LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA. Giedrius Dzikas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA Veterinarijos fakultetas Giedrius Dzikas PIENO PRAMONĖS ŠALUTINIŲ PRODUKTŲ PERDIRBIMAS Į ETANOLĮ, TAIKANT AEROBINĘ FERMENTACIJĄ DAIRY INDUSTRY BIOPRODUCTS CONVERSION TO ETHANOL IN AEROBIC AND ANAEROBIC CONDITIONS Veterinarinės maisto saugos ištęstinių studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS Darbo vadovas: Prof. dr. Elena Bartkienė Maisto saugos ir kokybės katedra Kaunas, 2016

DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas Pieno pramonės šalutinių produktų perdirbimas į etanolį, taikant aerobinę fermentaciją. 1. Yra atliktas mano paties. 2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir uţsienyje. 3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. (data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŢ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. (data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO (data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (aprobacijos data) (katedros (instituto) vedėjo (- os) vardas, pavardė) (parašas) Baigiamojo darbo recenzentai 1) 2) (vardas, pavardė) Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas: (parašai) (data) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas, pavardė) (parašas) 2

TURINYS Santrauka... 4 Summary... 5 Įvadas... 6 1. Literatūros apţvalga... 8 1.1 Pieno išrūgų charakterizavimas... 8 1.2 Pieno išrūgų perdirbimas... 8 1.3 Mielių panaudojimas perdirbant pieno išrūgas... 9 1.4 Etanolio gamyba iš pieno išrūgų... 10 1.5 Etanolio gamyba... 11 1.6 Pieno pramonės nuotekos... 11 1.7 Fuzelio junginiai... 12 2. Darbo metodika... 14 2.1 Pagrindinės tyrimų kryptys ir jų pagrindimas... 14 2.2 Tyrimų metodai... 15 2.3 Tyrimų objektai... 17 2.4 Matematinė statistinė duomenų analizė... 17 3. Rezultatai... 18 3.1 Raugalo fizikiniai cheminiai rodikliai... 18 3.2 Etilo alkoholio, metanolio ir aukštesniųjų alkoholių kiekis etanolyje pagamintame iš pieno pramonės atliekų... 21 3.3 Raugalo, sucukrinto biokatalizatoriais, fizikiniai cheminiai rodikliai... 23 3.4 Aukštesniųjų alkoholių kiekis, susidaręs išrūgas fermentuojant sucukrinus biokatalizatoriais... 25 4. Rezultatų aptarimas... 31 Išvados... 34 Literatūros sąrašas... 35 Priedai... 38 3

SANTRAUKA Pieno pramonės šalutinių produktų perdirbimas į etanolį, taikant aerobinę fermentaciją Giedrius Dzikas Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas Prof. dr. Elena Bartkienė Darbas parengtas 2013 2016 m. Lentelių skaičius darbe 6 Paveikslėlių skaičius darbe 18 Trumpas darbo apibūdinimas. Nustatyti etanolio, pagaminto perdirbant pieno pramonės šalutinius produktus kokybiniai ir kiekybiniai parametrai. Šalutinių produktų konversija į etanolį buvo atliekama ţaliavos sucukrinimui naudojant skirtingus fermentus bei fermentacijai aerobines ir anaerobines sąlygas. Darbo tikslas - atlikti pieno pramonės šalutinių produktų fermentaciją ir įvertinti gauto etanolio kokybinius ir kiekybinius parametrus. Darbe panaudoti metodai: Pieno perdirbimo šalutiniai produktai buvo fermentuoti Kluyveromyces marxianus ir Kluyveromyces lactis mielėmis, laktozės sucukrinimui prieš fermentaciją naudotos pieno rūgšties bakterijos (Lactobacillus sakei, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus) ir fermentus, fermentacija vykdyta aerobinėmis ir anaerobinėmis sąlygomis. Mėginiams įvertintas ph, refraktometrijos metodu nustatytas sausųjų medţiagų kiekis, dujų chromatografijos metodu atlikta kiekybinė ir kokybinė aukštesniųjų alkoholių ir kiti fuzelių junginių analizė. Duomenys apdoroti statistiškai, įvertinta skirtingų faktorių įtaka aukštesniųjų alkoholių ir kiti fuzelių junginių kiekiui. Išvados. Modeliuojant tvarios gamybos schemas, pieno produktų gamybos šalutinių produktų perdirbimui naudojant savitus mikroorganizmus ir sucukrinimo technologijas galima gauti vertingus maisto ir lengvojoje pramonėje produktus: etanolį, aukštesniuosius alkoholius, esterius, aldehidus. Raktiniai ţodţiai: išrūgos, aukštesnieji alkoholiai, etanolis, atliekų perdirbimas. 4

SUMMARY Dairy industry bioproducts conversion to ethanol in aerobic and anaerobic conditions Giedrius Dzikas Master s Theisis Work tutor prof. dr. Elena Bartkiene The work was performed in the Lithuanian University of Health Sciences, Veterinary Academy, Department of Food Safety and Quality. There are 6 tables and 18 pictures. Purpose of work: To evaluate qualitative and quantitative parameters of ethanol produced from the dairy industry bioproducts. To adapt for fermentation of raw material different yeast strains and for saccharification different enzymes, under aerobic and anaerobic conditions. Tasks of work: to perform the dairy industry bioproducts fermentation and to evaluate quality and quantity of ethanol. Samples evaluated for ph, refractometry determined solids content, gas chromatography conducted quantitative and qualitative higher alcohols and other compounds of fusel oil analysis. The data were processed statistically evaluated different factors on higher alcohols and other compounds in fusel oil. The methods used in experiment: Dairy industry bioproducts were fermented with Kluyveromyces marxianus and Kluyveromyces lactis yeasts, lactose hydrolysis was performed by using lactic acid bacteria (Lactobacillus sake, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus) and different enzymes, ethanol production was performed under aerobic and anaerobic conditions. ph of samples, dry matter (by using refractometeric method), higher alcohols and other fusel compounds (by using gas chromatography) in produced ethanols were evaluated. Also, statistical analysis of result was performed the influence of different factors on ethanol quantity and safety parameters was evaluated. Results: By designing sustainable food production schemes, and incorporation in dairy byproducts processing with specific micro-organisms and enzymes it is possible to convert bioproducts to valuable raw material (ethanol, higher alcohols, esters, aldehydes), which could be used for food and other industry. Keywords: whey, higher alcohols, ethanol, waste recycling. 5

ĮVADAS Pieno pramonė yra vienas iš pagrindinių pramoninių nuotekų šaltinių Europoje. Šios pramonės pagrindas yra ţaliavinio pieno gamybos ir perdirbimo į tokius produktus kaip jogurtas, ledai, sviestas, sūris, varškė, grietinė ir įvairių rūšių desertai. Produktai gaunami pasitelkus įvairius procesus, pavyzdţiui, pasterizavimą, koaguliaciją, filtravimą, centrifugavimą, atšaldymą ir t.t. Dėl skirtingų produktų ir procesų savitumo pieno pramonės nuotekų fizikiniai cheminiai ir mikrobiologiniai rodikliai gali labai skirtis, jos labai priklauso nuo galutinio produkto, sistemos tipo ir veikimo metodo. Nuotekos daţniausiai sudaro įvairių praskiedimų pieno (arba transformuotų produktų), nuoplovų vandens, kuriame šarmų ir rūgščių pusiausvyra skiriasi nuo panaudotų chemikalų technologinei įrangai ir paviršiams plauti. Išrūgos yra pagrindinis pieno pramonės šalutinis produktas. Įprastai išrūgos sudaro apie 85-95 proc. perdirbamo pieno kiekio, todėl senosios perdirbimo įmonės buvo statomos šalia vandens telkinių, į kuriuos buvo nukreipiamos visos perdirbimo atliekos. Šiandien tokios nuotekos neleidţiamos tekinti net į bendrą komunalinių nuotekų sistemą, nes tokios sistemos yra nepajėgios išvalyti ir nukenksminti nuotekas, kuriose didelė koncentraciją organinių reaktingų medţiagų. Šias nuotekas problematiška perdirbti dėl didelio angliavandenių kiekio (laktozės), maţo šarmingumo, greito rūgštėjimo ir metabolitų kaupimosi degraduojant laktozei (propiono rūgštis, etanolis ir acetatas). Tai gali inhibuoti fermentacijos reakcijas, siekiant veiksmingo fermentacijos proceso, reikia papildomo terpės šarminimo. Išrūgos yra pripaţįstamos kaip vertingas bioaktyvių junginių šaltinis, jos sudarytos iš laktozės, baltymų ir mineralinių druskų. Vis dėlto pagrindinė sudedamoji dalis yra laktozė, kuri sukelia reikšmingas aplinkosaugines problemas. Dėl didelio laktozės kiekio siekiama išrūgas perdirbti į bioetanolį. Taip būtu galima nukenksminti nuotekas, o gautą etanolį panaudoti kaip iškastinio kuro pakaitalą, maţinant priklausomybę nuo iškastinio kuro, kurio panaudojimas didina į aplinką išsiskiriančio CO 2 kiekį. Etanolio fermentacijai naudojamos ţaliavos, kurių sudėtyje yra daug angliavandenių. Tarp plačiausiai naudojamų ţaliavų etanolio gamyboje yra celiuliozė (šiaudai, cukranendrių išspaudos, makulatūra), krakmolo turinčios medţiagos (kukurūzai, kviečiai, ryţiai), cukrus (cukranendrių, cukrinių runkelių ir melasa). Panaudojus pramonines atliekas kaip ţaliavas etanoliui gaminti būtų išspręsta atliekų tvarkymo problema bei etanolio gamybai tiekiama pigi ţaliava. Susidarančius aukštesniuosius alkoholius etanolyje, iš frakcionavus, galima būtų panaudoti kosmetikos, chemijos ir farmacijos pramonėje [1]. Etanolio gamybai naudojant celiuliozės turinčias ţaliavas technologinis procesas nėra efektyvus ekonomiškai, dėl savo specifiškumo pirma atskiriamas ligninas, jis hidrolizuojamas (tai sudaro didţiausias gamybos išlaidas), gauti maţesnės molekulinės masės angliavandeniai 6

fermentuojami ir gautas raugalas po fermentacijos distiliuojamas. Iš krakmolo turinčių ţaliavų gamyba prasideda nuo sucukrinimo, fermentavimo ir distiliavimo. Procesas nesudėtingas, tačiau gamybos kaina didelė dėl ţaliavų, turinčių krakmolo, kainos. Tarp pigių ir patogių ţaliavų būtų melasa ir pieno išrūgos, kurios yra, atitinkamai, cukraus ir pieno pramonės atliekos. Dauguma tyrėjų etanolio gamybai siūlo naudoti išrūgas dėl didelio angliavandenių kiekio ir ekologinių sumetimų. Nors etanolio gamyboje daţniausiai naudojamos Saccharomyces genties mielės, jos nepajėgios fermentuoti laktozę į etanolį dėl galaktazės fermentų trūkumo. Todėl rekomenduojama rinktis Kluyveromyces genties mieles, kurios pajėgios fermentuoti laktozę i etanolį [2]. Darbo tikslas: atlikti pieno pramonės šalutinių produktų fermentaciją ir įvertinti gauto etanolio kokybinius ir kiekybinius parametrus. Darbo uţdaviniai: 1. Atlikti pieno pramonės šalutinių produktų fermentaciją ir įvertinti gauto raugalo pagrindinius parametrus. 2. Įvertinti etanolio, gauto iš pieno pramonės šalutinių produktų, kiekybinius parametrus. 3. Išanalizuoti etanolio, gauto iš pieno pramonės šalutinių produktų, kokybinius rodiklius, t.y., aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių kiekį jame. 4. Nustatyti koreliacinius ryšius tarp raugalo parametrų ir aukštesniųjų alkoholių bei kitų fuzelio junginių etanolyje. 5. Atlikti palyginamąją gautų rezultatų analizę. 7

1. LITERATŪROS APŢVALGA 1.1 Pieno išrūgų charakterizavimas Pieno išrūgos yra gelsvai ţalios spalvos skystis, jos susidaro nusodinus pieno kazeiną sūrių ir varškės gamybos proceso metu. Gelsvą spalvą joms suteikia riboflavinas (vitaminas B2) [3]. Pieno išrūgose yra 93 94 proc., vandens, laktozės 4,5 6 proc., baltymų 0,6 1,1 proc., mineralų 0,8 1 proc., pieno rūgšties 0,05 0,9 proc., riebalų 0,06 0,5 proc. Maţesni kiekiai nustatomi kitų komponentų: citrinų rūgšties, nebaltyminių azoto junginių (karbamido ir šlapimo rūgšties, B grupės vitaminų ir t.t [4]. Išrūgose buvo nustatyti: B-laktoglobulinas, A-laktoglobulinas, imunoglobulinas, albuminas ir laktoferino. Tai skatina pieno išrūgų perdirbimą į baltymų koncentratus [5]. Pieno išrūgose lieka didţioji dalis laktozės 39-60 kg m -3, tai sudaro 90 proc. visos piene esančios laktozės [6]. Pieno išrūgų vandenilio jonų koncentracija svyruoja nuo 3,8 iki 7 ph. Pieno išrūgos būna dviejų tipų: Rūgštinės ph 3,8 4,8 gaunamos po fermentacijos arba pridedant organinių ar neorganinių rūgščių; Saldţios ph 4,8 7 gaunamos pridedant proteolitinių fermentų tokių kaip chimozinas. Išrūgose gali būti neorganinių junginių: NaCl, KCl, kalcio druskų, kurios į išrūgas patenka technologinio proceso metu. Kiti veiksniai, turintys įtakos biologiniams procesams yra laisvas amoniakas, kalis, riebalų rūgštys ir kt [7]. 1.2 Pieno išrūgų perdirbimas Pieno išrūgos yra pagrindinis sūrių gamybos šalutinis produktas. Dėl savo cheminės sudėties, jos yra pripaţintos bioaktyvių junginių šaltiniu. Nepaisant to, didţiausia koncentracija išrūgose yra laktozės, kurios utilizavimas sudaro daug aplinkosauginių problemų. Išrūgų panaudojimas tapo iššūkiu, dėl padidėjusios sūrių gamybos. Dauguma pieno perdirbimo įmonių buvo statomos šalia vandens telkinių, upių tam, kad nereikalingą šalutinį produktą būtų galima be papildomo apdirbimo į jas nukreipti [8]. Pieno išrūgas buvo bandoma nukreipti į komunalinių nuotekų sistemas, taip siekiant jas atskiesti su miesto nuotekomis, jas išvalius leisti į vandenynus ir upes. Tačiau net ir praskiestos su nuotekomis jos stabdo mikroorganizmų, naudojamų vandens valymui, veiklą [9]. Galimi trys pieno išrūgų perdirbimo būdai. Pirmas yra pagrįstas revalvacijos taikymo technologija. Ši technologija skirta susigrąţinti iš išrūgų aukštos maistinės ir funkcionaliosios vertės junginius (baltymus ir laktozę). Antrasis būdas paremtas biologiniais procesais. Biologiniai procesai 8

taip pat gali būti taikomi kaip revalvacija. Pavyzdţiui, laktozės ir baltymų hidrolizė. Kontroliuojama fermentacija: pieno rūgšties gamyba, sviesto rūgšties, butanolio, acto rūgšties, glicerolio, acetono, etanolio, vandenilio, pavieniai ląstelių baltymai. Trečiasis būdas paremtas fizikinių cheminių procesų tokių kaip krešėjimo flokuliacijai, ozonavimu, terminiu ir izoelektriniu pagreitinimu, elektrochemine oksidacija. Pieno išrūgų perdirbimas buvo sutelktas į revalvaciją ir biologinius procesus, o pieno išrūgų nuotekų perdirbimas - į biologinių ir fizikinių procesų derinį [8]. Iš sūrio apdorojimo nuotekų buvo sudarytas bandomasis vandenilio (H 2 ) gamybos prototipas, tamsioje aplinkoje ir anaerobinės fermentacijos sąlygomis. Aerobinis skaidymas yra geras sprendimas taupant energiją ir maţinant aplinkos taršą. Juo pasiekiamas didelis energijos efektyvumas ir proceso paprastumas, palyginus su kitais atliekų perdirbimo būdais. Tačiau nepaisant šių privalumų, aerobinis skaidymas nėra plačiai paplitęs pieno pramonėje, dėl lėtos reakcijos, procesų stabilumo išlaikymo (terpės sparčiai rūgštėja). Publikuotas atliktas eksperimentas, kurio metu išrūgos buvo perdirbamos naudojant mišrių mikrobų kolonijas termofilinėmis sąlygomis. Rezultatai parodė, kad pieno perdirbimo nuotekos turėjo įtakos vandenilio kiekiui, tačiau pasiekti aukštą ir stabilią vandenilio gamyba iš nesterilių nuotekų yra labai sudėtinga [10]. 1.3 Mielių panaudojimas perdirbant pieno išrūgas Siekiant perdirbti kuo didesnį kiekį pieno išrūgų į alkoholį buvo atliekami tyrimai ir parenkamos mielių padermės, kurios būtų tinkamiausios didelį kiekį laktozės turinčios ţaliavos skaidymui. Kourkoutas ir kiti mokslininkai siūlo naudoti Kluyveromyces fragilis arba Kluyveromyces marxianus mieles [11]. Tiriant Kluyveromyces marxianus mieles, didţiausiu etanolio produktyvumu pasiţymėjo K. marxianus CBS 6556, BMT 4086 ir BMT 2653, o maţiausiu - K. marxianus UFMG 95 302.2 UFMG 95 205.3 ir UFMG 95 270,1 padermės [12]. K. marxianus išsiskiria savo didele metabolitų įvairove ir dideliu polimorfizmo laipsniu, kurį įrodo įvairios aplinkos terpės, iš kurių jos buvo izoliuotos [13]. Be laktozės fermentacijos K. marxianus turi kitą pageidaujamą savybę, t.y., jos yra termotolerantiškos, greitai auga biomasė, greitas metabolizmas ir didelės įvairovės fermentų išskyrimas, pvz., pentozes, heksozes ir disacharidus skaidančių [14]. Taip pat gerų rezultatų buvo pasiekta išrūgas fermentuojant Saccharomyces cerevisiae mielėmis. Jos turi aukštą fermentacinį pajėgumą ir toleruoja dideles etanolio koncentracijas substrate (iki 20 proc., (v / v) etanolio). Panašūs rezultatai gaunami ir naudojant Sake mieles [15]. 9

Fermentuojant pieno išrūgas K. fragilis mielėmis didţiausia etanolio koncentracija (55,9 kg m -3 ) buvo gauta, kai pradiniame fermentacijos etape buvo panaudota 150 kg m -3 koncentracijos laktozės [16]. K. lactis yra viena iš labiausiai tiriamų mielių rūšių ir tapo sisteminių tyrimų objektu, daţnai jų savybės lyginamos su S. cerevisiae mielėmis. Vėliau buvo susidomėta K. lactis dėl jų efektyvios laktozės apykaitos ir jų panaudojimo biotechnologijų schemose [17]. K. lactis nėra populiarios etanolio gamyboje, jos naudojamos biotechnologinėse schemose heterologinių baltymų gamyboje. Mallu ir kt. naudojant sūrio išrūgas, kaip terpę gaminant etanolį, fermentacijai naudojant K. lactis [18]. 1.4 Etanolio gamyba iš pieno išrūgų Dėl maţo laktozės kiekio tiesioginės fermentacijos būdu iš pieno išrūgų gaunamo etanolio koncentracija yra maţa (2-3 proc., v/v). Norint padidinti etanolio išeigą, fermentaciją reikia pradėti su didesniu laktozės kiekiu raugale, kurį galima pasiekti koncentruojant išrūgas, pvz., naudojant ultrafiltracijos ir / arba atvirkštinio osmoso procesus [19]. Alkoholio fermentacijos metu be etanolio susidaro ir kiti šalutiniai produktai: karboniliniai junginiai, aukštesnieji alkoholiai, esteriai, rūgštys ir acetatai. Visi jie veikia etanolio kokybę. Šalutinių produktų sudėtis ir koncentracija gali labai skirtis, priklausomai nuo daugelio faktorių. Kai kurių junginių koncentracija gali siekti iki šimtų mg/l, tačiau didesnės jų dalies koncentracija siekia tik ng/l. Panaudojant 1g Kluyveromyces marxianus ATCC 10022 mielų ekstrakto ir 20 g/l laktozės, tiriant distiliatą chromatografijos metodu buvo identifikuota dešimt pagrindinių junginių (6 aukštesnieji alkoholiai, 1 esterio, 1 aldehidų ir 2 rūgščių), kurių koncentracija viršijo 6,0 mg /l. Taip pat nustatyta 30 kitų komponentų, kurių koncentracija buvo ţenkliai maţesnė (7 aukštesnieji alkoholiai, 11 esteriai, 3 aldehidai, 5 rūgštys ir 4 terpenai), jų koncentracija kito nuo 26,5 iki 1740 lg/l. Šių junginių kiekis priklauso nuo ţaliavos kokybės ir tipo, fermentacijos proceso sąlygų ir daugelio kitų veiksnių [20]. Pagrindiniai lakieji junginiai, susidarantys fermentuojant išrūgas: izoamilo alkoholis, (3- metil-1-butanolio), izobutanolio (2-metil-1-propanolio), 1-propanolio, ir 2-metil-1-butanolio. Tarp esterių didţiausia koncentracija nustatyta etilo acetato (138 mg/l), iš rūgščių - acto rūgšties [21]. Acetaldehido koncentracija išrūgų distiliate buvo apie 24 kartus maţesnė nei aukštesniųjų alkoholių (3-metil-1-butanolio, 887 mg/l). Bendra aldehidų koncentracija buvo 36,8 mg/l, kuri buvo 52 kartus maţesnė nei bendra aukštesniųjų alkoholių esančių etanolyje koncentracija. Tokie rezultatai parodo, kad aldehidai, esantys išrūgų distiliate, neturėtų neigiamai veikti juslinių savybių. 10

Pagrindiniai lakieji komponentai nustatyti etanolyje, pagamintame iš išrūgų, tai 2-metil-1- propanolis, 3-metil-1-butanolis, propanolis, etilo acetatas, izoamilo acetatas ir acetaldehidas [16]. Be to, etilo acetatas gali būti traktuojamas kaip bakterinio uţterštumo indikatorius, nes jo būvimas parodo kad ţaliava prieš distiliavimą buvo netinkamai laikoma [22]. Raugalo fermentacijai įtakos turi technologinio proceso parametrai: temperatūra, maišymo greitis, pradinės kultūros savybės, substrato koncentracija, ištirpęs deguonis ir kt. Todėl tinkama šio proceso kintamųjų kontrolė yra labai svarbi, norint pasiekti aukštus rezultatus [16]. 1.5 Etanolio gamyba Etanolio gamybos technologijos raida ir augimas yra ekologiškai saugių technologijų skatinimas, dėl naujų strategijų energijos gavybos iš alternatyvių atsinaujinančių šaltinių (ţemės ūkio augalų, lignoceliuliozės biomasės ir šlutinių gamybos produktų) [23]. Šiuo metu labiausiai paplitę etanolio gamybai naudoti atsinaujinančius šaltinius (cukranendres, cukrinius runkelius, kukurūzus, bulves). Tačiau lignoceliuliozė kaip ţaliava yra pigesnė nes ji yra gausiausiai prieinama ţaliava ţemėje. Tai augalai arba augalinės medţiagos, kurios nėra naudojamos maistui arba pašarams. Jos apdorojimas ir panaudojimas yra sudėtingas procesas. Pirmiausiai hidrolizės būdu išgaunami fermentuojamieji angliavandeniai, o tada fermentacijos būdu gaminamas bioetanolis, kuris gali būti alternatyva iškastiniam kurui [24]. Etanolis yra bespalvis ir degus skystis, jis turi būdingą alkoholiui kvapą ir deginantį skonį. Jis gali maišytis su vandeniu ir benzinu įvairiais santykiais, dėl jame esančių vandenilinių jungčių. Etanolio lydymosi temperatūra -114,3 o C, virimo temperatūra 78,4 o C, ph 7,0. Dėl savo šių svybių lengvai pritaikomas įvairiose pramonės šakose: maisto, gėrimų, farmacijos, kosmetikos [25]. 1.6 Pieno pramonės nuotekos Pieno pramonė yra viena pagrindinių nuotekų šaltinių Europoje. Šios pramonės pagrindiniai sektoriai, tai ţaliavinio pieno perdirbimas į jogurtus, ledus, sviestą, sūrį ir įvairių rūšių desertus. Technologija paremta skirtingais procesais, pavyzdţiui, pasterizavimo, koaguliacijos, filtracijos, centrifugavimo, atšaldymo ir t.t. Pieno perdirbimo nuotekos savo charakteristika gali skirtis, priklausomai nuo galutinių produktų, technologinio proceso, perdirbimo įrenginių. Šias nuotekas daugiausiai sudaro skirtingų skiedimų pienas (arba perdirbti produktai) ir plovimo vanduo, kuriame yra šarminių ir rūgštinių chemikalų, atsirandančių įrenginių ir taros plovimo metų. Nuotekų ph 4 13,5, laktozės kiekis 0,03 44 g/l, baltymų kiekis 940 x 10-6 33,5 g/l [26]. 11

Įprasti išrūgų nuotekų perdirbimo būdai grindţiami anaerobinėmis ir aerobinėmis sąlygomis. Tačiau daugelis tyrėjų teigia, kad anaerobinis procesas yra vienintelis perspektyvus ekologiškas išrūgų nuotekų valymo būdas [27]. 1.7 Fuzelio junginiai Fuzeliai yra šalutiniai etilo alkoholio gamybos produktai, susidarantys fermentacijos ir pašalinami distiliuojant. Jų kokybinė sudėtis ir kiekis priklauso nuo panaudotos ţaliavos, fermentacijos ir distiliavimo sąlygų, pašalinimo iš etilo alkoholio metodų. Dideli fuzelių kiekiai nustatomi galutiniame produkte, kai netinkamai pasirenkamos distiliacijos proceso sąlygos. Šaldomuoju distiliavimo proceso metu fuzelių kiekis nesumaţėja, o atvirkščiai, padidėja jų koncentracija. Susidarančių fuzelių kiekis priklauso nuo fermentacijos temperatūros, ph (ţemesniame susidaro daugiau), kai mielių veikla apribojama prieinamų azoto junginių maţu kiekiu substrate. Daţniausiai susidaro: metanolis, izobutanolis, n propanolis, amilo alkoholis, n butanolis, izoamilo alkoholis, 2-butanolis, etilacetatas, metilacetatas, acetaldehidas. Gauti esteriai gali būti panaudojami pramonėje kaip tirpikliai, kvapiųjų medţiagų ekstraktai ir medicinoje [28]. Tiesioginis fuzelių panaudojimas yra ribotas, todėl didelė jų dalis yra utilizuojami dėl savo nepageidaujamos tamsiai rausvos spalvos ir nemalonaus kvapo. Tačiau tyrimai parodė, kad fuzelis yra vertinga ţaliava sintetinant kitus chemikalus, pavyzdţiui, baltymus ir / arba esterius [29]. Fuzelis yra 2-5 anglies atomų alkoholis, tokių kaip n-propanolio, izo-butanolio ir izo-amilo alkoholio mišinys. Fuzeliai daţniausiai susidaro etanolio fermentacijos procese kaip šalutinis produktas. Daugiausiai susidaro alifatinių alkoholių, visų priemaišų molekulinis svoris yra didesnis nei etanolio [30]. Nuo 1 iki 11 l fuzelių išgaunama distiliuojant 1000 l etanolio, priklausomai nuo naudojamo substrato, azotinių medţiagų, fermentacijos sąlygų ir distiliacijos komponentų. Distiliuotuose alkoholiniuose gėrimuose yra lakiųjų junginių (fuzelio alkoholių, riebalų rūgščių, esterių ir kitų), kurie atsiranda fermentacijos, distiliavimo ir laikymo metu. Šių junginių identifikavimas yra labai svarbus, ne tik siekiant įvertinti gėrimo juslines savybes, bet ir nustatyti nelegalius alkoholinius gėrimus ar parametrų nukrypimus technologinio proceso metu. Fuzeliai susidaro esant tam tikroms fermentacinėms sąlygoms, įtakos turi fermentacijos temperatūra, raugalo ph vertė, maţas azoto kiekis, mielių veikla. Didelė fuzelių koncentracija gėrimui suteikia nepageidaujamą skonį [31]. Esteriai vieni iš svarbiausių organinių junginių. Jie sudaryti iš trumpos grandinės, 2 8 anglies atomų riebalų rūgščių ir alkoholio grupės. Jie yra svarbūs skonio ir kvapo komponentai maisto, gėrimų ir farmacijos pramonėje. Dauguma alkoholių acetatų turi įvairių paskirčių. Etilo, izobutilo, 12

amilo ir izoamilo acetatai daţnai naudojami kaip kvapiųjų medţiagų sudedamosios dalys. Izoamilo esteriai (ypač izoamilo acetatas) maistui suteikia stiprų bananų ir kriaušių kvapą ir skonį. Per metus maisto pramonėje jų yra sunaudojama apie 74000 kg [28]. Naturalaus skonio esterių išskirtų iš augalinių medţiagų palyginti nedaug. Daugiau yra ţinoma mikroorganizmų gaminančių iš paprastų maistinių medţiagų de novo sintezės metu. 13

2. DARBO METODIKA 2.1 Pagrindinės tyrimų kryptys ir jų pagrindimas Eksperimento metu atlikta etanolio gamyba laboratorinėmis sąlygomis iš išrūgų, filtrato, kanalizacijos nuoplovų, Cip vandens (vanduo iš įrengimų su rūgštimis ir šarmais, kuriais plaunami pieno įmonių įrengimai), gamybos efektyvumui didinti, naudojant įvairius biokatalizatorius, taikant aerobines ir anaerobines sąlygas. Mėginiai gauti iš Serbijos Mlekara pieno perdirbimo įmonės 2015 metais. Pieno perdirbimo šalutiniai produktai buvo fermentuoti su Kluyveromyces marxianus ir Kluyveromyces lactis mielėmis, jų aprašymas pateiktas 1 lentelėje, laktozės hidrolizei naudojant pieno rūgšties bakterijas (Lactobacillus sakei, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus) ir fermentus, aerobinėmis ir anaerobinėmis sąlygomis. Jų aprašymas pateiktas 2 lentelėje ir 3 lentelėje. Gautiems raugalo mėginiams nustatyta vandenilio jonų koncentracija, sausųjų medţiagų kiekis, etanolio išeiga tūrio procentais ir susidariusių aukštesniųjų alkoholių ir fuzelių junginių kiekiai. 1 lentelė. Eksperimente panaudotos mielės Pavadinimas Aprašymas Kluyveromyces marxianus Pasiţymi termotolerancija, greitu augimu, Kluyveromyces lactis proteolitiniu aktyvumu, galimybe fernetuoti laktozę. Sintetina etilo alkoholį fermentacijos ir sucukrinimo proceso metu. 2 lentelė. Eksperimente panaudotos pieno rūgšties bakterijos Pavadinimas Aprašymas Lactobacillus sakei Heterofermentinės bakterijos galinčios gaminti alkoholį arba pieno rūgštį iš laktozės. Pediococcus acidilactici Gamina bakteoricinus, auga įvairaus ph terpėse, Pediococcus pentosaceus termotolerantinės, fermentacijos proceso metu gamina pieno rūgštį, tačiau jautrios proteazių veiklai. 3 lentelė. Eksperimente naudoti biokatalizatoriai Pavadinimas Rekomenduojama darbinio tirpalo dozė Lactozyme 2600L β-galactosidazė 1ml/100 ml 0,8ml/100 ml Aprašymas Grybinė laktazė, aktyvumas 2600 AV/g tirpalo, skaldo laktozę iki monosacharidų gliukozės ir galaktozės Bakterinė laktazė, aktyvumas 12,6 AV/mg, skaldo laktozę iki monosacharidų gliukozės ir galaktozės 14

2.2 Tyrimų metodai Etilo alkoholio gamyba iš išrūgų, filtrato, įrengimo plovimo vandens ir kanalizacijos nuoplovų laboratorinėmis sąlygomis, fermentacijai panaudotos Kluyveromyces marxianus ir Kluyveromyces lactis mielės, buvo vykdyta lygiagrečiai aerobinėmis ir anaerobinėmis sąlygomis. 200 ml mėginio sumaišyta su 20 ml mielų ir fermentuota 48 valandas 34 C temperatūroje anaerobinėmis ir aerobinėmis sąlygomis. Etilo alkoholio gamyba hidrolizei panaudojant pienarūgštes bakterijas Lactobacillus sakei, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus ir Kluyveromyces marxianus mieles buvo vykdoma anaerobinėmis sąlygomis. 200 ml išrūgų mėginio sumaišyta su 20 ml mielų ir 1 ml pienarūgščių bakterijų, fermentuota 48 valandas 34 C temperatūroje. Atlikus gauto raugalo kiekybinę ir kokybinę analizę nustatytas etanolio kiekis buvo 1 tūrio proc., o aukštesniųjų alkoholių etanolyje nebuvo nustatyta (5 priedas), todėl tyrimas šia linkme nebuvo tęsiamas. Antrame etape etanolis buvo gaminamas iš keturių skirtingų išrūgų mėginių, prieš fermentaciją sucukrinimui naudojant fermentinius preparatus (Lactozyme 2600L ir β- galactosidase). Etilo alkoholio gamyba panaudojant katalizatorius buvo vykdyta anaerobinėmis sąlygomis. Mėginiui sudaryti buvo paimti 4 išrūgų mėginiai su skirtingais parametrais 4 lentelė. Fermentų darbiniams tirpalams paruošti naudotas 1 g Lactozyme katalizatoriaus, ištirpinto 25 ml distiliuoto vandens, ir 0,1 g β-galaktozidazės ištirpintos 10 ml distiliuoto vandens. Vienam mėginiui sunaudota 200 ml išrūgų ir 2 ml Lactozyme katalizatoriaus arba 1,6 ml β-galaktozidazės. Mėginys sucukrintas termostate 2 valandas 60 C temperatūroje. Po sucukrinimo anaerobinei fermentacijai į mėginius pridėta 1 ml K. lactis mielių, fermentacija vykdyta 48 valandas 34 C temperatūroje. Kontrolinis mėginys pagamintas be katalizatorių ir fermentuotas su K.lactis be apcukrinimo. 4 lentelė. Išrūgų mėginių pirminiai parametrai Mėginiai Prieš fermentacija Sausosios medţiagos sm ph IšrūgosA 0,7 4,43 IšrūgosB 2,1 4,51 IšrūgosC 3,2 5,62 IšrūgosD 3,8 5,27 Po 48 valandų fermentacijos mėginiai buvo nufiltruoti pro marlės filtrą ir įvertintas sausųjų medţiagų kiekis (proc.) bei vandenilio jonų koncentracija (ph) raugale. Distiliavimui paimta 100 ml raugalo ir distiliuota iki 50 ml distiliato. Gautas distiliatas panaudotas tolesniems tyrimams: įvertintas etanolio kiekis (tūrio proc.) ir atlikta aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelių junginių analizė chromatografijos metodu. Tyrimų etapai pateikti 1 paveikslėlyje. 15

Etilo alkoholio gamyba aerobiniu ir anaerobiniu būdu iš šalutinių pieno perdirbimo produktų, hidrolizei naudojant mieles ir pienarūgštes bakterijas Etilo alkoholio gamyba iš šalutinių pieno perdirbimo produktų naudojant mieles Raugalo ph įvertinimas Sausųjų medţiagų kiekio įvertinimas (SM) Mėginių paruošimas chromatografinei analizei Etilo alkoholio mėginiuose nustatymas (tūrio proc.) Aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių kiekio įvertinimas dujų chromatografijos metodu 1 pav. Ekspermento schema Aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių palyginamasis įvertinimas Mėginiuose vandenilio jonų koncentracija (ph) išmatuota ph metru Sartorius Professional Meter PP 15. ph metro elektrodo nurodyti gamintojo darbiniai parametrai yra šie: ph matavimo ribos nuo 0 iki 14; tiriamųjų mėginių temperatūra galima nuo -5 C iki 105 C; elektrodas laikomas 3 mol/l KCl tirpale. Prieš kiekvieno mėginio matavimą nukalibruojama buferiniu tirpalu. Tirpių sausųjų medţiagų kiekis mėginiuose nustatytas refraktometru Pal 3. Refraktometro darbiniai parametrai nurodyti gamintojo šie: matavimo diapazonas 0,0 93,0 proc., temperatūra 10 100 C. Gautas tirpių sausųjų medţiagų kiekis išreikštas proc., tiriamojo tirpalo. Kokybinė ir kiekybinė aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių analizė tirtuose mėginiuose atlikta dujų chromatografijos metodu. Naudota kolonėlė Zebron ZB WAX; Phenomenex. Atliekant tyrimą buvo nustatyta programa, pagal kurią nuo 60 C kolonėlės temperatūra iki 120 C pakelta per 10 minučių, keliant po 6 C per minutę. 16

Aukštesniųjų alkoholių ir kitų fuzelio junginių koncentracija (mg/ml) mėginiuose buvo apskaičiuota pagal gautus smailių plotus, lyginant juos su standartiniu, ţinomos koncentracijos aukštesniųjų alkoholių tirpalu (5 lentelė). 5 lentelė. Aukštesniųjų alkoholių koncentracijos standartiniame tirpale Standartas mg/l Metilacetatas 18,64 Propanolis 32,16 Acetaldehidas 62,80 Metanolis 79,10 Izobutanolis 161,6 Etilacetatas 180,40 Izoamiloalkoholis 330,00 Etilo alkoholio koncentracija (tūrio proc.) mėginiuose buvo nustatyta naudojant areometrų rinkinį, matuojamas tirpalas 20 C. Etilo alkoholio koncentracija (tūrio proc.) mėginiuose įvertinta pagal ţinynuose pateiktas tirpalo tankio lenteles. 2.3 Tyrimų objektai Tyrime buvo atlikta etilo alkoholio gamyba laboratorinėmis sąlygomis iš išrūgų, filtrato, kanalizacijos nuoplovų, Cip vandens (vanduo iš įrengimų su rūgštimis ir šarmais, kuriais plaunami pieno įmonių įrengimai) panaudojant mieles ir pieno rūgšties bakterijas aerobinėmis ir anaerobinėmis sąlygomis. Mėginiai gauti iš Serbijos Mlekara pieno perdirbimo įmonės. Mėginių pirminiai parametrai pateikti 6 lentelėje. 6 lentelė. Mėginių pirminiai parametrai Mėginio pavadinimas Sausosios medţiagos tūrio, proc. ph Išrūgos 6,2 ±0.2 5,32 ±0.1 Filtratas 22,2 ±0.3 5,55 ±0.2 CIP vanduo 0,2 ±0.1 6,99 ±0.3 Kanalizacijos nuoplovos 0,6 ±0.1 6,49 ±0.2 2.4 Matematinė statistinė duomenų analizė Mėginių paruošimas buvo kartotas 2 kartus, tiriant lygiagrečiai 3 mėginius. Matematinė statistinė tyrimo duomenų analizė atlikta, naudojant MS Excel programą. Statistiškai įvertintas skirtumo tarp rezultatų reikšmių patikimumas (P), variacijos koeficientas, standartinis nuokrypis, standartinė paklaida ir vidutinė vertė. Matematinė statistinė duomenų analizė atlikta Prism 3.0 statistinės programos paketu. 17

3. REZULTATAI 3.1 Raugalo fizikiniai cheminiai rodikliai Atlikus raugalo fizikinę cheminę analizę po 48 valandų fermentacijos Kluyveromyces lactis mielėmis anaerobinėmis ir aerobinėmis sąlygomis 1 priedas, buvo nustatyti skirtingi sausųjų medţiagų kiekiai mėginiuose 2 pav.. Didţiausiu sausųjų medţiagų kiekiu išsiskyrė 2KdO2 mėginys (0,6 proc.). Šis mėginys buvo gautas fermentuojant išrūgų filtratą, kurio pradinis sausųjų medţiagų kiekis buvo 22,2 proc., aerobinėmis sąlygomis (48 valandas 32 C temperatūroje). Sausųjų medţiagų kitimui aerobinės sąlygos fermentuojant K. lactis mielėmis turėjo mėginiui įtakos. Kiekis tūrio, proc. 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 Kd 2 Kd 3 Kd 4 Kd 1 Kd O2 2 Kd O2 3 Kd O2 4 Kd O2 Mėginiai 2 pav. Raugalo sausųjų medžiagų kiekis fermentuojant Kluyveromyces lactis mielėmis anaerobinėmis ir aerobinėmis sąlygomis. (1 išrūgos, 2 filtratas 3 vanduo iš įrengimų plovimo su rūgštimis ir šarmais, 4 kanalizacijos nuoplovos, Kd Kluyveromyces lactis, O 2 aerobinėmis sąlygomis; be O 2 anaerobinėmis sąlygomis). P= 0.021, P patikimas, kai P 0,05. Po 48 valandų fermentacijos Kluyveromyces marxianus mielėmis anaerobinėmis ir aerobinėmis sąlygomis (2 priedas), mėginiuose nustatyti skirtingi sausųjų medţiagų kiekiai 3 pav. Didţiausiu sausųjų medţiagų kiekiu išsiskyrė 2KmO2 mėginys (0,7 proc.). Šis mėginys buvo pagamintas iš išrūgų filtrato, kuriame sausųjų medţiagų kiekis buvo 22,2 proc., fermentuojant aerobinėmis sąlygomis 48 valandas 32 C temperatūroje. 18

Kiekis tūrio, proc 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 Km 2 Km 3 Km 4 Km 1 Km O2 2 Km O2 3 Km O2 4 Km O2 Mėginiai 3 pav. Raugalo sausųjų medžiagų kiekis fermentuojant Kluyveromyces marxianus mielėmis anaerobinėmis ir aerobinėmis sąlygomis. (1 išrūgos, 2 filtratas 3 vanduo iš įrengimų plovimo su rūgštimis ir šarmais, 4 kanalizacijos nuoplovos, Km Kluyveromyces marxianus, O 2 aerobinėmis sąlygomis; be O 2 anaerobinėmis sąlygomis). P= 0.04, P patikimas, kai P 0,05. Po fermentacijos K. lactis mielėmis (4 pav) ph daugiausiai sumaţėjo 3Kd (3,36) ir 3KdO2 (3,34) mėginiuose. Šie mėginiai buvo pagaminti iš vandens, susidarančio po įrengimo plovimo su rūgštimis ir šarmais (ph 6,99). Taip pat ph kitimas nustatytas 4Kd (8,80), 4KdO2 (9,02) mėginiuose. Pastarasis mėginys pagamintas iš kanalizacijos nuoplovų (ph 6,49). Likusiuose mėginiuose 1Kd, 2Kd, 1KdO2 ir 2KdO2 ph kito paklaidų ribose, lyginant su mėginių pradinėmis ph vertėmis prieš fermentaciją. Fermentacijos proceso metu aerobinės ir anaerobinės sąlygos K. lactis mielėms ph kitimui įtakos neturėjo. 19

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ph 1 Kd 2 Kd 3 Kd 4 Kd 1 Kd O2 2 Kd O2 3 Kd O2 4 Kd O2 Mėginiai 4 pav. Raugalo ph fermentuojant Kluyveromyces lactis mielėmis anaerobinėmis ir aerobinėmis sąlygomis. (1 išrūgos, 2 filtratas 3 vanduo iš įrengimų plovimo su rūgštimis ir šarmais, 4 kanalizacijos nuoplovos, Kd Kluyveromyces lactis, O 2 aerobinėmis sąlygomis; be O 2 anaerobinėmis sąlygomis). P= 0.002, P patikimas, kai P 0,05. Po mėginių fermentacijos K. marxianus mielėmis anaerobinėmis ir aerobinėmis sąlygomis didţiausias ph sumaţėjimas nustatytas 3Km (3,0), 4Km (8,66), 3KmO2 (3,63) ir 4KmO2 (8,7) mėginiuose (5 pav). Kituose mėginiuose ph kito paklaidų ribose. K. marxianus kaip ir K. lactis mielėms aerobinės ir anaerobinės sąlygos ph kitimui įtakos neturėjo. ph 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 Km 2 Km 3 Km 4 Km 1 Km O2 2 Km O2 3 Km O2 4 Km O2 Mėginiai 5 pav. Raugalo ph fermentuojant Kluyveromyces marxianus mielėmis anaerobinėmis ir aerobinėmis sąlygomis. (1 išrūgos, 2 filtratas 3 vanduo iš įrengimų plovimo su rūgštimis ir šarmais, 4 kanalizacijos nuoplovos, Km Kluyveromyces marxianus, O 2 aerobinėmis sąlygomis; be O 2 anaerobinėmis sąlygomis). P= 0.003, P patikimas, kai P 0,05. 20

3.2 Etilo alkoholio, metanolio ir aukštesniųjų alkoholių kiekis etanolyje pagamintame iš pieno pramonės atliekų Po 48 valandų fermentacijos su Kluyveromyces lactis mielėmis anaerobinėmis ir aerobinėmis sąlygomis, mėginiuose buvo nustatytas skirtingas etilo alkoholio kiekis 1Kd (1 tūrio proc.) ir 1KdO2 (2 tūrio proc.) 6 pav. Abu mėginiai pagaminti iš išrūgų, 1Kd mėginys buvo fermentuojamas anaerobinėmis, o 1KdO2 aerobinėmis sąlygomis. Kitiems mėginiams etilo alkoholio kiekiui deguonies prieinamumas prie substrato įtakos neturėjo. Tūrio, proc. 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 Kd 2 Kd 3 Kd 4 Kd 1 Kd O2 2 Kd O2 3 Kd O2 4 Kd O2 Mėginiai 6 pav. Etilo alkoholis, tūrio proc., fermentuojant K. lactis mielėmis. (1 išrūgos, 2 filtratas 3 vanduo iš įrengimų plovimo su rūgštimis ir šarmais, 4 kanalizacijos nuoplovos, Kd Kluyveromyces lactis, O 2 aerobinėmis sąlygomis; be O 2 anaerobinėmis sąlygomis). P= 0.001, P patikimas, kai P 0,05. Chromatografijos metodu nustatyti aukštesnieji alkoholiai ir įvertintas jų kiekis 1 priedas. Metanolis nustatytas 2Kd (672,7 mg/l) ir 2KdO2 (283,4 mg/l) mėginiuose (7 pav.). Abu mėginiai gauti iš išrūgų filtrato fermentuojant K. lactis mielėmis. Didesnis metanolio kiekis (672,7 mg/l) gautas fermentuojant anaerobinėmis sąlygomis, kituose mėginiuose metanolio nenustatyta. Etilo acetatas nustatytas viename mėginyje 2KdO2 (210,0 mg/l) (7 pav.). Šis mėginys pagamintas iš išrūgų filtratą fermentuojant K. lactis mielėmis aerobinėmis sąlygomis, abiejuose mėginiuose buvo gautas vienodas etilo alkoholio kiekis (1 tūrio proc.). Kitų aukštesniųjų alkoholių ir fuzelių junginių mėginiuose, fermentuotose K. lactis mielėmis aerobinėmis ir anaerobinėmis sąlygomis nenustatyta. 21

mg/l 800 700 600 500 400 300 Etilo acetatas, mg/l Metanolis, mg/l 200 100 0 1 Kd 2 Kd 3 Kd 4 Kd 1 Kd O2 2 Kd O2 3 Kd O2 4 Kd O2 Mėginys 7 pav. Etilo acetato ir metanolio kiekis fermentuojant K. lactis mielėmis etilo alkoholyje. (1 išrūgos, 2 filtratas 3 vanduo iš įrengimų plovimo su rūgštimis ir šarmais, 4 kanalizacijos nuoplovos, Kd Kluyveromyces lactis, O 2 aerobinėmis sąlygomis; be O 2 anaerobinėmis sąlygomis). P= 0.02, P patikimas, kai P 0,05. Po 48 valandų fermentacijos Kluyveromyces marxianus mielėmis anaerobinėmis ir aerobinėmis sąlygomis, mėginiuose nustatytas skirtingas etilo alkoholio kiekis tik viename iš mėginių 1Km (1 tūrio proc.). Jis buvo gautas fermentuojant išrūgas anaerobinėmis sąlygomis. Visuose kituose mėginiuose buvo gautas vienodas etilo alkoholio kiekis (2 tūrio proc.) 8 pav. Tūrio, proc. 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 Km 2 Km 3 Km 4 Km 1 Km O2 2 Km O2 3 Km O2 4 Km O2 Mėginiai 8 pav. Etilo alkoholio kiekis tūrio proc. fermentuojant K.marxianus mielėmis. (1 išrūgos, 2 filtratas 3 vanduo iš įrengimų plovimo su rūgštimis ir šarmais, 4 kanalizacijos nuoplovos, Km Kluyveromyces marxianus, O 2 aerobinėmis sąlygomis; be O 2 anaerobinėmis sąlygomis). P= 0.0001, P patikimas, kai P 0,05. Chromatografijos metodu nustatyti aukštesnieji alkoholiai ir įvertintas jų kiekis, 2 priedas. Metanolis nustatytas tik viename iš mėginių, 2KmO2 (621,4 mg/l) mėginyje, išrūgų filtratą 22

fermentuojant K.marxianus mielėmis aerobinėmis sąlygomis (9 pav.). Kitų aukštesniųjų alkoholių ir fuzelio junginių mėginiuose nenustatyta. mg/l 700 600 500 400 300 Metanolio kiekis, mg/l - 200 100 0 2 Km 3 Km 4 Km 1 Km O2 2 Km O2 3 Km O2 4 Km O2 Mėginiai 9 pav. Metanolio kiekis mg/l etilo alkoholyje fermentuojant K. marxianus mielėmis. (1 išrūgos, 2 filtratas 3 vanduo iš įrengimų plovimo su rūgštimis ir šarmais, 4 kanalizacijos nuoplovos, Km Kluyveromyces marxianus, O 2 aerobinėmis sąlygomis; be O 2 anaerobinėmis sąlygomis). 3.3 Raugalo, sucukrinto biokatalizatoriais, fizikiniai cheminiai rodikliai Atlikus raugalo fizikinę cheminę analizę po 48 valandų fermentacijos Kluyveromyces lactis mielėmis anaerobinėmis sąlygomis sucukrinimo taikant katalizatorius Lactozyme 260 L ir β galaktozidazę 3 priedas, nustatyti skirtingi sausųjų medţiagų kiekiai mėginiuose 10 pav.. Maţiausias sausųjų medţiagų kiekis nustatytas mėginiuose AF1 (1,8 proc.). BF1 (1,8 proc.), CF1 (2,8 proc.) ir DF1 (3,4 proc.), kurių sucukrinimui naudotas Lactozyme 260 L katalizatorius. Didţiausias sausųjų medţiagų kiekis nustatytas kontroliniuose mėginiuose A (5,3 proc.), C (6,2 proc.), D (5,2 proc.) fermentuotuose prieš tai netaikant laktozės fermentinės hidrolizės. Lyginant sausųjų medţiagų kiekį pradiniame mėginyje, sausųjų medţiagų sumaţėjo BF1 mėginyje (nuo 2,1 proc. iki 1,8 proc.). Visuose kituose mėginiuose sausųjų medţiagų kiekis padidėjo, lyginant su pradiniu. 23

Kiekis tūrio, proc. 7 6 5 4 3 2 1 0 Mėginys 10 pav. Sausųjų medžiagų kiekis po fermentacijos sucukrinimui naudojant biokatalizatorius (F1 Lactozyme katalizatorius, F2 - β galaktozidaze katalizatorius, ABCD išrūgų mėginiai, kontrolė mėginys be katalizatoriaus, patikimumas P < 0,0001, P patikimas, kai P 0,05.). Tai gali būti dėl intensyvaus mielių dauginimosi, esant palankesnėms sąlygoms (daugiau fermentuojamų cukrų terpėje). Po fermentacijos didţiausias ph sumaţėjimas nustatytas DF1 mėginyje (11 pav.). Pradinis šio mėginio išrūgų ph 5,27 sumaţėjo iki 3,78 (po fermentacijos). DF1 mėginyje išrūgos sucukrintos panaudojant Lactozyme katalizatorių. Kontrolinio B mėginio ph nepakito. ph 4,8 4,6 4,4 4,2 4 3,8 3,6 Mėginiai 3,4 11 pav. ph kitimas po fermentacijos su K.lactis mielėmis, sucukrinimui naudojant biokatalizatorius. (F1 Lactozyme katalizatorius, F2 - β galaktozidaze katalizatorius, ABCD išrūgų mėginiai, kontrolė mėginys be katalizatoriaus, patikimumas P < 0,0001, P patikimas, kai P 0,05.). 24

Etanolio kiekis kontroliniuose mėginiuose C ir D nustatytas maţiausias (1 proc.) (12 pav.). Didţiausias etanolio kiekis nustatytas AF1 (5 proc.) ir DF1 (5 proc.) mėginiuose, pastarieji mėginiai prieš fermentaciją buvo sucukrinti Lactozyme katalizatoriumi. Kituose F1 mėginiuose etanolio nustatyta 4 proc.. Etanolio maţesni kiekiai nustatyti F2 mėginiuose, kurie buvo sucukrinti β galaktozidaze. Iš kontrolinių mėginių, mėginyje A etanolio buvo nustatyta daugiausiai 4 proc., maţiausiai kontroliniuose mėginiuose C (1 proc.) ir D (1 proc.). Tūrio, proc. 6 5 4 3 2 1 0 Mėginiai 12 pav. Etanolio kiekis po fermentacijos su K.lactis mielėmis, sucukrinimui naudojant biokatalizatorius. (F1 Lactozyme katalizatorius, F2 - β galaktozidaze katalizatorius, ABCD išrūgų mėginiai, kontrolė mėginys be katalizatoriaus, patikimumas P < 0,0001, P patikimas, kai P 0,05.). 3.4 Aukštesniųjų alkoholių kiekis, susidaręs išrūgas fermentuojant sucukrinus biokatalizatoriais Acetaldehido kiekis etanolyje visuose išrūgų mėginiuose pavaizduotas 13 pav.. B išrūgų kontrolinis mėginys išsiskyrė iš visų, jame acetaldehido susidarė daugiausiai 756,2 mg/l. Šis mėginys buvo pagamintas be sucukrinimo katalizatoriais technologinės operacijos. Visuose D išrūgų mėginiuose acetaldehido kiekis etanolyje buvo nustatytas maţiausias DF1 (27,2 mg/l), DF2 (44,9 mg/l), D (59,04 mg/l). A ir C išrūgų mėginiuose acetaldehido kiekis etanolyje svyravo nuo 456,4 mg/l (AF1 mėginyje) iki 215,2 mg/l C išrūgų kontroliniame mėginyje. 25

mg/l 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Mėginiai 13 pav. Acetaldehido kiekis po fermentacijos su K.lactis mielėmis, sucukrinimui naudojant biokatalizatorius. (F1 Lactozyme katalizatorius, F2 - β galaktozidaze katalizatorius, ABCD išrūgų mėginiai, kontrolė mėginys be katalizatoriaus, patikimumas P = 0,0003, P patikimas, kai P 0,05.). Metilacetato nustatyta visuose mėginiuose 14 pav. Didţiausias jo kiekis (651,7 mg/l) nustatytas AF1 mėginyje. Šiame mėginyje sucukrinimui naudotas Lactozyme katalizatorius. DF1 mėginys pagamintas taip pat sucukrinimui naudojant Lactozyme katalizatorių, bet metilacetato kiekis etanolyje nustatytas maţiausias 10,3 mg/l. Kituose mėginiuose metilacetato kiekis etanolyje kito nuo 241,2 mg/l (AF2 mėginyje) iki 96,1 mg/l (DF2 mėginyje). Kontroliniuose mėginiuose metilacetato kiekis etanolyje kito nuo 178,3 mg/l (A kontrolinis) iki 82,4 mg/l (C kontrolinis). 26

mg/l 700 600 500 400 300 200 100 0 Mėginiai 14 pav. Metilacetato kiekis po fermentacijos su K. lactis mielėmis, sucukrinimui naudojant biokatalizatorius. (F1 Lactozyme katalizatorius, F2 - β galaktozidaze katalizatorius, ABCD išrūgų mėginiai, kontrolė mėginys be katalizatoriaus, patikimumas P = 0,005, P patikimas, kai P 0,05.). Vertinant visus išrūgų mėginius susidariusio etilacetato kiekis etanolyje pateiktas 15 pav. Išsiskyrė D kontrolinis mėginys, jame susidarė didţiausias etilacetato kiekis 120 mg/l, DF2 mėginyje etilacetato kiekis susidarė maţiausias 9,5 mg/l, šio mėginio sucukrinimui naudota β galaktozidazė. Kituose mėginiuose susidariusio etilacetato kiekis etanolyje kito nuo 15,4 mg/l AF1 mėginyje iki 78,7 mg/l CF2 mėginyje. A išrūgų kontroliniame mėginyje, etilacetato etanolyje susidarė 32,5 mg/l, jis didesnis mėginyje, pagamintame iš tų pačių išrūgų ir sucukrinimui panaudojus katalizatorius Lactozyme (15,4 mg/l AF1 mėginyje) bei β galaktozidazę (24,4 mg/l AF2 mėginys). B išrūgų kontroliniame mėginyje etilacetato etanolyje kiekis susidarė maţesnis 26,7 mg/l, lyginant su mėginais, kuriuose sucukrinimui panaudoti katalizatoriai. Lyginant C išrūgų mėginius, išsiskyrė CF2 mėginys (78,7 mg/l) šiam mėginiui sucukrinti naudota β galaktozidazė. Kontroliniame (C kontrolinis) mėginyje nustatytas maţiausias etilacetato kiekis etanolyje 24,7 mg/l. 27

mg/l 140 120 100 80 60 40 20 0 Mėginiai 15 pav. Etilacetato kiekis po fermentacijos su K. lactis mielėmis, sucukrinimui naudojant biokatalizatorius. (F1 Lactozyme katalizatorius, F2 - β galaktozidaze katalizatorius, ABCD išrūgų mėginiai, kontrolė mėginys be katalizatoriaus, patikimumas P = 0,0012, P patikimas, kai P 0,05.). Didţiausias propanolio kiekis etanolyje tarp išrūgų mėginių 16 pav. 423,5 mg/l susidarė AF2 mėginyje. Maţiausias propanolio kiekis etanolyje nustatytas DF2 mėginyje (54,7 mg/l). Šių mėginių sucukrinimui naudotas katalizatorius β galaktozidazė. Kontroliniuose mėginiuose propanolio kiekis etanolyje kito nuo 74,5 mg/l (C kontrolinis) iki 253,4 mg/l (D kontrolinis). Lyginant C išrūgų mėginiuose susidariusio propanolio kiekį etanolyje, jis svyravo maţiausiai. Mėginiuose jis kito nuo 72,5 mg/l (CF2) iki 81,2 mg/l (CF1). mg/l 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Mėginiai 16 pav. Propanolio kiekis po fermentacijos su K. lactis mielėmis, sucukrinimui naudojant biokatalizatorius. (F1 Lactozyme katalizatorius, F2 - β galaktozidaze katalizatorius, ABCD išrūgų mėginiai, kontrolė mėginys be katalizatoriaus, patikimumas P = 0,0007, P patikimas, kai P 0,05). 28

Susidariusio izoamiloalkoholio kiekis etanolyje kito nuo 478,3 mg/l (BF1) iki 1888,67 mg/l (DF2) 17 pav. BF1 mėginio sucukrinimui naudotas Lactozyme katalizatorius, o DF2 β galaktozidazė. Kontroliniuose mėginiuose izoamiloalkoholio etanolyje susidarė daugiausiai C (1537,84 mg/l) ir D (1312,5 mg/l), maţiausiai B kontroliniame mėginyje (478,6 mg/l). A išrūgų kontroliniame mėginyje etanolyje susidarė 785,2 mg/l izoamiloalkoholio, panašus kiekis, nepriklausomai nuo panaudoto katalizatoriaus sucukrinimui, susidarė AF1 714,8 mg/l ir AF2 825,6 mg/l mėginiuose. B išrūgų mėginiuose izoamiloalkoholio kiekis etanolyje kito nuo 478,3 mg/l BF1 mėginyje iki 563,8 mg/l BF2 mėginyje. C išrūgų mėginiuose sucukrintuose katalizatoriais izoamiloalkoholio kiekis etanolyje nustatytas maţesnis (CF1 852,6mg/l, CF2 956,3 mg/l), lyginant juos su C kontroliniu mėginiu (1537,84 mg/l). D išrūgų mėginiuose susidaręs izoamiloalkoholis etanolyje kito nuo 998,3 mg/l (DF1 mėginyje) iki 1888,67 mg/l (DF2 mėginyje). Abu mėginiai sucukrinti panaudojant katalizatorius. 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 mg/l Mėginiai 17 pav. Izoamiloalkoholio kiekis po fermentacijos su K.lactis mielėmis, sucukrinimui naudojant biokatalizatorius. (F1 Lactozyme katalizatorius, F2 - β galaktozidaze katalizatorius, ABCD išrūgų mėginiai, kontrolė mėginys be katalizatoriaus, patikimumas P < 0,000, 1 P patikimas, kai P 0,05). Izobutanolio išrūgų mėginiuose susidarė nuo 421,3 mg/l (BF1 mėginyje) iki 115,3 mg/l (A kontroliniame mėginyje) 18 pav. BF1 mėginys sucukrintas Lactozym katalizatoriumi. Iš kontrolinių mėginių išsiskyrė C kontrolinis (412,7 mg/l). Jame nustatytas didţiausias izobutanolio kiekis etanolyje, o A kontroliniame mėginyje nustatytas maţiausias 115,3 mg/l kiekis. 29

Izobutanolio etanolyje nenustatyta AF1 mėginyje, šis mėginys prieš fermentaciją sucukrintas Lactozyme katalizatoriumi. AF2 mėginyje nustatyta 322,5 mg/l izobutanolio etanolyje. mg/l 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Mėginiai 18 pav. Izobutanolio kiekis po fermentacijos su K.lactis mielėmis, sucukrinimui naudojant biokatalizatorius. (F1 Lactozyme katalizatorius, F2 - β galaktozidaze katalizatorius, ABCD išrūgų mėginiai, kontrolė mėginys be katalizatoriaus, patikimumas P < 0,0001, P patikimas, kai P 0,05). 30

4. REZULTATŲ APTARIMAS Šalutiniai pieno gamybos produktai buvo panaudoti etanolio gamybai ir įvertinta jo sauga aukštesniųjų alkoholių bei kitų fuzelio junginių aspektu. Išrūgų mėginiuose buvo nustatyti aukštesnieji alkoholiai (izoamilo alkoholis, izobutanolis, propanolis), esteriai (etilacetatas ir metilacetatas), iš lakiųjų junginių nustatytas - acetaldehidas. Kenksmingų sveikatai junginių (acetaldehidas ir etilacetatas) kiekis pagamintame etanolyje nustatytas maţas. Bendras aukštesniųjų alkoholių kiekis etanolyje kito nuo 1752,7 mg/l iki 2760,0 mg/l. Aukštesniųjų alkoholių koncentracija gėrimuose, kurių koncentracija neviršija 300 mg/l prisideda prie pageidaujamo gėrimo aromato formavimosi. Jei fuzelio koncentracija viršija 400 mg/l, tuomet fuzelis laikomas neigiamu faktoriumi [29]. Vertinant mėginius pagal šias normas visuose mėginiuose fuzelių koncentracija viršijo šias ribas. Visuose mėginiuose izoamilo alkoholio koncentracija etanolyje viršijo 400 mg/l iki 6 kartų. Etilacetato ir propanolio koncentracija mėginiuose neviršijo 300 mg/l (4 priedas). Atlikus statistinę (vienfaktorinę ANOVA) analizę, nustatyta reikšminga skirtingų mielių įtaka eitlacetato kiekiui etanolyje (F(4,549) = 9604,761, p = 0,037) (6 priedas). Etilacetatas gaunamas, veikiant etanolį alkoholio acetiltransferazėms ir hidrolizuojant esterazėms. Šie fermentai turi įtakos etilacetato koncentracijos didėjimui etanolyje fermentacijos proceso metu. Mielės turi įtaką acetiltransferazių ir esterazių aktyvumui, dėl to didėja etilacetato kiekis fermentuotame produkte [33]. Kitiems faktoriams mielių įtaka nebuvo statistiškai reikšminga (p > 0,05). Mielių slopinamąjį poveikį gali sukelti laktozės koncentracijos padidinimas substrate iki 150 mg/l. Etilacetato kiekiui etanolyje reikšmingos įtakos turėjo ir aplinkos sąlygos (F(4,549) = 9604,761, p = 0,037) 8 priedas. Aplinkos sąlygos kitiems faktoriams reikšmingos įtakos neturėjo (p > 0,05). Etilacetato koncentracija parodo ilgą laika saugotų ţaliavų galimą acto bakterijų poveikį. Be to etilacetato buvimas gali rodyti mikrobiologinį gedimą, dėl netinkamo ţaliavų saugojimo prieš fermentaciją. Etilo esteris ir acetaldehidas ir jų sumins kiekis yra pagrindiniai rodikliai vertinant distiliato kokybę. Pavyzdţiui, etilacetatas, turi didelį poveikį distiliatų juslinėms savybėms. Šis esteris suteikia malonų vaisių aromatą, tačiau distiliato aromatas tampa nemaloniu, kai etilacetato koncentracija viršija 150 mg/l [16]. Lyginant gautus etilacetato kiekius (9,5-120 mg/l) galima teigti, kad išrūgų mėginiai iki distiliacijos buvo laikomi tinkamomis sąlygomis. Etanolio susidarymui reikšmingą įtaką turėjo laktazės hidrolizei išrūgų mėginiuose naudotų pieno rūgšties bakterijų rūšis (F(7,878) = 1,421, p < 0,0001) (7 priedas). Kitiems faktoriams pieno rūgšties bakterijų rūšis įtakos neturėjo (p > 0,05). Tačiau skirtingi išrūgų mėginiai etanolio susidarymui reikšmingos įtakos neturėjo (F(2,626) = 3,563, p = 0,067) (9 priedas). Taip pat 31