Microsoft Word - Laura-Nekraseviciute.docx

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA LAURA NEKRAŠEVIČIŪTĖ MĖLYNIŲ (VACCINIUM MYRTILLUS L.) LAPŲ CHEMINĖS SUDĖTIES IR ANTIRADIKALINIO AKTYVUMO TYRIMAS Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas Dr. Deividas Burdulis KAUNAS, 2017

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA TVIRTINU Farmacijos fakulteto dekanas prof. Dr. Vitalis Briedis 2017m. MĖLYNIŲ (VACCINIUM MYRTILLUS L.) LAPŲ CHEMINĖS SUDĖTIES IR ANTIRADIKALINIO AKTYVUMO TYRIMAS Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas Dr. Deividas Burdulis 2017m. Recenzentas Darbą atliko Magistrantė 2017m. Laura Nekraševičiūtė 2017m. KAUNAS, 2017

TURINYS TURINYS... 1 SANTRAUKA... 5 SUMMARY... 6 SANTRUMPOS... 7 ĮVADAS... 8 DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI... 9 1 LITERATŪROS APŽVALGA... 10 Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) apibūdinimas ir cheminė sudėtis... 10 Augalo apibūdinimas... 10 Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) lapų cheminė sudėtis... 11 Vaistinė augalinė žaliava, jos ruošimas ir laikymas... 11 Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) žaliavos indikacijos bei vartojimas medicinoje... 12 Antidiabetinis poveikis... 12 Priešopinis veikimas... 13 Regos sutrikimų gydymas... 13 Augalinio vaisto formos ir dozavimas... 14 Nepageidaujamos reakcijos, kontraindikacijos, toksiškumas ir sąveikos su vaistais... 14 Svarbiausių mėlynių lapų biologiškai aktyvių junginių apžvalga... 15 Bendra flavonoidų apžvalga bei cheminė struktūra ir klasifikacija... 15 Rauginės medžiagos ir jų klasifikacija... 18 Antioksidantinis aktyvumas... 20 2 TYRIMŲ OBJEKTAI IR METODAI... 22 Tyrimo objektas... 22 Naudoti reagentai ir medžiagos... 23

Naudota aparatūra ir priemonės... 23 Tyrimų metodai... 24 Nuodžiūvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje... 24 Ekstraktų ruošimo metodika... 24 Suminio flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu... 25 Suminio raugų kiekio nustatymas titrimetriniu metodu... 25 Suminio fenolinių junginių kiekio išreikšto galo rūgšties ekvivalentu, nustatymas Folin-Ciocalteu metodu... 26 Antiradikalinio aktyvumo nustatymas DPPH metodu... 28 Redukcinio aktyvumo įvertinimas FRAP metodu... 28 Statistinė duomenų analizė... 29 3 TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS... 30 Vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvis... 30 Ekstrakcijos metodo optimizavimas... 31 Flavonoidų kiekybinės sudėties kitimo dinamika augalo vegetacijos metu... 34 Raugų kiekybinės sudėties įvairavimas... 35 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas mėlynių lapų ekstraktuose... 38 Antiradikalinio aktyvumo nustatymas mėlynių lapų ekstraktuose DPPH metodu.... 40 Antiradikalinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu... 41 4 IŠVADOS... 45 5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS... 46 6 LITERATŪROS SĄRAŠAS... 47

5 SANTRAUKA Lauros Nekraševičiūtės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas dr. D. Burdulis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. Kaunas. Darbo pavadinimas Mėlynių lapų (Vaccinium Myrtillus L.) cheminės sudėties ir antiradikalinio aktyvumo nustatymas. Darbo tikslas ištirti natūraliose augimvietėse surinktų mėlynių lapų fenolinių junginių cheminę sudėtį ir antiradikalinį aktyvumą. Darbo uždaviniai: 1. Nustatyti tinkamiausią mėlynių lapų augalinės žaliavos ekstrakcijos metodą ir optimaliausias ekstrakcijos sąlygas. 2. Įvertinti suminio fenolinių junginių, flavonoidų, rauginių medžiagų kiekinės sudėties kitimo dinamiką augalo vegetacijos tarpsniais. 3. Įvertinti suminio fenolinių junginių, flavonoidų, rauginių medžiagų kiekinių rodiklių įvairavimą skirtingose Lietuvos augimvietėse surinktuose ėminiuose. 4. Įvertinti mėlynių lapų ekstraktų antiradikalinį aktyvumą. Tyrimo metodai. Ekstrakcijai buvo pasirinkta maceracija ultragarsinėje vonelėje ir ekstrahentas buvo panaudotas 80 proc. V/V etanolis. Suminiam flavonoidų kiekiui nustatyti panaudotas spektrofotometriniu metodas. Suminiam raugų kiekio tyrimui buvo panaudotas titrimetrijos metodas. Fenolinių junginių kiekis buvo įvertintas panaudojant Folin-Ciocalteu reagentą. Antiradikaliniam aktyvumui įvertinti panaudotas DPPH radikalų surišimo ir FRAP metodus. Tyrimo rezultatai ir išvados. Didžiausias suminis flavonoidų kiekis yra aptiktas augalo žydėjimo metu, apie liepos vidurį (3,37 ± 0,02 proc.). Suminio raugų kiekio didžiausia koncentracija buvo nustatyta dviem laikotarpiais, tai yra augalo vystymosi metu (2015 metais 4,92 ± 0,03 proc.; 2016 metais 5,96 ± 0,02 proc.) bei į žydėjimo pabaigą (2015 metais 4,13 ± 0,01 proc.; 2016 metais 4,62 ± 0,02 proc.). Fenolinių junginių didžiausias kiekis buvo pasiektas apie liepos vidurį, (12,11 ± 0,07 mg/g) kuomet buvo vaistinio augalo žydėjimo metas. Antiradikalinis aktyvumas svyravo nuo nuo 58,74 ± 0,6 proc. iki 72,56 ± 0,29 proc. Didžiausias redukcinis aktyvumas nustatytas FRAP metodu 2015 metais 63,65 ± 0,44 µmol/g, o 2016 metais 60,78 ± 0,12 µmol/g.

6 SUMMARY The master thesis by Laura Nekraševičiūtė. The supervisor is dr. Deividas Burdulis; Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosis, Kaunas. The topic of the master thesis: Chemical composition and antiradical effect assessment of Bilberry leaves (Vaccinium myrtillus L.). The aim of the research: To investigate in natural habitats collected Bilberry leaf chemical composition of the phenolic compounds and antiradical effect. The objectives of research: 1. To determine the most suitable extraction method of Bilberry leaves and the optimal extraction conditions. 2. To evaluate quantitative composition dynamics of phenolic compounds, flavonoids and tannins during the growing season. 3. To estimate quantitative indicators volume of composition dynamics of phenolic compounds, flavonoids, tannins and in different habitats Lithuania collected samples. 4. To determine antiradical effect of Bilberry leaf extracts. The methods of the research: The maceration by ultrasonic bath using 80 proc. V/V ethanol was selected for extraction. For total flavonoids determination, the spectrophotometric method was applied for total flavonoid content. For total tannin content the titration methods were applied. The quantative of phenolic compounds were evaluated by infusing Folin-Ciocalteu reagent. The antiradical activity was determined by using the DPPH radical scavenging and FRAP methods. The results of the research: The highest total flavonoid content was found in massive flowering period, in the middle of July (3,37 ± 0,02 proc.). The peak of total tannin content was observed in two periods, that is during development of the plant (2015 year 4,92 ± 0,03 proc; 2016 year 5,96 ± 0,02 proc.) and in the end of flowering (2015 year 4,13 ± 0,01 proc; 2016 year 4,67 ± 0,02 proc.). The maximum quantity of Phenolic compounds has been reached in the middle of July (12,11 ± 0,07 proc.), when there was a medicinal plant flowering time. DPPH radical bonding method ranged from 58,74 ± 0,6 proc. up 72,56 ± 0,29 proc. Maximum reduction activity as determined by method FRAP 2015 year was ranged from 41,72 ± 0,1 µmol/g and 63,65 ± 0,44 µmol/g.

7 SANTRUMPOS ABTS EMA EMA FC FRAP GRE LR RNS ROS TE VSN 2,2 - azino- bis- (3-etilbenztiazolin- 6- sulfono rūgšties diamino druska 2,2- difenil- 1- pikrilhidrazilo hidratas Europos vaistų agentūra (angl. European Medicines Agency Folin-Ciocalteu reagentas (angl.ferric reducing antioxidant power) geležies jonų redukcijos antioksidacinės galios tyrimas Galo rūgšties ekvivalentas Laisvieji radikalai (angl. Reactive nitrogen species) reaktyvios azoto formos (angl. Reactive oxygen species) reaktyvios deguonies formos Trolokso ekvivalentas Vidutinis standartinis nuokrypis

8 ĮVADAS Šio darbo objektas - mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) lapai. Mėlynės tai daugiametis puskrūmis augalas, priklausantis erikinių (Ericacea) augalų šeimai, plačiai paplitęs tiek šiaurės tiek centrinėje Europoje, tačiau taip pat randama Šiaurės Amerikoje bei Azijoje. Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) vaistinė augalinė žaliava gali būti lapai ir vaisiai. Mėlynių lapų vartojimas jau žinomas nuo senų laikų. Gausi mėlynių lapų polifenolinių junginių sudėtis pasižymi antiradikalinėmis savybėmis ir yra naudojama esant hiperglikemijai, burnos gleivinės opoms ir odos uždegimams slopinti, gerina akių funkcijos veiklą slopindamas laisvųjų radikalų daromą žalą. Mėlynės, Lietuvoje plačiai žinomas puskrūmis augalas, tačiau Lietuvoje nėra pakankamai duomenų apie fenolinių junginių kiekio įvairavimą bei biologiškai aktyvių medžiagų sudėtį mėlynių lapuose, todėl yra aktualu ištirti Lietuvoje augančių mėlynių lapų polifenolinių junginių sudėtį bei įvertinti tinkamiausią žaliavos ruošimo laiką Lietuvos klimato sąlygomis, Flavonoidai bei fenoliniai junginiai yra pagrindinės biologiškai aktyvios medžiagos randamos mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) lapuose, todėl išanalizuoti buvo pasirinktas spektrofotometrinis metodas, kuris leido įvertinti ir palyginti flavonoidų, fenolinių junginių kiekybinį pasiskirstymą tam tikru vegetacijos metu bei palyginti sudėties kintamumą skirtinguose Lietuvos regionuose. Taip pat žinoma, jog viena svarbiausių priežasčių akių degeneracijos susirgimams (katarakta, geltonosios dėmės degeneracija) yra laisvųjų radikalų sukeliami pažeidimai, todėl buvo svarbu ištirti mėlynių lapų antiradikalinį aktyvumą bei kokiu augalo vystymosi metu mėlynių lapų žaliava pasižymi stipriausiu antiradikaliniu poveikiu. Šio tyrimo naujumas yra flavonoidų, raugų ir fenolinių junginių kiekybinės sudėties kitimo dinamikos ir antiradikalinio aktyvumo nustatymas skirtingu augalo vegetacijos laikotarpiu bei skirtinguose augalo augimo regionuose Darbo tikslas - ištirti natūraliose augimvietėse surinktų mėlynių lapų (Vaccinium myrtillus L.) fenolinių junginių cheminę sudėtį ir antiradikalinį aktyvumą.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI 9 Darbo tikslas- ištirti natūraliose augimvietėse surinktų mėlynių lapų (Vaccinium myrtillus L.) fenolinių junginių cheminę sudėtį ir antiradikalinį aktyvumą. Darbo uždaviniai: 1. Nustatyti tinkamiausią mėlynių lapų augalinės žaliavos ekstrakcijos metodą ir optimaliausias ekstrakcijos sąlygas. 2. Įvertinti suminio fenolinių junginių, flavonoidų, rauginių medžiagų kiekinės sudėties kitimo dinamiką augalo vegetacijos tarpsniais. 3. Įvertinti suminio fenolinių junginių, flavonoidų, rauginių medžiagų kiekinių rodiklių įvairavimą skirtingose Lietuvos augimvietėse surinktuose ėminiuose. 4. Įvertinti mėlynių lapų ekstraktų antiradikalinį aktyvumą.

10 1 LITERATŪROS APŽVALGA Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) apibūdinimas ir cheminė sudėtis Augalo apibūdinimas 1pav. Mėlynė (Vaccinium myrtillus L.) Botaninis aprašymas. Mėlynių mokslinė klasifikacija yra skirstoma: mėlynė (Vaccinum myrtillus L.), karalystė: augalai (Plantae), skyrius: Mognolijūnai (Mognoliophyta), klasė: Mognolijainiai (Mognoliopsida), poklasis: Dilenijažiedžiai (Dilleniidae), šeima: Erikiniai (Ericaceae), gentis: Šilauogė ( Vaccinium), rūšis: Mėlynė (Vaccinum myrtillus L.) [1]. Mėlynė (Vaccinium myrtillus L.), tai puskrūmis daugiametis augalas, priklausantis erikinių (Ericacea) šeimai, Europos sąjungos šalyje žinomos angliškais pavadinimais: bilberry, huckleberry, whortleberry [2]. Dažniausiai užauga iki 40-60 cm aukščio, tankiai šakotas, randamas kalnuose bei miškuose. Lapai ovalios formos, smulkiai dantyti, nusmailėjusi viršūne, šviesiai žalios spalvos, pusiau matiniai. Jaunų augalų stiebas yra žalios spalvos, vėliau tampa rudas, lygus, apatinėje dalyje sumedėjęs. Vainikėlis rausvos spalvos, pūstas. Vaisiai juodi su mėlynos spalvos atspalviu, rutulio formos, 6-8 mm, sultinga, saldžiai rūgštaus skonio, malonaus kvapo. Žiedai randami pažastyse, pavieniai, rusvai žalsvos spalvos pražysta nuo balandžio iki liepos mėnesio, apdulkinus vabzdžiams. Vaisius prinoksta nuo liepos iki rugsėjo mėnesio. Gimtoji šalis yra Šiaurės ir Centrinė Europa, tačiau tai pat plačiai paplitęs Šiaurės Amerikoje ir Azijoje bei vidutinio ir arktinio klimato srityse. Mėlynės geriausiai auga aukštumose, kalnuose, drėgnuose ir vidutinio drėgnumo pievose, pelkėse bei stipriai rūgščiuose dirvožemiuose: pušynuose, spygliuočių miškuose, durpynuose [3].

11 Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) lapų cheminė sudėtis Išanalizavus mokslinę literatūrą, įvairius kokybinius ir kiekybinius tyrimus, mėlynių lapuose yra nustatyta labai įvairi biologiškai aktyvių medžiagų sudėtis. [4] [5]. Mėlynių lapai nuo vystymosi pradžios iki pabaigos (rudens), pasikeičia nuo žalios iki raudonos/ raudonai rudos spalvos ir toks lapų spalvų pokytis taip pat yra priskiriamas fitocheminės sudėties pokyčiui [6]. Pavyzdžiui, mėlynių lapuose esantis antocianinas buvo tirtas, kuomet mėlynių lapai yra žali ir raudoni ir gauti rezultatai parodė, jog raudonos spalvos lapuose buvo rastas 0,882 mg/g antocianinų, o žaliuose lapuose antocianinų nebuvo rasta išviso [7]. Taip pat mėlynių lapuose galima rasti raugų, kurie vadinami taninais ir jų kiekis gali svyruoti nuo 2 iki 20 proc. Mėlynių lapuose esantys flavonoidai yra stiprūs antioksidantai, kurie neutralizuoja laisvuosius radikalus bei mažina uždegimą [8] [9]. Šie flavonoidai savo antioksidantiniu poveikiu yra panašūs į žaliąją arbatą, vynuogių kauliukų ekstraktą, pušies žievės ekstraktą bei ginkmedį [10]. Mėlynių sudėtyje nustatytos medžiagos [11] [12]: Falvanoidai: hiperosidas, izokvercetinas, kvercetinas, astragalinas; Antocianidinai: mirtilinas, malvidinas, cianidinas, delfinidinas, peonidinas, petunidinas; Rauginės medžiagos: taninai 2-20 proc.; Fenoliniai glikozidai: arbutinas; Organinės rūgštys; Angliavandeniai: gliukozė, fruktozė; Pektinai; Alkaloidai: mirtinas ir epimirtinas [13]. Vaistinė augalinė žaliava, jos ruošimas ir laikymas Vaistinė augalinė žaliava pagal Europos medicinos agentūrą (EMA) yra naudojami šviežiai nuskintos arba sudžiovintos uogos bei mėlynių lapai [14]. Lapai skinami vasaros pabaigoje arba rudens pradžioje, kol dar būna visai žali. Juos džiovinti reikia gerai vėdinamoje patalpoje arba džiovykloje ne aukštesnėje kaip 40 C temperatūroje [15]. Laikyti sausoje vietoje. Mėlynių uogos yra renkamos sausos ir prinokusios. Surinkta augalinė žaliava (lapai ir uogos) yra paskleidžiami plonu sluoksniu ant audeklo ar lapo, sausoje ar gerai vėdinamoje patalpoje, geriausia pavėsyje ir vengiant tiesioginės saulės šviesos. Džiovintas mėlynių žaliavas galima vartoti 2 metus.

Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) žaliavos indikacijos bei vartojimas medicinoje 12 Mėlynių lapų vartojimas yra žinomos jau nuo senų laikų. XV a. Vienuolė, Hildegarda iš Bingeno, žymi žolininkė savo šaltiniuose skelbia, kad mėlynių lapai efektyviai mažina skausmą. Mėlynių lapai istoriškai buvo naudojami odos ir gleivinės membranos uždegimams slopinti. gydyti kosulį, inkstų akmenims šalinti, šlapimo takų infekcijoms, žarnyno ir kepenų sutrikimams slopinti, Fitoterapeutų teigimu mėlynių lapai plačiausiai naudojami vaistažolių arbatose taip pat vandeniniai- alkoholiniai ekstraktai tradicinėje medicinoje dėl savo antibakterinio ir antioksidantinio poveikio, taip pat mėlynių lapai gali būti naudojami profilaktiškai gydant kraujosruvas, venų verikozei, hemorojui. Mėlynių lapų panaudojimas medicinoje yra labai platus. Daugelį dešimtmečių mėlynės žinomos savo antimikrobiniu, antioksidantiniu bei uždegimą mažinančiu poveikio veiksmingumu. Daugiafunkcinis mėlynių poveikis buvo pritaikytas diabeto, vėžio bei kepenų sutrikimams gydyti. Taip pat mėlynių lapai pasižymi vertingu poveikiu gydant širdies ir kraujagyslių ligoms, gerina akių funkcijos veiklą. Taip pat, tradiciniu poveikiu, anksčiau mėlynės buvo naudojamos gydyti skorbutui bei šlapimo takų sutrikimams [16]. Antrojo pasaulinio karo metu, mėlynių uogos išpopuliarėjo tarp britų Karališkųjų oro pajėgų. Jų teigimu, mėlynių uogų naudojimas prieš naktinius puolimus, pagerino karių naktinio regėjimo prisitaikymą [17]. Naktinis matymas yra ypač svarbu vairuotojams, pilotams, kariams, vyresnio amžiaus žmonėms, taip pat esant trumparegystei ar dėl įvairių degeneracinių ligų atsiradęs naktinio matomumo sutrikimas. Mėlynių lapai savo poveikiu plačiausiai žinomi dėl savo gydomųjų savybių akių sutrikimams, taip pat naudojamas naktinio matymo gerinimui, stabdo kataraktos vystymąsi bei progresavimą, diabetinei retinopatijai bei geltonosios dėmės degeneracijai, o taip pat užkerta kelią glaukomos vystymuisi [12]. Mėlynių lapuose yra randama flavonoidų, kurie pasižymi antioksidantinėms savybėms bei suteikia mėlynių uogoms mėlyną spalvą. Mėlynėse randama įvairių cheminių medžiagų, tai vieni iš jų flavonoidai vadinami antocianinai bei kvarcetino ir heperozido, kurie žmogaus organizmui daro teigiamą įtaką sveikatai bei gerina organų veiklą [18]. Antidiabetinis poveikis Kanados mokslininkai prieš atrandant insuliną 1992 metais, cukriniam diabetui gydyti plačiai naudojo vaistines augalines žaliavas kartu derinant su griežtomis dietomis. Nors jau senai buvo žinoma, kad liga yra neišgydoma, tačiau visais laikais buvo tyrinėjami augalai, kurie pasižymi hipoglikeminiu poveikiu. Šimtmečius buvo naudojamas opiumas iki atrandant insuliną, tačiau jo

13 paskirtis buvo ne mažinti cukraus kiekį kraujyje, o lengviau pacientams išgyventi ligos kančias [19]. Prieš insulino atradimą buvo žinomi trys augalai, kurie buvo naudojami cukrinio diabeto gydymu: slyvinis gvazdikmedis (Syzygium cumini L.), daržinė pupelė (Phaseolus vulgaris L.) bei mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) lapai [20]. Mėlynių lapų nuoviro antidiabetinis poveikis jau žinomas prieš kelis dešimtmečius. Mėlynių hipoglikeminis poveikis gali būti iš dalies susijęs su fermento gliukozidazės aktyvumu bei jo poveikiu insulino sekrecijai ir gliukozės transportui. Nustatyta, jog antocianinai, tai yra delfinidinas ir cianidinas stipriausiai skatina insulino sekreciją iš graužikų kasos B ląstelių [21]. Atliktame tyrime, buvo skiriama mėlynių lapų vandeniniai- alkoholiniai ekstraktai pelėms, kurioms buvo streptozotocino sukeltas cukrinis diabetas. Gliukozės kiekis kraujyje reikšmingai sumažėjo 33 proc. skiriant 287 mg/g antocianinų iš mėlynių lapų ekstrakto bei 51 proc. sumažėjo skiriant 595 mg/g antocianinų [22]. Mėlynių lapų ekstraktas yra plačiai žinomas savo veiksmingumu užkertant kelią diabetinei retinopatijai. Diabetinė retinopatija, tai liga kurios metu, asmenims sergantiems cukriniu diabetu, išsivysčiusi akių patologija, dėl sutrikusios kraujo cirkuliacijos akyse. Buvo atliktas dvigubai aklas klinikinis tyrimas kurio metu, buvo tirta 14 pacientų, kurie serga diabetine retinopatija. Tyrimo metu, pacientams buvo skiriama kasdien, visą mėnesį mėlynių lapų ekstrakto, kurio sudėtyje yra 150 mg antocianidino. Tyrimo rezultatai parodė, jog reikšmingi pakitimai buvo nustatyti 11 pacientų [23]. Šis poveikis buvo paskirtas antocianidinui, kuris stipriausiai veikia hiperglikemiją. Junginys antocianidinas padidina kolageno vientisumą, stabilizuoja kapiliarų pralaidumą bei slopina sorbitolio kaupimąsi ir taip suteikia apsaugą kraujagyslių ir nervų sistemai nuo diabeto pasekmių. Priešopinis veikimas Mėlynių lapų ekstraktai pasižymi stipriu priešopiniu poveikiu. Jų sudėtyje yra 25 proc. antocianidinų, kurie pasižymi šiuo veikimu ir įrodytas atlikus tyrimus su graužikais. Šio tyrimo metu, statistinis reikšmingumas buvo įrodytas remiantis Mano-Vitnio testu. Mažiausia veiksminga dozė, turinti statistinio reikšmingumo buvo nustatyta 100 mg/kg, tačiau taip pat turėjo įtakos ir tai, kas sukelia opas. Mėlynių lapų ekstrakto efektyvumas buvo nustatytas, jog jis didina mukopolisacharidų išsiskyrimą ir padeda apsaugoti skrandžio gleivinę. Veikimo mechanizmas yra pagrįstas, jog antocianidinų poveikyje, skrandžio rūgštingumas mažėja ir padidėja gleivinės apsauga [24]. Regos sutrikimų gydymas Akių tinklainės pažeidimas yra viena pagrindinių aklumo priežastis visame pasaulyje. Mėlynių lapų ekstrakto gydymo ir profilaktikos privalumai yra labai plačiai tiriami. Fitoterapų

14 teigimu, mėlynių lapų ekstraktai yra plačiai pritaikomi regos sutrikimų profilaktikai: diabetinei ir hipertenzinei ratinopatija, senatvinei kataraktai, trumparegystei bei silpnu naktinio matymo prisitakymui [25]. Mėlynių lapų veikimo mechanizmas, duodantis teigiamą poveikį regėjimui dar pilnai nėra ištirtas, tačiau veikimo mechanizmas yra remiamas tuo, kad pagerina akies aprūpinimą deguonimi ir krauju. Taip pat, šalina laisvuosius radikalus, kurie sąlygoja neigiamą poveikį kataraktai ir geltonosios dėmės degeneracijai. Mėlynių lapų ekstraktai gali apsaugoti nuo didesnės glaukomos žalos bei nuo laisvų radikalų neigiamo poveikio. Atlikto tyrimo metu, aštuoni pacientai sergantys glaukoma, buvo gydomi 200 mg mėlynių lapų ekstraktu ir remiantis elektroretinografijos tyrimu, buvo pastebėti teigiami rezultatai [26]. Dviejų klinikinių tyrimų metu, Italijos mokslininkai nustatė, jog 76 proc. pacientų, kuriems yra nustatyta trumparegystė, pasižymėjo tinklainės jautrumu. Jiems buvo skiriama 150 mg mėlynių lapų ekstrakto per dieną iš viso 15 dienų, kartu su vitaminu A. Po šio laikotarpio buvo įvertintas reikšmingas tinklainės jautrumo sumažėjimas [13]. Augalinio vaisto formos ir dozavimas Dozavimo rekomendacijos remiamos priklausomai nuo to, kuri mėlynių dalis yra naudojama. Sausų ar šviežių vaisių nuovirai, skysti ekstraktai, tabletės ar kapsulės yra skirtos vidiniam vartojimui, tačiau nuovirai ar ekstraktai, taip pat gali būti pritaikyti vietiniam vartojimui. Jei naudojama šviežios uogos, tai rekomenduojama 55-115 g uogų tris kartus per dieną. Skysto ekstrakto yra rekomenduojama nuo 3 iki 6 ml, santykiu 1:1 per dieną [27]. Dažniausiai naudojama vandeninė standartizuota 25 proc. Antocianidinų suma esant 80-160 mg tris kartus per parą. Faktinė antocianidinų dozė yra 20-40 mg tris kartus per dieną [28]. Mėlynių lapai dažiausiai naudojami kaip arbata. Ji ruošiama užpilant 1-2 šaukštelius smulkintų mėlynių lapų 150 ml karštu vandeniu ir palaikoma 5-10 min ir nukošiama. [29] Gautas nuoviras gali būti naudojamas kaip arbata, skaliklis burnos gleivinės žaizdoms gydyti [30]. Nepageidaujamos reakcijos, kontraindikacijos, toksiškumas ir sąveikos su vaistais Mėlynių, lapų bei uogų vartojimas kaip ir galima tikėtis yra labai saugus. Atlikto tyrimo metu buvo pastebėta, jog dozės didesnės nei 400 mg/kg žiurkių svorio, neturėjo jokio neigiamo poveikio ar toksiškumo sindromų. Silpnas mutageninis aktyvumas buvo pastebėtas in vitro tyrime, kuris manoma atsirado dėl flavonoido kvercetino, tačiau kitais in vitro tyrimais nepavyko įrodyti mėlynių metabolinio poveikio bei aktyvumo [31].

15 Nepatartina vartoti mėlynių lapų nepasitarus su gydytoju jeigu yra krešėjimo sutrikimas, kadangi lapai pasižymi antitrombocitiniu poveikiu. Dozes reikia koreguoti pacientams, esantiems su hemoraginiu sutrikimu ir taip pat vartojantiems antikoaguliantus bei antitrombocitinius prepatatus (Varfarinas ir pan.). Atsižvelgiant į visus atliktus tyrimus, vartojant mėlynių lapus gali pasireikšti šalutinis poveikis kaip virškinimo trakto sutrikimai, viduriavimas, odos alergijos bei nervų sutrikimai. Mėlynių lapų preparatai pasižymi cukraus kiekį mažinančiu poveikiu, todėl vartojant kartu su antidiabetiniais preparatais gali stiprėti pastarųjų poveikis ir nekontroliuojant glikemijos, gali pasireikšti hipoglikemija [32]. Svarbiausių mėlynių lapų biologiškai aktyvių junginių apžvalga Bendra flavonoidų apžvalga bei cheminė struktūra ir klasifikacija Flavonoidai, tai biologiškai aktyvūs junginiai, kurių aglikono struktūros pagrindas yra sudarytas iš A ir B aromatinių žiedų, kurie yra susijungę trijų C atomų tilteliu ir kartu esantis deguonis sudaro hidroksilinį žiedą. Flavonoidai yra didelė polifenolinių junginių grupė, kurio pagrindas yra benzo-γ-pirono struktūra. Jie yra sintezuojami fenilpropanoidiniu keliu. Taip pat nustatyta, jog antriniai metabolitai yra atsakingi už daugelį farmakologinių poveikių [33] [34]. Cheminė flavonoidų prigimtinis priklauso nuo struktūrinės klasės, hidroksilinimo laipsnio, pakaitų, taip pat nuo jungimosi bei polimerizacijos laipsnio. 2 pav. Flavonoidų aglikono bendroji formulė Chemiškai flavonoidai yra sudaryti iš 15 anglies atomų, susidedančių iš dviejų benzeno žiedų (A ir B žiedais) (2 pav.) prijungti per heterociklį pirano žiedą (C žiedas) (2 pav. ). Flavonoidai yra skirstomi į klases: Flavonai (pvz.: flavonas, apigeninas, liuteolinas). Flavonai turi dvigubą jungtį tarp 2 ir 3 padėties bei ketoną, prisijungusį prie C4. Dauguma vaisių ir daržovių turinčių flavoną, turi hidroksilo grupę C5 padėtyje A žiede. Flavonoliai (pvz.: kvarcetinas, mircetinas, kemferolis) [35]. Palyginus su flavonais, jie turi hidroksilo grupę C žiede, kuris taip pat gali būti glikozilintas 3 padėtyje.

16 Flavononai (pvz.: herperetinas). Flavononai taip pat dar gali būti vadinami dihidroglavonais ir jie turi sotų C žiedą. Skirtingai nei flavonai, jie tarp C2 ir C3 neturi nesočios jungties ir tai yra vienintelis skirtumas tarp šių dviejų grupių Izoflavonai, šios grupės B žiedas yra prisijungęs prie C žiedo 3 padėtyje. Šios grupės junginiai struktūriškai yra panašūs į estrogenus, pvz estradiolį, dėl šios priežasties jie taip pat gali būti vadinami fitoestrogenais. Antocianidinai (pvz.: cianidinas, delfinidinas, malvidinas). Ši flavonoidų grupė, augalui suteikia spalvą (violetinė, raudona, mėlyna). Daugiausiai cukraus vienetai jungiasi prie C3 padėties. Šių antocianinų spalva priklauso nuo kelių veiksnių tokių kaip ph ir prie A ir B žiedo metilinimo ir acilinimo. Flavan-3-oliai, ši grupė beveik visada C žiedo C3 padėtyje turi hidroksilo grupę ir taip pat gali būti vadinami katechinais. Ši grupė kitaip nei dauguma grupių, neturi dvigubos jungties tarp C2 ir C3. Kitas skirtumas nuo kitų grupių yra tai, kad pvz. palyginus su flavonoliais, jog C3 padėtyje yra karbonilo grupė bei C4 padėtyje yra keto grupė. Šių junginių yra daugiausiai randama obuoliuose, vyšniose, kriaušėse, arbatose netgi vyne [36] [35].

17 1 Lentelė. Skirtingų flavonoidų grupių pavyzdžiai [37]. Klasės pavadinimas Bendra grupei cheminė struktūra Klasės pavadinimas Bendra grupei cheminė struktūra Flavonoliai Antocianidinai Flavononoliai Flavan- 3 oliai Flavononai Flavonai Izoflavonai Skirtingų klasių flavonoidai skiriasi tik oksidacijos laipsniu ir pakaitais C žiede. Flavonoidai atrandami kaip aglikonai, glikozidai ir metilinti dariniai. Pagrindinė struktūra flavonoiduose yra aglikonas. Šešių narių žiedas yra kondensuotas su benzeno žiedu gali būti α-pirono (flavonoliai ir flavononai) arba dihidro dariniai (flavanoliai ir flavononai). Flavonoidai yra dažnai hidroksilinti 3, 5, 7, 2, 3, 4 ir 5 padėtyse. 1.6.1.1 Flavonoidų poveikis žmogaus organizmui Flavonoidai pasižymi priešuždegiminiu veikimu, priešbakteriniu, priešvėžiniu aktyvumu ir kitu žmogaus organizmui naudingu poveikiu. Atliktos epidemiologinės studijos parodė, jog geriant žalią ar juodą arbatą gali sumažinti cholesterolio lygį kraujyje bei teigiamai veikia kraujo spaudimą ir taip yra apsaugomas organizmas nuo širdies ir kraujagyslių pažeidimų [38] [39]. Taip pat, yra manoma, jog flavonoidai esantys uogose, gali pagerinti atmintį bei turėti įtakos Parkinsono ligos vystymuisi.

18 Priešuždegiminis poveikis Uždegimas, tai normali organizmo reakcija į organizmo funkcijos sutrikdymą: audinio pažeidimą, mikrobinio patogeno infekciją, cheminį sudirginimą. Imuninė sistema gali būti veikiama dietų, farmakologinių veiksnių ar aplinkos veiksnių. Taigi, kai kurie flavonoidai, veika imuninės sistemos funkciją bei uždegimines ląsteles. Daugelis flavonoidų, tokių kaip hesperidinas, apigeninas, liuteolinas, kvercetinas pasižymi priešuždegiminiu bei skausmą malšinančiu poveikiu. Taip pat flavonoidai specifiškai gali veikti fermentų sistemas susijusias su uždegimo procesais, ypatingai tirozino ir serino-tironino baltymų kinazėms. Yra nustatyta, jog flavonoidai slopina izoformų ekspresiją: natrio oksido sintezę, ciklooksigenazę, lipooksigenazę, kurie yra atsakingi už produkciją azoto oksido, prostanoidų, leukotrienų ir kitų mediatorių kurie dalyvauja uždegimo procese. Flavonoidai taip pat slopina fosfodiesterazę, kuri dalyvauja ląstelių aktyvacijoje. Uždegimo vietoje, flavonoidai veikia baltymų citokinus, kartu veikiančius žalos vietoje leukocitų cirkuliaciją. Yra nustatyta, jog kai kurie flavonoidai slopina trombocitų adhesiją, agregaciją bei sekrecija esant 1-10 mm koncentracijai [40] [41]. Priešvėžinis aktyvumas. Mityba, dietos bei kiti gyvenimo įpročiai vaidiną svarbų vaidmenį norint apsisaugoti nuo vėžio. Vaisiuose, daržovėse randami flavonoidai yra pripažinti kaip padedantys apsisaugoti nuo vėžio junginiai. Svogūnuose bei obuoliuose yra randami kvercetino junginiai, padedantys apsisaugoti nuo prostatos, plaučių, skrandžio vėžio [42] [43]. Taip pat yra nustatyti keli flavonoidų veikimo mechanizmai, kurie turi įtakos karcinogenezei bei hormoniniam aktyvumui. Flavonoidų molekulių veikimo mechanizmai: ląstelės ciklo sustabdymas, tirozinkinazės slopinimas, baltymų temperatūros šoko slopinimas, esterogenų receptorių gebėjimas bei ROS ekspresijos slopinimas. Rauginės medžiagos ir jų klasifikacija Terminas taninai yra kilęs iš prancūziško žodžio tanin (rauginė medžiaga) ir buvo naudojama apibūdinti gamtinius polifenolinius junginius. Pirmą kartą šis terminas buvo panaudotas Seguine 1796 metais, kuomet buvo norima pavadinti medžiagas, esančias augalų ekstraktuose, kurias galėjo panaudoti apsaugoti gyvūnų kailius nuo puvimo. Nuo seniausių laikų yra žinoma, kad tam tikros medžiagos turi rauginimo savybes ir gali rauginti gyvūnų odą. Tačiau tik XXa. buvo išaiškinta kas vyksta rauginimo metu ir tam buvo pasitelktos analitinės technologijos. Raugai dažniausiai yra aptinkami vaisiuose, ankštyse, lapų audiniuose (apsisaugo nuo plėšrūnų), medžių žievėje (apsaugo medį nuo mikroorganizmų, šaknų ir šakniastiebių žievėje, stiebuose, lapuose, taip pat jų gausu raudonajame vyne, arbatoje. Raugai kaupiasi įvairiose augalų dalyse (lapuose, šaknyse, pumpuruose, stiebe) [44] [45].

19 Taninai yra augalinės kilmės rauginės medžiagos, kurių junginių pagrindą sudaro įvairios struktūros fenoliniai junginiai nuo paprasčiausių polifenolinių ir baigiant sudėtingais daugiamolekuliniais junginiais-flobafenais. Daugumos taninų molekulinė masė yra nuo 1000 iki 5000. Dažniausiai randami polifenoliai: Pirokatecholis Pirogalolis Fluorgliucinolis Galo rūgštis Metilinimo ir karboksilinimo reakcijų metu susidaro šie junginiai: galo rūgštis, įeinanti į daugelio raugų sudėtį, arba metilinti florogliucinolio dariniai- orsinas ir orselino rūgštis, įeinanti į kerpėse randamų raugų sudėtį. Naudojami tie augaliniai polifenoliai, kurių molekulinė masė yra nuo 1000 iki 5000, kartais gali siekti 20000. Visi gamtoje randami raugai yra klasifikuojami pagal gautus hidrolizės produktus ir jie skirstomi į hidrolizuojamus ir kondensuotus raugus. Hidrolizuojami raugai tai medžiagos, kurias veikiant praskiestomis rūgštimis ar fermentais suskyla ir sudaro monosacharidą D-gliukozę ir aciklinius junginius (galo arba elago rūgštį). Hidrolizuojami taninai gali būti rūgštimis ar fermentais, pavyzdžiui tanazės fermentais. Jie yra sudaryti iš kelių fenolio rūgščių molekulių (pvz.: galo rūgštis ar heksahidroksifenolinių rūgščių), kurias jungia esteriai į centrinę gliukozės molekulę. Hidrolizuoti taninai gali būti skirstomi į kelias grupes: galotaninai ir elagotaninai [46]. Kondensuoti raugai šių junginių molekulėse aromatiniai ciklai sujungti C-C jungtimis. Nuo hidrolizuojmų raugų, jie skiriasi tuom, kad veikiant praskiestomis rūgštimis ar fermentais, jie nesihidrolizuoja, o sudaro dar sudėtingesnius kondensacijos junginius. Kompleksiniai taninai ši taninų grupė yra sintetinta iš hidrolizuojamų taninų (daugiausiai C-gliukozido elagotanino) ir kondensuotų taninų. Jie susijungia C-C jungtimi, C1 elagotanino gliukozės dalis jungiasi su C6 ar C8 flavan-3-oliu dariniu. Monomerai taip pat yra įtraukti į oligomerų formavimąsi. Pseudotaninai tai yra mažos molekulinės masės taninai. Dėl struktūrinės įvairovės, taninai klasifikuojami pagal chemines savybes. Pagal struktūrines savybes, taninai skirstomi į keturias grupes [47]:

20 3 Lentelė. Raugų klasės: Raugų klasės Galotaninai Elagotaninai Kompleksiniai raugai Kondensuoti raugai Formulė R galo r. fragmentas ar kitos dalys 1. Galotaninai tai galo rūgšties ir gliukozės esteriai. yra visi taninai, kuriu galo rūgšties vienetai ar meta-depsidai yra prisijungę iki 5 gliukozės molekulių; 2. Elagotaninai tai taninai, kuriuose yra ne mažiau kaip dvi galo rūgšties vienetai sujungti C- C jungtimis viena su kita ir nėra susijusios su katechino vienetais; 3. Kompleksiniai raugai taninai kurių katechinų vienetai glikozidnėmis jungtimis prisijungęs su galo rūgtimi ir elagotanino vienetais; 4. Kondensuoti raugai tai tanino junginiai, kurie sudaryti iš oligomerinių ar polimerinių proatocianidinių ir katechinų. Antioksidantinis aktyvumas Antioksidantinis aktyvumas yra apibrėžiamas kaip junginio (antioksidanto) gebėjimas slopinti žalingą oksidacinį irimą. Ji yra vertinamas pagal antioksidanto galimybes, kuris yra nustatomas pagal junginio sudėtį ir savybes pagal junginio biologinį aktyvumą, kuris yra priklausomas nuo antioksidanto biologinio prieinamumo. Terminas laisvieji radikalai yra dažnai naudojamas nustatyti bet kokį atomą ar molekulę, turinčios vieną ar daugiau nesuporuotų elektronų, o tai lemia didelį aktyvumą reaktyvių molekulių reaguoti su bet kokiu netoliese esančiu junginiu [48]. Žalingas laisvųjų radikalų poveikis yra vadinamas oksidaciniu stresu. Oksidacinis stresas, tai kuomet didėja laisvųjų radikalų ar yra sutrikęs jų neutralizavimas bei jo poveikyje yra pažeidžiamos ląstelės. Laisvieji radikalai (LR), tai yra nestabilios reaktyvios molekulės, kurios yra praradusios vieną elektroną. Reakcijos, kuriose dalyvauja laisvieji radikalai, sukelia įvairius DNR pažeidimus, sukelia ląstelių membranų pokyčius, pokyčius žmogaus organizme, aktyvina žmogaus senėjimo procesą, sukelia jungiamojo ar raumeninio audinio pažeidimus ir sukelia uždegimą. Laisvieji radikalai yra nestabilūs ir reaguoja su organizmo sveikomis ląstelėmis, padarydamas joms žalą. Laisvieji radikalai, tai deguonies radikalais: superoksidio anijonas (O2 - ), Peroksinitritas

21 (ONOO - ), chloro anijonas (Cl - ), hidrosilo anijonas (OH - ), hipochloro rūgštis (HOCl - ), vandenilio peroksidas (H 2 O 2 ). Reaktyvios deguonies formos (ROS), taip pat kaip ir reaktyvios azoto formos (RNS), yra ląstelių metabolizmo produktai. ROS ir RNS atlieka du vaidmenis: turi tiek žalingą tiek naudingą poveikį. Naudingas ROS poveikis yra plačiau žinomas kaip apsauginė/gyvybinė funkcija nuo infekcinių ligų bei kaip signalinė sistemų funkcija. Žalingas laisvųjų radikalų poveikis yra vadinamas oksidaciniu stresu. Oksidacinis stresas, tai kuomet didėja laisvųjų radikalų ar yra sutrikęs jų neutralizavimas bei jo poveikyje yra pažeidžiamos ląstelės. Tyrimais in virto yra įrodyta, jog dauguma vaistinių augalų sugeba gaminti natūralius junginius, sugebančius apsaugoti žmogaus organizmą, tai yra turi antioksidantinį poveikį, kuris pasireiškia šalinant žalingą radikalų poveikį. Vaisių, daržovių, arbatų sudėtyje yra plataus veikimo antioksidantinio aktyvumo junginių, įskaitant vitaminus ir fenolinius junginius [49]. Antioksidantai yra junginiai, kurie kovoja ir neutralizuoja su laisvųjų radikalų poveikiu. Dažniausiai antioksidantai yra gaminami organizme (viduje), arba gaunama iš išorės su maistu, tai yra vaisiai bei daržovėms maisto papildai. Prie antioksidantų yra priskiriami vitaminai A, C, E, cinkas, beta karotenas, selenas, kofermentas Q10, flavonoidai [50].

22 2 TYRIMŲ OBJEKTAI IR METODAI Tyrimo objektas Tyrimo objektas- natūraliai augančių mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) lapai surinkti 2015-2016 metais, kiekinės sudėties kitimo dinamikai įvertinti vegetacijos metu žaliava rinkta Kauno rajone, Gervėnupio miške. Vaistinė augalinė žaliava rinkta beveik pusę metų, nuo balandžio iki rugpjūčio mėnesio (4-5 lentelės). Surinkta vaistinė augalinė žaliava buvo džiovinama gerai vėdinamoje aplinkoje, sausoje vietoje bei apsaugota nuo tiesioginių saulės spindulių. Kiekvienas mėginys buvo supakuotas į popierinius maišelius ir buvo laikomas sausoje bei tamsioje vietoje. Taip pat buvo rinkta žaliava skirtinguose Lietuvos regionuose: Gulbinų miške, Šiaulių rajone; Pageležių miške, Jonavos rajone; Juodkrantėje Raganų kalne; Velniakalnio kaime, Rokišio raj. 4 Lentelė. Vaistinės augalinės žaliavos rinkimo duomenys 2015 m. Gervėnupio miškas Augalo surinkimo data Augalo vystymasis 1. 2015.05.24 Vaistinis augalas vystosi 2. 2015.05.31 Vaistinis augalas mezga žiedpumpurius 3. 2015.06.04 Vaistinis augalas mezga žiedpumpurius 4. 2015.07.11 Sprogsta žiedpumpuriai 5. 2015.07.14 Sprogsta žiedpumpuriai 6. 2015.07.18 Vaistinis augalas brandina uogas 7. 2015.07.25 Vaistinis augalas brandina uogas 8. 2015.08.01 Vaistinis augalas brandina uogas 9. 2015.08.05 Vaistinis augalas pilnai subrandina uogas 10. 2015.08.08 Vaistinis augalas pilnai subrandina uogas

23 5 Lentelė. Vaistinės augalinės žaliavos rinkimo duomenys 2016 m. Gervėnupio miškas Augalo surinkimo data Augalo vystymasis 1. 2016.04.26 Vaistinis augalas vystosi 2. 2016.05.10 Vaistinis augalas vystosi 3. 2016.05.24 Vaistinis augalas vystosi 4. 2016.06.21 Vaistinis augalas mezga žiedpumpurius 5. 2016.07.15 Sprogsta žiedpumpuriai 6. 2016.08.09 Vaistinis augalas pilnai subrandina uogas 7. 2016.08.15 Vaistinis augalas pilnai subrandina uogas 8. 2016.08.30 Vaistinis augalas apnykęs, lapai pakeitę spalvą [51] Naudoti reagentai ir medžiagos 1. Aliuminio chloridas (,,Sigma-Aldrich, Anglija); 2. 30 proc. acto rūgšties tirpalas; (,,Sigma-Aldrich, Anglija); 3. Rutinas (,,Carl Roth GmbH, 76185, Vokietija); 4. Kalio permanganatas (,,Fluka, Šveicarija); 5. Indigosulfonrūgšties tirpalas (,,Fluka, Šveicarija); 6. Rektifikuotas etilo alkoholis 96,3 proc. V/V (,,Stumbras, Lietuva); 7. Troloksas (Sigma- Aldrich, Anglija); 8. 2,2-difenil-1-pikril-hidrazilas (DPPH) (,,Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Vokietija); 9. ABTS (2,2 -azino-bis-3-etilbenzotiazolino-6-sulfoninė rūgštis) (,,Sigma-Aldrich, Kanada); 10. Išgrynintas vanduo; 11. Folin-Ciocalteu reagentas (Sigma-Aldrich, Anglija); 12. Galo rūgštis (Sigma- Aldrich,, USA); 13. Natrio karbonatas (Chempur, Lenkija); Naudota aparatūra ir priemonės 1. Analitinės svarstyklės (,,Sartorius CP6M-0CE, Vokietija); 2. Mikropipetės (,,Eppendorf Research, JAV); 3. Elektrinis malūnėlis (Coffee grinder,,,first, Austrija); 4. Termostatinė vonelė (,,Lauda, Vokietija); 5. Spektrofotometras (Beckman DU-70, 4273041,,,Beckman Instruments, JAV); 6. Popieriniai filtrai (,,ODR-9303, Vokietija);

24 7. Ultragarsinė vonelė (,,Bandelin electronic DK 255p, Welch, 2511C- 02, 230V, 50Hz, 6A, JAV); 8. Mechaninė purtyklė (,,Laboratory shaker 358S, Lenkija). Tyrimų metodai Nuodžiūvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje Nuodžiūvis yra nustatomas remiantis Europos farmakopėjos straipsniu (Ph. Eur. 2.2.23). Tiriamoji vaistinė augalinė žaliava yra susmulkinama elektriniu malūnėliu. Atsisveriame 1 g (0,001 g tikslumu) žaliavos ir džiovinama 2 val. 100-105 o C temperatūroje iki pastovios nekintančios masės. Vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvis procentiškai apskaičiuojamas, remiantis formule: m " m $ m % x 100 m 1 žaliavos masė gramais prieš džiovinimą (g); m 2 žaliavos masė gramais po džiovinimo (g). Rezultatas yra apskaičiuojamas surandant trijų svėrimų rezultatų aritmetinis vidurkis (±0,01) tikslumu. Nuokrypis tarp vienu metu atliekamų vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvio tyrimų negali būti didesnis kaip ±0,5 proc. Ekstraktų ruošimo metodika Gaminami etanoliniai ekstraktai. Iš kiekvienos vaistinės augalinės žaliavos mėginio santykiu 1:10. Atsveriama po 1 g (±0,01) kiekvienos augalinės vaistinės žaliavos sumaltos su elektriniu malūnėliu. Paruošta žaliava yra užpilama 10 ml (±0,01) 70 proc. V/V etanoliu. Atsargiai suplakama, kad ekstrahentas gerai pasiskirstytų tarp vaistinės augalinės žaliavos miltelių dalelių. Palaikoma kambario temperatūroje. Gauti ekstraktai nufiltruojami su distiliuotu vandeniu sudrėkintą popierinį filtrą, naudojant vakuuminę pompą. Gautas tirpalas išpilstomas į tamsaus stiklo buteliukus, sandariai užkemšamas ir laikomas tamsioje, vėsioje vietoje, apsaugotas nuo tiesioginių saulės spindulių. Iš pagamintų vaistinės augalinės žaliavos mėginių imami po tris etanolinius ekstraktus, tam kad atliktume po tris pakartojamus, tokiomis pačiomis sąlygomis ir gautume didesnį rezultatų patikimumą. Etanoliniai ekstraktai yra naudojami flavonoidų, fenolinių junginių nustatyme.

Suminio flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu 25 Suminis flavonoidų kiekis yra nustatomas ekstraktą paveikus aliuminio chlorido tirpalu ir parūgštinus acto rūgšties tirpalu. Suminis flavonoidų kiekis įvertinamas palyginus tiriamojo tirpalo absorbcijos koeficientą su rutino tirpalo absorbcijos koeficientu. Tiriamąjį tirpalą ruošiame 25ml matavimo kolbutėje, į ją pilame 0,2 ml paruoštos vaistinės augalinės žaliavos ištraukos (mėlynių lapų etanolinio ekstrakto), 2 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo, 0,3 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo, 0,4 ml 5 proc. heksametilentetramino tirpalo. Ir praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki žymės ir viskas sumaišoma. Palaukiame 30 min. ir matuojame 10 mm tirpalo sluoksnio absorbcijos dydis ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu esant bangos ilgiui 407 nm. Palyginamasis tirpalas ruošiamas: į 25 ml matavimo kolbutę naudojant mikropipetes 0,2 ml paruoštos vaistinės augalinės žaliavos ištrauko (mėlynių lapų etanolinio ekstrakto), 2 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo. Gautas tirpalas yra praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 25 ml. Lygiai tokiomis pačiomis sąlygomis yra ruošiami etanoliniai rutino tirpalo palyginamasis ir tiriamasis tirpalai. Viskas atliekama kaip ir prieš tai nurodyta, tik vietoje mėlynių lapų etanolinio tirpalo pilame rutino tirpalo. 0,0125g rutino (tikslus svėrinys) tirpinamas 70 proc. V/V etanolyje 25 ml talpos matavimo kolbutėje. Flavonoidų kiekis vaistinėje žaliavoje, perskaičiuotas rutinu ir išreikštas procentais yra paskaičiuojamas naudojant formulę: X = m r x V važ. x 100 m važ. x A r x 25 m (r) rutino standarto masė gramais, sunaudota etaloniniam rutino tirpalui ruošti. V (važ.) visas paruoštos vaistinės augalinės žaliavos tūris mililitrais (priklauso nuo ekstrakcijos sąlygų). A (važ.) paruoštos vaistinės augalinės žaliavos tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis. m( važ.) vaistinės augalinės žaliavos masė gramais, sunaudota ištraukai ruoši. A (r) etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydis [52]. Suminio raugų kiekio nustatymas titrimetriniu metodu Atsveriama 2 g susmulkintos augalinės vaistinės žaliavos ir 500 ml talpos kūginėje kolboje užpilama 250 ml distiliuoto verdančio vandens. Šis mišinys virinamas 30 min vandens vonioje su grįžtamuoju kondensatoriumi, tam, kad nesumažėtų vandens kiekis ekstrakte. Virinant mišinys

dažnai maišomas. Praėjus 30 min. po virinimo, ekstraktas atvėsinamas vandens vonioje iki kambario temperatūros. 26 Apie 100 ml gautos vaistinės augalinės žaliavos ištraukos nukošiama per vatą į 200 ml talpos kūginę kolbą atidžiai saugant, kad į nukoštą ekstraktą nepatektų vaistinės augalinės žaliavos dalelių. Po to į 750 ml talpos kūginę kolbą įpilama 25 ml gautos vaistinės augalinės žaliavos ištraukos, 500 ml distiliuoto vandens ir 25 ml indigosulfonrūgšties tirpalo. Jis gaminamas taip: 1 g indigokarmino ištirpinama 25 ml sulfato rūgšties, ištirpinus įpilama dar 25 ml sulfato rūgšties ir praskiedžiama distiliuotu vandeniu iki 110 ml. Vėliau gautas mišinys titruojamas šviežiai laboratorijoje pagamintu kalio permanganato 0,02 M tirpalu nuolat maišant iki tol, kol atsiranda geltona spalva. Ji lyginama su tuščiojo mėginio, atliekamo kartu, tirpalo spalva. 1 ml 0,02 M kalio permanganato atitinka 0,004157 g raugų (perskaičiuotų į taniną). Visiškai sausos vaistinės augalinės žaliavos raugų kiekis procentais apskaičiuojamas naudojant formulę (X) : ml; X = V V1 x 0,004157x 250 x 100 x 100 3m x 25(100 W) V tiriamosios žaliavos ištraukai titruoti sunaudotas kalio permanganato 0,02 M tirpalo tūris V1 tuščiajam mėginiui titruoti sunaudotas kalio permanganato 0,02 M tirpalo tūris ml; m žaliavos masė g; W žaliavos drėgmė proc. [52]. Suminio fenolinių junginių kiekio išreikšto galo rūgšties ekvivalentu, nustatymas Folin-Ciocalteu metodu Suminis fenolinių junginių kiekis etanoliniuose ekstraktuose nustatytas remiantis Folin Ciocalteu kolorimetriniu metodu naudojantis spektrofotometru Beckman DU -70 (JAV). 1. Folin-Ciocalteu reagentas praskiedžiamas 10 kartų distiliuotu vandeniu ir gaunamas darbinis reagentas. 2. Į kolbutę įpilamas 1 ml paruoštas vaistinės augalinės žaliavos ekstraktas, sumaišomas su 5,0 ml pagamintu darbiniu reagentu ir 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo (Paruošiamas 7,5 proc. natrio karbonato tirpalas. 100 ml matavimo kolboje distiliuotame vandenyje ištirpinama 7,5 g natrio karbonato. Gautas tirpalas praskiedžiamas distiliuotu vandeniu iki atžymos.). 3. Gautas mišinys sumaišomas ir laikomas tamsoje kambario temperatūroje 1 val. 4. Spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija esant 765 nm bangos ilgiui.

27 Etaloninis galo rūgšties tirpalas ruošiamas 0,025 g tirpinant 25 ml kolbutėje parinktos koncentracijos etanolyje iki žymės. Ruošiami 5 galo rūgšties tirpalai 10 ml kolbutėse: 0,1 ml, 0,25 ml, 0,5 ml, 0,75 ml, ir 1 ml etaloninio tirpalo ir praskiedžiama atitinkamos koncentracijos (V/V) etanolyje iki žymės; Tiek tiriamasis, tiek ir palyginamasis galo rūgšties tirpalai buvo paruošti tomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamojo augalinio ekstrakto tirpalas. Tik vietoje 0,5 ml tiriamojo ekstrakto imta 0,5 ml žinomos koncentracijos (0,01 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,075 mg/ml ir 0,1 mg/ml) galo rūgšties tirpalų. paveiksle. pagal formulę: Išmatavus absorbciją, sudaroma galo rūgšties kalibracinė kreivė, kuri pavaizduota 3 Suminis fenolinių junginių kiekis išreiškiamas GAE gramui žaliavos. Jis apskaičiuojamas GAE = < >?, mg/g c galo rūgšties koncentracija mg/ml nustatyta iš kalibracinės kreivės; V ekstrakto tūris ml; m atsvertas žaliavos kiekis, g; Duomenys įvertinami pagal galo rūgšties kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį: y=0,9318 + 0,017 R 2 =0,99948 y=absorbcijos dydis; x= bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas GRE (galo rūgšties ekvivalentu) mg/ml. Absorbcija 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 y = 0,9318x + 0,017 R² = 0,99948 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Standarto galo rūgšties koncentracija, mg/ml 3 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė

28 Antiradikalinio aktyvumo nustatymas DPPH metodu Antiradikalinis aktyvumas nustatomas naudojant DPPH (2,2- difenil-1-pikrilhidrazil hidrato) radikalų surišimo metodiką, Etaloninis tirpalas ruoštas atsveriant 0,0024 g DPPH radikalo miltelių (0,0001 g tikslumu), kuris ultragarso bangų pagalba buvo ištirpintas 80 proc. (V/V) etanolyje 100 ml tūrio matavimo kolboje iki žymos. Paruošto tirpalo absorbcija buvo matuojama esant 515 nm bangos ilgiui. 80 proc. (V/V) etanolis buvo panaudotas kaip lyginamasis tirpalas. Tiriamasis tirpalas. Tiriamasis tirpalas buvo ruošiamas paimant 60 µl tiriamojo ekstrakto, įpilant ir sumaišant su 3ml etanolinio DPPH tirpalo. Palyginamajam tirpalui pagaminti panaudota 60 µl 80 proc. (V/V) etanolio ir 3 ml etanolinio DPPH tirpalo. Po 30 min, matuojamas absorbcijos pokytis esant 515 nm bangos ilgiui [53]. Apskaičiuojamas tiriamųjų tirpalų inaktyvuoto DPPH radikalo kiekis procentais: SAA = A pal. A(tir. ) x 100 proc. A(pal. ) A(tir.) tiriamojo tirpalo absorbcijos reikšmė A(pal.) palyginamojo tirpalo absorbcijos reikšmė Redukcinio aktyvumo įvertinimas FRAP metodu FRAP metodui, naudojami šie reagentai: 1. 300 mm acetatinis buferis: atsveriama 3,1 g natrio acetate, suberiamame 1000 ml matavimo kolbą, įpilama 16 ml ledinės acto rūgšties ir skiedžiama distiliuotu vandeniu iki žymės (ph 3,6). 2. 40 mm druskos rūgšties tirpale tirpinami atsverti TPTZ milteliai ir gaunamas 10 mm TPTZ tirpalas. 3. Atsveriamas tikslus geležies (III) chlorido heksahidrato kiekis ir ištirpinamas distiliuotame vandenyje. Gaunamas 20 mm geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalas. Darbinis FRAP reagentas ruošiamas: paimama 3 ml darbinio FRAP reagento ir pridedama 20 µl tiriamojo ekstrakto. Paruoštas mišinys 1 val. Laikomas tamsoje, kambario temperatūroje. Spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija, esant 594 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat, tik vietoj tiriamojo ekstrakto pilama tirpiklio [54]. Redukcinio aktyvumo galia išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos ir apskaičiuojama pagal šią formulę: TEFRAP = c V m ; µmol/g

29 c trolokso koncentracija µm, iš kalibracinės kreivės; V ekstrakto tūris L; m tikslus atsvertas žaliavos kiekis g.; 0,7 0,6 0,5 y = 3E-05x + 0,1067 R² = 0,9823 Absorbcija 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 Standarto trolokso koncentracija µm 4 pav. Trolokso kalibracinė kreivė FRAP metodu Statistinė duomenų analizė Gautų rezultatų analizei buvo panaudotos Microsoft Office Excel 2008 (Microsoft, JAV) ir,,spss 20 (IBM, JAV) statistikos paketai. Naudojant MS programinę įrangą buvo apskaičiuotos tyrimų duomenų matematinis vidurkis, standartinis nuokrypis ir statistinis duomenų reikšmingumas, braižomi grafikai bei lentelės.,,spss 20 programine įranga buvo įvertintas koreliacinių ryšių stiprumas.

30 3 TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS Vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvis Vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvis buvo nustatytas pagal 2.4.1 skyriuje aprašytą metodiką. Nuodžiūvio tyrimas buvo atliekamas tam, kad nustatytume ar žaliavos drėgmė atitinka farmakopėjinius kokybės reikalavimus ir ar tinkama tolimesniems tyrimams. 6 lentelėje yra nurodyta žaliavos rinkimo data bei gauti rezultatai. 6 Lentelė. Mėlynių lapų nuodžiūvio įvertinimas 2015 metais Eilės Nr. Surinkimo data Nuodžiūvis (proc.) 1 2015.05.24 10,54 (± 0,3) 2 2015.05.31 8,70 (± 0,4) 3 2015.07.05 9,72 (± 0,3) 4 2015.07.11 9,60 (± 0,3) 5 2015.07.14 9,01 (± 0,4) 6 2015.07.18 10,22 (± 0,1) 7 2015.07.25 10,09 (± 0,2) 8 2015.08.01 9,35 (± 0,2) 9 2015.08.05 9,25 (± 0,1) 10 2015.08.09 10,78 (± 0,2) 7 Lentelė. Mėlynių lapų nuodžiūvio įvertinimas 2016 metais Eilės Nr. Surinkimo data Nuodžiūvis (proc.) 1 2016.04.26 9,65 (± 0,1) 2 2016.05.10 9,87 (± 0,2) 3 2016.05.24 9,22 (± 0,1) 4 2016.06.21 9,88(± 0,1) 5 2016.08.09 9,62 (± 0,2) 6 2016.08.15 9,54(± 0,1) 7 2016.08.30 10,15(± 0,1)