolatinių studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS Darbo vadovė: prof. dr. G. Zaborskienė KAUNAS, 2015

DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas ETERINIŲ ALIEJŲ KOMPONENTŲ PANAUDOJIMAS VIŠTIENOS KOKYBĖS GERINIMUI. 1. Yra atliktas mano pačios; 2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje; 3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą. (data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. (data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO (data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (aprobacijos data) (katedros/instituto vedėjo/jos vardas, pavardė) (parašas) Magistro baigiamojo darbo recenzentas (vardas, pavardė) (parašas) Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) parašas) 2

TURINYS SANTRAUKA... 5 SUMMARY... 6 SANTRUMPOS... 7 ĮVADAS... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA... 10 1.1 Eteriniai aliejai... 10 1.2 Eterinių aliejų komponentai... 10 1.2.1 Timolis... 12 1.2.2 Linalolis... 12 1.3 Eterinių aliejų antibakterinis poveikis... 13 1.4 Eterinių aliejų antioksidacinis poveikis... 15 1.5 Eterinių aliejų fungicidinis poveikis... 16 1.6 Eterinių aliejų panaudojimo trūkumai... 16 2. MEDŽIAGOS IR METODAI... 18 2.1 Tyrimo laikas ir vieta... 18 2.2 Medžiagos... 18 2.3 Mėginiai naudoti tyrimui... 18 2.4 Tyrimo schema... 19 2.4.1 Mikrobiologinių rodiklių nustatymas... 19 2.4.2 Aktyviojo rūgštingumo ph nustatymas... 20 2.4.3 Spalvos intensyvumo matavimas... 20 2.4.4 Juslinės kokybės įvertinimas... 20 2.5 Statistinė duomenų analizė... 21 3. TYRIMO REZULTATAI... 22 3.1 Timolio ir linalolio poveikis smulkintos vištienos mikrobiologiniams rodikliams... 22 3

3.2 Smulkintos vištienos aktyviojo rūgštingumo ph pokytis... 24 3.3 Smulkintos vištienos spalvos intensyvumo analizė... 25 3.4 Smulkintos vištienos juslinė analizė... 25 4. REZULTATŲ APTARIMAS... 28 IŠVADOS... 31 LITERATŪROS SĄRAŠAS... 32 PRIEDAI... 39 4

SANTRAUKA Darbo pavadinimas: Eterinių aliejų komponentų panaudojimas vištienos kokybės gerinimui Baigiamasis magistro darbas Darbo vadovė: prof. dr. G. Zaborskienė Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Veterinarijos akademija Maisto saugos ir kokybės katedra Darbo apimtis: 38 psl., 4 lentelės, 10 paveikslų, 79 literatūros šaltiniai. Tyrimo tikslas: įvertinti eterinių aliejų komponentų poveikį vištienos kokybės rodikliams. Tyrimo uždaviniai: įvertinti eterinių aliejų komponentų timolio ir linalolio poveikį smulkintos vištienos mikrobiologiniams rodikliams; nustatyti timolio ir linalolio įtaką aktyviajam rūgštingumui ph ir spalvingumui smulkintoje vištienoje; įvertinti termiškai apdorotos smulkintos vištienos juslines savybes; apibendrinti rezultatus, atlikti rezultatų palyginamąją analizę, įvertinti eterinių aliejų komponentų panaudojimo galimybes smulkintai vištienai. Tyrimo objektas smulkinta vištiena. Pasverti smulkintos vištienos gabalėliai buvo suskirstyti į 5 tiriamąsias grupes: 1 grupė smulkinta vištiena paveikta 0,5 proc. pieno rūgštimi; 2 grupė smulkinta vištiena, paveikta 0,5 proc. pieno rūgštimi ir 0,024 proc. dihidrokvercitino; 3 grupė smulkinta vištiena, paveikta 0,5 proc. pieno rūgštimi, 0,024 proc. dihidrokvercitino ir 0,3 proc. timolio; 4 grupė smulkinta vištiena, paveikta 0,5 proc. pieno rūgštimi, 0,024 proc. dihidrokvercitino ir 0,3 proc. linalolio, 5 grupė kontrolė. Tyrimo metu buvo tiriami ir vertinami mikrobiologiniai, fizikiniai ir cheminiai rodikliai praėjus 24, 48 ir 72 valandoms po apdorojimo tiriamaisiais tirpalais. Tais pačiais intervalais buvo atliekami tyrimai ir kontrolėje. Juslinis vertinimas atliktas iškarto po apdorojimo minėtais tirpalais, prieš tai smulkintą vištieną išvirus vandenyje. Tyrimo metu nustatyta, kad eterinių aliejų komponentas timolis patikimai sumažino E. coli skaičių, o bendram bakterijų skaičiaus pokyčiui įtakos turėjo ir timolis ir linalolis (p<0,05). Koliforminių bakterijų bei mielių augimo pokyčių, veikiant biologiškai aktyviomis medžiagomis, nenustatyta. Efektyviausiai ph buvo sumažintas smulkintoje vištienoje, kuri buvo paveikta mišinio su timoliu ir mišinio su linaloliu (p<0,05). Smulkintos vištienos mėginiai, paveikti mišinio su timoliu, statistiškai reikšmingai skyrėsi savo šviesumu, bei gelsvumu nuo kontrolinio mėginio (p<0,05). Vertintojams jusliškai priimtiniausia smulkinta vištiena su linaloliu. Kiek prasčiau įvertinta smulkinta vištiena su timoliu, prasčiausiai kontrolė. Raktiniai žodžiai: timolis, linalolis, smulkinta vištiena, šviesumas, priimtinumas. 5

SUMMARY Use of Essential Oils Components for Poultry Quality Improvement Master thesis Work instructor: prof. Dr. G. Zaborskienė Lithuanian University of Health sciences Veterinary Academy Faculty of Veterinary Department of Food Safety and Quality The coverage of the work 37 pages, 4 tables, 10 pictures and 79 literature sources. The aim of the study - evaluate the effect of essential oils components on poultry quality. The tasks of the work were: to evaluate essential oils components thymol and linalool efficacy in minced chicken against microorganisms; find out thymol and linalool effect on minced chicken ph level and colour changes; evaluate sensory properties of minced chicken treated with thymol and linalool. Minced chicken were divided into five sample groups: group 1 minced chicken were treated with 0.5% lactic acid; group 2 treated with 0.5% lactic acid and 0.024% dihidrokvercitin; group 3 treated with 0.5% lactic acid, 0.024% dihidrokvercitin and 0.3% thymol; group 4 treated with 0.5% lactic acid, 0.024% dihidrokvercitin and 0.3% linalool; group 5 control. The study examined the physical, chemical and microbiological characteristics 24, 48 and 72 hours after minced chicken treatment with essential oils components and other biologically active components. Heat-treated minced chicken were sensory evaluated after essential oils components treatment. The study showed that minced chicken treated with thymol had the significant effect on E. coli number decrease (p<0.05). Samples witch contained thymol and linalool made significant effect on total bacteria number decrease (p<0.05). The number of coliform bacteria and yeast were decreased, but not significantly (p>0.05). Minced chicken which contained thymol and linalool had the biggest effect on the ph level decrease (p<0.05). The colour intensity was tested. Results showed that the most the brightest and the yellowest were samples with thymol (compared with control group was found significant difference, p<0.05). The best organoleptic properties such as taste, general taste intensity, general aroma and juiciness were found in minced chicken with linalool, the second best with thymol, and the worst on control group. Key words: thymol, linalool, minced chicken, brightness, preferability. 6

SANTRUMPOS DHK dihidrokvercetinas EA eteriniai aliejai EDTA etilendinitril-tetra acto rūgštis MIK minimali inhibicijos koncentracija PR pieno rūgštis KSV kolonijas sudarantys vienetai L* šviesumo intensyvumas a* rausvumo intensyvumas b* gelsvumo intensyvumas 7

ĮVADAS Pastaraisiais dešimtmečiais vis daugiau dėmesio skiriama sveikai gyvensenai ir sveikai mitybai. Maisto produktų gamintojai, raginami vartotojų, siekia sukurti kuo natūralesnius, saugesnius ir aukštesnės kokybės maisto produktus. Šių dienų vartotojai domisi maisto produkto sudėtinėmis dalimis, mitybine, biologine verte. Vartotojai pageidauja, kad maisto produktai būtų pagaminti iš kuo natūralesnių žaliavų, be dirbtinių konservantų, nesukeliantys alergijų bei nedidinantys organizmo jautrumo [42]. Mėsa ir mėsos produktai priskiriami greitai gendančių produktų kategorijai. Jie turi visas būtinas maistines medžiagas žmogaus bei mikroorganizmų mitybai. Tiek šviežios mėsos vandens aktyvumas (dažniausiai didesnis nei 0,85), tiek ph vertės yra palankios bakterijų, mielių ir pelėsinių grybelių augimui ir dauginimuisi [15]. Todėl, kad mėsa ir jos produktai ilgiau negestų, būtų užtikrina maisto sauga, o kartu ir visuomenės sveikata, į mėsos gaminius dažnai dedami įvairūs dirbtiniai maisto priedai [22, 69]. Tačiau suminiai sintetinių maisto priedų kiekiai gali daryti neigiamą įtaką žmogaus sveikatai, todėl ieškoma alternatyvų, siekiama naudoti natūralias priemones prieš mikroorganizmus [42]. Ieškoma tokių natūralių maisto priedų, kurie nepaliktų irimo produktų likučių maisto grandinėje, apsaugotų nuo mikroorganizmų maisto produktus, tačiau dar ir pagerintų produktų kokybę [65]. Eteriniai aliejai (EA) bei jų sudėtiniai komponentai puiki alternatyva sintetiniams maisto priedams, norint užtikrinti maisto saugą bei pagerinti juslines savybes. Dėl savo biologinių ypatybių, gebėjimo suteikti kvapą EA jau šimtmečius naudojami maisto ruošime. Išgaunami iš įvairių žolių ir augalų, EA pasižymi itin stipriu antibakteriniu poveikiu ir antioksidacinėmis savybėmis [9]. Priklausomai nuo mėsos ir mėsos produktų pasirenkami iš raudonėlio, čiobrelio, gvazdikėlio, melisos, imbiero, baziliko, kalendros, mairūno išskiriami EA, kurie turi itin stiprų antibakterinį, antioksidacinį ir fungicidinį poveikį [7, 21, 22]. Maisto gamyboje svarbus aspektas EA ir jų komponentų dozavimas, nes EA tiesiogiai veikia maisto juslinį priimtinumą. Siekiant užtikrinti pakankamą antibakterinę apsaugą, reikia naudoti itin koncentruotus EA, tačiau atsiranda rizika, kad maistas taps nepriimtino kvapo bei skonio [28]. Vertėtų atlikti daugiau tyrimų, kad būtų išsiaiškintos optimalios EA ir jų komponentų koncentracijos, kurios sugebėtų užkirsti kelią bakterijų dauginimuisi, o organoleptinės maisto savybės nenukentėtų [17]. Buvo pastebėta, kad EA skirtingai veikia mikroorganizmus vienas bakterijas slopina, tačiau, tuo pačiu, gali paskatinti kitų mikroorganizmų augimą [16]. Yra pripažįstama, kad vertėtų naudoti 8

kelis EA ir jų komponentus ir/ar jų kombinacijas, siekiant sumažinti nepageidaujamų bakterijų ir mikromicetų dauginimąsi [11]. Naudojant EA ir skirtingų rūšių bioaktyvias medžiagas su skirtingais veikimo mechanizmai yra užtikrinama efektyvesnė apsauga prieš patogeninius mikroorganizmus ir maisto gedimą sukeliančias bakterijas dėl pasireiškiančio sinergijos efekto [34, 45]. Darbo tikslas: įvertinti eterinių aliejų komponentų poveikį vištienos kokybės rodikliams. Darbo uždaviniai: 1. Įvertinti eterinių aliejų komponentų timolio ir linalolio poveikį smulkintos vištienos mikrobiologiniams rodikliams. 2. Nustatyti timolio ir linalolio įtaką aktyviajam rūgštingumui ph ir spalvingumui smulkintoje vištienoje. 3. Įvertinti termiškai apdorotos smulkintos vištienos juslines savybes. 4. Apibendrinti rezultatus, atlikti rezultatų palyginamąją analizę, įvertinti eterinių aliejų komponentų panaudojimo galimybes smulkintai vištienai. 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA 1.1 Eteriniai aliejai Eteriniai aliejai yra daugelio įvairių cheminių junginių mišiniai: angliavandenilių, alkoholių, ketonų, rūgščių, esterių, eterių bei kitų dideliu lakumu pasižyminčių junginių. Dažniausiai eterinius aliejus sudaro 85-99 % lakiųjų ir 1-15 % nelakiųjų junginių. Lakiųjų junginių sudėtyje yra terpenų, terpenoidų ir kitų aromatinių bei alifatinių sudedamųjų dalių, kuriems būdinga maža molekulinė masė [6]. Terpenai susideda iš įvairiais būdais susijungusių izopreno vienetų su bendra chemine formule C10H16. Be to, terpenai paprastai yra eterinių aliejų sudėtyje kaip pagrindinė arba viena iš pagrindinių sudedamųjų dalių. Priklausomai nuo izopreno vienetų kiekio, skiriamos aštuonios terpenų grupės, tačiau eteriniuose aliejuose dažniausiai aptinkami monoterpenai (timolis, mentolis, kamparas, 108- cineolis) ir seskviterpenai (serinas) [62]. Svarbu paminėti, kad terpenai pasižymi antibakteriniu bei priešvirusiniu veikimu, teigiamai veikia chemoreceptorius, malšina uždegimus, lengvina atsikosėjimą, skatina tulžies išsiskyrimą, turi antiseptinių, spazmolitinių (kraujagysles plečiančių) savybių [74]. Pagal cheminę sandarą eteriniai aliejai gali būti priskiriami alifatiniams ar cikliniams, daugiausia nesotiems angliavandeniliams, alkoholiams, aldehidams, ketonams, rūgštims, esteriams ir eteriams. Pasitaiko ir aromatinių junginių (fenilpropanų) [6]. Naujausi moksliniai tyrimai rodo, eterinių aliejų antibakterinį ir antigrybelinį aktyvumą prieš keletą gram teigiamų ir gram neigiamų bakterijų [36]. Mėsos produktų tyrimams dažniausiai naudojami iš raudonėlio, rozmarino, čiobrelio, šalavijo, baziliko, kalendros, imbiero, česnako ir gvazdikėlio išgauti EA ekstraktai. Tiriamas tiek vieno eterinio aliejaus poveikis, tiek kelių eterinių aliejų bendras antibakterinis veikimas, juslinės savybės, sugebėjimas prailginti tinkamumo vartoti terminą [26]. Kiti mokslininkai įžvelgia eterinių aliejų pranašumą prieš stiprius prieskonius, nes EA išlieka stabilūs sandėliavimo metu, jie saugūs mikrobiologiniu požiūriu, kvapiųjų medžiagų dalis gali būti itin koncentruota ir talpinama mažose tarose, tad sutaupoma vietos sandėlyje [73]. 1.2 Eterinių aliejų komponentai EA susideda iš daugiau nei 60 skirtingų organinių komponentų [10] ir, priklausomai nuo molekulinės masės, keičiasi jų antibakterinis ir antioksidacinis aktyvumas [31]. EA komponentai ir šaltiniai, kurie galėtų būti panaudoti mėsos ir mėsos produktų apdorojimui pateikiami 1 lentelėje. 10

1 lentelė. Informacija apie aromatinių žolelių sudedamąsias dalis, kurios gali būti naudojamos mėsoje ir mėsos produktuose Prieskoninių žolelių pavadinimai Blakinė kalendra Blakinė kalendra Lotyniškas augalo pavadinimas Coriandrum sativum (nesubrendę lapai) Coriandrum sativum (sėklos) Pagrindiniai sudėtiniai komponentai Linalolis E-2 decenalis Linalolis E-2 decenalis Apytikslė % sudėtis 26% 20% 70% - Nuoroda [19] [19, 46] Cinamonas Cinnamomum zeylandicum Transcinamaldehidas Eugenolis 46-75% 5-10% [19, 62, 66] Raudonėlis Rozmarinas Vaistinis šalavijas Gvazdikėliai Origanum vulgare Rosmarinus officinalis Salvia officinalis L. Syzygium aromaticum Karvakrolis Timolis γ-terpinenas ρ-cimenas α-pinenas Bornilo acetatas Kamparas 1,8- Cineolis Kamparas α-pinenas β-pinenas 1,8- Cineolis α-tujonis Eugenolas Eugenolo acetatas 0-80% 0-64% 2-52% 0-52% 2-25% 0-17% 2-14% 3-89% 6-15% 4-5% 2-10% 6-14% 20-42% 75-85% 8-15% [38, 71] [14, 18, 23] [18, 41, 56, 66] [25, 50, 62] Čiobrelis Tikroji levanda Thymus vulgaris Lavandula angustifolia Timolis Karvakrolis γ-terpinenas ρ-cimenas Linalolis Linalolo acetatas Trans-ocimenas 4-Terpinolis 10-64% 2-30% 2-31% 10-56% 22% 22% 6% 5% [5, 14, 35, 51, 68] [20] Hidroksilo grupės buvimas fenoliniams EA (pvz. timolis, karvakrolis, linalolis) suteikia didžiausią antibakterinį aktyvumą [10]. Šiame darbe plačiau tyrinėjamas timolio ir linalolio poveikis smulkintos vištienos kokybės gerinimui. 11

1.2.1 Timolis Timolis (5-metil-2-izopropil-fenolis) yra pagrindinis sudedamasis eterinių aliejų, išskirtų iš čiobrelių (Thymus) ir raudonėlių (Origanum) genties augalų, komponentas [33, 40]. Minėtas junginys pasižymi stipriu ir maloniu kvapu, kuris primena čiobrelį. Dar 1994 metais buvo išsiaiškinta, kad timolis stabdo gram teigiamų ir gram neigiamų bakterijų dauginimąsi [64]. Timolis yra natūrali biocidinių savybių turinti medžiaga, kuri veikdama viena ar su kitomis biocidinėmis medžiagomis, tokiomis kaip karvakrolis (čiobrelio eterinio aliejaus komponentas) pasižymi antibakteriniu poveikiu. Pažymima, kad iš augalų išskirtas timolis mažina bakterijų atsparumą antibiotikams [52]. Daugeliu tyrimu patvirtinta, kad timolis pasižymi ne tik antibakteriniu, bet ir antioksidaciniu poveikiu [59, 78]. Tyrimais nustatyta, kad geresnis antibakterinis ir fungicidinis poveikis būna tuomet, kai timolis sinergiškai veikia su kitu natūraliu biocidu, pavyzdžiui, karvakroliu [1, 52]. Eterinio aliejaus komponentai, išskirti iš raudonėlio, pasižymėjo itin efektyviu antimutageniniu poveikiu, o pats efektyviausias iš jų timolis [44]. Paskutinieji tyrimai, leidžia manyti, kad timolis turi ir priešvėžinių savybių [4], tikslus mechanizmas dar nėra išsiaiškintas, tačiau manoma, kad tai susiję su membranų vientisumo pažeidimu [75]. 1 pav. Timolis monoterpenų fenolis, turintis hidroksilo grupę. 1.2.2 Linalolis Linalolis (3,7-dimetil-okta-1,6-dien-triolis) natūralus gamtoje randamas terpenas, aptinkamas daugelyje gėlių (didžiausi kiekiai levandose) ir prieskonių (didžiausi kiekiai kalendrose). Šis junginys pasižymi maloniu gėlių ir prieskonių kvapu [53]. Linalolis, kaip kokybinis rodiklis, naudojamas sulčių kokybės nustatyme. Linalolio kiekis sultyse tiesiogiai lemia jų skonį ir kvapą. Be to, linalolio kvapas atbaido vaisines museles, tad žaliava, iš kurių gaminamos sultys, tampa saugesnė ir higieniškesnė [55]. 12

Linalolis plačiai tiriamas medikų. Žinoma, kad šis junginys pasižymi stresą mažinančiu poveikiu ir turinčiu savybių, padedančių kovoti su uždegiminiais procesais ir sumažinančių skausmą [30, 53]. 2 pav. Linalolis (3,7-dimetil-okta-1,6-dien-triolis). 1.3 Eterinių aliejų antibakterinis poveikis Atliekama daug eksperimentinių tyrimų, siekiant įrodyti EA antibakterinį efektyvumą. Tyrimų santrauka pateikiama 2 lentelėje. Ankstesniais tyrimais nustatyta, kad iš gvazdikėlio, raudonėlio, rozmarino, čiobrelio ir šalavijo gauti eteriniai aliejai labiau veikia gram teigiamų nei gram neigiamų bakterijų dauginimąsi [67]. Raudonėlio EA itin efektyvūs prieš puvimą sukeliančias bakterijas. Mokslininkai nustatė, kad raudonėlio EA, kurio koncentracija siekė nuo 0,6 proc. iki 0,9 proc., įdėjimas į smulkintą avieną efektyviai sumažino Salmonella enteritidis kiekį. 0,9 proc. raudonėlio EA efektyviau sumažino S. enteritidis kiekį 10 ºC laikomoje smulkintoje avienoje, nei 0,6 proc. kai laikymo temperatūra siekė 4ºC [27]. Penalver ir kt.[54] nustatė raudonėlio EA minimalią inhibicijos koncentraciją (MIK) prieš S. enteritidis, kuri siekia 0,25 proc. 0,8 proc. raudonėlio EA buvo pakankamas, norint sustabdyti kolonijas sudarančių bakterijų skaičiaus augimą, jautienos filė [76]. Čiobrelio EA antibakterinis poveikis prieš E. coli O157:H7 tyrinėjamas naudojant 0,3 proc., 0,6 proc., ir 0,9 proc. koncentracijos tirpalus [69]. Tyrimų metu paaiškėjo, jog malta jautiena paveikta 0,6 proc. čiobrelio EA, sustabdė E. coli O157:H7 augimą, kai mėsa buvo laikoma 10 ºC temperatūroje, o kai temperatūra siekė 4 ºC, augimas išliko [10]. Taip pat buvo pastebėtas bakteriostatinis ir bakteriocidinis čiobrelio EA poveikis E. coli O157:H7, kai EA koncentracijos siekė nuo 0,12 proc. iki 0,25 proc. Atliekant in vitro eksperimentus buvo nustatyti du pagrindiniai fenoliniai dariniai karvakrolis ir timolis, kurie aptinkami ne tik čiobrelio EA, bet ir raudonėlio EA. Tiek karvakrolis, tiek timolis laikomi efektyviausiai prieš E. coli O157:H7 augimą [11, 24]. 13

2 lentelė. Eterinių aliejų ir jų komponentų antibakterinis poveikis Mėsos rūšis/gaminys Eterinis aliejus ar jo komponentai Koncentracija, proc. Poveikis mikroorganizmui Šaltinis Raudonėlio EA 0,6 ir 0,9 S. enteritidis [47] Malta aviena Gvazdikėlio EA 0,5 ir 1 L. monocytogenes [43] Kapota ėriena Čiobrelių EA 0,1% čiobrelių aliejus kartu su modifikuotų dujų aplinka - MAP (80% CO2/20% N2) Jautienos filė Raudonėlio EA 0,8 Lactobacillus spp., Pseudomonas spp., B. thermosphacta, Enterobacteriaceae Lactobacillus spp., L. monocytogenes [36] [76] Čiobrelio EA 0,5 E. coli O157:H7, L. monocytogenes [22] Vištienos krūtinėlė Vištienos krūtinėlė Vištienos file 0,1 raudonėlių aliejus kartu su Raudonėlio EA MAP (30% CO2/70% N2 arba 70% CO2/30% N2) Karvakrolis arba cinamaldehidas 0,5 Rozmarino EA arba raudonėlio EA Rozmarino arba raudonėlio aliejus (0,20% V/m) su EDTA-lizocimo tirpalo (1,5% v/v) L. monocytogenes, Pseudomonas spp., B. thermosphacta, Enterobacteriaceae S. enterica E. coli O157:H7, L. monocytogenes L. monocytogenes, Pseudomonas spp., B. thermosphacta, Enterobacteriaceae [22] [13] [49] Čiobrelio EA sumažina natūralios mikrofloros kiekį vištienos krūtinėlių mėsoje. Šis EA padeda apsaugoti vištieną nuo sugedimo, pratęsia vištienos produktų galiojimo trukmę, kuomet produktų laikymo temperatūra siekia 4 ºC [22]. Čiobrelio EA (0,5 proc.) reikšmingai sumažina E. coli augimą, o balzamiko EA (0,5 proc.) Salmonella spp. augimą; vištienos mėsą paveikus abiem minėtais aliejais, stebimas mažesnis bendras bakterijų skaičius, nei kontroliniuose mėginiuose. Čiobrelio EA paveikta vištiena efektyviai stabdo pieno rūgšties bakterijų (PRB) augimą per visą vištienos laikymo periodą. Šie rezultatai sutinka su kitais tyrimais, kuriuose buvo nagrinėtas čiobrelio 14

EA poveikis E. coli ir Salmonella spp. augimui maiste ir tiriant in vitro [29]. Krisch ir kt. [37] pasiūlė, kad smulkintos kiaulienos galiojimo laikas galėtų būti prailgintas, papildomai į maltą mėsą dedant čiobrelio ir mairūno EA, kurie sumažina E. coli kiekius, ją laikant 5ºC temperatūroje. Chouliara ir kt. [13] pastebėjo, kad net 0,1 proc. čiobrelio EA panaudojimas, nors ir nežymiai, tačiau prailgina termiškai neapdorotos vištienos krūtinėlės galiojimo laiką. Menon ir Garg [43] tyrė gvazdikėlių EA antibakterinį poveikį L. monocytogenes maltoje avienoje, mėsą laikant 30 ºC ir 7 ºC temperatūroje. Buvo naudojamos 0,5 proc. ir 1 proc. koncentracijos gvazdikėlių EA. Tyrimo metu paaiškėjo, kad abi koncentracijos tiek 30 ºC tiek 7 ºC temperatūroje efektyviai mažina L. monocytogenes augimą avienoje. Panaudojus 1 proc. gvazdikėlių EA koncentraciją, tyrimo duomenys rodė efektyvesnį L. monocytogenes augimo stabdymą. 0,5 proc. gvazdikėlių EA koncentracija rekomenduojama naudoti tada, kai yra nedidelis mėsos užterštumas mikroorganizmais. Busatta ir kt. [12] vertino mairūno EA antibakterinį poveikį šviežiose dešrelėse, bei padarė išvadą: mairūno EA panaudojimas yra geras būdas siekiant prailginti produkto galiojimo trukmę. 0,2 proc. mairūno EA koncentracijos pakanka bakteriostatiniam poveikiui prieš E. coli. Burt [10] pastebėjo, kad kalendrų, gvazdikėlių ir čiobrelių EA efektyviai veikia prieš L. monocytogenes, A. hydrophila. 1.4 Eterinių aliejų antioksidacinis poveikis Laisvieji radikalai tai labai nestabilios toksinės reaktyvaus deguonies molekulės (toksinai), kurių išoriniame apvalkale trūksta vieno elektrono. Jie labai reaktyvūs ir gali sužaloti organizmo ląsteles. Nuolatinis laisvųjų radikalų susidarymas, vadinamas oksidaciniu stresu. Oksidacinio streso metu gali atsirasi ląstelių, baltymų, riebalų, angliavandenių ar DNR pakitimai, kurie vėliau gali sukelti Alzeimerio, Parkinsono ligas, paskatinti širdies ir kraujagyslių ligas, išsėtinę sklerozę ir vėžinius susirgimus [3]. Maisto vartojimas, kuris turi natūralių antioksidantų, daro teigiamą įtaką sveikatai. Natūralūs antioksidantai randami vaisiuose, daržovėse, prieskoniuose ir žolelėse, sugeba apsaugoti ląsteles nuo neigiamo laisvųjų radikalų poveikio, ko pasėkoje lėtinami senėjimo, degeneraciniai ir vėžiniai procesai [32]. Natūralūs antioksidantai svarbūs ne tik kūnui, tačiau ir maistui. Oksiduojantis riebalams suprastėja maisto juslinės savybės: keičiasi spalva, kvapas, formuojasi reaktyvūs vandenilio peroksidai, kurie neigiamai veikia sveikatą [57]. 15

Greita maisto riebalų oksidacija, skatina mokslininkus ieškoti būdų, kaip sustabdyti maisto senėjimą ir jį praturtinti natūraliais antioksidantais. Vis plačiau nagrinėjamas eterinių aliejų panaudojimas maisto pramonėje kaip veiksmingas būdas siekiant išvengti riebalų oksidacijos. Rozmarino, vynuogių odelių, žaliosios arbatos, kavos, baltojo pipiro EA turėjo teigiamą antioksidacinį poveikį kiaulienos kotletams, kurie buvo laikyti vakuuminėje pakuotėje, 4,5 ºC temperatūroje 10 dienų [48]. 1 proc. žaliosios arbatos ir rozmarino EA antioksidacinis poveikis išliko net 30 dienų 4 ºC temperatūroje laikomoje virtoje kiaulienoje [79]. 10 proc. mirtų, rozmarino ir citrinžolės EA kombinacija sumažino lipidų oksidaciją jautienos muštiniuose 120 dienų, kai mėsa buvo laikoma -20 ºC [2]. Iš vynuogių kauliukų išskirtas EA itin efektyvus, net mažos jo koncentracijos (0,01 ir 0,02 proc.) gerina virtos jautienos antioksidacinius rodiklius 8 dienas, kai mėsa laikoma 4 C temperatūroje [60]. Shan ir kt. [63] panaudojo cinamono, raudonėlio, gvazdikėlių ir granatų EA kiaulienai. Visi minėti EA padidino lipidų stabilumą. Gvazdikėlių EA buvo pats efektyviausias kovojant su riebalų oksidacija žalioje kiaulienoje. Statistiškai reikšmingi spalvos pokyčiai buvo stebimi panaudojus visus EA ir juos palyginus su kontroliniais mėginiais. 1.5 Eterinių aliejų fungicidinis poveikis Kai kurie eterinių aliejų komponentai pasižymi natūraliu fungicidiniu poveikiu prieš grybelinius patogenus. Literatūroje nurodoma, kad karvakrolis, timolis, cinamono aldehidas ir euganolis efektyviai slopina per maistą plintančius patogeninius grybus, įskaitant Aspergillus niger, Aspergillus flavus ir Aspergillus parasiticus [16, 59]. Boyraz ir Ozcan [8] ištyrė, kad dašio eteriniame aliejuje esantis timolis ir karvakrolis, efektyviai slopinana mikromicetus Alternaria ir Otrytis. Veikiant eteriniams aliejams efektyviai slopinamas micelio augimas, didėjant koncentracijai mikromicetų atžvilgiu pasireiškia ir fungicidinis efektas. Tuo tarpu iš gvazdikėlių ir čiobrelių eterinių aliejų išgautas eugenolis, timolis, karvakrolis ir q-cimenas veiksmingai slopiną mielių ir pelėsių augimą mėsos žaliavoje ir jos produktuose [72]. 1.6 Eterinių aliejų panaudojimo trūkumai Nors EA pasižymi stipriu antibakteriniu, antigrybeliniu ir antioksidaciniu poveikiu, jų panaudojimas maisto pramonėje turi tam tikrų apribojimų. EA efektyvumui didelę reikšmę turi maisto sudėtis ir struktūra [67]. Pastebėti žymūs EA aktyvumo skirtumai, skirtinguose mėsos produktuose. Nustatyta, jei in vitro metodu EA yra efektyvus prieš tam tikrą mikroorganizmą, maisto produkte jis 16

gali tapti neefektyviu. Manoma, kad riebalai, angliavandeniai, baltymai ir druskos koncentracija keičia EA aktyvumą [10, 12]. Pavyzdžiui, mėtų ir kalendros EA buvo neefektyvūs prieš L. monocytogenes tokiuose maisto produktuose, kurie pasižymi dideliu riebalų kiekiu (paštetai, kumpeliai) [24]. Taip pat sunku užtikrinti EA kokybę, nes gali skirtis EA dalių cheminė kompozicija. Cheminei EA dalių kompozicijai įtakos turi keletas faktorių: derliaus nuėmimo metas, augalo rūšis, gali skirtis aliejui išskirti naudojamos augalo dalys (gali būti naudojami lapai, žiedai, stiebai, šaknys, žievė ir kt.) [10, 31]. Mokslininkai pranešė, kad EA efektyvumui įtakos daro maisto produkto ph, temperatūra [31, 58] ir mikrobinio užterštumo lygis [70]. Kita problema, EA turi būti vartojami pakankamai koncentruoti, kad būtų užtikrintas jų antibakterinis aktyvumas. Aštrūs, pagardinti žolelėmis ir prieskoniais, mėsos gaminiai dažniausiai nėra papildomai paveikiami EA, nes baiminamasi, kad suprastės organaleptinės maisto savybės [31]. Naujausiuose moksliniuose darbuose tiriama, kaip būtų galima plačiau panaudoti EA maisto pramonėje. Pavyzdžiui, kaip alternatyva mėsos imersijai į EA, galėtų tapti valgomieji mėsos produktų dangalai, kuriuose būtų inkorporuoti lakieji EA komponentai [61]. Tačiau tokie tyrimai yra brangūs, todėl dažniau naudojamos mažesnės koncentracijos EA. Mažesnių koncentracijų EA galėtų būti panaudojami su kitais antibakteriniu poveikiu pasižyminčiais komponentais, jų sinerginis veikimas užtikrintų pakankamą antibakterinį apsaugos lygį [47]. 17

2. MEDŽIAGOS IR METODAI 2.1 Tyrimo laikas ir vieta Baigiamasis magistro darbas,,eterinių aliejų komponentų panaudojimas vištienos kokybės gerinimui buvo atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universitete Veterinarijos akademijoje (LSMU VA), Maisto saugos ir kokybės katedros laboratorijoje 2014-2015 metais. 2.2 Medžiagos Tyrimo objektas smulkina vištiena. Buvo perkama 0,5 kg sveriamos, laikomos aerobinėmis sąlygomis, smulkintos vištienos. Pirkta smulkinta vištiena buvo be pridėtinio vandens ir prieskonių. Ženklinimo etiketėje nebuvo nurodyta specifinė vištienos skerdenų dalis, iš kurios buvo gauta smulkinta vištiena. Smulkintos vištienos spalva buvo gan šviesi, minėta smulkinta vištiena riebi. Tyrimo metu naudota: linalolis (Sigma-Aldrich), timolis (Sigma-Aldrich), dihidrokvercetinas (DHK), pieno rūgštis (PR), mccda agaras (REF 610130, Liofilchem, Italy), Bolton sultinys (REF 611014, Liofilchem, Italy), CHROM selektyvioji terpė (REF 4012992, Biolife, Italy), Entero pluri Test testas (Liofilchem, Italija), SCF selektyvioji terpė (REF 610203, Liofilchem, Italy), mitybinė terpė (PCA-angl. Plate count agar). 2.3 Mėginiai naudoti tyrimui Smulkintos vištienos mėginiai buvo suskirstyti į 5 grupes. Pasirinkti eterinių aliejų komponentai timolis ir linalolis. Remiantis literatūros analize, timolio ir linalolio įtaką mėsos kokybės rodikliams, nuspręsta nagrinėti kartu su pieno rūgštimi (PR) ir antioksidantu dihidrokvercetinu (DHK). Mėginių koncentracijos buvo pasirinktos remiantis literatūros apžvalga bei ankstesnių tyrimų juslinėmis analizėmis. Smulkintos vištienos mėginiai 0,5% PR 0,5% PR 0,024% DHK 0,5% PR 0,024% DHK 0,03% timolis 0,5% PR 0,024% DHK 0,03% linalolis Kontrolė 3 pav. Mėginiai naudoti tyrimui 18

2.4 Tyrimo schema Mikrobiologinių rodiklių įvertinimas Campylobacter spp., E. coli, mielių ir pelėsių, bendro aerobinių bakterijų skaičiaus pokyčio vertinimas Smulkintos vištienos mėginiai Fiziko-cheminių rodiklių įvertinimas Spalvos intensyvumo ir aktyviojo rūgštingumo ph analizė Juslinė analizė Juslinių savybių profilio testas, priimtinumo vertinimas 4 pav. Tyrimo schema 2.4.1 Mikrobiologinių rodiklių nustatymas Campylobacter spp. buvo išskiriamos iš smulkintos vištienos tiesiogiai sėjant ant mccda agaro (REF 610130, Liofilchem, Italy) ir atlikus pagausinimą Bolton sultinyje (REF 611014, Liofilchem, Italy). Į selektyvias mccda terpes buvo pasėta po 0,1 ml mėginio. Užsėtos lėkštelės buvo inkubuojamos 37 C temperatūroje 48 valandas mikroaerofilinėmis sąlygomis (10% CO2, 85% N2 ir 5% O2). Po inkubavimo buvo atrenkamos mccda lėkštelės su būdingomis kolonijomis. Iš kiekvienos lėkšteles buvo atrenkama iki 2 būdingų kampilobakterijoms kolonijų ir persėjama į lėkšteles su kraujo agaru (5 % arklio kraujo) ir inkubuojama 37 C 48 val. Kiekvienas mėginys atitinkamai buvo pagausinamas Bolton sultinyje. Į sterilius mėgintuvėlius su 9 ml selektyviu Bolton pagausinimo sultiniu buvo įdedama po 1 g mėginio. Maišeliai su pagausinimo sultiniu buvo inkubuojami mikroaerofilinėmis sąlygomis, 42 C temperatūroje 24 valandas. Po inkubavimo 0,1 ml pagausinimo sultinio buvo sėjama į lėkšteles su mccda agaru. Preliminarus kampilobakterijų nustatymas ir išgryninimas atliekamas taip pat kaip buvo aprašyta anksčiau. Nustatant Escherichia coli skaičių tiriamo mėginio 0,1 ml pradinės suspensijos buvo sėjama į Petri lėkšteles su CHROM selektyviąja terpe (REF 4012992,, Biolife, Italy) ir kultivuojama 37 ºC temperatūroje, 24 valandas. Praėjus kultivavimo laikui, lėkštelės buvo išimamos iš termostato ir įvertinamos išaugusios kolonijos. E. coli bakterijos šioje terpėje išauga sudarydamos žalias kolonijas. 19

Charakteringos kolonijos dažomos pagal Gramą ( Diagnostika Merck, Vokietija) ir mikroskopuojamos. Enterobakterijų biocheminėms savybėms tirti buvo taikytas Entero pluri Test testas (Liofilchem, Italija). Nustatant bendrą mielių ir pelėsių skaičių 1,0 ml pradinės suspensijos buvo sėjama į Petri lėkšteles su SCF selektyviąja terpe (REF 610203, Liofilchem, Italy) ir dedamos kultivuoti 25 ºC temperatūroje, 5 paras. Bendras aerobinių kolonijų skaičius buvo nustatomas, atliekant dešimtkarčius skiedimus ir kultivuojant mikroorganizmus ant mitybinės terpės (PCA-angl. Plate count agar) 30 ºC, 72 val. pasirinktų eterinių aliejų komponentų ir pieno rūgšties ir dihidrokvercitino poveikis vertintas po 24, 48 ir 72 val. 2.4.2 Aktyviojo rūgštingumo ph nustatymas Tirta pagal ISO 2917:1999 standartinį metodą. Šio rodiklio vidutinė reikšmė ir standartinis nuokrypis buvo apskaičiuoti iš trijų matavimų. 2.4.3 Spalvos intensyvumo matavimas Mėginių spalvingumas nustatytas vienodo kontrasto spalvų erdvėje, išmatavus spalvos charakteristikas spektrofotometru CHROMA METER CR-400 (Kronica Minolta, INC., Japan). Šviesos atspindžio režime matuoti parametrai L*, a*, b* (atitinkamai šviesumas, raudonumo ir geltonumo koordinatės pagal CIELAB skalę). 2.4.4 Juslinės kokybės įvertinimas Juslinėms savybėms įvertinti taikytas juslinių savybių profilio testas. Jį atlieka apmokyta vertintojų grupė, analizuojanti iš anksto atrinktus mėginius ir parenkanti sąvokas (sudaro žodyną) juslinėms savybėms apibūdinti. Parinktos ir aptartos skalės tų savybių intensyvumui įvertinti. Visų produktų kiekvienos savybės intensyvumas vertintas atskiroje skalėje. Pagal šiuos duomenis, taikant matematinės statistikos metodus, kiekvienam produktui sudarytas juslinių savybių profilis, rodantis kiekvienos savybės intensyvumą. Tyrimų eigoje, aptariant atrinktas juslines savybes ir jas apibūdinančias sąvokas, visoms produktų grupėms nustatyta savybių pajautimo ir suvokimo seka: 1 kvapą apibūdinančios savybės; 2 spalvą bei išvaizdą apibūdinančios savybės; 3 tekstūra, pajaučiama burnoje; 20

4 skonis; 5 savybės, apibūdinančios liekamąjį skonį. Juslinę aprašomąją analizę atliko šešių vertintojų grupė. Jų amžius tarp 23 ir 42 metų. Vertintojai atrinkti ir apmokyti dirbti pagal LST ISO 8586-1, jie turėjo praktinių įgūdžių vertinti mėsos produktus, taikant aprašomosios analizės metodus. Vertinimas buvo uždaras, atliktas pagal LST ISO 8589 reikalavimus įrengtose LSMU VA Juslinės analizės laboratorijoje. Skonio receptoriams atgauti naudota puskvietinė duona, bekvapis, beskonis vanduo bei šilta silpna, nesaldinta arbata. Sudarant juslinių savybių profilį, naudotas visiškai subalansuotas atsitiktinis mėginių pateikimo planas, mėginiai vertinti tris kartus. Kiekvienoje sesijoje pateikti vertinti ne daugiau kaip trys mėginiai. Tada vertintojų grupė darė 15 min. pertrauką, po kurios mėginiai vertinti toliau. Juslinių savybių intensyvumas vertintas 5 balų skaitmenine skale. Tiriamųjų produktų priimtinumas įvertintas emociniu testu pagal analogišką 5 balų skaitmeninę skalę. 2.5 Statistinė duomenų analizė Statistinė duomenų analizė buvo atlikta, naudojant MS Excell programinį paketą. Analizuojant duomenis buvo apskaičiuota tiriamų rodiklių vidutinės vertės, standartiniai nuokrypiai, poriniu t-testu skirtumų patikimumo lygmuo (p), koreliacijos koeficientas (R). Skirtumas tarp duomenų laikomas statistiškai reikšmingu, kaip p 0,05. 21

Log10 KSV/g 3. TYRIMO REZULTATAI 3.1 Timolio ir linalolio poveikis smulkintos vištienos mikrobiologiniams rodikliams Tyrimo metu buvo siekiama ištirti eterinių aliejų komponentų, timolio ir linalolio, poveikį Campylobacter spp. bakterijoms. Ištyrus eksperimentui atrinktą smulkintos vištienos žaliavą, Campylobacter spp. nebuvo rasta, todėl tolimesni tyrimai, siekiant išsiaiškinti timolio ir linalolio poveikį Campylobacter spp., nebuvo atlikti. Įvertinus bendrą aerobinių bakterijų skaičių nustatyta (žiūrėti 5 pav.), kad smulkintos vištienos mėginiuose, kurių sudėtyje buvo timolio (mėginys Nr. 3) ir PR (mėginys Nr. 1) statistiškai patikimai sumažėjo bakterijų skaičius, lyginant su kontroliniu mėginiu (p<0,05). Mažiausias bendras bakterijų skaičius po 24 ir 72 val. nustatytas mėginyje su 0,5 proc. PR 0,024 proc. DHK ir 0,03 proc. timolio (mėginys Nr. 3), tačiau po 48 val. bendras bakterijų skaičius ženkliai padidėjo, lyginant su efektu nustatytu po 24 val. Pastebėta, kad su laiku bendras bakterijų skaičius nuolat didėjo kontroliniame mėginyje (Nr. 5), o nuolat mažėjo mėginyje su PR (Nr. 1). 7,70 7,60 7,50 7,40 7,30 7,20 7,10 7,00 6,90 6,80 24 48 72 Laikas, val Nr.1 0,5% PR Nr.2 0,5% PR+0,024% DHK Nr.3 0,5% PR+0,024% DHK+0,03% timolis Nr.4 0,5% PR+0,024% DHK+0,03% linalolis Nr.5 Kontrolė 5 pav. Bendro bakterijų skaičiaus pokytis Vertinant E. coli skaičių pastebėta (žiūrėti 6 pav.), kad po 24 valandų visuose mėginiuose buvo rasti nedideli kiekiai E. coli (2,69 3,15*10-2 KSV/g), tačiau praėjus 48 val. E. coli nustatyta tik mėginyje su PR (mėginys Nr. 1), o po 72 val. tik kontroliniame smulkintos vištienos mėginyje (Nr. 5). Nustatyta, kad smulkintos vištienos mėginiuose, kurie buvo paveikti mišiniu su timoliu ir mišiniu su linaloliu statistiškai patikimai sumažėjo E. coli kiekis (mėginiai Nr. 3 ir Nr. 4, p<0,05). 22

Log10 KSV/g Log10 KSV/g 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 Nr.1 0,5% PR Nr.2 0,024% DHK 0,5% PR Nr.3 0,024% DHK 0,5% PR 0,03% timolio Nr.4 0,024% DHK 0,5% PR 0,03% linalolio Nr.5 Kontrolė 1,00 24 48 72 Valandos 6 pav. E. coli skaičiaus pokytis Koliforminių bakterijų pokyčio analizėje ryškaus skirtumo tarp mėginių nenustatyta (žiūrėti 7 pav.). Mažiausias koliforminių bakterijų skaičius po 24 val. buvo smulkintos vištienos mėginyje, kuris buvo paveiktas mišiniu su timoliu (mėginys Nr. 3), po 48 val. smulkinta vištiena, paveikta mišinio su linaloliu (mėginys Nr. 4), po 72 val. smulkinta vištiena paveikta tik PR (Nr. 1). 7,00 6,00 Nr.1 0,5% PR 5,00 Nr.2 0,024% DHK 0,5% PR 4,00 3,00 2,00 Nr.3 0,024% DHK 0,5% PR 0,03% timolio Nr.4 0,024% DHK 0,5% PR 0,03% linalolio Nr.5 Kontrolė 1,00 0,00 24 48 72 Laikas, val. 7 pav. Koliforminių bakterijų skaičiaus pokytis 23

Log10 KSV/g Ryškesnis mielių skaičiaus pokyčio skirtumas nustatytas po 72 val. (žiūrėti 8 pav.). Praėjus 3 paroms mažiausias bakterijų skaičius nustatytas smulkintos vištienos mėginyje, paveiktoje mišinio su timoliu (mėginys Nr. 3) šis pokytis buvo statistiškai reikšmingas lyginant su kontroliniu mėginiu (Nr. 5) (p<0,05). Gausiausias mielių skaičius po 72 val. nustatytas smulkintos vištienos mėginyje, kuris buvo paveiktas linaloliu (mėginys Nr. 4). Pastaba: tiriamoje žaliavoje nebuvo nustatyta pelėsių, tad tolimesni tyrimai nebuvo atliekami. 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 Nr.1 0,5% PR Nr.2 0,024% DHK 0,5% PR Nr.3 0,024% DHK 0,5% PR 0,03% timolio Nr4. 0,024% DHK 0,5% PR 0,03% linalolio Nr.5 Kontrolė 1,00 0,00 24 48 72 Laikas, val. 8 pav. Mielių skaičiaus pokytis 3.2 Smulkintos vištienos aktyviojo rūgštingumo ph pokytis Mėginiuose, kurie buvo paveikti EA komponentais timoliu ir linaloliu (mėginiai Nr. 3 ir Nr. 4), pastebėtas statistiškai reikšmingas ph skirtumo pokytis (atitinkamai p<0,01 ir p<0,001, žiūrėti 3 lentelę). Aukščiausias ph po 24 val., po 48 val. ir po 72 val. fiksuotas smulkintos vištienos kontroliniame mėginyje (mėginys Nr. 5), žemiausias mėginyje su linaloliu ir timoliu per visą minėtą laiko tarpą (mėginiai Nr. 3 ir Nr. 4). Prieš atliekant eksperimentą, pamatuotas žaliavos ph 6,3 (±0,72). 24

3 lentelė. Smulkintos vištienos aktyviojo rūgštingumo ph pokytis per laiko tarpą. Mėginio Nr. Mėginys 24 val. 48 val. 72 val. 1 0,5% PR 5,47 (±0,08) 5,62 (±0,15) 5,86 (±0,12) 2 0,5% PR 5,79 (±0,02) 5,80 (±0,02) 6,13 (±0,12) 0,024% DHK 3 0,5% PR 5,71 (±0,06) 5,57 (±0,03) 5,58 (±0,01) a 0,024% DHK 0,03% timolio 4 0,5% PR 0,024% DHK 0,03% linalolio 5,37 (±0,01) 5,31 (±0,07) 5,54 (±0,03) b 5 Kontrolė 5,89 (±0,06) 5,92 (±0,01) 6,13 (±0,10) ab a p<0,01 ir b - p<0,001 3.3 Smulkintos vištienos spalvos intensyvumo analizė Instrumentiniu būdu įvertinus žalios smulkintos vištienos spalvos intensyvumą (žiūrėti 4 lentelę), nustatyta, kad šviesiausias mėginys su timoliu (L* 72,53 (±0,81), mėginys Nr. 3), kuris statistiškai reikšmingi skyrėsi nuo kontrolinio mėginio (Nr. 5) ir nuo pirmojo mėginio su 0,5 proc. PR (p<0,05). Vertinant mėginių raudonumą (a*), rausviausias mėginys buvo paveiktas timoliu (mėginys Nr. 3), tačiau statistiškai reikšmingo skirtumo su kitais mėginiais nenustatyta (p>0,05). Tirtas mėginių gelsvumas (b*) parodė, kad mėginys su timoliu (mėginys Nr. 3) reikšmingai skyrėsi nuo kontrolinio mėginio (p<0,05). 4 lentelė. Žalios smulkintos vištienos spalvos intensyvumas 9,05 Mėginio Nr. Mėginys L* a* b* 1 64,16 8,76 0,5% PR (±2,22) a (±0,79) 12,66 (±3,04) 2 7,77 0,5% PR+0,024%DHK 66,42 (±0,91) (±0,36) 11,77 (±0,77) 3 0,5% PR+0,024%DHK+0,03% 72,53 14,74 timolis (±0,81) a (±1,18) (±0,65) b 4 0,5% PR+0,024%DHK+0,03% 7,76 linalolis 70,96 (±2,23) (±0,19) 12,87 (±1,00) 5 66,55 5,60 Kontrolė (±2,98) a (±1,56) 9,50 (±1,79) b (a ir b p<0,05) 3.4 Smulkintos vištienos juslinė analizė Vertintojai nusprendė, kad sultingiausia virta smulkinta vištiena buvo su linaloliu (mėginys Nr. 4), surinkusi 5 balus, mažiausiai sultingas buvo kontrolinis vištienos mėginys (Nr. 5, žiūrėti 9 25

pav.). Mėginys su linaloliu (Nr. 4) pasižymėjo intensyviu liekamuoju skoniu (4 balai) bei pašaliniu kvapu (3 balai). Bendrasis skonio intensyvumas palankiausiai įvertintas taip pat mėginio su linaloliu (5 balai, mėginys Nr. 4)). Pastebima, kad nei vienas mėginys nebuvo įvertintas kaip turintis kartumo. Mėginiai su EA komponentai buvo įvertinti kaip mėginiai turintys pašalinį kvapą (mėginiai Nr. 3 ir Nr. 4, atitinkamai 2 ir 3 balai), tačiau bendro skonio intensyvumui pašalinis kvapas įtakos neturėjo. Pašalinis kvapas Bendras skonio intensyvumas 5 4 3 2 Liekamojo skonio intensyvumas Nr.1 0,5% PR Nr.2 0,5% PR+ 0,024 DHQ Kartumas Sultingumas 1 0 Pašalinio skonio intensyvumas Rūgštaus skonio intensyvumas Nr.3 0,5% PR + 0,024 DHQ + Tymol Nr.4 0,5% PR+0,024DHQ+Li nalol Nr.5 Kontrolė Bendras kvapo intensyvumas 9 pav. Virtos smulkintos vištienos juslinė analizė Degustatorių buvo paprašyta įvertinti minėtų mėginių priimtinumą (žiūrėti 10 pav.). Didžiausias vertintojų palankumas buvo mėginiams su EA komponentais timoliu ir linaloliu (mėginiai Nr. 3 ir Nr. 4, atitinkamai 5 ir 4 balai iš 5 galimų). Prasčiausiai įvertintas kontrolinis mėginys (Nr. 5), bei mėginys su PR (mėginys Nr. 1). 26

Priimtinumo balas 5 4 3 2 1 0 2 3 5 Mėginiai 4 2 Nr.1 0,5% PR Nr.2 0,5% PR+0,024%DHK Nr.3 0,5% PR+0,024%DHK+0,03% timolis Nr.4 0,5% PR+0,024%DHK+0,03% linalolis Nr.5 Kontrolė 10 pav. Mėginių priimtinumo įvertinimas Asmenys, dalyvavę jusliniame tyrime, mėginius su linaloliu (mėginys Nr. 4) ir mėginius su timoliu (mėginys Nr. 3) įvertino palankiausiai, nors šie mėginiai turėjo pašalinį kvapą (vertintojai teigė, jog ragaudami minėtus mėginius užuodė švelnų, malonų čiobrelio ir levandų kvapą). 27

4. REZULTATŲ APTARIMAS Vištiena vienas populiariausių baltymų šaltinių, pasižymintis švelnia raumenine struktūra, mažu kaloringumu, tačiau beveik pusė visos vištienos skerdenų yra užkrėsta. Vištiena dažnai siejama su Campilobacter spp., Salmonella spp., Listeria spp. bakterijomis. Smulkinta mėsa, o ypač vištiena, turi padidintą riziką mikrobiologinei taršai, nes smulkinant mėsą yra pažeidžiamos raumeninės skaidulų membranos, ląstelių turinys išsilieja ir tampa itin palankia terpe mikroorganizmams daugintis, o potencialiai labiau užteršti skerdenų paviršiai yra sumalami į vientisą masę [39]. Mikrobiologinis užterštumas vienas iš esminių rodiklių, tiesiogiai parodantis vartojamo produkto kokybę. Atliekant tyrimą buvo norima ištirti kokį poveikį mikrobiologiniams rodikliams daro eterinių aliejų (EA) komponentai timolis ir linalolis. Buvo tiriamas Campylobacter spp., E. coli, mielių ir pelėsių, bendro aerobinių bakterijų skaičiaus pokytis smulkintos vištienos mėginius paveikus 0,5 proc. PR (mėginys Nr. 1); 0,5 proc. PR + 0,024 proc. dihidrokvercitinu (DHK) (mėginys Nr. 2); 0,5 proc. PR + 0,024 proc. DHK + 0,03 proc. timolio (mėginys Nr. 3); 0,5 proc. PR + 0,024 proc. DHK + 0,03 proc. linalolio (mėginys Nr. 4) ir kontrole (mėginys Nr. 5). Poveikis buvo tiriamas po 24, 48 ir 72 val. Įvertinus bendrą aerobinių bakterijų skaičių po 72 val. nustatyta, kad smulkintoje vištienoje, kuri buvo paveikta mišiniu su timoliu, statistiškai reikšmingai sumažėjo bendras bakterijų skaičius lyginant su kontroliniu mėginiu. Verta paminėti, kad ne tik smulkintos vištienos mėginys su timoliu, o taip pat ir smulkinta vištiena, kuri buvo paveikta tik PR, turėjo statistiškai reikšmingos įtakos bendram aerobinių bakterijų skaičiaus mažėjimui (p<0,05). Tačiau, praėjus 24 val. po smulkintos vištienos paveikimo PR, bendras aerobinių bakterijų skaičiaus pokytis buvo nežymus, priešingai nei smulkintos vištienos su timoliu. Linalolis taip pat mažino bendrą aerobinių bakterijų skaičių, tačiau statistiškai reikšmingo skirtumo nebuvo nustatyta (p>0,05). Itin ženklus biologiškai aktyvių medžiagų poveikis buvo nustatytas tiriant E. coli skaičiaus pokytį. Smulkintos vištienos kontroliniame mėginyje nuolat buvo fiksuotas E. coli augimas, o smulkintoje vištienoje su timoliu ir linaloliu E. coli po 48 ir po 72 val. nebuvo nustatyta. Lyginant tarpusavyje smulkintos vištienos mėginius su timoliu ir linaloliu po 24 val., didesnį efektą E. coli skaičiaus mažėjimui turėjo timolis, nei linalolis, tačiau statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta (p>0,05). 28

Koliformninės bakterijos yra švaros indikatorius, dažniausiai parodantis fekalinę taršą [77]. Koliforminių bakterijų pokyčio analizėje žymaus skirtumo tarp smulkintos vištienos mėginių nebuvo nustatyta. Ryškesnis skirtumas matomas tik po 24 val., kada mažiausias bakterijų skaičius nustatytas smulkintoje vištienoje, paveiktoje mišiniu su timoliu ir mišiniu su linaloliu, tačiau statistiškai reikšmingo skirtumo su kontroliniu smulkintos vištienos mėginiu nebuvo rasta (p>0,05). Koliforminių bakterijų grupei priklauso ir E. coli, tačiau panašus efektas bakterijų skaičiaus pokyčiui neužfiksuotas, veikiausiai todėl, kad E.coli nebuvo dominantinė rūšis koliforminių bakterijų grupėje. Ryškesnis mielių skaičiaus pokyčio skirtumas nustatytas po 72 val. Praėjus 3 paroms mažiausias mielių skaičius nustatytas smulkintoje vištienoje, kuri buvo paveikta mišinio su timoliu, šis pokytis buvo statistiškai reikšmingas lyginant su kontroliniu mėginiu ir smulkinta vištiena, kurios mišinyje buvo linalolio (p<0,05). Priešingai, nei buvo manyta, gausiausias mielių skaičius po 72 val. buvo nustatytas ne kontroliniame mėginyje, o smulkintoje vištienoje, paveiktoje mišiniu su linaloliu. Kitų mokslininkai teigia, kad linalolis pasižymi itin aktyviu antibakteriniu poveikiu, tačiau mėsos savybės taip pat yra labai svarbios ir kartais skirtingai mėsai ir skirtingoms bakterijų rūšims vertėtų naudoti kitus EA komponentus arba padidinti komponentų koncentracijas [10]. Fizikiniai ir cheminiai rodikliai tokie kaip ph itin svarbūs norint užtikrinti maisto saugą. Parūgštinus aplinką, sudaromos nepalankios sąlygos mikroorganizmams daugintis. Šiame tyrime buvo naudojama pieno rūgštis, kuri neabejotinai sumažino smulkintos vištienos ph, tačiau statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas tarp kontrolinio mėginio ir smulkintos vištienos, paveiktos mišiniu su linaloliu (p<0,01) bei tarp kontrolinio mėginio ir smulkintos vištienos, paveiktos mišiniu su timoliu (p<0,001). Dar kartą tenka pripažinti, jog egzistuoja sinerginis biologiškai aktyvių medžiagų veikimas, kuris yra efektyvesnis už pavienių medžiagų poveikį [34, 45]. Spalvinio intensyvumo pokyčiai fiksuoti smulkintoje vištienoje, paveiktoje mišinio su timoliu. Smulkinta vištiena su timoliu skyrėsi nuo kontrolinio mėginio savo šviesumu, bei gelsvumu (p<0,05). Ne vienas autorius pažymi, kad linalolis, o ypatingai timolis, pasižymi dideliu antioksidaciniu aktyvumu. Atioksidacinis aktyvumas stabdo riebalų oksidaciją, tad mėsos spalvos išlieka ryškesnės [57]. Šio tyrimo atveju, fiksuotas nedidelis spalvos pokytis. Spalvos intensyvumas matuotas praėjus 24 val., nuo smulkintos vištienos mėginių apdorojimo. Tyrimo metu buvo naudojami išgryninti EA komponentai, tačiau naudojant EA, kuriuose yra visi EA komponentai, galimas ir natūralių dažančių medžiagų buvimas, tad spalvos pokyčiai tikėtinai galėtų būti didesni. Įvertinus smulkintos vištienos ph ir spalvos intensyvumą, nuspręsta atlikti koreliacijų tyrimą (žiūrėti 1 priedą). Nustatyta vidutinio stiprumo tiesinė koreliacija tarp smulkintos vištienos, paveiktos 29

mišiniu su timoliu (R=0,55), o tarp smulkintos vištienos, paveiktos mišiniu su linaloliu, rasta stipri atvirkštinė koreliacija (R=-0,97). Galima daryti prielaidą, kad kuo ph yra mažesnis, tuo vištiena su timolio mišiniu yra tamsesnė, o kuo mažesnis smulkintos vištienos ph su linaloliu, tuo vištiena tampa šviesesne. Juslinė analizė, kad būtų kiek įmanoma objektyvesnė, buvo atliekama griežtai prisilaikant LST ISO 8589 reikalavimų. Pirmiausia, vertintojai atkreipė dėmesį į smulkintos vištienos kvapą. Intensyviausiu bendru ir pašaliniu kvapu pasižymėjo smulkinta vištiena, paveikta mišiniu su timoliu ir mišiniu su linaloliu, atitinkamai surinkusi 4 ir 5 bei 4 ir 3 balus. Kontrolinio mėginio bendras kvapo intensyvumas buvo įvertintas prasčiausiai (2 balai), tačiau šiuose smulkintos vištienos mėginiuose pašalinio kvapo vertintojai neužuodė (0 balų). Sultingiausia smulkinta vištiena buvo paveikta mišiniu su timoliu ir mišiniu su linaloliu (atitinkamai 4 ir 5 balai), kai kontrolinis mėginys buvo įvertintas 3 balais. Tiek bendro skonio intensyvumas, tiek liekamojo skonio intensyvumas geriausiai įvertintas smulkintoje vištienoje su timoliu (4 balai) ir smulkintoje vištienoje su linaloliu (5 balai). Šiame tyrime buvo naudotas itin mažos EA komponentų koncentracijos, tad vertintojai nepastebėjo smulkintos vištienos, paveiktos timoliu ir linaloliu, kartumo (0 balų). PR koncentracija naudota taip pat nedidelė, tad didžiausias rūgštingumas siekė vos 2 balus. Degustatorių buvo paprašyta įvertinti smulkintos vištienos priimtinumą. Labiausiai priimtina smulkinta vištiena, paveikta mišinio su timoliu (5 balai) ir mišinio su linaloliu (4 balai). Mažiausiai priimtina smulkinta vištiena, kuri nebuvo paveikta jokiomis biologiškai aktyviomis medžiagomis, bei vištiena, paveikta tik PR, surinkusi po 2 priimtinumo balus. Tokį priimtinumo pasiskirstymą galima būti sieti su tuo, kad smulkinta vištiena, paveikta mišinio su timoliu ir mišinio su linaloliu, vertintojams buvo pati sultingiausia, o skonis intensyviausias. 30

IŠVADOS 1. Eterinių aliejų komponentas timolis patikimai sumažino E. coli skaičių (p<0,05), o bendram bakterijų skaičiaus pokyčiui smulkintoje vištienoje įtakos turėjo ir timolis, ir linalolis (p<0,05). Nebuvo nustatyta statistiškai reikšmingo koliforminių bakterijų bei mielių augimo pokyčio smulkintoje vištienoje, veikiant biologiškai aktyvioms medžiagoms (p>0,05). 2. Efektyviausias smulkintos vištienos ph sumažėjimas buvo fiksuojamas tuose mėginiuose, kurie buvo paveikti timoliu ir linaloliu (p<0,05). 3. Su timoliu paveikti smulkintos vištienos mėginiai savo spalvos intensyvumu statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo kontrolinio mėginio, pastarasis buvo tamsesnis (p<0,05). Rasta vidutinio stiprumo tiesinė koreliacija tarp ph ir šviesumo smulkintos vištienos mėginių, kurie buvo paveikti timoliu (R=0,55) ir stipri atvirkštinė koreliacija tarp minėtų rodiklių ir smulkintos vištienos, paveiktos linaloliu (R=-0,97). 4. Vertintojams jusliškai priimtiniausi smulkintos vištienos mėginiai su linaloliu, kiek prasčiau įvertintas mėginys su timoliu, prasčiausiai kontrolinis mėginys. Smulkinta vištiena paveikta mišiniu su linaloliu bei mišiniu su timoliu buvo sultingesnė, pasižymėjo geresniu bendru skoniu ir jo intensyvumu. 5. Apibendrinus tyrimo rezultatus, kuriuose matomas mišinių su timoliu ir linaloliu reikšmingas E. coli, bendro aerobinių bakterijų skaičiaus ir ph mažėjimas, šviesumo bei smulkintos vištienos sultingumo padidėjimas, siūlyčiau timolį ir linalolį, naudojant kartu su kitomis biologiškai aktyviomis medžiagomis, taikyti smulkintos vištienos apdorojimui. 31