Genų ekspresijos vertė ŪML rizikos įvertinimui E. Gineikienė

Transkriptas

1 Genų ekspresijos vertė ŪML rizikos įvertinimui E. Gineikienė

2 Leukeminės kamieninės ląstelės Dažniausiai taikomas ŪML gydymas chemoterapija ir KKL transplantacija. Didelė dalis relapsuoja. ŪML gydymui FDA patvirtintas naudojimas DNR alkilinančių medžiagų, topoizomerazės inhibitorių, antibiotikų, steroidų. Vis tiek ŪML prognozė yra prasta, ypač vyresnio amžiaus pacientams. Po standartinės indukcinės chemoterapijos pacientams taikoma skirtinga post remisinė gydymo strategija. Tai priklauso nuo pacientui nustatytų citogenetinių ir molekulinių radinių, kurie tradiciškai priskiria pacientą rizikos kategorijoms (bloga, tarpinė, gera). Tačiau dalis pacientų neatsako į gydymą, dalis iš jų relapsuoja, nepriklausomai nuo to, kad blogos rizikos veiksnių jiems nebuvo nustatyta. Pagrindinė leukemijos iniciacijos, progresijos, atsparumo gydymui ir ligos atkryčio priežastis leukeminės kamieninės ląstelės (LKL), turinčios daug kamieninių ląstelių požymių, tame tarpe pastovaus ląstelių rezervo palaikymo funkciją. LKL identifikavimas leukemijoje labai svarbus ligos diagnozei, prognozei, monitoravimui ir vaistų parinkimui. Tuo tarpu LKL biologinės savybės yra reikalingos vaistų kūrimui, taikininei terapijai, molekulinių mechanizmų išaiškinimui. Stem Cell Investig 2017;4:19

3 Leukeminių kamieninių ląstelių biologiniai požymiai (žymenys)

4 LKL paviršiaus žymenys CD34+ (adhezijos molekulė) CD38 (cyclic ADP ribose hydrolase glikoproteinas) derinys nėra LKL unikalus, tuos pačius žymenis turi ir normalios KKL. Interleukino 3 receptoriaus alfa grandinės CD123 ekspresuojamas ant CD34+CD38 ląstelių leukemijoje, o normalios CD34+CD28 KKL šio žymens ekspresijos neturi. CD123 ekspresija susijusi su blogu atsaku chemoterapijai ir blogina ŪML prognozę. TIM3 (T ląstelių Ig mucinas 3), neigiamas Th1 T ląstelių reguliatorius. Diskriminuoja KKL ir LKL, nes yra stipriai ekspresuojama LKL paviršiuje, o normalioms KKL jo ekspresija nebūdinga. Tai unikalus ŪML kamieninių ląstelių paviršiaus žymuo. CD32 (paviršiaus receptorius, B ląstelių ko receptorius) ir CD25 (interleukino 2 receptioriaus alfa grandinė) yra stipriai ekspresuojami LKL. KKL ir LKL diskriminacijai naudojama CD96 ekspresija (T ir NK ląstelių receptorius).

5 TIM 3 T ląstelių imunoglobulinas mucinas 3 (TIM 3) yra ląstelės paviršiaus glikoproteinas. TIM 3 yra ekspresuojamas CD34+/CD38 ŪML LKL frakcijoje ir daugumoje tolimesnių CD38+ pirmtakų, praktiškai visuose FABuose, išskyrus M3. Todėl TIM 3 yra beveik unikalus ŪML LKL paviršiaus taikinys. Nustatyta stipri koreliacija tarp TIM 3 ir galektino 9, kurio koncentracija ŪML pacientuose yra padidėjusi. Galektiną 9 daugiausia sekretuoja CD34+ ŪML frakcija su esančiomis joje LKL. Susijungus galektinui 9 ir TIM 3, leukeminėse ląstelėse aktyvuojasi NFκBirβ katenino signalo keliai, kurie indukuoja žymius genų ekspresijos pokyčius, tame tarpe MCL 1, kuris yra LKL išgyvenamumo faktorius.

6 LKL transkripcijos faktoriai Tranksripcijos faktoriai, kurie veikia ŪML LKL ir kurių funkcija lemia ŪML refrakterumą ir relapsą. Taikant chemoterapinį gydymą ir po jo LKL išgyvenamumas ir tolesnė evoliucija yra įtakojami p53 inaktyvacijos. p53 aktyvumas gali būti reguliuojamas histonų deacetilazėmis (HDAC). p53 aktyvumo reguliacijai, atsako chemoterapijai sustiprinimui ir LKL galimam naikinimui galima naudoti HDAC baltymus moduliatorius. Hipoksijos indukuojamas factorius 1α (HIF 1α) yra žemo deguonies lygio reguliatorius. HIF 1α taip pat dalyvauja KKL, LKL ląstelių atsinaujinimo procese. NF κbyra svarbus transkripcijos faktorius, dalyvaujantis ląstelių išgyvenamumo, proliferacijos, diferenciacijos procesuose. NF κb ekspresija KKL yra maža, tuo tarpu LKL žymiai padidėjusi. Todėl pagal NF κbekspresijos lygį galima atskirti KKL ir LKL, be to gali būti selektyvaus LKL išnaikinimo taikiniu, išsaugant KKL. β kateninas yra pagrindinis Wnt/β katenino signalinimo kelio dalyvis, kuris yra svarbus LKL atsinaujinimui, naviko atsiradimui ir vystymuisi, naviko atsinaujinimui ir gydymo atsparumui. Wnt/β katenino signalo kelias yra aktyvus tiek KKL, tiek LKL, tačiau β kateninas nereikalingas suaugusių KKL atsinaujimui. Farmakologinė β katenino inhibicija blogina LKL funkciją ir sumažina leukeminių ląstelių linijos augimą in vitro.

7 Kiti LKL biožymenys ir genai Viduląstelinis aktyvus deguonis (ROS) reaktyvūs metabolitai su deguonimi palaiko kamieninių ląstelių funkciją ir, deja, tam tikru laipsniu įtakoja leukemijos indukciją ir progresiją. LKL turi mažesnį ROS kiekį, nei KKL. Todėl gydymui galima panaudoti agentus, indukuojančius ROS superprodukciją, kas selektyviai išnaikintų LKL. LKL priklauso nuo telomerazės, kuri svarbi atsinaujinimo ir intensyvios proliferacijos palaikymui. Mikro RNR mir 34a, mir 126, mir 21, mir 196b ir mir dalyvauja LKL funkcijų reguliacijoje ir gali būti gydymo taikiniai.

8 LKL identifikacijos žymenys CD34, CD44, CLL 1, BMI 1 CD34... CD44 palaiko KKL/pirmtakų migraciją, proliferaciją, diferenciaciją ir išgyvenamą. LKL CD44 ekspresija yra padidėjusi, palyginus su normaliomis KKL. CLL 1 yra II tipo transmembraninis glikoproteinas, C tipo lectin like receptorius, dalyvaujantis LKL imuninėje reguliacijoje, ekspresuojamas ~90% ŪML atvejų. Normalioms KKL jo ekspresija yra silpna. BMI 1 (B lymphoma Mo MLV insertion region 1 homolog reguliuoja ląstelės ciklo inhibitorius, onkogenas) superekspresuojamas skirtinguose navikuose, tame tarpe krūties navikuose. Jis inhibuoja apoptozę, kontroliuoja ląstelių dalijimąsi. Funkcionuoja, kaip apsauginis agentas prieš oksidacinį stresą. Be BMI 1 aktyvus deguonis kaupiasi ląstelėse, aktyvuojami DNR pažaidų taisymo keliai ir indukuojami apototiniai procesai. BMI 1 superekspresija apsaugo LKL ir blastus nuo apoptozės. Šis reiškinys gali paaiškinti ryšį tarp BMI 1 superekspresijos ir blogos prognozės, t.y. atsparumo gydymui. Oncotarget 2016, Vol. 7, No. 36

9 Leukeminių kamieninių ląstelių žymenų ekspresija (CD34, CLL 1, TIM 3, BMI 1) Genų ekspresija RT qpgr CD34 ekspresija yra padidėjusi ( x) visuose FAB. CLL 1 didelė ekspresija nustatyta M1, M4, M5, ir M7 grupėse (3.5 6 X), ekspresija M2 grupėje mažesnė (2.5 X). BMI 1 labai stipriai ekspresuojamas M1 (13.2 X), M5 (17.5 X), mažiau M7 (4.3 X) grupėje ir tik apie X M2, M3, ir M4 grupėse. TIM 3 ekspresija ženkliai padidėjusi M1 M4 grupėse (12.7 ir 4.6 X), mažiau M2, M5 ir M7 grupėse ( X).

10 Ekspresija prognozei Įvertinus bendrą išgyvenamumą, pacientų su maža tirtų genų ekspresija išgyvenamumo trukmė ilgesnė, palyginus su didelės ekspresijos pacientais. BMI 1 ir CLL 1 ekspresija žymiai padidėjusi FAB M5 (17 X) kas rodo blogą išgyvenamumą. M4 ir M2 grupėse žymenų ekspresija yra padidėjusi saikingai (2.7 ir 3.5 X) ir yra geresnės prognozės.

11 Ekspresijos žymenys gydymo taikiniai

12 I. Trijų genų ekspresijos vertė 1. RNR sekvenavimas skirtingose mėginių populiacijose. 2. Univariacinė analizė, siekiant nustatyti visus genus su didžiausia įtaka bendram išgyvenamumui. 3. Multivariacinė analizė pridedant amžiaus faktorių. Atrinkimas tų genų, kurie reikšmingiausi bendram išgyvenamumui uni ir multivariacinėse analizėse. 4. Nustatyta 30 genų. Wilop et al. Journal of Hematology & Oncology (2016) 9:78

13 Reikšmingumo lygis didėja didėjant genų skaičiui. Ieškant geriausiai bendrą išgyvenamumą atspindinčio genų rinkinio vertinami įvairiausi deriniai tarp tų 30 genų ir mažiausia p reikšmė multivariacinėje analizėje, įtraukiant amžių ir citogenetinę rizikos grupę.

14 Geriausias prognostinis 3 genų derinys 1. C-X-C chemokitno receptorius 6 (CXCR6), 2. šeima su sekos homologija124b (FAM124B) 3. su adenilinciklaze asocijuotas baltymas 1 (CAP1) Didesnė CAP1 ir FAM124B ekspresija blogesnis išgyvenamumas Didesnė CXCR6 ekspresija geresnis išgyvenamumas Ekspresijos vertės nustatymas: atskirų genų rizikos laipsnis multivariacinėje analizėje +2 tšk, kad būtų tik teigiamos reikšmės, nustatoma vertė nuo 1 iki 4: +1 tšk; jei CAP1 ekspresija > už medianą 1 tšk; jei CXCR6 ekspresija > už medianą +1 tšk; jei FAM124B ekspresija > už medianą +2 tšk (kad gautųsi tik teigiamos reikšmės)

15 Rizikos įvertinimas pagal trijų genų ekspresijos vertę Ši ekspresijos vertė pavadinta Tri-AML score (TriAS). Pagal TriAS vertę pacientus galima sugrupuoti į rizikos grupes : 1 tšk: maža rizika, n = 31, 2/3 tšk: tarpinė rizika, n = 181, 4 tšk: didelė rizikan = 30, p < TriAS yra nepriklausomas prognostinis faktorius multivariacinėje analizėje su amžiumi tirtose kohortose (p < ) arba bent jau rodo tam tikrą tendenciją link nepriklausomo prognostinio faktoriaus (p = ) kitose kohortose.

16 Pagal ELN klasifikaciją (citogenetika + molekuliniai) bendras išgyvenamumas susigrupuoja į kategorijas - gera, tarpinė-1-2 ir bloga prognozės. Kiekvienoje ELN rizikos grupėje didelė TriAS vertė pergrupuoja dalį pacientų į trumpesnio išgyvenamumo grupę ir vice versa. Sudėjus kartu ELN ir TriAS ir 3 metų sekimo laikotarpį, rizikos grupių nustatymas yra tikslesnis. 167/375 (44.5 %) ELN charakterizuotų pacientų gavo kitas rizikos kategorijas.

17 II. Keturių genų ekspresija prognozei British Journal of Haematology, 2016, 172,

18 Univariacinė analizė siekiant nustatyti genų geriausiai numatančių bendrą išgyvenamumą ir išgyvenamumą be įvykių (EFS). Univariacinė Cox analizė: Rizikos laipsnis + statistinis patikimumas = S17 genų rinkinys, rodantis didžiausią koreliacijos laipsnį su OS ir EFS.

19 S17 genai S17 rinkinys (16 unikalių transkriptų ADGRG1 geno 2 transkriptai) leido optimaliai nustatyti aukštos WT1 ekspresijos grupę su bloga prognoze. Probe set Gene Symbol Gene Title _at ADGRG1 adhesion G protein coupled receptor G _at KIAA0125 FAM30A _s_at NGFRAP1 nerve growth factor receptor (TNFRSF16) associated protein _at WBP5 WW domain binding protein _s_at ADGRG1 adhesion G protein coupled receptor G _s_at LTK leukocyte receptor tyrosine kinase _s_at PTP4A3 protein tyrosine phosphatase type IVA, member _at CD109 CD109 molecule _at ZC3H12C zinc finger CCCH type containing 12C _s_at PYGB phosphorylase, glycogen; brain _at CHIC1 cysteine rich hydrophobic domain _a_at HAVCR2 hepatitis A virus cellular receptor _at TMEM110 transmembrane protein _at HAL histidine ammonia lyase _at HDAC4 histone deacetylase _s_at BLVRA biliverdin reductase A _at P2RY2 purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 2

20 OS ir EFS pagal S17 genų rinkinį Nyderlandų kohortoje. OS ir EFS pagal S17 genų rinkinį vokiečių kohortoje. OS ir EFS pagal S17 genų rinkinį TCGA validacijos kohortoje.

21 Keturių genų rinkinys W4 geriausiai koreliuojantis su EFS Pagal ROC kreivę įvertinus 17 genų derinius geriausiai koreliuojančius su EFS keturių genų rinkinys (Netherlands kohorta). Genai, kurių area under the curve viršija 0.5 teigiamai koreliuoja su EFS, o jei AUC mažesnis nei 0.5 koreliuoja neigiamai. Probe set Gene Area under the curve P value 95% CI, lower limit 95% CI, upper limit _at CD E _at KIAA E _s_at NGFRAP E _at ZC3H12C E _at ADGRG E _at HAL E _at WBP E _s_at ADGRG E _at HDAC E _s_at PTP4A E _at CHIC E _at TMEM E _s_at PYGB E _at P2RY E _s_at LTK E _s_at BLVRA E _a_ at HAVCR E

22 W4 ekspresijos vertė koreliuoja su EFS tirtose kohortose. W4 genų ekspresija žymiai padidėjusi blogos rizikos grupėje. W4 vertė Cox regresijos analizėje atskyrė blogos ir geros rizikos grupes: vidutinis OS 109 mėn. vs 855 mėn. atitinkamai didelės ir mažos W4 vertės grupėse. Vidutinis EFS 80 mėn. vs 267 mėn. šitose grupėse. Pakoregavus pagal žinomus prognostinius faktorius, W4 vertė išliko statistiškai reikšmingu prognostiniu faktoriumi. b OS EFS Variable P val HR 95% CI for HR 95% CI for HR P val HR Lower Upper Lower Upper W4 score < Age Complex karyotype inv del5_7q < t8_ FLT3_ITD < NPM1 < < CEBPA dbl mut Multivariate analysis of the OS and EFS in the Netherlands AML series using Cox Regression analysis of those variables which were significant at the level of P < 0.1 in univariate Cox Regression.

23 III. Septyniolikos genų ekspresijos vertė Genų ekspresijos profilis 138 LSC+ ir 89 LSC frakcijose. Palyginus LSC+ ir LSC GEPus 104 genai rodė ~2 kartinius ekspresijos lygio skirtumus. 1 5 d e c e m b e r VO L N AT U RE Raudona LSC+ Mėlyna LSC

24 Pagal vidutinį tų 104 genų ekspresijos lygį nustatytas LSC+ referentinis profilis. LSC+ Normalios HSC Subrendę gran+mono LSC+ referentinis GEPas koreliavo su normalių KKL ir multipotentinių progenitorių (MPP) GEPu. LSC+ referentinis GEPas buvo priešingas subrendusių mieloidinių ląstelių DEPui. Buvo nuspręsta, kad tie 104 genai, kurių ekspresija labiausiai skyrėsi tarp LSC+ ir LSC frakcijų yra susiję su kamieninių ląstelių transkripcijos procesais, kurie turėtų būti panašūs tarp LSC+ ir normalių KKL/MPP ląstelių.

25 Kad atrinkti transkripcinius komponentus, veikiančius kamieniškumo stadijoje, peranalizuoti duomenys liko 89 genai. Susiejus 43/89 stipriau LSC+ ekspresuojamus genus su išgyvenamumu, gavosi optimalus 17 genų rinkinys (LSC17 vertė), kuris apskaičiuojamas kaip 17 genų ekspresijos reikšmių suma. P.S. pacientai su didelėmis LSC17 vertėmis turėjo didesnį blastų skaičių kaulų čiulpuose diagnozės metu, didesnį FLT3 ITD dažnį, blogos prognozės citogenetiką, didesnį relapso dažnį, blogesnį atsaką į standartinę indukcinę chemoterapiją (LSC GEP programa ir klinikinių išeičių koreliacija) W4 W4

26 LSC17 vertė išgyvenamumui NanoString Mikro gardelės RNRseq LSC17 vertė lemia bendrą išgyvenamumą skirtingose tiriamosiose kohortose ir nustatyta skirtingomis ekspresijos platformomis. a,b OS pagal LSC17 nustatytą mikrogardelėmis c RNR sekvenavimas d NanoString. e OS pagal LSC17 vertę, priklausomai nuo to, ar po gydymo pasiektas CR (CR yra linija; CR nėra punktyras). f palyginimui, OS pagal LSC3 vertę Raudonai LSC17 vertė virš medianos, mėlyna žemiau medianos.

27 Multivariacinėje analizėje LSC17 vertė išlaikė prognostinį reikšmingumą visose tirtose kohortose nepriklausomai nuo kitų reikšmingų prognostinių faktorių (amžius, WBC skaičius, citogenetinė rizikos grupė, ŪML tipas de novo vs antrinė), FLT3 ITD+/NPM1+.

28 LCS17 prognostinė vertė kartu įtraukus mutacinį profilį Įtraukus kai kurias ŪML aberacijas univariacinėje analizėje buvo nustatytos reikšmingos asociacijos su OS. Multivariacinėje analizėje (aberacijos + amžius + WBC + citogenetinė rizikos grupė) įtraukus LSC17 vertę, tik DNMT3A išlaikė reikšmingumą, o LSC17 išliko reikšmingu nepriklausomu prognostiniu faktoriumi.

29 LSC17 vertė ir asct P = 0.06 OS pagal LSC17 vertę, nustatyta NanoString GEPu priklausomai nuo to, ar pacientas buvo transplantuotas. Raudona LSC17 vertė virš medianos, mėlyna žemiau. Linija tx, punktyras netransplantuotas. Univariacinė analizė įtraukus autologinę transplantaciją neparodė reikšmingos asct įtakos bendram išgyvenamumui tiek su didele LSC17 verte, tiek su maža (high LSC17 score, P = 0.20; low LSC17 score, P = 0.06) Bet didelė LCS17 vertė susijusi su trumpesniu OS nepriklausomai, ar pacientai transplantuoti, ar ne (asct: medianinis OS 11.7 vs 28.4 mėn. didelės vs mažos LSC17 vertės grupėse; HR = 2.14; P = 0.005; netransplantuoti: medianinis OS 14.7 vs mėn; HR = 2.99; P < 0.001).

30 LSC17 vertė, relapsas ir mirtis nuo CR1 Laikas nuo CR1 iki pirmo relapso ar mirties. Didelė LSC17 vertė susijusi su ankstesniu relapsu netransplantuotų pacientų grupėje (uni ir multi ) (P < 0.001; P = 0.003); medianinis laikas iki relapso 9.31 mėn. vs 65.2 mėn.) Mirties dažnis žymiai didesnis tiek didelės, tiek mažos LSC17 vertės transplantuotose grupėse (P < 0.001). Mirties rizika po tx ir relapso rizika be tx labai panaši mažos LCS17 vertės pacientuose. Pagal LSC17 vertę reiktų nustatyti, kuriuos pacientus geriau transplantuoti.

31 LSC17 vertė numato atsparumą gydymui (nepasiektas CR po indukcijos). Tiriamojoje ŪML kohortoje univariacinėje analizėje LSC17 vertė geriau numatė atsparumą gydymui, negu citogenetinės rizikos kategorijos (ROC = 0.78 vs 0.70). Multivariacinėje analizėje įvertinus amžių, WBC skaičių, citogenetinę riziką ir de novo vs antrinę ŪML, LCS 17 vertė žymiai pagerino prognostinę gebą (ROC = 0.82 vs 0.73, jautrumas padidėjo 3,4%, specifiškumas padidėjo 9,2%). Wald chi squared statistiniame modelyje LCS17 vertė buvo reikšmingiausia. a, ROC kreivės, numatančios atsparumą gydymui (amžius, WBC skaičius, citogenetinė rizika ir de novo vs antrinė) su LCS17 verte (raudona) ir be (mėlyna). b, Kiekvieno faktoriaus prognostinis gebėjimas numatyti atsparumą gydymui multivariacinėje analizėje (chi squared statistic)

32 OS (c, d) ir EFS (e, f) su didele LCS17 verte (c, e) ir maža (d, f) gydyti standartine chemoterapija su gentuzumabu (raudona) ar be (mėlyna).