LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA PAULIUS CIEGIS ALPRAZOLAMO, KODEINO IR PAR

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA PAULIUS CIEGIS ALPRAZOLAMO, KODEINO IR PARACETAMOLIO MIŠINIO KOKYBINĖ ANALIZĖ PLONASLUOKSNĖS IR EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODAIS Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas: Doc. Dr. Andrejus Ževžikovas (Parašas) (Data) Kaunas, 2014

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis TVIRTINU: Data ALPRAZOLAMO, KODEINO IR PARACETAMOLIO MIŠINIO KOKYBINĖ ANALIZĖ PLONASLUOKSNĖS IR EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODAIS Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas: Doc. Dr. Andrejus Ževžikovas (Parašas) (Data) Recenzentas Vardas Pavardė Parašas Data Darbą atliko Magistrantas Paulius Ciegis Data Kaunas, 2014

Turinys SANTRUMPOS... 4 1. ĮVADAS... 5 2. LITERATŪROS APŽVALGA... 7 2.1. Alprazolamo, kodeino ir paracetamolio vartojimo paplitimas... 7 2.1.1. Alprazolamo, kodeino ir paracetamolio vartojimo paplitimas Lietuvoje... 7 2.1.2 Alprazolamo, kodeino ir paracetamolio vartojimo paplitimas kitose šalyse... 9 2.1.3 Alprazolamo, kodeino ir paracetamolio suvartojimo skirtingose šalyse palyginimas... 11 2.2. Apsinuodijimo alprazolamu, kodeinu ir paracetamoliu statistika... 13 2.3. Alprazolamo, kodeino ir paracetamolio toksiškumas... 15 2.3.1. Alprazolamo toksiškumas... 15 2.3.2. Paracetamolio toksiškumas... 17 2.3.3. Kodeino toksiškumas... 18 2.3. Alprazolamo, kodeino ir paracetamolio kokybinis vertinimas plonasluoksnės chromatografijos metodu... 20 2.3.1. Plonasluoksnė chromatografija (PC)... 20 2.3.2. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos, tinkamos identifikuoti alprazolamą, kodeiną arba paracetamolį... 20 2.4. Alprazolamo, kodeino ir paracetamolio kokybinis vertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu... 22 2.4.1. Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC)... 22 2.3.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos, tinkamos identifikuoti alprazolamą, kodeiną arba paracetamolį... 23 3. EKSPERIMENTINĖ DALIS... 25 3.1. Tyrimo objektas ir metodika... 25 3.1.1. Tyrimo objektas... 25 3.1.2. Kokybinis vertinimas plonasluoksnės chromatografijos (PC) metodu... 25 3.1.3 Kokybinis vertinimas efektyviąja skysčių chromatografija (ESC) metodu... 27 3.2. Rezultatai ir aptarimas... 29 3.2.1. Plonasluoksnės chromatografijos metodo optimizavimas... 29 3.2.2. Vaistinių preparatų analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu... 34 3.2.3 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo optimizavimas... 36 3.2.4. Vaistinių preparatų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu... 40 4. Išvados... 43 5. Praktinės rekomendacijos... 45 LITERATŪROS SĄRAŠAS... 46

SANTRAUKA ALPRAZOLAMO, KODEINO IR PARACETAMOLIO MIŠINIO KOKYBINĖ ANALIZĖ PLONASLUOKSNĖS IR EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODAIS P. Ciegio magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas doc. dr. A. Ževžikovas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas. Raktiniai žodžiai: alprazolamas, kodeinas, paracetamolis, plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, kokybinis vertinimas. Darbo tikslas: Optimizuoti plonasluoksnės chromatografijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodikas, tinkamas alprazolamo, kodeino ir paracetamolio kokybiniam įvertinimui. Tyrimo objektas ir metodai: Optimizuojant PC metodiką, analizuoti etaloniniai 0,2 mg/ml koncentracijos alprazolamo, kodeino, paracetamolio trichlormetaniniai tirpalai ir jų mišinys. Tirpiklių sistemoms buvo naudoti etanolis, trichlormetanas, eteris, 25% amonio hidroksidas, acetonas, izobutanolis. Dėmių ryškinimui naudota UV šviesos (254nm; 365nm) lempa arba Dragendorfo reagentas (modifikuotas pagal Munjė). Optimizuotos metodikos pritaikytos tiriant trichlormetaninius darbinius tirpalus, pagamintus iš vaistinių preparatų Xanax, Paracetamolis Sanitas ir Ultracod. Siekiant pritaikyti ESC metodiką tiriamųjų junginių analizei, buvo tirti etaloniniai 0,1 mg/ml koncentracijos alprazolamo, kodeino ir paracetamolio metanoliniai tirpalai bei jų mišinys. Medžiagų atskyrimui ir identifikavimui naudotas chromatografas Waters 2695 su fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996 (210 400 nm bangų ilgio diapazonas). Chromatografavimui naudoti metanolis, 3% acto rūgšties vandeninis tirpalas. Optimizuota ESC metodika pritaikyta tiriant metanolinius darbinius tirpalus, pagamintus iš vaistinių preparatų Xanax, Ultracod ir Solpadeine. Rezultatai ir išvados: Tinkamiausios tirpiklių sistemos alprazolamo, kodeino ir paracetamolio mišinio kokybiniam vertinimui PC metodu TS-D (trichlormetanas: acetonas: koncentruotas amonio hidroksidas (55:40:5)) ir TS-F (trichlormetanas: eteris: izobutanolis: koncentruotas amonio hidroksidas (50:30:15:5)). TS-D ir TS-F tirpiklių sistemos yra tinkamos tiriamųjų medžiagų mišinio kokybiniam įvertinimui bei jų nustatymui vaistiniuose preparatuose. Alprazolamo, kodeino ir paracetamolio kokybiniam vertinimui ESC metodu, naudota ACE C18 (25cm 4,6mm 5µm) chromatografinė kolonėlė. Gradientinis eliuavimo režimas (3% acto rūgšties ir metanolio mišinys). Tėkmės greitis 1ml/min. Injekcijos tūris 10 µl. Fotodiodų matricos detektorius (210 240nm diapazonas). Medžiagų UV absorbcijos spektrai, išmatuoti fotodiodų matricos detektoriumi, identiški pateiktiems mokslinėje literatūroje. [21] Metodika yra tinkama alprazolamo, kodeino ir paracetamolio mišinio kiekybiniam vertinimui bei jų nustatymui vaistiniuose preparatuose.

SUMMARY ALPRAZOLAM, CODEINE AND PARACETAMOL MIXTURE QUALITATIVE ANALYSIS USING TLC AND HPLC METHODS Key words: alprazolam, codeine, paracetamol, thin-layer chromatography, high-performance liquid chromatography, qualitative determination. Aim: To optimize thin-layer chromatography and high-performance liquid chromatography methods for alprazolam, codeine, paracetamol and their mixture qualitative analysis. Object and methods: For TLC method optimization alprazolam, codeine, paracetamol and their mixture stock solutions (0,2 mg/ml) in trichlormetan were analysed. For mobile phase were used: ethanol, trichlormetan, ether, 25% ammonia hydroxide, acetone, isobutanol. For spots development were used UV light lamp (254nm; 365nm) or Dragendorff reagent (modified by Munje). Optimized methods were tried with pharmaceutical products Xanax, Paracetamolis Sanitas and Ultracod solutions. For HPLC method optimization alprazolam, codeine, paracetamol and their mixture stock solutions (0,1 mg/ml) in methanol were analysed. Chromatograph Waters 2695 with photo diode array detector Waters 996 (210-400 nm wave length) were used for qualitative determination. Analysis was made by using methanol and 3% acetic acid aqueous solution. Optimized method was applied in analysis of pharmaceutical products Xanax, Ultracod and Solpadeine solutions. Results: The best mobile phases for alprazolam, codeine and paracetamol mixture qualitative analysis using TLC is TS-D (trichlormetan: acetone: concentrated ammonia hydroxide (55:40:5)) and TS-F (trichlormetan: ether: isobutanol: concentrated ammonia hydroxide (50:30:15:5)). TS-D and TS-F mobile phases are suitable for examined substances qualitative analysis in mixture and determination in pharmaceutical products. HPLC method was developed using ACE C18 (25cm 4,6mm 5µm) chromatographic column. Gradient elution mode was used (mixture of 3% acetic acid and methanol). Flow rate 1ml/ml. Injection volume 10 µl. Photo diode array detector (210-240 nm wave length). Alprazolam, codeine and paracetamol absorbtion of UV light were similar as in scientific literature. [21] HPLC method is suitable for examined substances qualitative analysis in mixture and determination in pharmaceutical products.

4 SANTRUMPOS AAKC Amerikos apsinuodijimų kontrolės centras (angl. American Association of Poison Control Centers) AMTK Amerikos medicinos toksikologijos kolegija (angl. American College of Medical Toxicology) DDD nustatyta paros vaisto dozė, kuri yra vaisto suvartojimo techninis vienetas ESC efektyvioji skysčių chromatografija LTVSPĮ Lietuvos teritorinių visuomenės sveikatos priežiūros įstaigos PC plonasluoksnė chromatografija Rf sulaikymo rodiklis TS tirpiklių sistema UV ultravioletinė šviesa

5 1. ĮVADAS Progresyviai didėjantis vaistų suvartojimas Lietuvoje ir pasaulyje skatina susimąstyti apie neigiamus šio socialinio reiškinio padarinius. Remiantis Valstybinės vaistų kontrolės tarnybos duomenimis 2012 metais Lietuvoje parduotos 72 483 608 vaistinių preparatų pakuotės, iš kurių 39 % buvo nereceptiniai vaistiniai preparatai. Atitinkamai vaistinių preparatų suvartojimas Lietuvoje per ketverius metus išaugo nuo 699 DDD/1000 gyventojų/per dieną (2009m.) iki 989 DDD/1000 gyventojų/per dieną (2012m.) [4]. Vaistinių preparatų suvartojimas glaudžiai susijęs su apsinuodijimo vaistiniais preparatais rizika. 2012 m. pateiktoje Lietuvos sveikatos apsaugos ministerijos Žmonių apsinuodijimų, išanalizuotų 2007 2011 metais, lyginamojoje analizėje matyti, kad per 2011 m. medikamentais Lietuvoje apsinuodijo 751 žmogus (41,5 % visų apsinuodijimų) [3]. Apsinuodijimai vaistiniais preparatais galimi dėl neteisingai pavartotos vaisto dozės, tyčinio perdozavimo, aplaidumo arba pasireiškusios vaistų sąveikos. Vaikų ir paauglių iki 18 metų apsinuodijimai vaistais 2011 m. sudarė 60,98% visų apsinuodijimo atvejų, kurių dauguma buvo atsitiktiniai dėl netinkamoje vietoje laikytų vaistinių preparatų [3]. Daugėjant apsinuodijimų dėl medikamentų vartojimo atvejų, svarbu atsižvelgti į jų neigiamą įtaką Lietuvos pacientų gyvenimo kokybei ir demografiniams šalies rodikliams. Siekiant efektyviai mažinti apsinuodijimų dažnumą ir jų sunkumą, būtina diegti prevencines sistemas, kurios ne tik informuotų visuomenę apie galimus pavojus ir reikalingas atsargumo priemones vartojant vaistinius preparatus, bet ir padėtų įvertinti, kurie vaistai yra potencialios galimų apsinuodijimų priežastys. Greitas ir tikslus apsinuodijimą sukėlusios medžiagos identifikavimas mažina mirties atvejų tikimybę ir padeda lengviau nustatyti mirties priežastis. Siekiant optimizuoti toksikologinės laboratorijos darbą, nustatant galimas apsinuodijimo priežastis, tikslinga naudoti analizės metodus, kurie gebėtų identifikuoti keletą medžiagų vienos analizės metu. Šiame darbe aprašyti alprazolamo, kodeino, paracetamolio ir jų mišinio, kurie gali sukelti apsinuodijimus, kokybinės analizės būdai paremti plonasluoksnės chromatografijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos instrumentiniais metodais. Darbo tikslas: Optimizuoti plonasluoksnės chromatografijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodikas, tinkamas alprazolamo, kodeino ir paracetamolio kokybiniam įvertinimui. Darbo uždaviniai: 1. Optimizuoti plonasluoksnės chromatografijos metodiką, kuri būtų tinkama alprazolamo, kodeino, paracetamolio ir šių medžiagų mišinio kokybiniam įvertinimui. 2. Optimizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką, kuri būtų tinkama alprazolamo, kodeino, paracetamolio ir šių medžiagų mišinio kokybiniam įvertinimui.

6 3. Pritaikyti optimizuotas plonasluoksnės ir efektyviosios skysčių chromatografijų metodikas alprazolamo, kodeino ir paracetamolio, išskirtų iš vaistinių preparatų, kokybiniam įvertinimui.

7 2. LITERATŪROS APŽVALGA 2.1. Alprazolamo, kodeino ir paracetamolio vartojimo paplitimas 2.1.1. Alprazolamo, kodeino ir paracetamolio vartojimo paplitimas Lietuvoje Siekiant įvertinti ir palyginti vaistų suvartojimą įvairiose šalyse, vietovėse ar tarp atskirų gydymo įstaigų, dažnai remiamasi ATC DDD metodologija, kuri leidžia įvertinti vaistų skyrimo ir suvartojimo tendencijas. Vaistų suvartojimas pateikiamas DDD (PSO nustatyta vidutinė terapinė paros (dienos) dozė) skaičiumi, tenkančiu 1000-čiui gyventojų per dieną. [4,5,40] Remiantis vaistų suvartojimo statistika, Lietuvoje 2012 metais nervų sistemą veikiančių vaistų (N) (pagal ATC klasifikaciją), suvartojimas siekė 136,402 DDD/1000gyv./per dieną. Tai antroji pagal suvartojimą medikamentų klasė po širdies ir kraujagyslių sistemą veikiančių vaistų, kurių suvartojimas 2012 m. siekė 425,449 DDD/100gyv./per dieną.[4] Lyginant 2009 m. ir 2012 m. laikotarpius, nervų sistemą veikiančių preparatų pardavimai išaugo 47,12%, o širdies ir kraujagyslių sistemą veikiančių vaistų pardavimo augimas tuo pačiu laikotarpiu sudarė 29,31%.[4] Benzodiazepino darinių, pagal ATC klasifikaciją, priskiriamų N05BA pogrupiui, bendras suvartojimas 2012 m. siekė 40,463 DDD/1000gyv./per dieną.[4] Tai daugiausiai suvartojamas nervų sistemą veikiančių vaistų pogrupis Lietuvoje (29,66%). 2012 m. populiariausi benzodiazepino dariniai Lietuvoje buvo lorazepamas (19,973 DDD/1000gyv./per dieną), alprazolamas (6,485 DDD/1000gyv./per dieną), diazepamas (6,083 DDD/1000gyv./per dieną) ir bromazepamas (5,907 DDD/1000gyv./per dieną) (1 lentelė). Nepaisant to, lyginant 2009 m. ir 2012 m. benzodiazepinų suvartojimo mastus daugiausiai augo alprazolamo (44,82%) ir bromazepamo (19,57%) suvartojimas, o diazepamo (7,95%) ir lorazepamo (1,02%) populiarumas kito nežymiai. [4] ATC kodas Pavadinimas DDD/1000 Lietuvos gyventojų/per dieną 2009 metai 2010 metai 2011 metai 2012 metai N05BA Benzodiazepino dariniai 37,197 36,339 37,099 40,463 N05BA01 Diazepamas (DDD 10 mg) 5,635 5,947 5,843 6,083 N05BA02 1 lentelė. Benzodiazepino darinių suvartojimas Lietuvoje 2009 2012 metais (šaltinis: VVKT Vaistų vartojimo Lietuvoje 2012 m. ataskaita) [4] Chlordiazepoksidas (DDD 30 mg/o; 50 mg/p) 0,159 0,136 0,115 0,115 N05BA03 Medazepamas (DDD 20 mg) 1,183 0,915 0,895 0,795

8 N05BA04 Oksazepamas (DDD 50 mg) 0,440 0,354 0,333 0,332 N05BA05 Klorazepato kalio druska (DDD 20 mg) 0,590 0,703 0,710 0,773 N05BA06 Lorazepamas (DDD 2,5 mg) 19,772 18,768 18,565 19,973 N05BA08 Bromazepamas (DDD 10 mg) 4,940 4,826 5,207 5,907 N05BA12 Alprazolamas (DDD 1 mg) 4,478 4,690 5,431 6,485 Paracetamolis, pagal ATC klasifikaciją priskiriamas N02B (kiti analgetikai ir antipiretikai) vaistų pogrupiui buvo dažniausiai Lietuvoje vartojamas šios klasės vaistas 2009 2012 metais. 2012 m. gryno paracetamolio preparatų buvo suvartota 3,029 DDD/1000gyv./per dieną, o deriniuose su kitomis veikliosiomis medžiagomis 5,756 DDD/1000gyv./per dieną. Lyginant 2009 m. ir 2012 m. pardavimus stebima nežymi recesija (apie 4 %). Kitų šiai klasei priskiriamų vaistų suvartojimas 2012 m. nėra didelis: cholino salicilatas 0,075 DDD/1000gyv./per dieną, metamizolio natrio druska 1,09 DDD/1000gyv./per dieną, flupirtinas 0,010 DDD/1000gyv./per dieną. Acetilsalicilo rūgšties, kurios DDD 3 g, vartojamos vienos ir deriniuose su kitomis veikliosiomis medžiagomis, suvartojimas atitinkamai buvo 1,394 ir 0,521 DDD/1000gyv./per dieną [4]. ATC kodas Pavadinimas DDD/1000 Lietuvos gyventojų/per dieną 2009 metai 2010 metai 2011 metai 2012 metai N02B Kiti analgetikai ir antipiretikai 5,412 11,383 11,669 11,875 N02BA01 Acetilsalicilo rūgštis (DDD 3 g) 0,855 1,385 1,400 1,394 N02BA03 Cholino salicilatas (DDD 3 g) 0,115 0,137 0,099 0,075 N02BA51 2 lentelė. Analgetikų ir antipiretikų suvartojimas Lietuvoje 2009 2012 metais (šaltinis: VVKT Vaistų vartojimo Lietuvoje 2012 m. ataskaita) [4] Acetilsalicilo rūgštis, deriniai (DDD 3 g) * 0,105 0,108 0,521 N02BB02 Metamizolo natrio druska (DDD 3 g) 1,240 1,128 1,095 1,09 N02BE01 Paracetamolis (DDD 3 g) 3,202 2,737 3,137 3,029 N02BE51 Paracetamolis, deriniai (DDD 3 g) * 5,887 5,821 5,756 N02BG07 Flupirtinas (DDD 0,4 g) * 0,004 0,009 0,010 Kodeinas Lietuvos rinkoje parduodamas tik kaip sudėtinių vaistinių preparatų komponentas, kartu su paracetamoliu ( Ultracod ) arba su paracetamoliu ir kofeinu ( Solpadeine ). [6] Nors kodeinas pagal ATC klasifikaciją priskiriamas natūraliems opijaus alkaloidams (N02AA), lyginti jo pardavimo statistiką su morfinu ar su kitais opioidiniais analgetikais (petidinu, fentaniliu, tramadoliu)

9 nėra tikslinga dėl poveikio skirtumų. 2012 m. kodeino fosfato hemihidrato derinyje su paracetamoliu buvo suvartota 0,125 DDD/1000gyv./per dieną. Lyginant 2009m. ir 2012 m. jo suvartojimo augimas siekė 30,2% [4]. 2.1.2 Alprazolamo, kodeino ir paracetamolio vartojimo paplitimas kitose šalyse Siekiant įvertinti alprazolamo, paracetamolio ir kodeino vaistinių preparatų vartojimo populiarumą pasaulyje, aprašyti Estijos (2010 2012m.), Latvijos (2010 2012m.), Danijos (2008 2012m.), Slovėnijos (2007 2011 m.) ir Australijos (2008 2010m.) vaistų suvartojimo ataskaitose pateikti duomenys. Alprazolamas yra vienas iš dažniausiai skiriamų benzodiazepinų grupės preparatų ne tik Lietuvoje, bet ir kitose pasaulio šalyse. Baltijos šalyse jo suvartojimas 2012 m. siekė 5,893 DDD/1000gyv./per dieną Estijoje ir 5,18 DDD/1000gyv./per dieną Latvijoje. Lyginant su 2010 m. duomenimis, buvo pastebimas 6,19% pardavimo augimas Estijoje ir 22,46% augimas Latvijoje. Vertinant pagal ATC DDD rodiklį, Latvijoje alprazolamo suvartota daugiausiai iš benzodiazepino darinių, o Estijoje daugiau nei alprazolamo 2012 m. buvo suvartota diazepamo (6,46 DDD/1000gyv./per dieną).[12] Kitų analizuotų šalių vaistų suvartojimo ataskaitose matyti, jog alprazolamo suvartojimas kasmet mažėjo. 2008 2010 metų Australijos vaistų suvartojimo ataskaitos duomenimis 2010 m. alprazolamo buvo suvartota 3,833 DDD/1000gyv./per dieną, 0,44 % mažiau nei 2008 m.[19] Danijoje 2012 m. alprazolamo buvo suvartota 65,21 % mažiau nei 2008 m. ir tai sudarė 2,3 DDD/1000gyv./per dieną.[24] Didžiausias alprazolamo suvartojimas iš lyginamų šalių buvo Slovėnijoje 6,48 DDD/1000gyv./per dieną (2011m.), nors lyginant su 2007 m. pastebima 5,55% recesija.[26] Alprazolamas 36% Bromazepamas 5% Chlordiazepoksidas 2% Klobazamas 1% Diazepamas 27% Nordazepamas 2% Kiti 6% Oksazepamas 2% Lorazepamas 19% 1 diagrama. 2011 m. pasaulyje pagamintų benzodiazepino junginių pasiskirstymas pagal kiekius (šaltinis: Jungtinių Tautų Tarptautinės narkotikų valdybos 2012 m. psichotropinių medžiagų suvartojimo ataskaita) [35]

10 Remiantis Jungtinių Tautų Tarptautinės narkotikų kontrolės valdybos 2012 m. pateiktos ataskaitos duomenimis, alprazolamas sudarė 36 % bendro visų 2011 m. pagamintų benzodiazepinų grupės anksiolitikų kiekio. Skritulinėje diagramoje (1 diagrama) atvaizduotas benzodiazepinų, pagamintų 2011 m. kiekių santykis. Tos pačios ataskaitos duomenimis 2000 2005 m. vidutinis metinis pasaulinis alprazolamo suvartojimas siekė 4,8 milijardo DDD, o 2009 20011 m. sudarė 8,5 milijardo DDD. [35] Vertinant Estijos, Latvijos, Danijos, Slovėnijos ir Australijos paracetamolio suvartojimo tendencijas, daugelyje jų pastebimas nuoseklus kasmetinis pardavimo augimas. Ryškiausias progresas stebimas Australijoje, kurioje 2010 m. paracetamolio suvartojimas siekė 25,804 DDD/1000gyv./per dieną ir buvo 23,78 % didesnis nei 2008 m. [19] Itin daug, lyginant su kitomis šalimis, paracetamolio suvartojama Danijoje, kurioje 2012 m. nurodomas 65,9 DDD/1000gyv./per dieną suvartojimas. Lyginant 2008m. ir 2012 m. šis rodiklis Danijoje išaugo 5,27 %. [24] Estijoje 2012 m. vaistinių preparatų, kuriuose buvo tik paracetamolis, suvartota 5,67 DDD/1000gyv./per dieną, o sudėtinių preparatų 2,7 DDD/1000gyv./per dieną, atitinkamai 18,86 % ir 10,66 % daugiau nei 2010 m. [12] Latvijoje paracetamolio suvartojimas buvo mažesnis nei Estijoje: gryno paracetamolio suvartojimas 2012 m. sudarė 1,72 DDD/1000gyv./per dieną, o paracetamolio vaistinių preparatų kartu su kitomis veikliosiomis medžiagomis 2,29 DDD/1000gyv./per dieną. 2010 m. Latvijoje gryno paracetamolio buvo suvartojama 4,87% mažiau, o mišiniuose 6,98% daugiau nei 2012 m. [12] Slovėnijoje paracetamolio kartu su kitomis veikliosiomis medžiagomis vartojimo populiarumas nėra didelis 0,04 DDD/1000gyv./per dieną, tačiau gryno paracetamolio 2011 m. buvo suvartota 5,54 DDD/1000gyv./per dieną (13,75 % daugiau nei 2007 m.). [26] Kodeinas pagal ATC klasifikaciją priskiriamas dviems terapiniams pogrupiams: natūralių opijaus alkaloidų, skirtų skausmui malšinti (N02AA) ir natūralių opijaus alkaloidų, skirtų kosuliui malšinti (R05DA). Latvijoje ir Estijoje registruoti vaistiniai preparatai, į kurių sudėti įeina kodeinas, priklauso N02AA terapiniam pogrupiui. 2012 m. šių vaistų suvartojimas sudarė 0,92 DDD/1000gyv./per dieną Estijoje ir 0,41 DDD/1000gyv./per dieną Latvijoje. [12] 2010 m. Australijoje, kodeino, skirto kosulio slopinimui (R05DA), buvo suvartota 5,415 DDD/1000gyv./per dieną.[19] Plačiausiai kodeinas vartojamas Danijoje: skausmui malšinti skirtų vaistinių preparatų, kurių sudėtyje yra kodeino, 2012 m. suvartojimas siekė 2,3 DDD/1000gyv./per dieną, o kosuliui slopinti skirtų preparatų 3,2 DDD/1000gyv./per dieną. Lyginant su 2008 m. šių preparatų suvartojimas mažėjo atitinkamai 26,09 % ir 6,25 %. [24]

2.1.3 Alprazolamo, kodeino ir paracetamolio suvartojimo skirtingose šalyse palyginimas 11 Vertinant duomenis iš aprašytų šalių vaistų suvartojimo ataskaitų galima daryti išvadą, jog alprazolamas yra plačiai vartojamas benzodiazepinų grupės preparatas (2 diagrama). Didžiausias DDD tenkantis 1000 gyventojų per dieną fiksuojamas Baltijos šalyse (Lietuvoje, Latvijoje ir Estijoje) bei Slovėnijoje. Šio vaisto suvartojimas Danijoje ir Australijoje akivaizdžiai mažesnis. Baltijos šalių regione taip pat matyti vartojimo augimo tendencija lyginant 2010 2012 metus. Ryškiausias augimas stebimas Lietuvoje; Latvijoje ir Estijoje suvartojimo didėjimas ne toks staigus. Kita vertus, Slovėnijoje ir Australijoje ryškių pokyčių susijusių su alprazolamo vartojimu nematyti, o Danijoje matomas ryškus vartojimo sumažėjimas lyginant 2008 2012 metus. 7 6 5 4 3 2 2008 metai 2009 metai 2010 metai 2011 metai 2012 metai 1 0 Lietuva Latvija Estija Danija Slovėnija Australija 2 diagrama. Alprazolamo suvartojimas išreikštas DDD/1000 gyv./dieną 2008 2012 metais Paracetamolio vartojimo įpročiai itin skiriasi lyginant Baltijos šalis ir Slovėniją su Australija bei Danija (3 diagrama). Lietuvoje, Latvijoje, Estijoje ir Slovėnijoje paracetamolio DDD/1000gyv./dieną yra iki trijų kartų mažesnis lyginant su Australija ir iki dvylikos kartų mažesnis lyginant su Danijos paracetamolio suvartojimu. Vertinant 2008 2012 m. suvartojimą Danijoje ir Slovėnijoje matomas nuoseklus paracetamolio suvartojimo augimas.

12 70 60 50 40 30 20 10 2008 metai 2009 metai 2010 metai 2011 metai 2012 metai 0 Lietuva Latvija Estija Slovėnija Australija Danija 3 diagrama. Paracetamolio suvartojimas išreikštas DDD/1000 gyv./dieną 2008 2012 metais (su Australijos ir Danijos duomenimis) Lyginant Lietuvos, Latvijos, Estijos ir Slovėnijos paracetamolio suvartojimą (4 diagrama) matyti, jog didžiausias šio vaisto suvartojimas yra fiksuojamas Estijoje, kurioje nuo 2010 m. stebimas spartus vartojimo augimas. Slovėnijoje, kurioje suvartojimas panašus į Estijos pavyzdį, 2011 m. taip pat fiksuojamas suvartojimo augimas. Lietuvoje ir Latvijoje paracetamolio suvartojama mažiau, lyginant su kitomis šalimis. Abiejose šalyse 2011 2012 m. stebimas vartojimo mažėjimas. 6 5 4 3 2 1 2008 metai 2009 metai 2010 metai 2011 metai 2012 metai 0 Lietuva Latvija Estija Slovėnija 4 diagrama. Paracetamolio suvartojimas išreikštas DDD/1000 gyv./dieną 2008 2012 metais (be Australijos ir Danijos duomenų)

13 Kodeinas, mišiniuose kartu su analgetikais arba kaip sausą kosulį slopinančių preparatų sudėtinė dalis, lyginamosiose šalyse yra populiariausias Australijoje ir Danijoje (5 diagrama). Lietuvoje, Latvijoje ir Estijoje kodeino suvartojama nuo 5 iki 30 kartų mažiau nei Danijoje ir nuo 8 iki 50 kartų mažiau nei Australijoje. Australijoje ir Danijoje 2008 2012 metų laikotarpiu matomas nežymus suvartojimo svyravimas. 2010 2012 metais Baltijos šalyse kodeino vartojimas nežymiai, bet užtikrintai augo. 6 5 4 3 2 1 2008 metai 2009 metai 2010 metai 2011 metai 2012 metai 0 Lietuva Latvija Estija Australija Danija 5 diagrama. Kodeino suvartojimas išreikštas DDD/1000 gyv./dieną 2008 2012 metais 2.2. Apsinuodijimo alprazolamu, kodeinu ir paracetamoliu statistika Apsinuodijimai vaistiniais preparatais yra viena iš dažniausiai pasitaikančių apsinuodijimų priežasčių Lietuvoje ir pasaulyje. Remiantis Lietuvos teritorinių visuomenės sveikatos priežiūros įstaigų (LTVSPĮ) duomenimis, 2011 m. užfiksuoti 751 apsinuodijimo medikamentais atvejai visoje Lietuvoje, kurie sudarė 41,5 % visų nustatytų apsinuodijimo atvejų. [3] Amerikos Medicinos Toksikologijos kolegijos (AMTK) įsteigta apsinuodijimų registracijos sistema (ToxIC) 2011 m. užregistravo 6456 apsinuodijimų atvejus, iš kurių 48 % buvo susiję su vaistinių preparatų perdozavimu [41]. 2005 2006 metais Australijoje dėl apsinuodijimo vaistais, narkotinėmis ir kitomis biologiškai aktyviomis medžiagomis buvo hospitalizuoti 28 612 asmenų, iš kurių daugiau nei 20 % medikamentais apsinuodijo atsitiktinai. [23] Itin didelę dalį, vaistiniais preparatais apsinuodijančių pacientų, sudaro vaikai iki 18 metų. 2011 metų LTVSPĮ duomenimis daugiau nei 60 % visų apsinuodijusių medikamentais pacientų buvo nepilnamečiai. [3] Australijoje kasmet vidutiniškai hospitalizuojama apie 4700 vaikų, iš kurių 63 % į ligoninę paguldomi dėl apsinuodijimo vaistais. [23] Remiantis 2012 metų Amerikos Apsinuodijimų

14 Kontrolės Centro (AAKC) pranešimu asmenys iki 20 metų amžiaus sudarė 61,66 % visų užregistruotų žmonių apsinuodijimo atvejų. [22] Išanalizavus vaikų apsinuodijimo priežastis Lietuvoje 2003 2010 m. laikotarpiu nustatyta, jog ikimokyklinio amžiaus vaikai, dažniau apsinuodija atsitiktinai, o 12 17 metų amžiaus jaunuoliai dažniau medikamentais nuodijasi tyčia. [1] Suaugusių pacientų grupėje vyrauja apgalvoti apsinuodijimai vaistiniais preparatais. Ištyrus 2011 m. suaugusiųjų apsinuodijimo atvejus Lietuvoje, nustatyta, jog 71 % apsinuodijimų buvo tyčiniai. Daugiausiai tokių apsinuodijimų įvyko dėl piktnaudžiavimo įvairiomis medžiagomis (50,9%) ar turint suicidinių ketinimų (37,7%). [3] Remiantis AAKC 2012 metų metine ataskaita 19,2% apsinuodijimų medikamentais atvejų buvo tyčiniai, kai tyčiniai apsinuodijimai ne vaistine medžiaga tesudarė 3,7%. [22] Ištyrus 2000 2005 metais Europoje įvykusias savižudybes nustatyta, jog nuodijimasis vaistinėmis medžiagomis yra antras pagal populiarumą savižudybės būdas po karimosi ir sudaro 12,7 % visų savižudybių atvejų. [37] Vertinant vaistinius preparatus, kuriais dažniausiai apsinuodijama, vyrauja psichotropiniai vaistai, nenarkotiniai analgetikai, nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo bei opioidiniai analgetikai. Remiantis teritorinių visuomenės sveikatos įstaigų duomenimis 2011 m. Lietuvoje 24,1% pacientų apsinuodijo centrinę nervų sistemą veikiančiais vaistiniais preparatais. [3] AMTK duomenimis, apsinuodijimus sukėlė: 23 % sedatyvinės hipnotinės medžiagos, 21 % nenarkotiniai analgetikai, 17% opiodiniai analgetikai, 16 % antidepresantai, 12% stimuliuojančios medžiagos ir 8% etanolis. [41] 2005 2006 metais Australijoje dažniausiai buvo apsinuodijama: benzodiazepinais (17%), nenarkotiniais analgetikais ir nesteroidiniais vaistais nuo uždegimo (16%), antidepresantais (6%), antipsichoziniais vaistais (4%) ir psichostimuliantais (4%). [23] Sedatyvinių hipnotinių vaistų klasei priskiriami benzodiazepinai yra vieni iš dažniausiai apsinuodijimus sukeliančių vaistų. 2003 2010 m. Lietuvoje benzodiazepinai sukėlė 41 % vaikų apsinuodijimų atvejų. [1] Jungtinėse Amerikos Valstijose 2011 m. iš benzodiazepinų grupės preparatų dažniausiai buvo apsinuodyta klonazepamu (30%), alprazolamu (29%), lorazepamu (18%) ir diazepamu (9%). [41] 2012 m. Didžiojoje Britanijoje buvo užregistruotos 2597 mirtys, susijusios su vaistų ir narkotinių medžiagų perdozavimu iš kurių 10,9% sukėlė benzodiazepinai. [25] Lyginant 2003 m. ir 2009 m. Floridos valstijoje (JAV) mirčių, kurias sukėlė alprazolamas skaičius išaugo 233,8% (4,4 mirtys tenkančios 100 000 gyventojų) - tai antra, pagal dažnumą mirtinus apsinuodijimus sukelianti vaistinė medžiaga po oksikodono (6,4 mirtys tenkančios 100 000 gyventojų). [20] Išanalizavus 1994 2006 metų netyčinius mirtinus apsinuodijimus Oklahomos valstijoje (JAV) nustatyta, kad alprazolamas sukėlė 15 % iš visų užregistruotų 2112 mirtinų vaistų perdozavimų. [27] Nenarkotiniai analgetikai yra ne tik viena plačiausiai naudojamų vaistų grupių, tačiau ir dažna apsinuodijimų priežastis. Amerikos Apsinuodijimų kontrolės centro metinės ataskaitos duomenys skelbia, jog analgetikai, kaip viena iš apsinuodijimą sukėlusių medžiagų, 2011 metais nustatyti 311

15 347 apsinuodijimų atvejų, tai sudarė 11,59 % visų ištirtų apsinuodijimų. [22] Tarp nenarkotinių analgetikų sukeliančių apsinuodijimus, itin dažnai nustatomas paracetamolis. 2005 2006 m. Australijoje paracetamolis buvo nustatytas 12 % visų apsinuodijimo atvejų (72,53% atvejų kai apsinuodijimo priežastis buvo nenarkotinis analgetikas). [23] 2011 m. Jungtinėse Amerikos Valstijose paracetamolis buvo užregistruotas 9% visų apsinuodijimo ir 70% mirtinų apsinuodijimų atvejų. [41] Nuo 2008 m. iki 2012 m. Didžiojoje Britanijoje užfiksuotos 1103 mirtys, kurias sukėlė paracetamolio perdozavimas. Paracetamolis yra bene dažniausiai suicidiniams tikslams naudojama vaistinė medžiaga. [32] Opioidiniams analgetikams priskiriamas kodeinas yra vienas iš plačiausiai ne medicinos tikslais naudojamų analgetikų Jungtinėse Amerikos Valstijose. 2012 metais kodeinu, mišiniuose kartu su paracetamoliu, piktnaudžiavo daugiau nei 18 mln. amerikiečių, o gryną kodeiną, ne medicinos reikmėms, vartojo 6,4 mln. Jungtinių Amerikos Valstijų gyventojų. [30] Lyginant 2004 2011 metų laikotarpį, Kentukio valstijoje (JAV) piktnaudžiavimo kodeinu atvejų skaičius išaugo 39 %. [9] Amerikos apsinuodijimų kontrolės centro duomenimis, 2011 m. JAV buvo užregistruoti 1953 apsinuodijimo kodeinu atvejai. [22] Alprazolamas, kodeinas ir paracetamolis yra plačiai pasaulyje vartojami vaistiniai preparatai, galintys sukelti mirtinus apsinuodijimus vartojant juos netinkamomis dozėmis. Stebint šių preparatų vartojimo paplitimo augimo tendencijas, prieita išvada, jog reikalingos šių preparatų kokybinės analizės metodikos, kurios galėtų palengvinti toksikologinės laboratorijos kasdieninį darbą. 2.3. Alprazolamo, kodeino ir paracetamolio toksiškumas 2.3.1. Alprazolamo toksiškumas Alprazolamas yra triazolobenzodiazepinas, naudojamas gydant įvairius centrinės nervų sistemos sutrikimus, tokius kaip generalizuotą nerimą, panikos priepuolius ar depresiją.[25] Lietuvoje alprazolamas registruotas kaip vaistiniai preparatai: Alprasedon, Alprazolam Grindeks, Alrazolam Orion, Frontin, Xanax, Zomiren. [6] C 17 H 13 ClN 4 M R 308,8 IUPAC: 8-Chloro-1-metil-6-fenil-4H-[1,2,4]tirazolo[4,3-a][1,4]- benzodiazepinas [13]

16 Alprazolamas yra balti arba beveik balti kristaliniai milteliai. Praktiškai netirpūs vandenyje, gerai tirpūs chloroforme ir dichlormetane, sunkiau tirpūs acetone ir etanolyje.[13] Tai lipofilinė medžiaga, kuri lengvai skverbiasi per hematoencefalinį barjerą ir pasiekia centrinę nervų sistemą. Dideliu afinitetu jungdamasis prie gama amino sviesto rūgšties (GABA A ) receptorių, alprazolamas didina chloro jonų kanalų atsidarymo dažnį taip sukeldamas nervinių ląstelių hiperpoliarizaciją. [14] Alprazolamo farmakologinis poveikis priklauso nuo dozės. Mažos terapinės dozės slopiną nerimą, pasižymi sedaciniu ir hipnotiniu poveikiu. Didelėmis dozėmis jis sukelia anterogradinę amneziją, slopina traukulius ir atpalaiduoja skeleto raumenis.[34] Alprazolamas gerai absorbuojamas iš virškinamojo trakto priklausomai nuo dozės iki 90 % suvartoto kiekio patenka į sisteminę kraujotaką. Suvartojus vienkartinę 1 mg alprazolamo dozę, didžiausias vaisto kiekis (C max ) 12 22 µg/l pasiekiamas po 1 2 valandų (T max ). Apie 80 % alprazolamo kraujyje cirkuliuoja susijungusio su kraujo baltymais. [14] Alprazolamas priskiriamas vidutinės poveikio trukmės benzodiazepinų grupei. Jo pusinės eliminacijos laikas, priklausomai nuo individualaus paciento metabolizmo, svyruoja nuo 6,3 iki 25,9 valandų (t 1/2 ). [17] Pasiskirstymo tūris (Vd) sudaro 0,8 1,3 L/kg, o klirensas (Cl) svyruoja nuo 0,7 iki 1,5 ml/min/kg. Vyresnio amžiaus pacientams būdingas mažesnis vaisto klirensas, nei jaunų pacientų, todėl reikalinga dozės korekcija. [14] Alprazolamas metabolizuojamas kepenyse citochromo P450 sistemos. Pagrindiniai du metabolitai, 4-hidroksi alprazolamas ir α- hidroksi alprazolamas pasižymi silpnu poveikiu lyginant su nemetabolizuotu vaistu. Iki 80 % alprazolamo per inkstus pašalinama nemetabolizuotos formos. Vaisto pašalinimą iš organizmo ilgina kepenų ir inkstų patologija, nutukimas.[14,16] Alprazolamo toksinis poveikis pasireiškia dėl centrinės nervų sistemos slopinimo. Palyginti mažos dozės gali sukelti svaigulį, koordinacijos ir regėjimo sutrikimus, raumenų silpnumą. Didelės alprazolamo dozės (0,10 mg/l), ypač kartu su alkoholiu ar kitomis centrinę nervų sistemą veikiančiomis medžiagomis (opiodiniais analgetikais, tricikliais antidepresantais, kokainu, metamfetaminu ir kt.), gali sukelti haliucinacijas, ataksiją, sąmonės netekimą, komą, kvėpavimo centro slopinimą, hipotenziją, refleksinę tachikardiją ir mirtį. [14, 16, 34] Net 94,9% mirtinų apsinuodijimų alprazolamu atvejų, pacientų kraujyje būna nustatomi ir kitų, ne tik alprazolamo, medžiagų metabolitai. Dažniausiai tai opioidiniai analgetikai (64,6 %), kiti benzodiazepinai (44,4%) ir alkoholis (34,5%). [17] Lyginant su kitais benzodiazepinais, apsinuodijimo alprazolamu atvejais pacientams pasireiškia didesnis toksinis poveikis. Apsinuodijus alprazolamu, 2,06 karto daugiau pacientų buvo reikalinga skubi intensyvios terapijos priežiūra, nei apsinuodijus kitais benzodiazepinais. Vidutinė intensyvaus paciento stebėjimo trukmė, po apsinuodijimo alprazolamu sudarė 19 valandų tai 1,27 karto daugiau, lyginant su kitų benzodiazepinų sukeltais apsinuodijimais. Flumazenilis ir dirbtinė

17 plaučių ventiliacija pacientams, apsinuodijusiems alprazolamu, buvo taikoma atitinkamai 8 % ir 11 % dažniau, nei kitų apsinuodijimų atvejais. Dvylikai procentų ligonių pasireiškė koma (GCS <9), lyginant su 10 % dėl kitų benzodiazepinų perdozavimo. [31] 2.3.2. Paracetamolio toksiškumas Paracetamolis yra nenarkotinis analgetikas, vienas ar mišiniuose, plačiai naudojamas skausmo ir pakilusios kūno temperatūros slopinimui. [28] Jis randamas daugelyje nereceptinių vaistų skirtų skausmo ar peršalimo simptomams mažinti. Paracetamolis kaip veiklioji medžiaga įeina į tokių Lietuvoje registruotų vaistinių preparatų sudėtį kaip : APAP, Askofenas L, Coldrex, Citramonas L, Daleron Cold3, Efferalgan, Fervex, Gripex, Panadol, Paracetamolis Santitas, Saridon, Solpadeine, Theraflu, Ultracod ir kituose. [6] C 8 H 9 NO 2 M R 151,2 IUPAC: N-(4-hydroksifenil)acetamidas [13] Paracetamolis yra balti arba beveik balti kristaliniai milteliai. Sunkiai tirpūs vandenyje, laisvai tirpūs etanolyje, šiek tiek tirpūs metileno chloride. [13] Nors paracetamolis gydymui naudojamas nuo 1950 m., jo veikimo mechanizmas nėra iki galo išaiškintas. Paracetamolis yra silpnas ciklooksigenazės-1 (COX -1) ir ciklooksigenazės 2 (COX-2) inhibitorius periferiniuose audiniuose, nesukeliantis žymaus prostaglandinų sintezės sumažėjimo trombocituose ir skrandžio gleivinėje. Manoma, kad jis taip pat inhibuoja ciklooksigenazę 3 (COX - 3), centrinėje nervų sistemoje. Paracetamolis organizmą veikia kaip analgetinė ir antipiretinė vaistinė medžiaga. [14, 17] Paracetamolis greitai absorbuojamas iš virškinamojo trakto. Biopraeinamumas lyginant su intravenine injekcija 63 89 %, dėl pirminio vaisto metabolizmo kepenyse. Maksimali vaisto koncentracija plazmoje 5-20 µg/ml (C max ), susidaranti po vienkartinės 500mg dozės pasiekiama po 30 60 min. nuo vaisto pavartojimo. [28] Vaisto pasiskirstymo tūris (Vd) sudaro 0,8 1 l/kg. Paracetamolis nežymiai jungiasi su plazmos baltymais iki 90% jo sisteminėje kraujotakoje cirkuliuoja laisvo. Vaisto klirensas (Cl) esant sveikiems pacientams 367,8 ± 62,5 ml/min. Pusinis eliminacijos laikas priklausomai nuo kepenų ir inkstų būklės svyruoja nuo 1,6 iki 2,4 valandos. [11, 14, 28]

18 Paracetamolio metabolizmas priklauso nuo amžiaus ir suvartotos vaisto dozės. Jis beveik visas metabolizuojamas kepenyse ir tik 2 5% nepakitusio vaisto pasišalina su šlapimu. Pagrindiniai paracetamolio metabolitai yra sulfato (35%), gliukuronido (60%), cisteino ir merkapto rūgšties konjugatai (3%), tačiau nedidelė dalis paracetamolio metabolizuojama į N-acetil p benzochinoneiminą (NAPQI), kuris pasižymi hepatotoksiniu poveikiu. Naujagimių ir vaikų organizme paracetamolis metabolizuojamas lėčiau, daugiausiai susidarant paracetamolio konjugatams su sulfato rūgštimi. Nemetabolizuotas paracetamolis ir jo metabolitai šalinami kartu su šlapimu. [28] Dideli atsitiktinai ar suicidiniais tikslais pavartoti paracetamolio kiekiai gali sukelti kepenų nekrozę ir kepenų funkcijos nepakankamumą. Vienkartinė 10 15 gramų dozė gali sukelti kepenų veiklos sutrikimus, o didesnis nei 25 gramų paracetamolio kiekis laikomas mirtinu. Pykinimas, vėmimas, viduriavimas, pilvo skausmas ir šokas yra pirminiai apsinuodijimo simptomai pasireiškiantys po 4 12 valandų nuo vaisto perdozavimo. 24 48 valandų laikotarpyje pradeda ryškėti kepenų pažeidimo požymiai. Ryškiausias kepenų pažeidimas atsiranda po 4 6 dienų nuo vaisto perdozavimo (kepenų fermentų aktyvumas pasiekia 10 000 vienetų analogiška pacientams sergantiems virusiniu hepatitu). Citochromo CYP 450 CYP2E1 fermentas paracetamolį metabolizuoja į toksišką NAPQI, kuris, esant įprastiniams paracetamolio kiekiams organizme, detoksikuojamas prijungiant glutationą ir pašalinant per inkstus. Esant dideliems NAPQI kiekiams arba išsekus glutationo atsargoms, NAPQI jungiasi prie nukleofilinių hepatocitų makromolekulių, formuodamas paracetamolio baltymų konjugatus. Paracetamolio jungimasis prie hepatocitų makromolekulių sukelia hepatocitų nekrozę, kuri lemia kepenų funkcijos nepakankamumą ir gali būti mirties priežastis. Paracetamolio toksiškumui didelės įtakos turi alkoholio, fenobarbitalio, izoniazido ir kitų medžiagų, kurios skatina CYP 450 CYP2E1 aktyvumą arba mažina glutationo kiekį, vartojimas. [11] 2.3.3. Kodeino toksiškumas Kodeinas yra opijaus alkaloidas naudojamas silpnam ir vidutinio stiprumo skausmui malšinti arba sausam kosuliui slopinti. Lietuvoje kodeinas, kaip veiklioji medžiaga, įeina į vaistinių preparatų Solpadeine ir Ultracod sudėtį, kurie yra skirti skausmui slopinti. [6] C 18 H 21 NO 3 M R 317,4 IUPAC: 7,8-didehidro-4,5α-epoksi-3-metoksi- 17 metilmorfinan-6αolis [13]

19 Kodeinas yra balti arba beveik balti kristaliniai milteliai arba bespalviai kristalai. Tirpūs verdančiame vandenyje, lengvai tirpūs etanolyje, chloroforme, sunkiau benzene ir eteryje. Gerai tirpūs metanolyje ir skiestose rūgštyse. [13] Kodeinas pasižymi silpnesniu analgeziniu poveikiu nei morfinas dėl mažesnio afiniteto µ, κ ir δ opioidiniams receptoriams. Organizme kodeinas fermento CYP2D6 yra metabolizuojamas į morfiną, kuris pasižymi dideliu afinitetu opioidiniams receptoriams. Opioidiniai receptoriai, veikdami per G-baltymą slopina adenil-ciklazę, taip blokuodami Ca2+ jonų patekimą į neurono presinapsę ir skatindami K+ patekimą į posinapsinį neuroną. Sutrikdžius nervinio impulso perdavimą centrinėje nervų sistemoje sukeliamas analgezinis poveikis, lydimas kvėpavimo centro slopinimo, sedacijos ir galimos euforijos, priklausomai nuo suvartotos vaisto dozės. [14,17] Kodeinas ir jo druskos gerai absorbuojamas iš virškinamojo trakto. Maksimalus kiekis plazmoje (C max ) pasiekiamas po valandos nuo vaisto pavartojimo, o biopraeinamumas siekia 50%. Pasiskirstymo tūris (Vd) yra 3,5 l/kg, plazmos klirensas siekia 10 15 ml/min/kg. Kraujotakoje 25% kodeino cirkuliuoja sujungto su kraujo baltymais. Pusinės eliminacijos greitis, priklausomai nuo paciento kepenų ir inkstų būklės, svyruoja nuo 2,5 iki 4 valandų. [10, 15, 36] Kodeinas biotrasformuojamas kepenyse veikiant citochromo CYP450 CYP2D6 fermentui. Vykstant O- ir N- demetilinimui kodeinas metabolizuojamas į norkodeiną (57%), normorfiną (12%) ir morfiną (11%). Nepakitęs kodeinas ir jo metabolitai jungiasi su gliukurono ir sulfato rūgštimis. Iš organizmo kodeinas bei jo metabolitai šalinami su šlapimu. Dėl CYP2D6 fermento polimorfizmo 4 5 % amerikiečių ir 16 28 % šiaurės afrikiečių bei arabų pasireiškia itin greitas kodeino metabolizmas į morfiną, dėl kurio didėja morfino koncentracija kraujo plazmoje, galinti sukelti toksinį poveikį. [34] Kodeino toksinis poveikis gali pasireikšti dėl vaisto perdozavimo arba pacientams turintiems citochromo CYP450 šeimos CYP2D6 fermento polimorfinę formą, dėl kurios vyksta itin greitas kodeino metabolizmas į morfiną. Perdozavus kodeino pasireiškia pykinimas ir vėmimas, svaigulys, euforija, vidurių užkietėjimas, spazminiai pilvo skausmai ir hipotenzija. Dėl centrinės nervų sistemos ir kvėpavimo centro slopinimo po 4 valandų nuo perdozavimo pacientą gali ištikti mirtis. Letalinė kodeino dozė suaugusiam žmogui svyruoja nuo 0,5 iki 1,0 gramo. Nors kodeinas priskiriamas silpniems opioidinių receptorių agonistams, jis gali sukelti pripratimą ir toleranciją vartojant jį ilgą laiką. Kadangi kodeinas dažniausiai vaistiniuose preparatuose yra mišiniuose su paracetamoliu arba aspirinu, piktnaudžiavimas juo gali sukelti kepenų funkcijos sutrikimus arba stiprius skrandžio gleivinės pažeidimus. [34]

20 2.3. Alprazolamo, kodeino ir paracetamolio kokybinis vertinimas plonasluoksnės chromatografijos metodu 2.3.1. Plonasluoksnė chromatografija (PC) Plonasluoksnė chromatografija (PC) (ang. Thin layer chromatography (TLC)) yra paprasčiausias iš chromatografinės analizės metodų. [39] Nuo 1938 m., kai buvo pirmą kartą pristatyta rusų mokslininkų N. A. Izmailovo ir M. S. Šraiberio, PC yra vienas iš plačiausiai naudojamų kokybinės junginių analizės metodų. [33] Šio metodo populiarumą lemia tai, jog jis paprastas, patikimas, atrankus, lengvai atliekamas ir plačiai pritaikomas. Analizuojant cheminių medžiagų mišinius PC metodu galima pasiekti aukštos kokybės medžiagų išskirstymą bei itin tikslų medžiagų identifikavimą.[33] Plonasluoksnės chromatografijos atlikimo metodika iš esmės nekito daugiau nei penkis dešimtmečius [39]. Analizei naudojamos aliuminio, stiklo ar plastiko plokštelės, padengtos plonu (0,10 0,25 mm) sorbento sluoksniu. Kaip sorbentai yra naudojamos įvairios medžiagos, iš kurių populiariausios yra silikagelis, aliuminio oksidas, celiuliozė, celitas, sefadeksas ir krakmolas. Mėginys tirpinamas atitinkamame tirpiklyje ir mikrokapiliaru užnešamas ant chromatografinės plokštelės. Chromatografinė kamera pripildoma apie 1,5 cm storio sluoksniu tirpiklių sistemos ir į ją talpinama išdžiovinta chromatografinė plokštelė. Veikiamas adsorbcijos, eliuentas kyla chromatografine plokštele, kartu skirtingu greičiu keldamas tiriamąsias medžiagas. Tiriamųjų medžiagų diferencijavimas vyksta dėl skirtingo jų afiniteto mobilios ir stacionarios fazių atžvilgiu. Tirpiklių sistemai pasiekus finišo liniją, plokštelė išimama ir džiovinama. Tiriamųjų medžiagų dėmės ryškinamos naudojant UV šviesą arba cheminius ryškinimo reagentus. [33, 39] Plonasluoksnė chromatografija gali būti naudojama vaistinių medžiagų identifikavimui biologiniuose skysčiuose, cheminių ar augalinės kilmės vaistų sudėties vertinimui, junginių valymui ir priemaišų nustatymui.[33] 2.3.2. Plonasluoksnės chromatografijos metodikos, tinkamos identifikuoti alprazolamą, kodeiną arba paracetamolį Mokslinės literatūros šaltiniuose pateikiamos įvairios analizės, naudojant plonasluoksnę chromatografiją, metodikos, kurios gali būti naudojamos alprazolamui, kodeinui arba paracetamoliui identifikuoti biologiniuose skysčiuose ar vaistiniuose preparatuose. Dauguma pateikiamų analizės metodikų yra pritaikytos analizuoti individualius arba turinčius artimą cheminę struktūrą bei fiziko chemines savybes junginius dažniausiai tam tikras vaistinių medžiagų grupes, pavyzdžiui,

21 benzodiazepinų junginius ar opioidinius analgetikus. 3 lentelėje pateikiama informacija apie literatūroje aprašytas plonasluoksnės chromatografijos metodikas, kurios galėtų būti pritaikytos kokybiškai vertinant alprazolamą, kodeiną arba paracetamolį. 3 lentelė. PC mobilios fazės taikytinos alprazolamo, kodeino ir paracetamolio kokybinei analizei Mobili fazė Bevandenė acto rūgštis: vanduo: metanolis: etilo acetatas (2:15:20:80) [13] Metanolis: koncentruotas amonio hidroksidas (100:1,5) [21] Cikloheksanas: toluenas: dietilaminas (75:15:10) [21] Trichlormetanas: metanolis (90:10) [21] Trichlormetanas: Acetonas (80:20) [21] Etilo acetatas: metanolis: koncentruotas amonio hidroksidas (85:10:5) [21] Etilo acetatas [21] Acetonas [21] Metanolis [21] Metanolis: n-butanolis (60:40) ir 0,1 mol/l natrio bromido tirpale [21] Benzenas: dioksanas: koncentruotas amonio hidroksidas: metanolis: etanolis (60:25:5:10:10) [21] Trichlormetanas: acetonas: koncentruotas amonio hidroksidas (80:20:1) [21] Trichlormetanas: metanolis: bevandenė acto rūgštis (95:5:2,5) [8] Alprazolamo Rf reikšmė Kokybinis įvertimas pagal etaloninės medžiagos Rf Kodeino Rf reikšmė Paracetamolio Rf reikšmė - - 0,67 0,33 0,95 0,01 0,06 0,00 0,57 0,18-0,07-0,15 0,47 0,35 0,45 0,02-0,32 0,14 0,03-0,67 0,21 0,77 0,66 0,22-0,62 - - - - 0,14 - - 0,24 Iš lentelėje pateiktų duomenų matyti, jog dauguma aprašytų mobilių fazių nėra tinkamos alprazolamo, kodeino ir paracetamolio mišinio išskirstymui. Dažnu atveju atskyrimas negalimas dėl artimų Rf reikšmių arba tirpiklių sistemų tinkamumas nėra įvertintas visoms trims medžiagoms. Kaip plonasluoksnės chromatografijos mobilios fazės sudedamosios dalys dažnai yra naudojami metanolis, trichlormetanas, acetonas ir koncentruotas amonio hidroksidas. Vykdant literatūros analizę nebuvo rasta informacijos apie alprazolamo, kodeino ir paracetamolio mišinio kokybinį vertinimą plonasluoksnės chromatografijos metodu, todėl prieita išvada, jog mišinio tyrimams optimaliausia mobili fazė bus ieškoma eksperimentiškai.

22 2.4. Alprazolamo, kodeino ir paracetamolio kokybinis vertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu 2.4.1. Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) 1970 m. dvidešimt pirmojoje Pitsburgo konferencijoje, kuri vyko Klivlende (JAV), profesorius Horvatas pateikė Efektyviosios skysčių chromatografijos terminą. Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) (angl. High-performance liquid chromatography (HPLC)) tai kolonėlinė skysčių chromatografija, išsiskirianti itin dideliu efektyvumu ir analizės greičiu. [41] Būtent dėl greitos ir efektyvios analizės, ESC yra vienas iš plačiausiai naudojamų kokybinės ir kiekybinės analizės metodų farmacijos, biotechnologijų, maisto, toksikologijos ir kitose srityse. Efektyvioji skysčių chromatografija nuo įprastinės kolonėlinės skysčių chromatografijos skiriasi tuo, kad ESC yra naudojamos trumpos (5 25 cm) ir siauros (2 6 mm) vidinio skersmens plieno kolonėlės, pripildytos 3 5µm skersmens nejudrios fazės granulių. Dėl mažo sorbento dalelių skersmens susidariusiam hidrodinaminiam slėgiui įveikti naudojami aukšto slėgio siurbliai (0,5 40 MPa), kurie leidžia vykdyti greitą tiriamų medžiagų analizę. ESC kolonėlėse linijinis mobilios fazės tekėjimo greitis yra apie 100 kartų didesnis nei įprastinėse stiklo kolonėlėse, todėl greitėja medžiagų skirstymas ir trumpėja analizės trukmė. Mažos sorbento dalelės lemia daug didesnį medžiagų išskirstymo efektyvumą. [41] Chromatografinis skirstymas paremtas analičių plovimu pro nejudančios fazės poras. Iš rezervuaro, kuriame patalpinta mobili fazė, aukšto slėgio siurbliu eliuentas tiekiamas į kolonėlę. Dažniausiai, kaip sorbentas yra naudojamas silikagelis, kurio cheminė struktūra gali būti modifikuota. Kartu su eliuentu tiekiamas ir analizuojamasis mišinys. Priklausomai nuo mišinio komponento afiniteto sorbentui, jis iš kolonėlės išplaunamas skirtingu laiku. Medžiagų atskyrimui naudojami įvairūs mechanizmai: adsorbcija, eksliuzija, pasiskirstymas, jonų mainai ir kt. Kuo silpniau sorbentas adsorbuoja analitę, tuo greičiau ji išplaunama iš kolonėlės. Išplauta medžiaga detektoriaus yra fiksuojama kaip signalas, o šis kompiuterinės sistemos verčiamas į signalo stiprumo priklausomybės nuo laiko grafiką chromatogramą. [41] Efektyvioji skysčių chromatografija plačiai naudojama gryninant sintetinius ir natūralius produktus, nustatant metabolitus, kiekybiškai vertinant sudėtines mišinių dalis, priemaišas ir irimo produktus, farmakodinamikos ir farmakokinetikos tyrimuose. [41]

2.3.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos, tinkamos identifikuoti alprazolamą, kodeiną arba paracetamolį 23 Mokslinės literatūros šaltiniuose yra aprašyti įvairūs ESC metodai, kurie buvo taikomi tiriant alprazolamą, kodeiną ar paracetamolį. Jie plačiai taikomi vaistų klinikiniuose tyrimuose vertinant medžiagų farmakokinetines savybes bei pramonėje vykdant kokybės kontrolę. 4 lentelėje pateiktos ESC metodikos, kurios gali būti naudojamos alprazolamo, kodeino ir paracetamolio kokybinei analizei biologiniuose skysčiuose ar vaistiniuose preparatuose. 4 lentelė. ESC metodikos taikytinos alprazolamo, kodeino ir paracetamolio kokybinei analizei Metodika HZ [21] HAA [21] HAL [21] HAM [21] HAX [21] HAY [21] Alprazolamo sulaikymo laikas Kodeino sulaikymo laikas Paracetamolio sulaikymo laikas RT 4,0 min RT 1,9 min RT 1,9 min RT 17,0 min RT 5,0 min RT 5,6 min RT 6,3 min - - - - RT 2,0 min RT 6,4 min RT 6,1 min RT 4,8 min RT 6,4 min RT 3,4 min RT 3,7 min Metodika HZ: Kolonėlė: C 18 LiChrospher 100 Rp-18e (125 4,0 mm, 5µm) su prieškolonėle LiChrocart 124-4. Mobili fazė: Į 530 ml vandens įpilama 146µl trietilamino ir 750µl fosforo rūgšties. Naudojant 10% kalio hidroksido tirpalą tirpalo ph privedamas iki 3,3. Gautas tirpalas sumaišomas su 470 ml acetonitrilo. Tekėjimo greitis 0,6 ml/min/ Detektorius: fotodiodų matricos detektorius Metodika HAA: Kolonėlė: C 8 Symmetry (250 4,6 mm, 5µm) su prieškolonėlė Symmetry C 18 (20 mm). Kolonėlės temperatūra: 30 C. Mobili fazė (A:B) fosfatinis buferis (ph 3,8) acetonitrilas. Gradientinis eliuavimas: (85:15) 6,5 min pereinant į (65:35) iki 25 min pereinant į (20:80) 3 minutes, grįžtant į pradinę sistemą per 7 minutes.

24 Tekėjimo greitis: 1 ml/min 6,5 minutės, tada didėja iki 1,5 ml/min 6,5 25 min ir laikoma 3 minutes. Rekalibracija vyksta esant 1,5 ml/min tekėjimo greičiui. Detektorius: fotodiodų matricos detektorius Metodika HAL: Kolonėlė C 18 Novapak (150 4,6 mm, 5µm) Mobili fazė: acetonitrilas: metanolis: 6 mmol/l fosfatinis buferis (ph 5,7) (30:10:60) Tekėjimo greitis: 1,3 ml/min. Detektorius: Fotodiodų matricos detektorius Metodika HAM: Kolonėlė C 18 (150 4,0 mm, 3µm) su C 18 prieškolonėle (40 4,0 mm, 3 µm). Mobili fazė: vanduo acetonitrilas (50:50). Tekėjimo greitis: 0,7 ml/min. Detektorius: UV (ƛ = 313 nm). Metodika HAX: Kolonėlė: Supelcosil LC DP (250 4,6 mm, 5µm). Mobili fazė: acetonitrilas: fosforo rūgštis (0,025% v/v): trietilamino buferis (25:10:5). Tekėjimo greitis: 0,6 ml/min. Detektorius: fotodiodų matricos detektorius (ƛ = 229 nm). Metodika HAY: Kolonėlė: LiChrospher 100 RP 8 (250 4,0 mm, 5µm). Mobili fazė: acetonitrilas: fosforo rūgštis (0,025% v/v): trietilamino buferis (60:25:15). Tekėjimo greitis: 0,6 ml/min. Detektorius: fotodiodų matricos detektorius (ƛ = 229 nm). Atlikus literatūros analizę nerasta tyrimų, kuriuose būtų analizuotas alprazolamo, kodeino ir paracetamolio mišinys. 4 lentelėje pateiktos ESC metodikos pritaikytos analizuoti visas tris medžiagas atskirai, tačiau medžiagų sulaikymo laikai daugelyje sistemų yra artimi, todėl mišinio analizei aprašytos metodikos nėra tinkamos. Literatūroje pateiktos ESC metodikos buvo naudojamos kaip pamatas, kuriant ir tobulinant tinkamiausią ESC metodiką, tinkančią alprazolamo, kodeino ir paracetamolio kokybinei analizei jiems esant mišinyje.