LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA Veterinarijos fakultetas Vesta Vadapolaitė Įvairios mikrofloros išskyrimas iš šunų lyt

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA Veterinarijos fakultetas Vesta Vadapolaitė Įvairios mikrofloros išskyrimas iš šunų lyties organų Various bacterial flora isolation from genital tract of dogs Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS Darbo vadovas: prof. dr. Jūratė Šiugždaitė Kaunas, 2016

DARBAS ATLIKTAS VETERINARINĖS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas Įvairios mikrofloros išskyrimas iš šunų lyties organų. 1. Yra atliktas mano paties (pačios). 2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje. 3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Vesta Vadapolaitė (data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. Vesta Vadapolaitė (data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO prof. dr. Jūratė Šiugždaitė (data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE) prof. habil. dr. Saulius Petkevičius (aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė) (parašas) 1) 2) (vardas, pavardė) Magistro baigiamojo darbo recenzentai (parašai) Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas: (data) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas, pavardė) (parašas) 2

TURINYS SANTRAUKA... 4 SUMMARY... 5 SANTRUMPOS... 6 ĮVADAS... 7 1. LITERATŪROS APŽVALGA... 8 1.1. Natūrali šunų lytinių takų mikroflora... 8 1.1.1. Kalių lytinių takų mikroflora... 8 1.1.2. Šunų lytinių takų mikroflora... 9 1.2. Mycoplasma spp. charakteristika... 10 1.3. Pagrindinės šunų reprodukcijos ligos ir jų sukėlėjai... 13 2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA... 17 3. TYRIMO REZULTATAI... 20 3.1. Šunų lytinių organų mikrobiologinis tyrimas... 20 3.1.1. Išskirtos bakterijų padermės iš šunų lytinių organų... 20 3.1.2. Išskirtų bakterijų padermių jautrumas antimikrobinėms medžiagoms... 24 4. REZULTATŲ APTARIMAS... 31 IŠVADOS... 33 LITERATŪROS SĄRAŠAS... 34 3

SANTRAUKA Įvairios mikrofloros išskyrimas iš šunų lyties organų Vesta Vadapolaitė Magistro baigiamasis darbas Sveikų kalių ir šunų lytiniuose takuose normalią mikroflorą sudaro įvairūs mikroorganizmai, iš kurių daugiausia oportunistinių patogenų. Kalių makšties bakterinė mikroflora skiriasi priklausomai nuo šuns veislės, lytinio ciklo laikotarpio ir sezono. Darbo tikslas: Išskirti vyraujančią mikroflorą šunų lyties organuose ir nustatyti jų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms. Tyrimo metodai ir medžiaga: Tyrimas buvo atliktas 2015 2016 m. Mėginiai imti patelėms iš makšties ir patinams iš apyvarpės. Paimti mėginiai buvo talpinami į transportines terpes TRANSWAB (Amies, Liofilchem, Italija), o mikoplazmoms tirti skirti mėginiai buvo talpinami į UTM-RT (universali transportinė terpė). Visi paimti mėginiai per 24 val. buvo pristatyti į mikrobiologijos laboratoriją. Buvo ištirta 50 įvairių veislių ir amžiaus šunų. Iš 50 tirtų šunų ištirtos 45 patelės ir 5 patinai. Tyrime dalyvavo 1 9 metų amžiaus šunys, kurie buvo suskirstyti į 3 amžiaus grupes. Tiriamieji mėginiai buvo sėjami į Petri lėkšteles ant mėsos peptono agaro. Užsėtos Petri lėkštelės buvo kultivuotos 24 48 val. Po 24 48 val. buvo ruošti tepinėliai, mikroorganizmai buvo identifikuoti pagal biochemines bei antigenines savybes. Mikoplazmoms išskirti ir MIC nustatyti buvo naudojami komerciniai testai (Liofilchem, Italija). Tyrimo rezultatai: Ištyrus 50 šunų lytinių organų mikroflorą vyravo šie mikroorganizmai: Staphylococcus spp. 23,5 proc., Escherichia coli 9,8 proc., Proteus spp. 7,8 proc., Streptococcus spp. 3,9 proc., Mycoplasma spp. 3,9 proc., Pseudomonas spp. 2 proc., Pasteurella multocida 2 proc., Ureaplasma spp. 2 proc., Klebsiella spp. 2 proc. Mycoplasma genties mikroorganizmai buvo atspariausi klaritromicinui ( 16 μg/ml) ir eritromicinui ( 16 μg/ml), o jautriausi buvo azitromicinui ( 4 μg/ml), minociklinui ( 4 μg/ml), doksiciklinui ( 4 μg/ml), ofloksacinui ( 1 μg/ml) ir tetraciklinui ( 4 μg/ml). Didžiausias išskirtų bakterijų atsparumas buvo nustatymas spiramicinui 100 proc., tetraciklinui 100 proc., tilozinui 91,7 proc. Veiksmingiausios antimikrobinės medžiagos buvo marbofloksacinas 87,5 proc. ir enrofloksacinas 78,3 proc. Raktažodžiai: lytiniai organai, mikroflora, šunys. 4

SUMMARY Various bacterial flora isolation from genital tract of dogs Vesta Vadapolaitė Final Master s thesis Normal bacterial flora of genital tracts of healthy bitches and dogs is made of various microorganisms, and the most common of them are opportunistic pathogens. Vaginal bacterial flora of bitches differs subject to breed, period of sexual cycle and season. Aim of research: to isolate predominant bacterial flora from genital tract of dogs and to determine its resistance to antimicrobial agents. Methods and materials of research: research was carried out during the period of 2015 2016. The samples were collected from vaginas of bitches and prepuce of dogs. The samples were placed into transport swabs TRANSWAB (Amies, Liofilchem, Italy), while the ones for mycoplasmas were placed into UTM-RT (universal transport medium). All collected samples were delivered to Microbiology Laboratory within 24 hours. 50 dogs of various breeds and ages were examined. Out of the 50 dogs there were 45 female dogs and 5 male dogs. 1 9 year-old dogs took part in research and were divided into 3 groups. The examined samples were plated in Petri dishes on meat peptone agar. The plated Petri dishes were cultivated for 24 48 hours. 24 48 hours later, smears were prepared; microorganisms were identified, according to biochemical and antigenic properties. Commercial tests Liofilchem, Italy, were used for isolation of mycoplasmas and identification of MIC. Results of research: The following microorganisms were prevalent upon examining the bacterial flora of genital tract of 50 dogs: Staphylococcus spp. 23.5 %, Escherichia coli 9.8 %, Proteus spp. 7.8 %, Streptococcus spp. 3.9 %, Mycoplasma spp. 3.9 %, Pseudomonas spp. 2 %, Pasteurella multocida 2 %, Ureaplasma spp. 2 %, Klebsiella spp. 2 %. Mycoplasma spp. were the most susceptible to azithromycin ( 4 μg/ml), minocycline ( 4 μg/ml), doxycycline ( 4 μg/ml), ofloxacin ( 1 μg/ml), and tetracycline ( 4 μg/ml). The highest resistance was observed to clarithromycin ( 16 μg/ml) and erythromycin ( 16 μg/ml). The highest resistance of the isolated bacteria was found to spiramycin 100 %, tetracycline 100 %, tylosin 91.7 %. The most effective antimicrobials were marbofloxacin 87.5 % and enrofloxacin 78.3 %. Keywords: genital tract, microflora, dogs. 5

SANTRUMPOS C laipsniai pagal Celsijų B. abortus Brucella abortus B. suis Brucella suis E. coli Escherichia coli KA kraujo agaras KSV Kolonijas sudarantis vienetas m. metai M. canis Mycoplasma canis M. cynos Mycoplasma cynos MIC minimali slopinamoji koncentracija ml mililitrai pav. paveikslas proc. procentai S. aureus Staphylococcus aureus S. canis Streptococcus canis S. dysgalactiae por. equisimilis Streptococcus dysgalactiae por. equisimilis S. equi Streptococcus equi spp. rūšys subsp. porūšis val. valandos 6

ĮVADAS Ankstesniais tyrimais nustatyta, kad sveikų kalių ir šunų lytiniuose takuose yra paplitusių įvairių mikroorganizmų, kurių dauguma yra oportunistinių tai yra tokių, kurie prie tam tikrų sąlygų gali sukelti ligas. Tarp dažniausiai randamų mikroorganizmų, kalių lytiniuose organuose, yra Staphylococcus intermedius, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus canis, Pasteurella multocida, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Bacillus spp., Ureaplasma spp., taip pat ir mielių (1, 4). Kai kuriais tyrimais nustatyta, kad Mycoplasma canis taip pat priklauso prie normalios sveikų kalių makšties mikrofloros, o jos patogeniškumas nėra žinomas (2). Yra ir nuomonių, kad mikoplazmos ir ureaplazmos kalėms gali sukelti vaginitą, sunkumų pastojant, ankstyvą embrionų žūtį, embrionų rezorbsiją, abortus, taip pat šuniukai gali gimti negyvi arba silpni (1). Dažniausios naujagimių infekcijų sukėlėjos yra iš makšties, pieno liaukos sekreto ir gimdymo takų išskirtos bakterijos (43). Panaši bakterijų rūšinė sudėtis būdinga ir šunų patinų lytiniams organams ten randama streptokokų, Pasteurella multocida, Escherichia coli, Staphylococcus intermedius, mikoplazmų ir ureaplazmų, kurios gali būti perduodamos kalėms kergimosi metu (25). Nors ir randamos visiškai sveikų šunų lytiniuose organuose, esant tinkamoms sąlygoms, visos šios bakterijos gali sukelti įvairias lytinių organų ligas (2). Todėl svarbu nustatyti, kokia yra normali mikroflora skirtingų veislių šunų lytiniuose organuose ir koks yra tų bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms (4). Bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms yra didelė problema veterinarinėje medicinoje, kuri nulemia gyvūnų sveikatos sutrikimus, gyvūnų tapimą zoonozių sukėlėjų rezervuarais ir atsparių antimikrobinėms medžiagoms bakterijų plitimą žmonių tarpe (29). Darbo tikslas: Išskirti vyraujančią mikroflorą šunų lyties organuose ir nustatyti jų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms. Darbo uždaviniai: 1. Išskirti mikroorganizmus iš šunų lyties organų. 2. Palyginti išskirtus mikroorganizmus pagal šunų lytį, amžių ir veislę. 3. Nustatyti išskirtų mikoplazmų minimalią slopinamąją koncentraciją. 4. Nustatyti išskirtos mikrofloros atsparumą antimikrobinėms medžiagoms. 7

1. LITERATŪROS APŽVALGA 1.1. Natūrali šunų lytinių takų mikroflora 1.1.1. Kalių lytinių takų mikroflora Sveikų kalių lytiniuose takuose aptinkama daug skirtingų bakterinių mikroorganizmų. Dažniausiai aptinkami mikroorganizmai yra šie: Escherichia coli, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Pasteurella spp., Proteus spp., Bacillus spp., Corynebacterium spp., Pseudomonas spp., Micrococcus spp., Neisseria spp., Klebsiella spp. ir Moraxella spp. Kai kurie iš šių mikroorganizmų buvo aptikti tiek sveikose, tiek ir nevaisingose kalėse. Visos sveikos kalės turi bakterinę mikroflorą, esančią priekinėje makšties dalyje, panašių rūšių aerobinės bakterijos išskirtos ir iš nevaisingų kalių makščių. Kalių makšties bakterinė mikroflora nėra sterili makštyje aptinkamas didelis kiekis normalios ar užterštos mikrofloros. Makšties mikrofloroje yra daug įvairių bakterijų rūšių, įskaitant aerobinius ir anaerobinius organizmus (1). Sveikų kalių lytiniuose takuose fiziologinė bakterinė flora yra sudaryta iš įvairių mikroorganizmų, daugiausia oportunistinių patogenų (22). Kalių makšties bakterinė mikroflora skiriasi priklausomai nuo šuns veislės, lytinio ciklo laikotarpio ir sezono. Yra tik keli pranešimai apie Mycoplasma canis išskyrimą iš sveikų kalių makšties ir rezultatai yra iš dalies prieštaringi. Manoma, jog egzistuoja mikoplazmų sąsaja su kalių nevaisingumu, tačiau įtikinamų įrodymų trūksta (2). 2011 metais atliktas tyrimas parodė, kad kalių makšties bakterijų kultūra, tiriama visiems šunims penktą ovuliacijos dieną, buvo teigiama 79,1 proc. nuo viso šunų skaičiaus (n=34). 1 lentelėje nurodyti mikroorganizmai, kurie buvo išskirti iš kalių makščių (3). 1 lentelė. Iš kalių makščių išskirti mikroorganizmai. Mikroorganizmai Skaičius Proc. Enterococcus faecalis 8 23.5 Streptococcus haemolyticus 7 20.6 Pasteurella multocida 3 8.8 E. coli 1 2.9 Klebsiella pneumoniae 1 2.9 Proteus mirabilis 1 2.9 E. coli haemoliticus 1 2.9 Arcanobacterium pyogenes 1 2.9 8

1 lentelės tęsinys. Ne hemoliziniai streptokokai 1 2.9 Streptococcus spp. 1 2.9 Staphylococcus spp. 1 2.9 Iš viso: 26 Šaltinis: Gropetti D., Pecile A., Barbero C., Martino P. A., Universita di Milano, 2011. Atliktų tyrimų duomenimis, skirtumas tarp kalių, užsikrėtusių M. canis, ir kalių, užsikrėtusių kitais mikroorganizmais, taip pat ir bakterijų skaičius viename mėginyje gali priklausyti nuo įvairių aplinkos sąlygų. Mikoplazmų patogeniškumas kalių lytiniuose takuose nėra aiškus. Eksperimentinė infekcija su M. canis sukėlė pūlingą endometritą. Tačiau Mycoplasma spp. buvo išskirtos panašiais kiekiais iš kalių su lytinių takų ligomis ir iš sveikų gyvūnų (2). 1.1.2. Šunų lytinių takų mikroflora Sveikų šunų lytiniuose ir šlapimo takuose aptinkamos įvairios mikroorganizmų rūšys: Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Corynebacterium spp., E.coli, Pseudomonas spp., ir Pasteurella spp. Nenormalus šių bakterijų skaičiaus padidėjimas laikomas šunų urogenitalinių takų infekcijų pagrindine priežastimi. Nustatyta, kad apie 14 proc. šunų nors kartą per savo gyvenimą suserga šlapimo takų infekcija (24). Mikoplazmų ir ureaplazmų aptikimui šunų lytiniuose organuose buvo lyginami 136 šunys su įvairiomis reprodukcijos sutrikimų anamnezėmis. Mycoplasma spp. buvo išskirtos iš 88 proc. vaginos tamponų, 85 proc. apyvarpės tepinėlių ir 72 proc. spermos pavyzdžių. Mikroorganizmų aptikimo lygis buvo šiek tiek didesnis šunų, kurie buvo nevaisingi arba sirgo lytinių organų ligomis, tačiau skirtumai nuo tų, kurie buvo vaisingi ar kliniškai sveiki, statistiškai reikšmingi buvo tik šunų patinų. Šunų patinų rezultatai išskiriant Ureaplasma spp. buvo statistiškai reikšmingi nevaisingų šunų (69 proc.), lyginant su tais, kurie buvo vaisingi (0 proc.) (p 0,05) (12). Streptococcus spp. padermės yra oportunistinių ligų sukėlėjai, kurie paprastai aptinkami viršutiniuose kvėpavimo, žarnyno, apatiniuose šlapimo ir lyties organuose jie gali sukelti vietinę infekciją ar septicemiją visų amžiaus grupių šunims. Streptokokų infekcijos tyrimas 393 šunims buvo atliktas siekiant nustatyti Streptococcus spp., išskiriamas rūšis, nustatyti nukentėjusių šunų demografiją ir apibūdinti ligų, susijusių su infekcija, procesus. 9

Pagrindinės išskirtos streptokokų rūšys buvo S. canis 88 atvejai (22,4 proc.), S. dysgalactiae por. equisimilis 13 atvejų (3,3 proc.) ir S. equi por. zooepidemicus 4 atvejai (1 proc.). Lytis nebuvo rizikos veiksnys (p>30). Vaisiaus ir naujagimių grupės buvo labiau linkę turėti streptokokų infekcijų nei kitos amžiaus grupės (p<001) (11). Šunų patinų lytinių takų mikroflorai būdingos tos pačios rūšies bakterijos kaip ir kalių. Iš aerobinės mikrofloros dažnai išskiriami Streptococcus spp., E. coli, Pasteurella multocida, Staphylococcus spp., Proteus spp., Corynebacterium spp., rečiau aptinkami tokie mikroorganizmai, kaip Pseudomonas aeruginosa (23). Sveikų šunų populiacijoje šie mikroorganizmai neturi įtakos apvaisinimui, nors jie ir perduodami kalėms kergimo metu (25). Uždegiminės ląstelės tiesiogiai koreliavo su bakterijomis spermos mėginiuose (26). 1.2. Mycoplasma spp. charakteristika Mikoplazmos yra normaliai makšties mikroflorai priskiriami bakteriniai mikroorganizmai, kurie dėl jų itin mažo dydžio yra išskiriami į atskirą klasę. Be to, skirtingai nuo kitų bakterijų, mikoplazmoms trūksta standžios ląstelės sienelės, todėl joms neturi įtakos į ląstelės sienelę veikiantys antibiotikai (pavyzdžiui, penicilinas). Mikoplazmos yra labai išrankūs mikroorganizmai, kuriuos sunku išskirti be specialių sąlygų (5). Pirmasis dokumentuotas šunų mikoplazmų aptikimas užfiksuotas 1934 metais. Per pastaruosius 80 metų iš šunų imtuose mėginiuose buvo aptikta 15 žinomų ir 2 neištirtos mikoplazmų rūšys: Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma arginini, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma canis, Mycoplasma cynos, Mycoplasma edwardii, Mycoplasma feliminutum, Mycoplasma felis, Mycoplasma gateae, Mycoplasma haemocanis, Mycoplasma maculosum, Mycoplasma molare, Mycoplasma opalescens, Mycoplasma spp. HRC689 kamienas, Mycoplasma spp. VJC358 kamienas, Mycoplasma spumans ir Ureaplasma canigenitalium. 2 lentelėje pateikiamos Mycoplasma spp. rūšys, pasiskirsčiusios pagal šeimininkus (13). 2 lentelė. Mycoplasma spp. rūšys priklausomai nuo šeimininko. Rūšis Padermės tipas Savininkas (šeimininkas) Acholeplasma laidlawii PG8 Įvairūs Mycoplasma arginini G230 Šunys, ožkos, katės, avys Mycoplasma bovigenitalium PG11 Jaučiai, šunys Mycoplasma canis PG14 Jaučiai, šunys, žmonės 10

2 lentelės tęsinys. Mycoplasma cynos H831 Šunys Mycoplasma edwardii PG24 Šunys Mycoplasma feliminutum Ben Šunys, katės Mycoplasma felis CO Šunys, arkliai, katės, žmonės Mycoplasma gateae CS Šunys, katės Mycoplasma maculosum PG15 Šunys Mycoplasma molare H542 Šunys Mycoplasma opalescens MH5408 Šunys Mycoplasma spumans PG13 Šunys Mycoplasma spp., HRC689 HRC689 Šunys kamienas Mycoplasma spp., VJC358 VJC358 Šunys kamienas Ureaplasma canigenitalium D6P-C Šunys Šaltinis: Chalker V. J. Research in Veterinary Science, 2005. Pirmasis mikoplazmų išskyrimas iš šunų lytinių takų buvo registruotas 1951 metais. Vėlesni sveikų šunų tyrimai parodė, kad mikoplazmos yra natūralūs šunų ir kalių lytinių organų mikroorganizmai (6). Keletas mikoplazmų rūšių buvo nustatytos kaip natūrali mikroflora šunų ir kačių viršutiniuose kvėpavimo takuose ir lyties organuose, todėl jos gali būti išskirtos iš burnos, nosies, akių junginės ir lyties organų. Keleto tyrimų metu buvo nagrinėjamas mikoplazmų išskyrimas iš vaisingų kalių lytinių takų lyginant su nevaisingomis kalėmis ir šunimis, tačiau nebuvo rasta jokio reikšmingo skirtumo. Dėl šios priežasties mikoplazmų išskyrimas iš makšties arba spermos ne visada koreliuoja su reprodukcinėmis ligomis, taip pat ne visada būna reikalingas gydymas. Kadangi šie mikroorganizmai egzistuoja tiek kvėpavimo takuose, tiek lytiniuose organuose, oro lašelinis perdavimas nuo šuns šuniui (laižymas, uostymas ir kt.) yra dažnesnis, nei perdavimas lytiniu būdu (5). Mikoplazmos ir ureaplazmos yra klasifikuojamos kaip mažiausi laisvai gyvenantys mikroorganizmai. Mycoplasmataceae šeima yra dalijama į dvi gentis: Mycoplasma spp. ir Ureaplasma spp., abiejų genčių augimui yra reikalingas sterolis (7). 11

Mikoplazmos ir ureaplazmos sukelia urogenitalines ligas žmonėms ir gyvūnams. Šie mikroorganizmai gali sukelti vyriškos ar moteriškos lyties nevaisingumą, lytinių takų ligas, prastą pastojimo tikimybę, ankstyvąją embriono mirtį, abortą, sąlygoti silpnus ir sergančius naujagimius. Lytiškai plintančios ligos yra dažnai susijusios su šiais mikroorganizmais tiek žmonių, tiek gyvūnų tarpe. Prastos kokybės sperma taip pat buvo susijusi su šių mikroorganizmų išskyrimu (7). Mycoplasma canis buvo dažniausiai išskirta iš šunų lytinių organų, pagal dažnį po jos sekė M. cynos. Ureaplazmos iš šunų lytinių organų dažnai išskiriamos kartu su kitų rūšių mikoplazmomis (7). Nors mikoplazmos gali būti ir įprastais reprodukcinio trakto gyventojais, tačiau jos yra siejamos su nevaisingumu, pakitimais dauginimosi organuose ir spermos sutrikimais. Mycoplasma spp. yra oportunistiniai patogenai, todėl klinikinių požymių atsiranda, kai gyvūnas būna paveikiamas streso ar didelio mikroorganizmų skaičiaus. Uždaros intensyvios gyvūnų laikymo patalpos, tokios kaip dideli veislynai, patalpos parodose, sudaro tinkamas sąlygas vystytis dideliems mikroorganizmų kiekiams (5). Kadangi mikoplazmas ir ureaplazmas yra sunku išskirti, daugelis laboratorijų nesiryžta pateikti kiekybinių rezultatų, todėl teigiamo rezultato interpretacija dažnai yra neaiški. Viename iš tyrimų buvo lyginami mikoplazmų ir ureaplazmų kultūrų rezultatai tarp kliniškai sveikų kalių be vaisingumo istorijos (n=16), vaisingų kalių (n=10), nevaisingų kalių (n=27) ir kalių su vaginitu (n=22). Mikoplazmų nagrinėjamame tyrime buvo aptikta 88 proc. šunų, o ureaplazmų 51 proc. šunų (4). Buvo nustatyta, kad plataus spektro antibiotikų vartojimas gali slopinti daugumą kitų bakterijų, kurios sudaro normalią lytinių takų mikroflorą, tačiau mikoplazmų jis neveikia. Todėl profilaktinis antimikrobinių medžiagų vartojimas prieš veisimą nerekomenduojamas, kadangi jis gali sukelti patogeninę būklę ir prisidėti prie antimikrobinėms medžiagoms atsparių rūšių plitimo (4). Mikoplazmų kultūra turėtų būti tiriama tokiais atvejais, jei: 1. Šuo nesugebėjo apvaisinti keletos kalių iš eilės. 2. Morfologiškai įvertinus spermą, rasta pakitusių spermatozoidų. 3. Kalė neapsivaisino, nors buvo kergiama su vaisingu patinu tinkamomis lytinio ciklo dienomis. 4. Kalė apsivaisino, bet yra didelė tikimybė abortuotis (5). Svarbu žinoti, kad išvardintas problemas gali sąlygoti ir daugelis kitų priežasčių. Todėl mikoplazmų kultūros tyrimas turėtų būti tik vienas iš veterinarijos gydytojo, turinčio patirties gydant šunų reprodukcijos ligas, kruopščiai atliekamų tyrimų (5). 12

1.3. Pagrindinės šunų reprodukcijos ligos ir jų sukėlėjai Įvairios gyvūnų augintinų lytinių organų ligos yra žinomos kaip sukeliančios gyvūnų sergamumą ir mirtingumą. Gimdos kaklelis, gimda ir makštis yra pirminiai bakteriniai šaltiniai, iš kurių išsivysto pūlingos lytinių organų ligos, tokios kaip piometra, mukometra, metritas, endometritas, vaginitas ir gimdos kaklelio uždegimas. Šių ligų diagnozė ir gydymas vykdomi remiantis kiekvienos iš išvardintų ligų charakteristika ir žinomo gydymo būdo taikymu. Pavyzdžiui, kiaušidžių histerektomija yra susieta su piometros, mukometros ir lėtinio metrito gydymu. Naminių gyvūnų lytinių organų ligų, tokių, kaip ūmus metritas, endometritas, gimdos kaklelio uždegimas ir vaginitas, gydymas antibiotikais dažniausiai yra sėkmingas, nors sunkiais ar lėtiniais atvejais, kad gyvūnas pasveiktų, yra būtinas chirurginis gydymas (8). E. coli yra viena iš dažniausiai iš šunų lytinių takų išskiriamų bakterijų (31). E. coli yra dažnas šlapimo infekcijų sukėlėjas, taip pat ši bakterija yra pagrindinis prostatito šunims ir piometros kalėms sukėlėjas. E. coli buvo išskirta iš 50 85 proc. kalių, sirgusių piometra (9, 32). Piometra yra viena iš dažniausiai pasitaikančių ligų gyvūnų augintinių tarpe (36 40). Be to, piometra yra gerai žinoma kaip kalių tarpe paplitusi gyvybei pavojinga liga (28,41). Atliktas tyrimas siekiant nustatyti kalių, sergančių piometra, lytinių takų mikroflorą. Tyrime dalyvavo 34 piometra sergančios kalės, kurioms atlikta ovariohisterektomija. Rezultatai parodė kad 28 (82,4 proc.) tyrime dalyvavusių kalių tepinėlių mėginiuose bakterijos išaugo. Net 27 (96,3 proc.) išaugo E. coli iš jų 25 mėginiuose išskirta gryna E. coli kultūra. Mėginiuose kuriuose E. coli nebuvo rasta aptikti kiti mikroorganizmai, kurie patinkami ir sveikų kalių makštyse, tokių kaip Staphylococcus intermedius ir Enterococcus faecalis. (8) Dažnai nustatoma, kad piometra sergančios kalės taip pat serga ir šlapimo takų infekcijomis. Dauguma atveju tas pats E. coli padermės tipas buvo išskirtas ir iš šlapimo takų, ir iš gimdos turinio. Be Staphylococcus aureus, E. coli yra svarbi perinatalinės šunų ir kačių jauniklių mirties priežastis. E. coli padermės gali būti perduodamos lytiniu keliu, taip sukeldamos abortą arba jauniklių mirtį pirmosiomis gyvenimo dienomis. Be to, slaptasis kalių mastitas buvo nustatytas kaip dar vienas svarbus bakterinis infekcijos šaltinis gimusiems šuniukams (10). Šunų piometra yra liga, kuri pasireiškia specifiniais klinikiniais požymiais ir sukelia patologinius pakitimus. Šunų piometros patogenezė nėra visiškai aiški, nepaisant dešimtmečius atliekamų tyrimų, susijusių su šios ligos etiologija. Apskritai, tyrimų, atskleidusių, kurios bakterijos yra susijusios su šunų piometra, yra nedaug. Tačiau buvo nustatyta, kad labiausiai paplitusi piometrą sukelianti bakterija yra E. coli ji buvo išskirta iš 59 96 proc. sirgusių kalių. Rečiau išskiriamos 13

bakterijos, pavyzdžiui, Klebsiella spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp. buvo taip pat išskirtos iš piometra sirgusių kalių (10). Kalėms sergančioms piometra buvo pastebėtos tokios komplikacijos kaip peritonitas, šlapimo takų infekcijos, žaizdų infekcijos ir širdies aritmija. Taip pat buvo išsiaiškinta apie keletą įprastų peritonitą padedančių nustatyti parametrų, kartu nustatant ir gydymo pratęsimą. Leukopenija buvo susijusi su padidėjusia peritonito rizika ir ilgesne ligos eiga (17). Šunų piometra, taip pat žinoma kaip cistinės endometrinės hiperplazijos kompleksas, yra suaugusių šunų liga su gimdos uždegimu ir paprastai atsiranda liuteininėje rujos fazėje. Liga yra susijusi su hormoniniais pakitimais ir bakterinėmis infekcijomis. Piometros pasitaikymo dažnumas kalėms yra didelis ir pripažintas kaip viena iš pagrindinių ligos ir mirties priežasčių. Endometrinė hiperplazija yra sukeliama progesterono ir įprastai stebima prieš piometros atsiradimą. Bakterinė infekcija yra antrinė ligos priežastis. Bakterijos poravimosi metu pereina per gimdos kaklelį į gimdą. Kalių, sergančių cistine endometrine hiperplazija, imuninė sistema negali sunaikinti bakterijų, kurios gali išgyventi gimdoje pasigaminusiame skystyje. Vienas iš mikroorganizmų, paprastai susijęs su šia liga, yra E. coli. Kai kurie E. coli kamienai yra patogeniniai žmonėms (vyrams) ir gyvūnams. Žmonėms jie susiję su sunkiais virškinimo trakto sutrikimais, papildoma žarnyno infekcija ir šlapimo takų infekcijomis (21). Infekcinės ligos yra dažna kalių nevaisingumo priežastis, todėl jas reikėtų laiku tirti bei diagnozuoti, kad užkratas neplistų. Bakterijos, tokios kaip Brucella canis, retai B. abortus ar B. suis, Salmonella spp., Streptococcus spp. ir E. coli padermės yra nustatytos kaip kalių nevaisingumo priežastys (18). Šunys gali užsikrėsti 4 iš 6 Brucella spp. rūšių (33). Svarbiausias klinikinis požymis yra vėlyvasis abortas kalėms (34) ir epididimitas šunims (35). Geriausiu piometros gydymu, tiek su atviru, tiek su uždaru gimdos kakleliu, buvo laikomas chirurginis gydymas. Jis taikomas siekiant išvengti ligos recidyvo. Tais atvejais, kai buvo pasirenkama operacija, visais atvejais buvo pašalinama gimda ir beveik visais atvejais pašalinamos kiaušidės. Tais atvejais, kai buvo paliekamos kiaušidės, buvo siekiama išvengti nepageidautino sterilizacijos poveikio (19). Yra manoma, kad piometra susergama dėl patogeniškų bakterijų ir skirtingų lygių progesterono sąveikos. Prevencijai prieš patogenus kalių lytinių organų sistema pati sukuria atitinkamus imuninius mechanizmus. Įgimtas imunitetas yra universaliausias ir geriausiai nuo patogenų sąveikos organizme apsaugantis mechanizmas (16). 14

Sepsinis peritonitas yra gana dažna šunų liga. Antrinis sepsinis peritonitas, piometros atvejais, paprastai yra siejamas su perforacijomis žarnyne arba užkrėstais vidaus organais, pavyzdžiui, gimda. Piometra yra gerai žinoma ir dažna, šunų gyvybei pavojinga liga, kuri gali sukelti antrinį sepsinį peritonitą. Tokiais atvejais bakterijos po plyšimo dėl išsipūtusių gimdos sienelių paprastai plinta į pilvaplėvės ertmę (14). Mukometra yra laikoma į piometrą panašia liga, kadangi abiejų ligų atvejais pasireiškia intrauterinio skysčio kaupimasis. Tačiau šio skysčio sudėtis skiriasi piometros atveju kaupiasi pūlingas užkrėstas skystis, tuo tarpu mukometros eigoje ertmėje atsiranda sterilaus gleivinio serozinio skysčio. Šunų mukometros eiga lengvesnė nei piometros, tačiau manoma, jog vystymasis kartu su cistine endometrine hiperplazija gali paskatinti piometros progresavimą (19). Hipotirozė yra bendra liga, kuri, kaip manoma, yra paveldima tarp kai kurių šunų veislių. Kadangi daugelis grynaveislių šunų yra specialiai veisiami, hipotirozės poveikis šunų reprodukcijai turi didelę klinikinę svarbą. Daug įvairių sutrikimų, įskaitant nereguliarų lytinį ciklą, nevaisingumą, abortus, negyvo vaisiaus atvedimą, priešlaikinį gimdymą ir mažą jauniklio svorį, yra kalių hipotirozės priežastys. Tačiau nėra pakankamai žinių apie skydliaukės hormono trūkumo poveikį kalių reprodukcinei veiklai (20). Streptokokinė septicemija yra laikoma svarbia kalių abortų ir naujagimių mirties priežastimi, būdinga skirtingoms amžiaus grupėms. Tyrimais buvo nustatyta sezoninė šios ligos tendencija: šunys yra labiau linkę užsikrėsti streptokokine infekcija vasaros metu (11). Yra žinomas streptokokinės septicemijos atvejis, kuomet veislyne 8 kalės jaunikliai nugaišo 72 valandų bėgyje. 2 iš jų buvo nuspręsta ištirti. Ištyrus jauniklius abiejų jų organų mėginiuose buvo aptikta Staphylococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae ir beta-hemolizinių streptokokų. Patvirtinta, kad ir kitų šuniukų mirties priežastimi galėjo būti šie mikroorganizmai. Rezultatai sustiprino šių sukėlėjų klinikinę svarbą. Buvo patvirtinta, kad visi šuniukai susirgo tuo pačiu laikotarpiu, tačiau tvirto įrodymo, kad S. dysgalactiae subsp. dysgalatiae buvo vienintelė jauniklių mirties priežastis, nebuvo. Gaišimą taip pat galėjo sukelti prasta intrauterinė mityba, mažas jauniklių svoris, netgi kalės patirtas stresas. Reikšmingas faktas buvo ir tas, jog jaunikliai turėjo užsikrėsti vienu metu tai galėjo nutikti ir atvedimo metu, kadangi beta-hemoliziniai streptokokai randami sveikos kalės makšties mikrofloroje, ir gimdymo metu jie galėjo patekti į jauniklių organizmą (14). Šuniukų gaišimas pirmąją savaitę vyrauja nuo 15 proc. iki 40 proc. (42 ). Mirtis dažniausiai būna staigi, be klinikinių požymių. Manoma, kad infekcijos šaltinis plinta per motiną arba aplinką (43,44). Dažniausiai pasitaikantys sukėlėjai yra Streptococcus canis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, 15

Klebsiella spp., Pseudomonas spp. (44) ir Staphlococcus pseudintermedius (27). Italijoje atlikto tyrimo metu išskirti koaguliazei teigiami stafilokokai iš makšties (33 mėginiai) ir iš negyvų šuniukų (27 mėginiai) (46). Mikroorganizmai, dažniausiai išskiriami iš kalių makšties, yra išvardinti 3 lentelėje. Mikroorganizmai, dažniausiai išskiriami iš sveikų kalių ir kalių, sergančių vaginitu, yra beveik identiški (4). 3 lentelėje šie mikroorganizmai pateikiami pagal jų išskyrimo dažnumą. 3 lentelė. Mikroorganizmai, išskirti iš sveikų ir sergančių vaginitu kalių. Aerobinės bakterijos, išskirtos iš Aerobinės bakterijos, išskirtos iš kalių, sveikų kalių sergančių vaginitu E. coli E. coli Streptococcus canis Streptococcus canis Pasteurella multocida Staphylococcus intermedius Staphylococcus aureus Beta hemoliziniai streptokokai Streptococcus spp. Staphylococcus aureus Beta hemoliziniai streptokokai Pasteurella multocida Alfa hemoliziniai streptokokai Proteus mirabilis Bacillus spp. Proteus mirabilis Staphylococcus intermedius Staphylococcus spp. Šaltinis: Root Kustritz V. M. Theriogenology, 2006. Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Escherichia coli ir Pasteurella multocida yra dažniausiai išskiriami iš kalių su reprodukciniais sutrikimais, tačiau tyrėjai sąsajos tarp nevaisingumo ir šių rūšių bakterijų aptikimo nenustatė (15). Manoma, jog infekcinės ligos lemia didžiąją dalį šunų veislynuose auginamų patinų nevaisingumo priežasčių. Mikroorganizmai sukelia prostatos uždegimą, kuris gali keisti prostatos skysčių biocheminę sudėtį. Be to, infekcijos dažnai sukelia orchitą su vėlesniais spermos kokybės pakitimais. Numanomas paaiškinimas galėtų būti hematogeninis mikroorganizmo išplitimas į sėklides, o taip pat indukcinė sisteminė imuninė reakcija, atsiradusi dėl autoantigenų poveikio sėklidėms (23). 16

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA Tyrimas buvo atliktas 2015 2016 m. Mėginiai imti patelėms iš makšties ir patinams iš apyvarpės. Paimti mėginiai buvo talpinami į transportines terpes TRANSWAB (Amies, Liofilchem, Italija), o mikoplazmoms tirti skirti mėginiai talpinami į UTM RT (universali transportinė terpė). Visi paimti mėginiai per 24 val. buvo pristatyti į mikrobiologijos laboratoriją. Tyrimui buvo pasirinkti 50 skirtingų lyčių šunys. Suskirstyti į 3 amžiaus grupes: 1 3 metų, 3 6 metų, 6 9 metų ir skirtingų dydžių grupes: mažų, vidutinių ir didelių veislių. Detalūs mėginių ėmimo duomenys pateikti 4 lentelėje. Lytis 4 lentelė. Mėginių pasiskirstymas pagal lytį, veislės dydį ir amžių. Mėginių skaičius, n= 50 Veislės dydis Mėginių skaičius, n= 50 Amžius, m. Mėginių skaičius, n= 50 Patelės 45 Mažųjų veislių šunys Patinai 5 Vidutinių veislių šunys Didelių veislių šunys 19 1 3 17 17 3 6 23 14 6 9 10 Tiriamieji mėginiai buvo sėjami į Petri lėkšteles su mėsos peptono agaru. Užsėtos Petri lėkštelės buvo kultivuotos 24 48 val. Po 24 48 val. ruošti tepinėliai iš išaugusių mikroorganizmų kultūrų ir dažyti Gramo būdu ( Diagnostica Merk, Vokietija). Vertinant tepinėlius mikroskopu, sukėlėjai neidentifikuojami, tačiau nustatoma mikroorganizmų morfologija. Gramteigiami mikroorganizmai nusidažo violetine spalva, gramneigiami raudona spalva. Mikoplazmoms išskirti naudojami komerciniai testai (Liofilchem, Italija). Tai 24 šulinėlių sistema, skirta urogenitalinio trakto mikoplazmų kiekybiniui nustatymui bei įvertinti minimalią slopinamąją koncentraciją (MIC). Transportinėje terpėje mėginiai įmerkiami į fiziologinį tirpalą ir laukiama 5 minutes. Atsargiai maišoma, neprisiliečiant prie sienelių. Iš transportinės terpės įlašinama po 0,2 ml klinikinio mėginio suspensijos į kiekvieną sistemos šulinėlį. Kiekvienas šulinėlis uždengiamas 1 lašu vazelino aliejaus. Sistema uždengiama ir kultivuojama termostate +36 C, 36 valandas. Vertinimas: spalvos pasikeitimas iš geltonos į raudoną 1 GR+ šulinėlyje rodo mažiau nei 10 4 KSV/ml mikoplazmų ląstelių. Mažiau nei 10 5 KSV/ml mikoplazmų ląstelių rodo spalvos pasikeitimas 17

1 GR+ ir 2 GR+ šulinėliuose. Daugiau nei 10 5 KSV/ml mikoplazmų ląstelių rodo spalvos pasikeitimą 3 GR+ šulinėlyje. Identifikavimas: Mycoplasma spp. buvimą rodo spalvos pasikeitimas iš geltonos į raudoną 1 3 ADC šulinėliuose. Ureaplasma urealyticum buvimą rodo spalvos pasikeitimas 5 UR šulinėlyje. Mycoplama spp. ir Ureaplasma urealyticum buvimą rodo spalvos pasikeitimas 4 ADC ir 5 UR šulinėliuose. MIC nustatymas: mikoplazmų jautrumą antimikrobinėms medžiagoms rodo geltona spalva šulinėliuose. Iš geltonos pasikeitimas į oranžinę spalvą šulinėliuose rodo vidutinišką mikoplazmų jautrumą. Mikoplazmų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms rodo į raudoną pakitusi geltona spalva. Naudojami kelių skirtingų koncentracijų antibiotikai: tetraciklinas 4 μg/ml ir 8 μg/ml, ofloksacinas 1 μg/ml ir 4 μg/ml, doksiciklinas 4 μg/ml ir 8 μg/ml, eritromicinas 8 μg/ml ir 16 μg/ml, klaritromicinas 8 μg/ml ir 16 μg/ml, minociklinas 4 μg/ml ir 8 μg/ml, azitromicinas 4 μg/ml ir 8 μg/ml. Stafilokokams identifikuoti naudojamas Manito druskos (Oxoid, Anglija) agaras ir kraujo agaras (KA). Užsėtos lėkštelės kultivuojamos termostate +37ºC temperatūroje 24 48 val. Kraujo agare vyko visiška (β) arba dalinė (α) hemolizė. Siekiant atskirti Streptococcus spp. nuo Staphylococcus spp. buvo atliktas katalazės testas. Buvo naudotas 3 proc. vandenilio peroksido tirpalas (H2O2). Escherichia coli identifikuoti naudotas TBX, MacConkey agaras (Liofilchem, Italija). Ant MacConkey agaro užaugusios Escherichia coli bakterijų kolonijos paprastai būna rožinės, laktozei teigiamos. TBX terpėje daugelį Escherichia coli padermių nuo kitų koliforminių bakterijų galima diferencijuoti pagal gliukuronidazės fermantą, kuris yra specifiškas Escherichia coli. Pseudomonas spp. bakterijos sėjamos ant KA, kuriame sukelia visišką hemolizę. Kai kurių kamienų kolonijos dėl trimetilamino gamybos paprastai išskiria saldų kvapą. Pseudomonas spp. identifikuoti naudotas selektyvinis Pseudomonas citramide agar Base (Oxoid, Anglija) agaras. P. aeruginosa šioje terpėje būna geltonos žalios arba geltonos rudos spalvos išskiria dviejų tipų pigmentus piocianiną ir pioverdiną. Dėl fluorescuojančio pigmento pioverdino P. aeruginosa tiriant švyti ultravioletinėje šviesoje. Proteus spp. išskirti naudojamas kraujo agaras (KA). Kultūrai išgryninti buvo persėta ant SIM terpės (Sulfide Indole Motility Medium, Oxoid, Anglija), dėl sieros vandenilio gamybos terpė būna juodos spalvos. Pasteurella spp. morfologija tirta preparatus dažant Gimzos metodu. Pasteurella spp. identifikavimui naudotas Drigalskio ir Mac Conkey agaras (Oxoid, Anglija). 18

Bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms buvo nustatytas pagal modifikuotą Kirby- Bauer metodą (indikatorinių diskų metodas). Išaugusios bakterijų kolonijos perkeliamos į mėgintuvėlį su fiziologiniu tirpalu. Jos turi atitikti standartą 0,5 McFarlando vienetus. Bakterijos sėjamos į specialų Mueller Hinton II Agar agarą (Oxoid, Anglija). Ant agaro paviršiaus 30 mm atstumu vienas nuo kito dedami indikatoriniai antimikrobinių medžiagų diskai. Užsėtos Petri lėkštelės buvo kultivuotos termostate 24 48 val. fakultatyvinėmis aerobinėmis sąlygomis, esant +37 o C temperatūrai. Atsparumas antimikrobinėms medžiagoms vertinamas išmatuojant bakterijų augimo inhibicijos zoną. Gauti rezultatai vertinti pagal galiojančius standartus. Naudoti šie indikatoriniai antimikrobinių medžiagų diskai: amoksicilinas 30 µg (Oxoid/A) bei amoksicilinas su klavulano rūgštimi 30 µg (Pfizer/A), enrоflоksacinas 2,5 µg (Oxoid A), marbоflоksacinas 5 µg (Oxoid A), gentamicinas 10 μg (Oxoid/A), cefovekinas 2 µg (Oxoid/A), sulfametoksazolas trimetоprimas (Oxoid A), trimetoprimas (Oxoid/A), tetraciklinas 30 μg (Oxoid/A), tilozinas (Oxoid/A), spiramicinas (Oxoid/A), doksiciklinas (Oxoid/A). Tyrimo analizė buvo atlikta naudojant Microsoft Excel'2010 skaičiuoklę. Tyrimo duomenys patikimi, kai p<0,05, p<0,01 ir p<0,001. 19

3. TYRIMO REZULTATAI 3.1. Šunų lytinių organų mikrobiologinis tyrimas 3.1.1. Išskirtos bakterijų padermės iš šunų lytinių organų 30% 25% 23.5% 25.5% 20% 17.6% 15% 10% 7.8% 9.8% 5% 2.0% 2.0% 3.9% 2.0% 2.0% 3.9% 0% 1 pav. Išskirtos bakterijų padermės iš šunų lytinių organų. 1 paveiksle matyti, jog atlikus šunų lytinių organų bakteriologinį tyrimą, dažniausiai buvo išskirti Staphylococcus spp., Escherichia coli ir Proteus spp. Mūsų tyrime rečiau pasitaikė išskirti Mycoplasma spp., Streptococcus spp., Klebsiella spp., Ureaplasma spp., Pseudomonas spp. ir Pasteurella multocida. 20

5.4% Mycoplasma spp. Kitos bakterijos 94.6% 2 pav. Tyrime išskirtos Mycoplasma spp. iš gyvūnų augintinių lytinių organų. 2 paveiksle matyti, kad iš didžiosios dalies mėginių buvo išskirtos kitos bakterijos, o Mycoplasma spp. išskirta iš 2 sveikų kalių mėginių. Niekas neišaugo Mišri mikroflora Streptococcus spp. Klebsiella spp. Escherichia coli Ureaplasma spp. Mycoplasma spp Proteus spp. Pasteurella multocida Pseudomonas spp. Staphylococcus spp. 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 45% Patinai Patelės 3 pav. Bakterijų padermių pasiskirstymas pagal lytį. 3 paveiksle matyti, jog iš tyrime dalyvavusių patelių daugiausiai išskirta Staphylococcus spp. bei Escherichia coli, mažiausiai išskirta Klebsiella spp., Ureaplasma spp., Mycoplasma spp., Pasteurella multocida, Pseudomonas spp. Mišrią mikroflorą išskyrėme iš beveik ketvirtadalio mėginių, taip pat beveik ketvirtadalyje mėginių mikroorganizmų neaptikta. 21

Patinų grupėje daugiausiai išskyrėme Streptococcus spp. bei Staphylococcus spp., iš mažiau nei ketvirtadalio mėginių išskyrėme mišrią mikroflorą, bei tokiame pačiame mėginių skaičiuje bakterijų augimo nenustatėme. Pseudomonas spp., Pasteurella multocida, Proteus spp., Mycoplasma spp., Ureaplasma spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. patinų grupėje taip pat nenustatyta. Lyginant tyrime dalyvavusių patinų bei patelių grupes, panašūs rezultatai buvo gauti išskiriant mišrią mikroflorą bei Staphylococcus spp. Rezultatai statistiškai nereikšmingi p> 0,05. 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% Mikroorganizmai 1-3 metų amžiaus grupėje Mikroorganizmai 6-9 metų amžiaus grupėje Mikroorganizmai 3-6 metų mažiaus grupėje 4 pav. Bakterijų padermių pasiskirstymas pagal amžiaus grupes. Iš 4 paveikslo matyti, jog tyrime dalyvavusioje 1 3 metų amžiaus grupėje, kurioje tirta 17 šunų, buvo išskirta daugiausiai Staphylococcus spp., Escherichia coli., o mažiausiai Proteus spp. Šioje amžiaus grupėje Pseudomonas spp., Pasteurella multocida, Mycoplasma spp., Ureaplasma spp., Klebsiella spp., Streptococcus spp. neišskirta. Iš ketvirtadalio mėginių išskyrėme mišrią mikroflorą, taip pat ketvirtadalyje mėginių mikroorganizmų augimas nenustatytas. 3 6 metų amžiaus grupėje išskirta daugiausiai Staphylococcus spp. ir Escherichia coli. Mažiausiai išskirta Pasteurella multocida, Proteus spp, Mycoplasma spp., Ureaplasma spp., Streptococcus spp. Šioje amžiaus grupėje Pseudomonas spp. ir Klebsiella spp. neišskirta. 22

6 9 metų amžiaus grupėje daugiausiai išskirta Staphylococcus spp. Mažiausiai išskirta Pseudomonas spp., Proteus spp., Mycoplasma spp., Klebsiella spp., Streptococcus spp. Šioje amžiaus grupėje Pasteurella multocida, Ureaplasma spp. ir Escherichia coli nenustatyta. Rezultatai statistiškai nereikšmingi p>0,05. 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% Mažųjų veislių Vidutinių veislių Didelių veislių 5 pav. Bakterijų padermių pasiskirstymas pagal veislės dydį. 5 paveiksle matyti, kad mažųjų šunų veislių grupėje, kurioje tirta 19 gyvūnų, daugiausiai išaugo Staphylococcus spp. ir Escherichia coli. Šioje grupėje Pseudomonas spp., Pasteurella multocida, Proteus spp., Mycoplasma spp., Ureaplasma spp., Klebsiella spp. ir Streptococcus spp. nenustatyta. Vidutinių šunų veislių grupėje daugiausiai išaugo Staphylococcus spp., mažiausiai Pseudomonas spp., Proteus spp., Mycoplasma spp., Ureaplasma spp., Escherichia coli, Streptococcus spp. Ketvirtadalyje mėginių nustatėme mišrią mikroflorą. Didelių šunų veislių grupėje daugiausiai išaugo Staphylococcus spp., Proteus spp., mažiausiai Escherichia coli, Klebsiella spp., Streptococcus spp., Pasteurella multocida, Mycoplasma spp. Šioje veislės grupėje Pseudomonas spp. nenustatyta. Lyginant veislių grupes, beveik ketvirtadalyje visų mėginių nebuvo bakterijų augimo. Rezultatai statistiškai nereikšmingi p>0,05. 23

3.1.2. Išskirtų bakterijų padermių jautrumas antimikrobinėms medžiagoms Klaritromicinas Eritromicinas Azitromicinas Minociklinas Doksiciklinas Ofloksacinas Tetraciklinas 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Atsparu Vidutiniškai jautru Jautru 6 pav. Mycoplasma spp. jautrumas antimikrobinėms medžiagoms. 6 paveiksle matyti, kad Mycoplasma spp. buvo atspariausia klaritromicinui ( 16 μg/ml) ir eritromicinui ( 16 μg/ml). Mikrobiologiniame tyrime išskirtos Mycoplasma spp. jautriausios buvo azitromicinui ( 4 μg/ml), minociklinui ( 4 μg/ml), doksiciklinui ( 4 μg/ml), ofloksacinui ( 1 μg/ml) ir tetraciklinui ( 4 μg/ml). Doksiciklinas Sulfametoksazolas/ trimetoprimas Spiramicinas Tetraciklinas Tilozinas Trimetoprimas Cefovecinas Gentamicinas Marbofloksacinas Enrofloksacinas Amoksicilinas Amoksicilinas/ klavulano rūgštis 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Jautru Vidutiniškai jautru Atsparu 7 pav. Išaugusių bakterijų padermių bendras jautrumas antimikrobinėms medžiagoms. 24

Pagal 7 paveiksle pateiktus duomenis matyti, kad didžiausias išskirtų bakterijų atsparumas nustatytas spiramicinui, tetraciklinui, tilozinui, doksiciklinui ir trimetorpimui. Taip pat nustatyta, jog enrofloksacinas, amoksicilinas su klavulano rūgštimi ir marbofloksacinas buvo veiksmingiausios antimikrobinės medžiagos. Daugiau nei pusė išskirtų bakterijų buvo jautrios cefovecinui ir sulfametoksazolui su trimetoprimui. Išskirtos bakterijų padermės buvo vidutiniškai jautrios amoksicilinui. Lyginant antimikrobinių medžiagų poveiki buvo nustatyta, kad amoksicilinas su klavulano rūgštimi buvo veiksmingesnis nei amoksicilinas (p=0,0055), enrofloksacinas taip pat buvo veiksmingesnis nei amoksicilinas (p= 0,0029), o cefovecinas buvo veiksmingesnis nei trimetoprimas (p=0,01). Doksiciklinas Sulfametoksazolas/ trimetoprimas Spiramicinas Tetraciklinas Tilozinas Trimetoprimas Cefovecinas Gentamicinas Marbofloksacinas Enrofloksacinas Amoksicilinas Amoksicilinas/ klavulano rūgštis 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Jautru Vidutiniškai jautru Atsparu 8 pav. Bendras išaugusių bakterijų padermių jautrumo antimikrobinėms medžiagoms pasiskirstymas tarp patelių. 8 paveiksle matyti, kad didžiausias išskirtų bakterijų padermių atsparumas tarp patelių nustatytas spiramicinui, tetraciklinui, tilozinui, doksiciklinui, trimetoprimui. Amoksicilinui nustatytas vidutiniškas bakterijų jautrumas. Veiksmingiausios antimikrobinės medžiagos buvo marbofloksacinas, enrofloksacinas, amoksicilinas su klavulano rūgštimi. Pusė išskirtų bakterijų padermių buvo jautrios sulfametoksazolui su trimetoprimu, cefovecinui ir gentamicinui. 25

Sulfametoksazolas/ trimetoprimas Trimetoprimas Gentamicinas Enrofloksacinas Amoksicilinas Amoksicilinas/ klavulano rūgštis 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Jautru Vidutiniškai jautru Atsparu 9 pav. Bendras išaugusių bakterijų padermių jautrumo antimikrobinėms medžiagoms pasiskirstymas tarp tirtų patinų. Iš 9 paveikslo matyti, kad patinų tarpe nustatytas išskirtų bakterijų padermių atsparumas trimetoprimui ir gentamicinui. Vidutiniškas jautrumas nustatytas amoksicilinui. Veiksmingiausios antimikrobinės medžiagos buvo amoksicilinas su klavulano rūgštimi ir sulfametoksazolas su trimetoprimu. Pusė išskirtų bakterijų buvo jautrios enrofloksacinui. Doksiciklinas Sulfametoksazolas/ trimetoprimas Spiramicinas Tetraciklinas Tilozinas Trimetoprimas Cefovecinas Gentamicinas Marbofloksacinas Enrofloksacinas Amoksicilinas Amoksicilinas/ klavulano rūgštis 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Jautru Vidutiniškai jautru Atsparu 10 pav. Staphylococcus spp. jautrumas antimikrobinėms medžiagoms. 26

10 paveiksle pateikti duomenys rodo, kad Staphylococcus spp. jautriausi buvo marbofloksacinui, amoksicilinui su klavulano rūgštimi, enrofloksacinui ir cefovecinui. Didžiausias Staphylococcus spp. atsparumas nustatytas doksiciklinui, sulfametoksazolui su trimetoprimu, spiramicinui, tetraciklinui, tilozinui ir trimetoprimui. Pusė išskirtų Staphylococcus spp. kultūrų buvo jautrios amoksicilinui. Doksiciklinas Spiramicinas Tetraciklinas Tilozinas Trimetoprimas Cefovecinas Gentamicinas Enrofloksacinas 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Jautru Vidutiniškai jautru Atsparu 11 pav. Pseudomonas spp. jautrumas antimikrobinėms medžiagoms. 11 paveiksle pateikti duomenys rodo, kad Pseudomonas spp. jautriausi buvo gentamicinui, enrofloksacinui, trimetoprimui, tilozinui, tetraciklinui, spiramicinui, doksiciklinui. Pseudomonas spp. buvo atspariausi cefovecinui. Tetraciklinas Tilozinas Trimetoprimas Enrofloksacinas Amoksicilinas Amoksicilinas/ klavulano rūgštis 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Jautru Vidutiniškai jautru Atsparu 12 pav. Pasteurella multocida jautrumas antimikrobinėms medžiagoms 27

12 paveiksle matyti, kad Pasteurella multocida didžiausias jautrumas buvo nustatytas amoksicilinui su klavulano rūgštimi, enrofloksacinui, trimetorpimui. Didžiausias Pasteurella multocida atsparumas nustatytas amoksicilinui, tilozinui, tetraciklinui. Doksiciklinas Spiramicinas Tetraciklinas Tilozinas Trimetoprimas Cefovecinas Gentamicinas Marbofloksacinas Enrofloksacinas Amoksicilinas Amoksicilinas/ klavulano rūgštis 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Jautru Vidutiniškai jautru Atsparu 13 pav. Proteus spp. jautrumas antimikrobinėms medžiagoms. 13 paveiksle matyti, kad didžiausias Proteus spp. atsparumas nustatytas doksiciklinui, spiramicinui, tetraciklinui, tilozinui, trimetoprimui, amoksicilinui. Didžiausias jautrumas nustatytas marbofloksacinui, enrofloksacinui. Pusė tirtų Proteus spp. buvo jautrūs cefovecinui, vidutiniškai jautrūs enrofloksacinui. 28

Doksiciklinas Spiramicinas Tilozinas Trimetoprimas Cefovecinas Gentamicinas Enrofloksacinas Amoksicilinas Amoksicilinas/ klavulano rūgštis 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Jautru Vidutiniškai jautru Atsparu 14 pav. Escherichia coli jautrumas antimikrobinėms medžiagoms. 14 paveiksle matyti, kad didžiausias Escherichia coli atsparumas nustatytas spiramicinui, tilozinui. Didžiausias jautrumas nustatytas enrofloksacinui, amoksicilinui su klavulano rūgštimi. Pusė išskirtų Escherichia coli buvo jautrios gentamicinui. Sulfametoksazolas/ trimetoprimas Tetraciklinas Gentamicinas Enrofloksacinas 0% 20% 40% 60% 80% 100% Jautru Vidutiniškai jautru Atsparu 15 pav. Klebsiella spp. jautrumas antimikrobinėms medžiagoms. 15 paveiksle matyti, kad mikrobiologiniame tyrime išskirtos Klebsiella spp. buvo jautrios enrofloksacinui ir sulfametoksazolui su trimetoprimu. Didžiausias jų atsparumas nustatytas tetraciklinui ir gentamicinui. 29

Sulfametoksazolas/ trimetoprimas Trimetoprimas Gentamicinas Tetraciklinas Enrofloksacinas Amoksicilinas Amoksicilinas/ klavulano rūgštis 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Jautru Vidutiniškai jautru Atsparu 16 pav. Streptococcus spp. jautrumas antimikrobinėms medžiagoms. Kaip matyti 16 paveiksle, didžiausias Streptococcus spp. atsparumas nustatytas amoksicilinui ir amoksicilinui su klavulano rūgštimi. Didžiausias Streptococcus spp. jautrumas nustatytas enrofloksacinui ir sulfametoksazolui su trimetoprimu. 30

4. REZULTATŲ APTARIMAS Sveikų šunų lytinių takų normali mikroflora susideda daugiausia iš oportunistinių mikroorganizmų (30). Kalių lytinių takų mikroflora gali varijuoti priklausomai nuo veislės, lytinio ciklo stadijos ir sezono (16). Mūsų tyrimo metu gyvūnus suskirstėme pagal lytį, amžų ir veislės dydį. Iš kalių lytinių takų paprastai išskiriama įvairiausių bakterijų padermių. Dažniausiai pasitaikančios yra Escherichia coli, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Pasteurella spp., Proteus spp., Bacillus spp., Corynebacterium spp., Pseudomonas spp. taip pat Micrococcus spp., Neisseria spp., Klebsiella spp. ir Moraxella spp. (1). Mycoplasma spp. ir Ureaplasma spp. tai mikroorganizmai, kuriuos galima aptikti sveikų kalių lytiniuose takuose (3). Mūsų tyrimo metu iš kalių makšties buvo išskirti šie mikroorganizmai: Staphylococcus spp. 24,4 proc., Pseudomonas spp. 2,2 proc., Pasteurella multocida 2,2 proc., Proteus spp. 8,9 proc., Mycoplasma spp. 4,4 proc., Ureaplasma spp. 2,2 proc., Escherichia coli 11,1 proc., Klebsiella spp. 2,2 proc. Mišri mikroflora buvo išskirta iš 17,6 proc. mėginių. Mūsų tyrime Mycoplasma spp. buvo išskirta iš sveikų kalių. Lenkijoje atlikto tyrimo metu Mycoplasma spp. taip pat išskirta iš sveikų kalių (16). Mycoplasma spp. tirti yra būtina nepriklausomai nuo to, kad tyrime išskyrėme tik kelis procentus, bet šis mikroorganizmas yra nevaisingumo priežastis. Šunims iš apyvarpės ir spermos daugiausia išskiriami Pasteurella multocida, beta hemoliziniai streptokokai, Escherichia coli, Staphylococcus intermedius, Mycoplasma spp., Ureaplasma spp. (25). Mūsų tyrimo metu iš tirtų šunų apyvarpės išskyrėme Staphylococcus spp. 20 proc., Streptococcus spp. 40 proc., 20 proc. sudarė mišri mikroflora. Labai svarbu yra tirti šunų lytinių organų mikroorganizmus, nes jie gali būti perduodami lytinio kontakto metu. Taip pat, svarbu ir dėl to, jog kergimo metu galimas patogeninių stafilokokų perdavimas. Italijoje atlikto tyrimo metu šunų amžius svyravo nuo 1 iki 9,5 metų, daugiausia išskirtų bakterijų buvo Escherichia coli 2,9 proc., Streptococcus spp. 2,9 proc., Pasteurella multocida 8,8 proc., Staphylococcus spp. 2,9 proc. (14). Mūsų tyrime taip pat dalyvavo šunys nuo 1 iki 9 metų, kurie buvo suskirstyti į amžiaus grupes. 1 3 metų amžiaus grupėje nustatėme 17,6 proc., o 3 6 metų amžiaus grupėje nustatėme 8,7 proc. E. coli. 3 6 metų amžiaus grupėje nustatėme 4,3 proc., o 6 9 metų amžiaus grupėje 10 proc. Streptococcus spp. 3 6 metų amžiaus grupėje išskyrėme 4,3 proc. Pasteurella multocida. Visose amžiaus grupėse išskyrėme Staphylococcus spp.: 1 3 metų amžiaus grupėje 23,5 proc., 3 6 metų amžiaus grupėje 26,1 proc., 6 9 metų amžiaus grupėje 20 proc. (11 pav.). 31