Jurgita Gaubaitė

Transkriptas

1 Jurgita Gaubaitė 5 kursas, 12 grupė ANTIBAKTERINIŲ SKALAVIMO SKYSČIŲ POVEIKIS BURNOS GRYBELINIŲ LIGŲ SUKĖLĖJAMS. IN VITRO TYRIMAS Baigiamasis magistrinis darbas Darbo vadovas: Dr. Inga Vaitkevičienė Kaunas, 2017

2 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA ODONTOLOGIJOS FAKULTETAS DANTŲ IR BURNOS LIGŲ KLINIKA ANTIBAKTERINIŲ SKALAVIMO SKYSČIŲ POVEIKIS BURNOS GRYBELINIŲ LIGŲ SUKĖLĖJAMS. IN VITRO TYRIMAS Baigiamasis magistrinis darbas Darbą atliko magistrantė... Darbo vadovas:... Jurgita Gaubaitė V k., 12 gr. Dr. Inga Vaitkevičienė 2017 m...mėn...d m...mėn...d. Kaunas, 2017

3 KLINIKINIO-EKSPERIMENTINIO BAIGIAMOJO MAGISTRINIO DARBO VERTINIMO LENTELĖ Įvertinimas:... Recenzentas:... (moksl. laipsnis, vardas, pavardė) Recenzavimo data:... Eil. Nr. BMD dalys BMD vertinimo aspektai BMD reikalavimų atitikimas ir įvertinimas Taip Iš dalies Ne Ar santrauka informatyvi ir atitinka darbo 1. 0,2 0,1 0 turinį bei reikalavimus? Santrauka Ar santrauka anglų kalba atitinka darbo 2. (0,5 balo) 0, turinį bei reikalavimus? 3. Ar raktiniai žodžiai atitinka darbo esmę? 0, Ar darbo įvade pagrįstas temos naujumas, Įvadas, tikslas aktualumas ir reikšmingumas? 0,4 0, uždaviniai Ar tinkamai ir aiškiai suformuluota (1 balas) problema, hipotezė, tikslas ir uždaviniai? 0,4 0, Ar tikslas ir uždaviniai tarpusavyje susiję? 0,2 0,1 0 Ar pakankamas autoriaus susipažinimas su 7. kitų mokslininkų darbais Lietuvoje ir 0,4 0,2 0 pasaulyje? Ar tinkamai aptarti aktualiausi kitų 8. Literatūros apžvalga (1,5 balo) mokslininkų tyrimai, pateikti svarbiausi jų rezultatai ir išvados? 0,6 0,3 0 Ar apžvelgiama mokslinė literatūra yra pakankamai susijusi su darbe nagrinėjama 0,2 0,1 0 problema? Ar autoriaus sugebėjimas analizuoti ir sisteminti mokslinę literatūrą yra 0,3 0,1 0 pakankamas?

4 11. Ar išsamiai paaiškinta darbo tyrimo metodika, ar ji tinka iškeltam tikslui? 0,6 0, Ar tinkamai sudarytos ir aprašytos imtys, tiriamosios grupės; ar tinkami atrankos 0,6 0,3 0 kriterijai? Medžiaga ir Ar tinkamai aprašytos kitos tyrimo metodai 13. medžiagos ir priemonės (anketos, vaistai, 0,4 0,2 0 (2 balai) reagentai, įranga ir pan.)? Ar tinkamai aprašytos statistinės programos, 14. naudotos duomenų analizei, formulės, 0,4 0,2 0 kriterijai, kuriais vadovautasi įvertinant statistinio patikimumo lygmenį? 15. Ar tyrimų rezultatai išsamiai atsako į iškeltą tikslą ir uždavinius? 0,4 0, Ar lentelių, paveikslų pateikimas atitinka reikalavimus? 0,4 0, Rezultatai Ar lentelėse, paveiksluose ir tekste kartojasi (2 balai) informacija? 0 0,2 0,4 18. Ar nurodytas duomenų statistinis reikšmingumas? 0,4 0, Ar tinkamai atlikta duomenų statistinė analizė? 0,4 0,2 0 Ar tinkamai įvertinti gauti rezultatai (jų 20. svarba, trūkumai) bei gautų duomenų 0,4 0,2 0 patikimumas? Ar tinkamai įvertintas gautų rezultatų Rezultatų 21. santykis su kitų tyrėjų naujausiais 0,4 0,2 0 aptarimas duomenimis? (1,5 balo) 22. Ar autorius pateikia rezultatų interpretaciją? 0,4 0,2 0 Ar kartojasi duomenys, kurie buvo pateikti 23. kituose skyriuose (įvade, literatūros 0 0,2 0,3 apžvalgoje, rezultatuose)? 24. Išvados Ar išvados atspindi baigiamojo darbo temą, (0,5 balo) iškeltus tikslus ir uždavinius? 0,2 0,1 0

5 25. Ar išvados pagrįstos analizuojama medžiaga; ar atitinka tyrimų rezultatus? 0,2 0, Ar išvados yra aiškios ir lakoniškos? 0,1 0, Literatūros sąrašas 29. (1 balas) 30. Ar bibliografinis literatūros sąrašas sudarytas pagal reikalavimus? 0,4 0,2 0 Ar literatūros sąrašo nuorodos į tekstą yra teisingos; ar teisingai ir tiksliai cituojami 0,2 0,1 0 literatūros šaltiniai? Ar literatūros sąrašo mokslinis lygmuo tinkamas moksliniam darbui? 0,2 0,1 0 Ar cituojami šaltiniai, ne senesni nei 10 metų, sudaro ne mažiau kaip 70 % šaltinių, o 0,2 0,1 0 ne senesni kaip 5 metų ne mažiau kaip 40 %? Papildomi skyriai, kurie gali padidinti surinktą balų skaičių Ar pateikti priedai padeda suprasti 31. Priedai nagrinėjamą temą? Praktinės Ar yra pasiūlyta praktinių rekomendacijų ir 32. rekomendacijos ar jos susiję su gautais rezultatais? +0,2 +0,1 0 +0,4 +0,2 0 Bendri reikalavimai, kurių nesilaikymas mažina balų skaičių p. <15 p. 33. Ar pakankama darbo apimtis (be priedų) (-2 (-5 balai) balai) 34. Ar darbo apimtis dirbtinai padidinta? -2 balai -1 balas Bendri reikalavimai Ar darbo struktūra atitinka baigiamojo darbo rengimo reikalavimus? -1 balas -2 balai Ar darbas parašytas taisyklinga kalba, -0,5 balo -1 balas moksliškai, logiškai, lakoniškai? Ar yra gramatinių, stiliaus, kompiuterinio -2 balai -1 balas raštingumo klaidų? Ar tekstui būdingas nuoseklumas, vientisumas, struktūrinių dalių apimties -0,2 balo -0,5 balo subalansuotumas?

6 39. Plagiato kiekis darbe >20 % (nevert.) Ar turinys (skyrių, poskyrių pavadinimai ir puslapių numeracija) atitinka darbo struktūrą ir yra tikslus? Ar darbo dalių pavadinimai atitinka tekstą; ar yra logiškai ir taisyklingai išskirti skyrių ir poskyrių pavadinimai? Ar buvo gautas (jei buvo reikalingas) Bioetikos komiteto leidimas? Ar yra (jei reikalingi) svarbiausių terminų ir santrumpų paaiškinimai? Ar darbas apipavidalintas kokybiškai (spausdinimo, vaizdinės medžiagos, įrišimo kokybė)? * Iš viso (maksimumas 10 balų): *Pastaba: surinktų balų suma gali viršyti 10 balų. -0,2 balo -0,5 balo -0,2 balo -0,5 balo -1 balas -0,2 balo -0,5 balo -0,2 balo -0,5 balo Recenzento pastabos:

7 Recenzento vardas, pavardė Recenzento parašas

8 TURINYS SANTRAUKA...9 SUMMARY...10 SANTRUMPOS...11 ĮVADAS LITERATŪROS APŽVALGA Burnos kandidomikozė Candida grybelių virulentiškumo veiksniai Veiksniai, lemiantys burnos kandidozės atsiradimą Burnos kandidozės gydymas TYRIMO MEDŽIAGOS IR METODAI Tiriamųjų atrankos kriterijai Candida rūšių identifikavimas Etaloninių Candida rūšių kultivavimas Candida rūšių suspensijų ruošimas Chlorheksidino digliukonato (CHD) 0,06 %, 0,12 %, 0,2 % tirpalų ruošimas Kultivavimo terpės ruošimas Statistinė duomenų analizė TYRIMO REZULTATAI Tiriamųjų charakteristika Antibakterinių skalavimo skysčių poveikio skirtingoms Candida rūšims palyginimas Skirtingų CHD koncentracijų poveikio Candida rūšims palyginimas REZULTATŲ APTARIMAS...38 IŠVADOS...40 PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS...41 LITERATŪROS SĄRAŠAS...42 PRIEDAI...46

9 ANTIBAKTERINIŲ SKALAVIMO SKYSČIŲ POVEIKIS BURNOS GRYBELINIŲ LIGŲ SUKĖLĖJAMS. IN VITRO TYRIMAS SANTRAUKA Problemos aktualumas ir darbo tikslas. Apie 80 % visiškai sveikų žmonių burnoje yra įvairių Candida rūšių. Kandidozė yra vietinė infekcija, kuri atsiranda dėl Candida mieliagrybio išvešėjimo burnoje. Kandidozės gydymui naudojami priešgrybeliniai vaistai, kurie turi daug šalutinių poveikių. Dezinfekuojamieji burnos skalavimo skysčiai pagalbinis arba alternatyvus priešgrybeliniams vaistams gydymo metodas. Tyrimo tikslas - nustatyti dezinfekuojamųjų burnos skalavimo skysčių ir skirtingos koncentracijos chlorheksidino digliukonato (CHD) priešgrybelinį poveikį in vitro sąlygomis. Medžiaga ir metodai. Iš 40 pacientų buvo paimta gleivinės apnašų mėginių mikroskopiniams grybams identifikuoti. Candida grybeliui identifikuoti mėginiai in vitro sąlygomis buvo sėti į chromagaro terpę. Išauginta Candida (C. albicans (n 17), C. tropicalis (n 4), C. krusei (n 2), C. parapsilosis (n 2) ir C. glabrata (n 3)) mielinis grybelis. Etaloninių kultūrų suspensijos buvo sėjamos į Miulerio Hintono agarą. Tyrimas atliktas duobelių, į kurias buvo pilti skalavimo skysčiai Oralflux, Eludril classic, Octenidol, Curasept, Listerine green tea ir 0,06 %, 0,12 %, 0,2 %, 2 % CHD koncentracijos tirpalai, metodu. Po 24 valandų buvo išmatuoti sterilių zonų, susidariusių aplink duobeles, skersmenys. Tyrimo duomenys apdoroti Microsoft Excel ir SPSS 13 programomis. Skirtumai laikyti statistiškai patikimi esant ne didesnei kaip 5 proc. paklaidai (p<0,05). Rezultatai. Visų rūšių Candida grybelio augimą reikšmingai (p<0,05) stipriausiai inhibuoja Oralflux burnos skalavimo skystis. Reikšmingai (p<0,05) silpniausias priešgrybelinis poveikis būdingas Eludril classic burnos skalavimo skysčiui. Octenidol ir Curasept burnos skalavimo skysčių poveikis visoms Candida grybelio rūšims (išskyrus C. parapsilosis) reikšmingai (p < 0,05) nesiskiria. Tokios pačios koncentracijos CHD tirpalo poveikis skirtingoms Candida rūšims reikšmingai (p>0,05) nesiskiria. Priešgrybelinis CHD poveikis tiesiogiai priklauso nuo koncentracijos tirpale: reikšmingai (p < 0,05) stipriausiai veikia 2 %, o silpniausiai 0,12 % CHD tirpalas. Išvados. Stipriausias priešgrybelinis poveikis būdingas Oralflux burnos skalavimo skysčiui. Priešgrybelinis CHD poveikis tiesiogiai priklauso nuo koncentracijos kuo ji didesnė, tuo poveikis stipresnis. Raktiniai žodžiai: Candida, candidiasis, mouthwashes, chlorhexidine digluconate.

10 ANTIBACTERIAL LIQUID EFFECTS AGAINST ORAL FUNGAL PATHOGENS. AN IN VITRO STUDY SUMMARY Relevance of the problem and aim of the work. About 80 % of completely healthy people s mouths are colonized by various Candida species. Oral candidiasis is an opportunistic infection caused by an overgrowth of Candida species. Antifungal drugs used to treat oral candidiasis has a lot of side effects. Antibacterial mouthwashes could be auxiliary or even alternative treatment of oral candidiasis. The aim of this study was to determine the antifungal effect of antibacterial mouthwashes and different concentrations of chlorhexidine digluconate (CHD) in in vitro conditions. Material and the methods. The samples of oral mucosa and tongue surface were taken from 40 patients. In the in vitro conditions there was grown Candida (C. albicans (n 17), C. tropicalis (n 4), C. krusei (n 2), C. parapsilosis (n 2) and C. glabrata (n 3)) yeasty fungus. Candida suspensions were seeded in Müller-Hinton agar. The research was conducted by making 7 pits in every Petri plate into which was poured rinsing liquids Oralflux, Eludril classic, Octenidol, Curasept, Listerine green tea and 0.06 %, 0.12 %, 0.2 %, 2 % CHD solutions. The antifungal effect of the research material was evaluated by measuring the sterile zone around the size of the hole. The data was processed in Microsoft Excel and SPSS 13 software. Differences were considered statistically reliable at not more than 5 % error (p <0,05). Results. Significantly (p<0,05) strongest antifungal effect was established of Oralflux mouthwash, which showed the best results on all tested Candida species. Significantly (p<0,05) weakest antifungal effect was set by using Eludril classic antibacterial mouthwash. Antifungal effect of "Octenidol and Curasept" mouthwashes for all tested Candida species (except C. parapsilosis) significantly (p <0,05) didn t differ. The same concentration of CHD solution effects for different Candida species was statistically not significant (p>0,05). The antifungal effect of CHD directly depends on the concentration in the solution with significant (p<0,05) strongly affected by 2% and the weakest % solution of CHD. Conclusions. Mouthwash Oralflux showed significantly (p<0,05) strongest antifungal effect on all tested Candida species. Antifungal effects of CHD solution directly dependent on the concentration - the higher it is, the stronger the impact. Keywords: Candida, candidiasis, mouthwashes, chlorhexidine digluconate.

11 SANTRUMPOS C. albicans Candida albicans; C. krusei Candida krusei; C. tropicalis Candida tropicalis; C. parapsilosis Candida parapsilosis; C. glabrata Candida glabrata; ODH octenidino dihidrochloridas; CHD chlorheksidino digliukonatas; ŽIV žmogaus imunodeficito virusas; AIDS įgytas imuninio nepakankamumo sindromas, angl. acquired immune deficiency sindrome ; SN standartinis nuokrypis. 11

12 ĮVADAS Kandidozę, arba pienligę, žmonija žino jau daugiau nei 2000 metų. Garsiausias antikinės Graikijos gydytojas Hipokratas ( m. pr. m. e.) savo atradimuose šią infekciją aprašo kaip paviršutines burnos ir makšties gleivinės aftas [1]. Pagrindinis grybelinių ligų patogenas C. albicans buvo identifikuotas XIX a. Fredrikas Bergas 1841 m. nustatė, kad pienligę sukelia panašūs į pelėsį grybai, kurie filamentais plinta tarp epitelinių ląstelių m. Charlesas Phillipe as Robinas šiuos mikroorganizmus pavadino Oidium albicans, publikavo jų ląstelių piešinius, plačiai aprašė šiuos mikroorganizmus [2]. Pastaraisiais dešimtmečiais labai padaugėjo įvairių kandidozės formų [1]. Šių susirgimų skaičiaus didėjimą galima būtų paaiškinti išaugusiu plataus spektro antibiotikų, imuninę sistemą slopinančių vaistų po organų transpalantacijų vartojimu, didėjančiu invazinių chirurginių procedūrų skaičiumi, taip pat didėjančiu užsikrėtusių ŽIV ir sergančių AIDS žmonių skaičiumi [3]. Apie 80 % visiškai sveikų žmonių burnoje yra įvairių Candida rūšių. Šie mieliagrybiai yra normalios burnos ertmės mikrobiomos sudedamoji dalis [3]. 5 7 % visiškai sveikų naujagimių išsivysto penligė, 9 31 % AIDS sergančių žmonių serga ir burnos kandidoze, apie 20 % sergančių onkologinėmis ligomis serga ir burnos kandidoze [1]. Labiausiai paplitusi Candida rūšis C. albicans. Ją turi % žmonių, kuriems nepasireiškia jokie klinikiniai simptomai [7]. Sveikiems arba nedidelį imuninės sistemos sutrikimą turintiems žmonėms Candida rūšių sukelta infekcija dažniausiai būna paviršinė, atsiradusi ant drėgnų gleivinės paviršių liežuvio, burnos gleivinės, lūpų. Turintiems didelį imunodeficitą gali vystytis sisteminė kandidozė, kuri lemia aukštus mirtingumo rodiklius. Intensyviosios terapijos skyriuose gulinčių ir sistemine kandidoze sergančių pacientų mirtingumas siekia % [4]. Burnos floros kokybinis ir kiekybinis pusiausvyros pokytis gali būti viena priežasčių, skatinančių grybelinių mikroorganizmų augimą. Išimamų dantų protezų nešiojimas, steroidinių inhaliatorių naudojimas, sumažėjęs seilėtekis, didelis angliavandenių kiekis maiste, amžius, endokrininės sistemos ligos, imunosupresinės būklės, plataus spektro antibiotikų vartojimas, nevisavertė mityba veiksniai, lemiantys kokybinius ir kiekybinius mikroorganizmų pokyčius burnoje ir skatinantys kandidozės vystymąsi [3]. Vienas pagrindinių burnos kandidozės gydymo būdų yra priešgrybeliniai preparatai, kurie gali būti vartojami tiek vietiškai, tiek sistemiškai. Kovojant su grybeline infekcija, dažniausiai vartojami polieniniai antibiotikai ir azoliai [32, 33]. Candida grybelių patogeniškumas ir gebėjimas prisitaikyti prie įvairių aplinkos sąlygų didina jų atsparumą prišgrybeliniams vaistams, tokiems kaip amfotericinas B ir flukonazolis [36]. Tiek azolių grupės vaistai, tiek polieniniai antibiotikai sukelia 12

13 daug šalutinių reakcijų [3, 34]. Konservatyvesnis kandidozės gydymo būdas dezinfekuojamieji burnos skalavimo skysčiai. Skalavimo skysčiai, kurių sudėtyje yra CHD, odontologijoje naudojami kaip plataus veikimo antibakteriniai preparatai. Jie pasižymi ir priešgrybeliniu poveikiu [43]. Darbe analizuojamas antibakterinių skalavimo skysčių, kurių sudėtyje yra CHD, octenidino dihidrochlorido (ODH), augalinės kilmės medžiagų ir skirtingų koncentracijų CHD, poveikis burnos kandidozės sukėlėjams in vitro sąlygomis. Tyrimo tikslas nustatyti dezinfekuojamųjų burnos skalavimo skysčių ir skirtingos koncentracijos CHD tirpalų priešgrybelinį poveikį in vitro sąlygomis. Darbo uždaviniai: 1. Nustatyti dezinfekuojamųjų burnos skalavimo skysčių priešgrybelinį poveikį skirtingoms Candida grybelio rūšims in vitro sąlygomis. 2. Nustatyti 0,06 %, 0,12 %, 0,2 % koncentracijos CHD tirpalų priešgrybelinį poveikį skirtingoms Candida grybelio rūšims in vitro sąlygomis. 13

14 1. LITERATŪROS APŽVALGA 1.1 Burnos kandidomikozė Burnos kandidomikozė yra vietinė arba kitaip oportunistinė (angl. opportunity palanki proga) infekcija. Tai sąlygiškai patogeninių mikroorganizmų sukeltas infekcinis procesas. Pasireiškia pažeidimu ir atsakomąja reakcija uždegimu arba specifiniu imuniniu atsaku prasiskverbimo vietoje, dažniausiai odoje ir gleivinėje. Tai dažna ir neretais atvejais blogai diagnozuojama infekcija tarp vyresnio amžiaus žmonių, kurie nešioja išimamus dantų protezus. Burnos kandidomikozė taip pat yra sisteminių ligų, tokių kaip cukrinis diabetas, ženklas. Be to, tai dažna liga tarp nusilpusį imunitetą turinčių žmonių. Burnos kandidozė atsiranda dėl į mieles panašaus grybelio išvešėjimo burnos ertmėje. Mieliagrybiai tai vienaląsčiai, 4 8 mm dydžio mikroorganizmai, kurie dauginasi blastokonidijomis, standžiose mitybinėse terpėse auga kolonijomis. Šie vienaląsčiai gamina proteazes, kurios yra invazijos į žmogaus organizmą veiksnys. Audiniuose sudaro siūliškos formos darinius pseudohifus [6]. Kaip ir kiti grybai, Candida yra nevykdantys fotosintezės eukariotiniai organizmai, turintys ląstelės sienelę. Skirtingų Candida rūšių mikroskopinės ir makroskopinės charakteristikos yra labai panašios. Tai mikroorganizmai, kurie gali metabolizuoti gliukozę tiek aerobinėmis, tiek anaerobinėmis sąlygomis. Temperatūra turi įtakos šių mikroorganizmų dauginimuisi. Esant 37 o C temperatūrai, auga pseudohifai [7]. Svarbiausios Candida rūšys: C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. pseudotropicalis, C. krusei, C. guillierimondii, C. lusitaniae, C. parapsilosis ir C. stellatoidea. C. albicans ir C. glabrata sukelia grybelinę infekciją burnoje [5]. Daugiau kaip 90 % grybelinių infekcijų sukelia C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis ir C. krusei [44]. Nustatyta, kad C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata, kaip ir C. albicans, gali formuoti bioplėvelę. Ekstraląstelinėje matricoje yra skirtingi kiekiai baltymų ir angliavandenių, kiekvienai rūšiai šių medžiagų poreikis yra skirtingas. C. parapsilosis bioplėvelę sudaro gana dideli kiekiai angliavandenių, proteinų randama daug mažiau. C. glabrata ir C. tropicalis bioplėvelėje randama daugiau baltymų, mažiau angliavandenių [45]. C. tropicalis sukeltos infekcijos yra vienos labiausiai paplitusių oportunistinių ligų atogrąžų šalyse. Taksonomiškai C. tropicalis yra labai panašus į C. albicans. Šis mieliagrybis itin pavojingas žmonėms, kurių kraujyje yra sumažėjęs baltųjų kraujo kūnelių kiekis. Dažnai hematogeniniu būdu pernešamas į periferinius organus [46]. Kaip ir C. albicans, C. tropicalis gali formuoti bioplėvelę [47]. C. albicans bioplėvelės sudėtis įvairesnė, joje galima rasti blastosporų, hifinių ir pseudohifinių ląstelių. C. tropicalis bioplėvelės struktūra sudaryta iš kelių sluoksnių blastosporų. Abiem atvejais 14

15 bioplėvelė yra prisitvirtinusi tarpląstelinėje matricoje [48]. Nepaisant šių dviejų rūšių bioplėvelės struktūros skirtumų, žinoma, kad jos susidarymas priklauso nuo substrato kokybės, augimo terpės, angliavandenių šaltinio ir jų koncentracijos bei aplinkos ph. Pagrindiniai C. tropicalis virulentiškumo veiksniai gebėjimas įveikti žmogaus imuninę sistemą, adhezija prie ląstelių, bioplėvelės formavimas, hidrolizinių fermentų išskyrimas, polimorfiškumas [49]. C. glabrata grybelis yra normali burnos ir žarnyno mikrofloros dalis. Šis grybelis dažniausiai auga kaip vienaląstės mielės, nesudaro hifinių ląstelių, bet, esant azoto trūkumui, o C temperatūrai in vitro sąlygomis galima stebėti pseudohifinių ląstelų dauginimąsi. C. glabrata grybelis nėra toks patogeniškas žmogaus organizmui kaip C. albicans. Grybelis leidžia imuninės sistemos aktyvuotiems makrofagams juos atakuoti, bet sugeba toliau daugintis ir sukelti trumpalaikę uždegiminę reakciją. Nepaisant šių įžvalgų, C. glabrata virulentiškumas molekuliniu lygiu vis dar nėra gerai ištirtas, todėl sunku atrasti tinkamus baltymus, kurie efektyviai kovotų su šios rūšies mieliagrybiais [50]. C. krusei turi dvejopą reikšmę žmonėms. Tradiciškai laikomas nepatogeniniu mieliagrybiu, randamas daugelyje fermentuotų maisto produktų sudėtyje. Pieno pramonėje gaminant įvairius sūrius, netgi kefyrą, kakavos pupelių fermentacijoje, saldžių bulvių miltų gamyboje naudojami C. krusei mieliagrybiai. Šiandien jie žinomi kaip žmogaus organizmui patogeniški mieliagrybiai. C. krusei randama dviejų morfologinių formų mielių ir pseudohifinių ląstelių. Mielių ląstelių morfologinė forma paprastai yra neinvazinė. Perėjimas iš mielinių ląstelių į pseudohifines C. krusei tampa invazine forma žmogaus organizmui. Gebėjimas keisti morfologinę formą pripažintas vienu pagrindinių virulentiškumo veiksnių. Mieliagrybiui būdingas hidrofobiškumas, ši savybė gerina adheziją prie žmogaus ląstelių. C. krusei yra atsparūs azolių grupės priešgrybeliniams preparatams, ypač flukonazoliui [51]. Įvairių rūšių Candida sukelia vietinius uždegiminius procesus, kurie gali plisti. Infekcijų plitimą skatinantys veiksniai yra odos masceracija, imunosupresija, disbiozė, nekontroliuojamas cukrinis diabetas, įvairios traumos, invazinės chirurginės procedūros, neracionalus antibiotikų vartojimas [6]. 1.2 Candida grybelių virulentiškumo veiksniai Vienas pagrindinių Candida rūšių virulentiškumo veiksnių yra gebėjimas prisitaikyti prie įvairių aplinkos sąlygų, prisitvirtinti prie įvairių paviršių ir augti įvairių mikroorganizmų aplinkoje. Bakterinė ir grybelinė mikroorganizmų bioplėvelė paprastai susiformuoja per penkias stadijas: 1. Mikroorganizmų adhezija prie paviršiaus; 15

16 2. Kolonijų formavimasis ir ląstelių organizavimasis; 3. Ekstraląstelinių polimerinių medžiagų sekrecija; 4. Kolonijų brendimas; 5. Ląstelių dispersija (išsisklaidymas, išsibarstymas) [21]. Polimorfizmas. C. albicans yra polimorfinis grybelis, kuris gali egzistuoti trijų formų: mielių ląstelių, dar vadinamos blastosporomis, pseudohifų ląstelių ir hifų ląstelių. Mielių ląstelės yra apvalios arba kiaušinio formos, lengva atskirti vienas nuo kitų. Pseudohifai yra pailgos, elipsoido formos mielių ląstelės, kurios susijungia per susiaurėjusią pertvarą, auga šakodamosi. Manoma, kad tokia augimo struktūra užtikrina geresnį apsirūpinimą maistinėmis medžiagomis. Tikrosios hifų ląstelės yra ilgos, lygiagrečiais šonais, neturi akivaizdžių susiaurėjusių pertvarų tarp ląstelių [22]. Esant žemam aplinkos ph (ph < 6), C. albicans daugiausia gali augti mielių ląstelių forma, esant rūgštinei aplinkai (ph >7), inicijuojamas tikrųjų hifinių ląstelių augimas. Mieliagrybių dauginimąsi hifinėmis ląstelėmis taip pat inicijuoja maistinių medžiagų trūkumas, fiziologinė temperatūra ir anglies dvideginio buvimas aplinkoje. Mieliagrybių gebėjimas augti skirtingomis formomis, prisitaikyti prie skirtingų ir besikeičiančių aplinkos sąlygų yra vienas svarbesnių patogeniškumo veiksnių [23]. Nustatyta, jog hifinėmis ląstelėmis besidauginantys mieliagrybiai yra patogeniškesni ir labiau invazyvūs į žmogaus organizmą [22]. Adhezijos ir invazijos mechanizmai. C. albicans turi specifinį rinkinį baltymų (adheziniai baltymai), kurie tarpininkauja kaip adhezijos veiksnys tarp kitų mikroorganizmų, abiotinės aplinkos ar epitelio ląstelių. Labiausiai ištirti C. albicans adheziniai baltymai yra ALS ( agglutinin-like sequence ), kurie kovalentiniu ryšiu hifais prisijungia prie šeimininko ląstelių [24]. Invazijai į kitą ląstelę C. albicans gali naudoti du mechanizmus: pasyvią endocitozę arba aktyvią infiltraciją. Mieliagrybiai gamina baltymus, kurie sukimba su šeimininko ląstelių išskiriamais ligandais, todėl mieliagrybių ir šeimininko ląstelės susilieja. Kadangi šiam procesui nereikia energijos, netgi negyvybingos mieliagrybių ląstelės įsiskverbia į šeimininko ląsteles. Mieliagrybiai, infiltruodamiesi aktyvios infiltracijos būdu, turi būti gyvybingi, nes aktyviai infiltracijai reikalinga energija. Šiuo metu dar nėra tiksliai aiškus šis mechanizmas, manoma, kad adhezija, fizikinės jėgos ir mieliagrybių išskiriamos proteazės čia atlieka svarbiausią vaidmenį [25]. Grybelinės bioplėvelės formavimasis. Kitas svarbus mieliagrybių virulentiškumo veiksnys yra gebėjimas suformuoti grybelinę bioplėvelę aplink biotinius ir abiotinius paviršius. Labiausiai paplitę substratai, aplink kuriuos dažniausiai formuojasi mieliagrybių bioplėvelė, yra kateteriai, plokšteliniai dantų protezai, gleivinių epitelinės ląstelės. Bioplėvelės formavimasis yra nuoseklus procesas, susidedantis iš ląstelių adhezijos, infiltracijos, hifinių ląstelių formavimosi viršutiniame 16

17 bioplėvelės sluoksnyje, tarpląstelinio matrikso susidarymo ir ląstelių pasklidimo (išsisklaidymo) iš bioplėvelės į aplinkines struktūras. Brandžios bioplėvelės ląstelės yra daug atsparesnės antimikrobinėms medžiagoms bei šeimininko imuninės sistemos veiksniams. Padidėjusį subrendusios bioplėvelės atsparumą lemia bioplėvelės matricos struktūra, sunki vaistinių medžiagų infiltracija per didelį sluoksnį, mieliagrybių išskiriamų metabolinių produktų kiekis [26, 27]. Mechaninis kontaktas. Dėl sąlyčio su tam tikru paviršiumi C. albicans ląstelės geba formuoti hifus arba bioplėvelę, ant kietų paviršių formuojasi bioplėvelė (kateteriai, plokšteliniai dantų protezai), ant gleivinių, tam tikrų agarų aktyvuojamas hifų augimas, kad būtų galima infiltracija [28]. Fermentai hidrolazės. C. albicans hifinės ląstelės gamina keletą ekstraląstelinių fermentų. Manoma, kad jie turi žalingą poveikį šeimininko ląstelėms. Šie fermentai palengvina mieliagrybių ląstelių infiltraciją į šeimininko ląstelę. Manoma, kad hidrolazės pagerina maistinių medžiagų pasisavinimą. Viena fermentinių hidrolazių grupių yra aspartilio proteinazės (SAPs) C. albicans jų gamina mažiausiai 10 rūšių. Skirtingos proteinazės fermentuojamos esant skirtingoms aplinkos sąlygoms. Vienos proteinazės išskiriamos esant aukštam ph, kitos žemam. Šis heterogeniškumas užtikrina C. albicans atsparumą besikeičiančioms aplinkos sąlygoms. Šios proteinazės pasižymi gebėjimu skverbtis į keratinizuotas ląsteles ir jas ardyti, palengvina hifinių ląstelių patekimą į šeimininko audinius, padidina sukibimą su receptoriais, todėl skaido imunoglobulinus ir kitus baltymus, kurie dalyvauja gynybiniuose procesuose. Kita hidrolazių grupė fosfolipazės. Ištirtos septynios skirtingos fosfolipazės. Pagrindinė jų užduotis ardyti esterines jungtis tarp fosfolipidų. Taip suardoma lastelės membrana, kuri lydi ląstelę link jos žūties [3]. Prisitaikymas prie ph pokyčių. Žmogaus organizmo ph yra labai dinamiškas, kraujo ir audinių ph šiek tiek šarminis (ph = 7.4), o virškinamojo trakto ph svyruoja nuo labai rūgštaus (ph = 2) iki lengvai šarminio (ph = 8). Gana didelis ph svyravimas žmogaus organizme gali slopinti įvairių baltymų, kuriuos gamina mieliagrybiai, veiklą, sutrikdyti maistinių medžiagų pasisavinimą. Mieliagrybiai gamina baltymus β-glikozidazes Phr1 ir Phr2, kurios mieliagrybiams leidžia prisitaikyti prie kintančių ph sąlygų. β-glikozidazė Phr1 sintetinama esant neutraliai arba lengvai šarminei aplinkai, o Phr2 β-glikozidazė gaminama esant rūgščiam ph. C. albicans yra ne tik galintis prisitaikyti prie aplinkos ph, bet ir pats reguliuoti ekstraląstelinį ph patogenas. Jis gali aktyviai šarminti aplinką esant maistinių medžiagų trūkumui. Šarmindamas aplinką jis koreguoja hifinių ląstelių išsidėstymą. Gebėjimas šarminti ekstraceliulinę aplinką yra siejamas su aminorūgščių ir kitų amino grupę turinčių junginių įsisavinimu. Ląstelės viduje skaidydamas amino grupę turinčias 17

18 molekules šis patogenas atpalaiduoja amoniako jonus, kurie ir keičia aplinkos rūgštingumą. Tai skatina hifinių ląstelių dauginimąsi [29]. Metabolinis prisitaikymas. Esant infekcijai, pagrindinis C. albicans mitybinis šaltinis yra gliukozė, bet, pasikeitus aplinkos sąlygoms ar anatominei nišai, šis mieliagrybis gali naudoti lipidus, baltymus ar aminorūgštis kaip pagrindinį maisto šaltinį. C. albicans geba greitai ir dinamiškai reaguoti į šeimininko ir kitų patogeninių mikroorganizmų sukeltus mikroaplinkos pokyčius, kad galėtų naudoti šiuos skirtingus maistinių medžiagų šaltinius [23]. 1.3 Veiksniai, lemiantys burnos kandidozės atsiradimą Seilės. Jose esantys polipeptidai, sialoperoksidazės, laktoferinas ir lizocimas slopina mieliagrybių vešėjimą ir peraugimą į burnos gleivinę, todėl pakitusi kiekybinė ir kokybinė seilių sudėtis turi įtakos kandidozės atsiradimui [1]. Seilėse taip pat yra IgA, kurie inhibuoja C. albicans prisitvirtinimą prie burnos gleivinės. Seilių išsiskyrimo sumažėjimas pastebimas pas sergančius Sjögreno sindromu, kurie gydomi priešvėžiniais vaistais arba rentgeno spinduliais. Sumažėjus seilių kiekiui burnoje, nevyksta natūralus burnos gleivinės plovimas, ji išsausėja, todėl didėja rizika susirgti burnos kandidoze [8]. Pilni ir daliniai plokšteliniai dantų protezai. Apie 65 % žmonių, nešiojančių plokštelinius protezus, yra linkę sirgti burnos kandidoze. Dantų protezai, pagaminti iš akrilinės plastmasės, sukuria palankią terpę mikroorganizmų, taip pat Candida, adhezijai. Nešiojant tokius protezus, sumažėja seilių išsiskyrimas, sunkiau palaikyti tinkamą burnos higieną [1]. Vietinio poveikio vaistai. Dažnas vietiškai naudojamų ir inhaliacinių kortikosteroidų vartojimas taip pat didina riziką susirgti burnos kandidoze. Dažnai naudojami šie preparatai slopina vietinį imunitetą ir sukelia pakitimų gleivinėje, pasikeičia burnos ertmės mikrofloros pusiausvyra [1, 9]. Rūkymas. Tyrimai rodo, kad rūkymas kartu su kitais veiksniais daro įtaką kandidozės atsiradimui, bet dar nėra įrodyta, kokių pokyčių atsiranda. Manoma, kad grybelinei infekcijai plisti padeda dėl rūkymo atsiradę burnos ertmės gleivinės pokyčiai, dūmuose esantys aromatinių angliavandenilių junginiai, vietinio imuniteto slopinimas, sumažėjęs dantenų vagelių skysčio išsiskyrimas [1]. Mityba. Nesubalansuota mityba, didelis kiekis rafinuoto cukraus, sacharozės, įvairių vaisių sultys, medus, klevų sirupas, pieno produktai, alkoholis, džiovinti vaisiai skatina Candida grybelio augimą. Pieno produktų vartojimas grybelių augimą stimuliuoja ne tik dėl šiuose produktuose esančios laktozės, bet ir dėl galimo antibiotikų naudojimo pieno pramonėje. Nustatyta, 18

19 kad per mažas vitamino C vartojimas taip pat gali būti vienas nepriklausomų veiksnių kandidozei vystytis [10, 12]. Amžius. Švedijoje atliktame tyrime, kuriame dalyvavo šimtas naujagimių, buvo nustatyta, kad 12 % naujagimių, sulaukusių 8 savaičių, išsivysto pienligė. Burnos kandidozės atvejų padaugėjo iki 15 %, kai vaikai sulaukė 12 mėnesių. Buvo atrastas ryšys tarp priešlaikinio gimdymo, mažo naujagimių svorio ir kandidozės atsiradimo [11]. Vyresnio amžiaus žmonės dažniau serga burnos grybelinėmis infekcijomis, nes dažniau vartoja sisteminius ir inhaliuojamus kortikosteroidus, dažniau serga onkologinėmis ligomis, būna susilpnėjęs vietinis burnos ertmės gleivinės imunitetas, plonesnis gleivinės epitelis, kuris mažiau linkęs atsinaujinti [12]. Sisteminiai vaistai. Dėl ilgo ir dažno sisteminių plataus veikimo antibiotikų vartojimo pasikeičia žmogaus mikrofloros sudėtis, todėl susidaro sąlygos vešėti C. albicans. Ilgai vartojami kortikosteroidai, kontraceptinės tabletės, vaistai nuo skrandžio opos, ypač ranitidinas, vaistai, kurie sukelia burnos sausumo pojūtį, keičia vietinę burnos floros sudėtį, suardo gleivinės epitelį ir mažina seilių liaukų produkcines savybes [10]. Endokrininės ligos. Indijoje atliktame tyrime buvo nustatyta, kad diabetu sergančių žmonių seilėse gliukozės kiekis yra didesnis. Taip pat nustatyta, kad cukriniu diabetu sergančių žmonių burnoje dažniau yra Candida mieliagrybių. Didelis gliukozės kiekis seilėse gerina sąlygas mieliagrybiams prisitvirtinti prie burnos gleivinės epitelio [14]. Piktybiniai navikai. Piktybinėms onkologinėms ligoms gydyti naudojama chemoterapija arba spindulinis gydymas slopina žmogaus imuninę sistemą, mažėja organizmo atsparumas įvairioms infekcijoms. Kandidozės paplitimas tarp gydomų nuo piktybinių navikinių ligų yra 7,5 % prieš gydymą, 39,1 % gydymo metu, 32,6 % po gydymo [1]. ŽIV, AIDS. Burnos gleivinės kandidozės paplitimas tarp ŽIV turėtojų siekia 90 %. Atsiradus agresyviam antiretrovirusiniam gydymui, burnos kandidozių paplitimas tarp ŽIV turinčių ir AIDS sergančių pacientų sumažėjo dėl imuninės sistemos gynybinių funkcijų atsikūrimo ir Candida mieliagrybių gaminamų fermentų slopinimo [15]. 1.4 Burnos kandidozės gydymas Gydant burnos kandidozę, vienas svarbiausių gydymo aspektų yra klinikinės anamnezės surinkimas. Būtina tiksliai išsiaiškinti, kokie veiksniai lemia ligos atsiradimą. Pavyzdžiui, pacientams, kenčiantiems nuo lėtinės eriteminės kandidozės, kurią sukelia išimami plokšteliniai protezai, labai svarbu suteikti visą informaciją apie išimamų dantų protezų priežiūrą, valymą, nurodyti priemones, turinčias priešgrybelinį poveikį protezams (1 % sodos hipochlorito tirpalas arba 19

20 0,2 % chlorheksidino tirpalas), paaiškinti, kad chlorheksidino tirpalo naudojimas gali sukelti dantų ir gleivinės spalvos pokyčius. Jeigu įmanoma, šalinti rizikos veiksnius [3]. Burnos kandidozės gydymą sudaro keturios pagrindinės strategijos: 1. Ankstyvas ir tikslus kandidozės diagnozavimas; 2. Rizikos veiksnių šalinimas arba koregavimas; 3. Candida grybelio rūšies įvertinimas; 4. Tinkamas priešgrybelinių vaistų parinkimas, įvertinant kiekvienu atveju galimą jų toksiškumą ir veiksmingumą [30]. Mechaninis Candida bioplėvelės pašalinimas toks pat svarbus, kaip ir cheminių preparatų skyrimas. Mechaniniam šalinimui galima naudoti dantų šepetėlį, medvilninius tamponus, liežuvio valiklį arba paprastą mentelę. Aišku, mechaninis bioplėvelės pašalinimas nėra įmanomas sunkiai pasiekiamuose burnos ertmės paviršiuose, todėl reikėtų nepamiršti antibakterinių skalavimo skysčių. Keletas rūšių antibakterinių burnos skalavimo skysčių, kurių sudėtyje yra CHD, triklozano, octenidino, augalinių ekstraktų ir eterinių aliejų, turi priešgrybelinį poveikį. Eteriniai aliejai tiesiogiai veikia Candida plazminę membraną ir stabdo tam tikrų fermentine veikla pasižyminčių baltymų sintezę [31]. Antibakterinių preparatų pasirinkimas yra kur kas didesnis nei priešgrybelinių. Tam įtakos turi tai, kad grybelinė invazija į žmogaus organizmą ir jos patogeninis poveikis šeimininkui yra pripažinti palyginti visai neseniai, sunku atrasti mažai toksiškus ir veiksmingus preparatus. Kita priežastis mieliagrybiai yra eukariotiniai mikroorganizmai, jų ląstelės artimos žinduolių ląstelėms, veikimo mechanizmai panašūs, todėl sunku rasti chemines medžiagas, kurios veiktų tik mieliagrybio ląstelę, o žinduolio ląstelę paliktų gyvą [3]. Dažniausiai vartojami priešgrybeliniai vaistai yra polieniniai antibiotikai ir azoliai. Polienai yra amfotericinas B ir nistatinas. Jie pasižymi fungicidiniu poveikiu vartojant didelėmis dozėmis ir fungistatiniu poveikiu vartojant mažesnėmis dozėmis. Jautrumas polienams yra susijęs su steroliais, esančiais ląstelių plazminėse membranose. Polienai dėl struktūros ypatumų prasiskverbia per ląstelių plazminę membraną, susijungia su ergosteroliais ir suardo membraną. Dėl poveikio ergosteroliams sukeliamas plazminės membranos irimas, mieliagrybio ląstelės žūtis. Žinduolių sterolio ekvivalentas yra cholesterolis, kuris yra mažiau giminingas su polienais, todėl šeimininko ląsteles daro mažiau jautrias toksiniam polienų poveikiui [32]. Tačiau didesnės polienų dozės turi neigiamą toksinį poveikį žinduolių organizmams. Polienai yra blogai absuorbuojami per žarnyną, todėl sisteminis jų vartojimas yra gana ribotas. Geresnis polienų poveikis pasireiškia, kai vartojami pastilėmis arba suspensija. Šie preparatai dažnai skiriami esant lėtinei eriteminei kandidozei, 20

21 amfotericinas B skiriamas sergantiems ŽIV ir AIDS, kai ligonių organizmas atsparus kitiems preparatams [3]. Azoliai, priešingai nei polienai, pasižymi tik fungistatiniu poveikiu. Jų veikimo mechanizmas paremtas fermentų, kurie dalyvauja ergosterolių sintezėje, gamybos slopinimu. Sutrikus ergosterolių gamybai, išeikvojamos jų atsargos, todėl slopinamas mieliagrybių augimas ir plazminės membranos pralaidumas. Pagrindiniai azoliai, naudojami burnos ertmės kandidozei gydyti, yra flukonazolis ir itrakonazolas. Šie preparatai gerai absorbuojami per žarnų gleivinę, todėl vartojant sistemiškai yra veiksminga priemonė gydant burnos ertmės kandidozę. Be to, didelė koncentracija flukonazolio patenka į seiles, todėl labai tinka gydyti burnos ertmės kandidozę [33]. Deja, pastaraisiais metais buvo pastebėta, kad Candida mieliagrybių sukeltos infekcijos tampa vis atsparesnės azolio grupės priešgrybeliniams preparatams. Toks atsparumo padidėjimas gali atsirasti dėl Candida mieliagrybių sintezuojamų fermentų struktūros pokyčių. Fermentai tampa mažiau jautrūs azolių grupės preparatams, azoliai greičiau pašalinami iš ląstelės [32]. Azolių grupės priešgrybeliniai vaistai sukelia labai daug nepageidaujamų reakcijų: pykinimą, galvos, pilvo skausmą, odos pažeidimų, gali atsirasti kepenų pažeidimų požymių, virškinimo sutrikimų. Jie slopina testosterono sintezę. Šie preparatai yra embriotoksiški ir teratogeniški [34]. Kaip alternatyva azoliams ir polienams visai neseniai pasirodė nauja priešgrybelinių vaistų klasė. Tai echinokandinai. Šie preparatai slopina fermentinio baltymo D-gliukano sintezę, kuris reikalingas mieliagrybio ląstelės sienelei formuotis, atsiranda osmosinis nestabilumas, kuris sukelia ląstelės mirtį. Šio fermento žinduolių ląstelės negamina, todėl šeimininko ląstelėms toksinis poveikis yra labai mažas. Šios grupės preparatai pasižymi fungicidiniu poveikiu, jų vartojimas yra ribotas dėl gana didelių molekulinių struktūrų, todėl jie dažniau vartojami sisteminei grybelinei infekcijai gydyti, skiriami vartoti intraveniškai [35]. Didėjant Candida rūšių sukeltų infekcijų atsparumui priešgrybeliniams preparatams ir esant gana dažniems bei pavojingiems šalutiniams poveikiams, reikėtų atsigręžti į konservatyvų gydymą, ieškoti naujų, alternatyvių kandidozės gydymo būdų. Reguliari profesionali ir tinkama individuali burnos higiena gali užkirsti kelią burnos ertmės kandidozei. Svarbu, kad pacientas žinotų, kaip taisyklingai atlikti individualią burnos higieną, gebėtų tinkamai pasirinkti priemones ir teisingai jas naudoti. Dantų, gleivinės ir liežuvio valymas, tinkama dantų protezų priežiūra užtikrina burnos sveikatą, užkerta kelią bakterinėms ir grybelinėms infekcijoms burnos gleivinėje. Antibakterinių burnos skalavimo skysčių naudojimas, kurių sudėtyje yra CHD, ODH ir natūralių, antimikrobinių savybių turinčių augalinės kilmės medžiagų, užtikrina antibakterinį ir priešgrybelinį poveikį burnos ertmės gleivinės vietose, kurias sunku pasiekti dantų šepetėliu [5, 36]. Išimami plokšteliniai dantų protezai taip pat turi būti kruopščiai valomi ir dezinfekuojami šiais tirpalais. 21

22 Visus burnos skalavimo skysčius galima suskirstyti į dvi dideles grupes: skysčiai, kurių sudėtyje yra cheminių medžiagų, turinčių antibakterinį poveikį, ir skysčiai, kurių sudėtyje nėra šių cheminių medžiagų, tačiau yra augalinės kilmės preparatų, kurie gali turėti antibakterinį ir priešgrybelinį poveikį [36]. CHD katijoninis biguanidas, kuris jungiasi su mikroorganizmų ląstelės sienelės komponentais. Tai plataus veikimo antimikrobinis preparatas. Mažos koncentracijos tirpalai pasižymi bakteriostatiniu veikimu, o didesnės koncentracijos CHD tirpalai veikia bakteriocidiškai gramteigiamus ir gramneigiamus mikroorganizmus, taip pat kai kuriuos grybelius (C. albicans) ir virusus (raudonukės, tymų, parotito, ŽIV) [37]. CHD naudojamas jau daugiau nei 40 metų ir vis dar laikomas efektyviausia priemone, kuri inhibuoja bakterinio apnašo formavimąsi burnos ertmėje. Kol kas nėra jokių įrodymų apie besivystantį bakterijų atsparumą, susijusį su šio antibakterinio preparato vartojimu. Tačiau CHD turinčių antibakterinių burnos skalavimo skysčių naudojimo laikas yra ribotas dėl seniai žinomų nepageidaujamų reiškinių dantų spalvos, skonio pokyčių, burnos ertmės gleivinės dirginimo. Retais atvejais galimos alerginės, labai retais atvejais anafilaksinės reakcijos [38]. Nustatyta, kad CHD yra citotoksiškas dantenų fibroblastams [39]. Octenidino dihidrochloridas (ODH) alternatyvus CHD antibakterinis preparatas, kurį 1980 m. sukūrė Sterlingas Winthropas. Pasižymi panašiomis plataus veikimo antibakterinėmis savybėmis ne tik gramneigiamoms, bet ir gramteigiamoms bakterijoms, taip pat turi priešgrybelinių savybių. Nustatyta, kad efektyviai veikdamas bakterijas, kurios formuoja burnos ertmės mikroplėvelę, nekenkia normaliai sveikos burnose ertmės mikroflorai. Tačiau dėl kartaus skonio grynas ODH nebuvo naudojamas kaip burnos skalavimo skystis, kol rinkoje atsirado burnos skalavimo skysčių šio preparato pagrindu, o nemalonus skonis buvo panaikintas įvairiais papildais ir kvapiosiomis medžiagomis [40]. 22

23 2. TYRIMO MEDŽIAGOS IR METODAI 2.1 Tiriamųjų atrankos kriterijai Burnos ertmės gleivinės ir liežuvio nuograndų mėginiai buvo paimti iš pacientų, kurie kreipėsi į LSMU Dantų ir burnos ligų kliniką dėl burnos ertmės gleivinės pakitimų. Pacientai skundėsi gleivinės ar liežuvio spalvos pakitimais, deginimo jausmu valgant, burnos sausumu. Mėginiai bakteriologiniam tyrimui paimti iš 40 pacientų, gavus LSMU Bioetikos centro leidimą (Nr. BEC OF 67, išduota , priedas Nr. 1) bei tiriamajam sutikus dalyvauti tyrime (priedas Nr. 2, 3). Tiriamųjų imtis apskaičiuota pagal imties nustatymo formulę: n= n imties tūris, z α/2 standartinio normaliojo skirstinio N (0,1) α lygmens kritinė reikšmė (su 95 proc. patikimumu z α/2 = 1.959, N atrankinės visumos dydis, π mus dominančio parametro proporcija atrankinėje visumoje; jei iš ankstesnių tyrimų neturime informacijos apie atrankinės visumos proporcijas, tariame, kad π = 0,5, Ɛ atrankos paklaida, maksimali leistina atrankos paklaidos riba yra ± 5 proc. Apskaičiuota, kad, norint gauti patikimus rezultatus, reikia paimti mažiausiai 28 burnos gleivinės ir liežuvio nuograndų mėginius. C. albicans yra normali žmogaus burnos mikroflora, kurią turi apie proc. žmonių, nepasireiškiant jokiems klinikiniams simptomams [8]. Siekiant išskirti kuo daugiau Candida rūšių buvo paimta 12 mėginių daugiau. 2.2 Candida rūšių identifikavimas Tiriamoji medžiaga paimta steriliais tamponais ir transportinėse terpėse gabenta į LSMU Mikrobiologijos ir virusologijos instituto mikrobiologijos laboratoriją. Tiriamoji medžiaga steriliais tamponais pasėta į chromagarą (agaras 15,0 g/l, peptotonas 10,2 g/l, chromfenikolis 0,5 g/l, chromogeninis mišinys 22,0 g/l, ph 6,1 +/- 0,2, CHROMagar Candida). Chromagaras su pasėta tiriamąja medžiaga kultivuotas termostate aerobinėmis sąlygomis val., esant ⁰C temperatūrai. Chromagare išaugusios spalvotos kolonijos identifikuotos kaip tam tikros Candida rūšys (1 lentelė, 1 paveikslas). 23

24 1 lentelė. Candida rūšių augimo pobūdis chromagare Candida spp. Kolonijos spalva C. albicans Žalia C. tropicalis Mėlyna C. krusei Šviesiai rožinė C. glabrata Rausvai violetinė, ruda C. parapsilosis Balta 1 pav. Candida rūšių identifikavimas chromagare Iš viso ištirta 40 asmenų. Candida rūšys išskirtos iš 17 tiriamųjų (42,5 proc.). Nustatyta 17 C. albicans kultūrų, 4 C. tropicalis, 2 C. krusei, 2 C. parapsilosis ir 3 C. glabrata kultūros. 24

25 2.3 Etaloninių Candida rūšių kultivavimas Identifikuotos Candida rūšys (C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata, C. parapsilosis) tolesniems tyrimams buvo kultivuotos ir saugomos Sabūro maltozės agare ( Oxoid LTD, Basingstokas, Hampšyras, Anglija), kurį sudaro peptonas 10,0 g/l; maltozė 40,0 g/l; agaras 15,0 g/l, ph 5,6 +/ 0,2 (2 paveikslas). 2 pav. Etaloninių Candida rūšių kultivavimas 2.4 Candida rūšių suspensijų ruošimas Candida kultūros buvo kultivuotos 24 val. 25 ⁰C temperatūroje. Išaugusių Candida rūšių suspensijos buvo ruošiamos steriliame fiziologiniame tirpale. Candida ląstelių kiekis suspensijoje standartizuotas McFarlando standartiniu indikatoriumi ( standart indicator McFarland ), matuojančiu suspensijos drumstumą. Tyrime naudotos 1,5 McFarlando drumstumo Candida rūšių suspensijos. 25

26 2.5 Chlorheksidino digliukonato (CHD) 0,06 %, 0,12 %, 0,2 % tirpalų ruošimas CHD 2 % tirpalas buvo skiedžiamas steriliu distiliuotu vandeniu. Tirpiklio masė, kuri reikalinga sumažinti tirpalo koncentraciją iki norimos, randama pagal formulę: m s = m T m s tirpiklio masė, m T turimo tirpalo masė, c o turimo tirpalo koncentratas, c 1 pageidaujama tirpalo koncentracija. Gaminant 0,06 % koncentracijos CHD tirpalą, į sterilius mėgintuvėlius buvo pilama po 0,2 ml 2 % CHD tirpalo ir 6,46 ml distiliuoto vandens. 0,12 % CHD tirpalui gaminti į sterilius mėgintuvėlius buvo pilama po 0,4 ml 2 % CHD tirpalo ir 6,26 ml distiliuoto vandens. 0,2 % koncentracijos CHD tirpalui gaminti buvo pilama 0,6 ml 2 % CHD tirpalo ir 5,4 ml distiliuoto vandens. 2.6 Kultivavimo terpės ruošimas Antibakterinių burnos skalavimo skysčių Oralflux, Eludril classic, Octenidol, Curasept, Listerine green tea (2 lentelė) ir CHD tirpalų antimikrobinis aktyvumas prieš C. albicans (n 17), C. tropicalis (n 4), C. krusei (n 2), C. parapsilosis (n 2) ir C. glabrata (n 3) atliktas duobučių metodu. Į kiekvieną sterilią Petri lėkštelę įpilta po 1 ml standartizuotos Candida suspensijos ir 30 ml skysto 45 ⁰C temperatūros Miulerio Hintono agaro ( Oxolid LTD, Basingstokas, Hampšyras, Anglija), kurį sudaro dehidratuotos jautienos mišinys 300 g/l, kazeino hidrolizatas 17,5 g/l, krakmolas 1,5 g/l, agaras 17,0 g/l, ph 7,3 +/ 0,1. Sustingus agarui, buvo daromos duobutės. Petri lėkštelėse buvo daromos septynios 6 mm skersmens duobutės, į kurias sterilia mikropipete lašinama po 0,18 ml antibakterinio burnos skalavimo skysčio arba chlorheksidino tirpalų, į vieną iš duobučių lašinta distiliuoto vandens (3 paveikslas). Taip paruoštos kultūros kultivuotos 48 val. termostate esant 25 ⁰C temperatūrai. Apie tiriamų burnos skalavimo skysčių ir skirtingų koncentracijų CHD tirpalų priešgrybelinį aktyvumą buvo sprendžiama pagal sterilių zonų (Candida grybelių neaugimo zona) dydį apie duobutes su tirpalais (priedas Nr. 4). 26

27 2 lentelė. Antibakterinių skalavimo skysčių sudėtys Skalavimo skystis Sudėtis Vanduo, glicerinas, ksilitolis, PEG-40 hidrintas ricinos Oralflux aliejus, aromatinės medžiagos, 0,12 % CHD, 0,2 % natrio fluoridas, citrinų rūgštis, kalio acesulfamas Vanduo, ksilitolis, propilenglikolis, PEG-40 hidrintas Curasept ricinos aliejus, askorbo rūgštis, 0,2 % CHD, aromatinės medžiagos, poloksameras 407, natrio metabisulfitas, natrio citratas, C. I Vanduo, PEG-40 hidrintas ricinos aliejus, glicerinas, Octenidol aromatinės medžiagos, natrio gliukonatas, sukralozė, oktenidino dihidrochloridas, citrinos rūgštis, butilhidroksitoluenas Glicerinas, alkoholis, vanduo, aromatinės medžiagos, Eludril benzilo alkoholis, 0,1 % CHD, 0,5 % chlorbutanolio, CI classic (dažiklis), natrio dioktilsulfosukcinatas, eugenolis, limonenas, linalolis, mentolis Vanduo, propilenglikolis, sorbitolis, natrio laurilsulfatas, poloksameras 407, natrio sacharinas, aromatinės Listerine medžiagos, eukaliptolis, benzenkarboksirūgštis, natrio green tea benzoatas, metilo salicilatas, timolis, natrio fluoridas, mentolis, sukralozė, kininio arbatmedžio lapų ekstraktas, kofeinas, chinolino geltonasis Gamintojas Actavis Group PTC, Islandija Curadent Healthcare, Italija Shülke & Mayr GmbH, Vokietija Pierre fabre medicament, Prancūzija Johnson & Johnson, JAV 27

28 3 pav. Paruoštas Miulerio-Hintono agaras su Candida suspensija 2.7 Statistinė duomenų analizė Eksperimento statistinė duomenų analizė atlikta standartiniais programinės įrangos paketais: Microsoft Office Excel 2010 ir SPSS 13. Kelioms nepriklausomoms imtims taikyti ANOVA ir Kruskal-Wallis testai. Normalusis kiekybinių dydžių skirstinys buvo nustatytas Kolmogorov- Smirnov testu. Kiekybinių dydžių lyginimas atliktas naudojant Stjudento t ir Fišerio kriterijus. Duomenys laikyti statistiškai patikimi esant ne didesnei kaip 5 proc. paklaidai (p<0,05). Rezultatai pateikti apskaičiavus sterilių zonų vidurkius milimetrais, pateiktas standartinis nuokrypis (SN). 28

29 3. TYRIMO REZULTATAI 3.1 Tiriamųjų charakteristika 1 diagrama. Tyrime dalyvavusiųjų pacientų charakteristika Tyrimui atrinkta 40 pacientų, kurie kreipėsi į LSMU Dantų ir burnos ligų kliniką dėl burnos ertmės gleivinės pakitimų. Teigiamas Candida rūšių augimas buvo pastebėtas 17 gleivinės ir liežuvio nuograndų mėginių. C.parapsilosis 7% C.glabrata 11% C.tropicalis 14% C.krusei 7% C.albicans 61% 2 diagrama. Candida etaloninių rūšių pasiskirstymas 29

30 Iš viso identifikuotos 28 etaloninės rūšys: C. albicans 17, C. tropicalis 4, C. krusei 2, C. parapsilosis 2, C. glabrata Antibakterinių skalavimo skysčių poveikio skirtingoms Candida rūšims palyginimas 3 diagrama. Antibakterinių burnos skalavimo skysčių poveikis C. albicans Nustatyta, kad antibakterinis burnos skalavimo skystis Oralflux efektyviausiai veikia C. albicans kultūrą, sterilios zonos skersmuo 24,88 (0,86) mm. Mažiausiu priešgrybeliniu poveikiu šiai kultūrai pasižymi Eludril classic skalavimo skystis, kurio nustatytas sterilios zonos skersmuo yra 15,35 (1,62) mm, gautas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05). Statistiškai reikšmingi skirtumai tarp sterilių zonų pasiskirstymo gauti tarp visų skysčių, išskyrus Octenidol ir Curasept (p>0,05). Abu skysčiai C. albicans veikia panašiai, jų sterilių zonų skirtumas, matuojant milimetrais, yra 0,59 mm. 30

31 4 diagrama. Antibakterinių burnos skalavimo skysčių poveikis C. tropicalis Nustatyta, kad antibakterinis burnos skalavimo skystis Oralflux efektyviausiai veikia C. tropicalis kultūrą, sterilios zonos skersmuo 26,25 (0,96) mm. Mažiausiu priešgrybeliniu poveikiu šiai kultūrai pasižymi Listerine green tea skalavimo skystis su žaliosios arbatos ekstraktu, nustatytas sterilios zonos skersmuo yra 11,25 (1,5) mm, gautas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05). Statistiškai reikšmingi skirtumai tarp sterilių zonų pasiskirstymo gauti tarp visų skysčių, išskyrus Octenidol ir Curasept (p>0,05). Abu skysčiai C. tropicalis veikia panašiai, jų sterilių zonų skirtumas, matuojant milimetrais, yra 0,5 mm. 5 diagrama. Antibakterinių burnos skalavimo skysčių poveikis C. krusei 31

32 Nustatyta, kad antibakterinis skalavimo skystis Oralflux efektyviausiai veikia C. krusei kultūrą, sterilios zonos skersmuo yra 23,75 (0,96) mm. Mažiausiu priešgrybeliniu poveikiu šiai kultūrai pasižymi Eludril classic skalavimo skystis, nustatytas sterilios zonos skersmuo yra 14,5 (1,92) mm, gautas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05). Taip pat nustatytas statistiškai reikšmingas (p<0,05) sterilių zonų pasiskirstymo skirtumas tarp Oralflux ir Listerine green tea, Eludril classic ir Octenidol. Sterilių zonų dydžio reikšmingo pasiskirstymo tarp Oralflux ir Octenidol, Oralflux ir Curasept, Eludril classic ir Curasept, Eludril classic ir Listerine green tea, Octenidol ir Curasept, Octenidol ir Listerine green tea, Curasept ir Listerine green tea nėra (p>0,05). 6 diagrama. Antibakterinių burnos skalavimo skysčių poveikis C. parapsilosis Nustatyta, kad antibakterinis burnos skalavimo skystis Oralflux efektyviausiai veikia C. parapsilosis kultūrą, sterilios zonos skersmuo yra 22,8 (0,84) mm. Mažiausiu priešgrybeliniu poveikiu šiai kultūrai pasižymi Eludril classic skalavimo skystis, nustatytas sterilios zonos skersmuo yra 13,8 (1,3) mm, gautas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05). Statistiškai reikšmingi skirtumai tarp sterilių zonų pasiskirstymo gauti tarp visų skysčių, išskyrus Octenidol ir Listerine green tea (p>0,05). 32