VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS BIOCHEMIJOS IR BIOTECHNOLOGIJOS KATEDRA Giedrė Blažukienė Bičių pikio fenolinių ir lakių jungi

VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS BIOCHEMIJOS IR BIOTECHNOLOGIJOS KATEDRA Giedrė Blažukienė Bičių pikio fenolinių ir lakių junginių analizė, taikant spektrofotometrijos, efektyvios skysčių chromatografijos ir dujų chromatografijos - masių spektrometrijos metodus Magistro baigiamasis darbas Vadovas: Dr.Prof Audrius Maruška (Moksl. Laipsnis, vardas, pavardė) (Parašas) (Data) Apginta: Prof. Habil. Dr. Algimantas Paulauskas (Fakulteto dekanas) (Parašas) (Data) KAUNAS, 2013

TURINYS SANTRAUKA... 6 SUMMARY... 7 ĮVADAS... 9 1. LITERATŪROS APŽVALGA... 10 1.1 BIČIŲ PIKIO KILMĖ IR RŪŠYS... 10 1.2 BIČIŲ PIKIO FIZIKINĖS SAVYBĖS... 10 1.3 FENOLINIAI JUNGINIAI NATURALŪS ANTIOKSIDANTAI... 11 1.4 BIČIŲ PIKIO BIOLOGIŠKAI AKTYVIOS MEDŽIAGOS... 13 1.5 BIČIŲ PIKIO BOTANINĖ KILMĖ... 17 1.6 BIČIŲ PIKIO ANTIBAKTERINIS IR ANTIGRYBELINIS POVEIKIS... 18 1.7 BIČIŲ PIKIO CHEMINĖS ANALIZĖS BŪDAI... 20 1.7.1 SPEKTROFOTOMETRIJA... 20 1.7.2 EFEKTYVIOJI SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJA... 21 1.7.3 KIETAFAZĖ MIKROEKSTRAKCIJA... 25 1.7.4 KFME IŠ VIRŠERDVĖS... 25 1.7.5 VIRŠERDVĖS OPTIMIZAVIMAS... 27 1.7.6 DUJŲ CHROMATOGRAFIJA... 27 2. MEDŽIAGOS IR METODAI... 29 2.1 BIČIŲ PIKIO MĖGINIAI... 29 2.2 BIČIŲ PIKIO EKSTAKCIJA... 29 2.3 SPEKTROFOTOMETRIJOS METODAS... 30 2.4 EFEKTYVIOJI SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJA SU REAKCIJOS DETEKTORIUMI... 31 2.5 BIČIŲ PIKIO KIETAFAZĖ MIKROEKSTRAKCIJA IŠ VIRŠERDVĖS IR TIESIOGINĖ VIRŠERDVĖS INJEKCIJA... 32 2.6 DUJŲ CHROMATOGRAFIJA - MASIŲ SPEKTROMETRIJA... 32 3. DUOMENŲ STATISTINIS ĮVERTINIMAS... 33 4. REZULTATAI IR APTARIMAS... 34 4.1 BIČIŲ PIKIO EKSTRAKTŲ BENDRO FENOLINIŲ JUNGINIŲ, FLAVONOIDŲ, RADIKALO SURIŠIMO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS, TAIKANT SPEKTROFOTOMETRIJOS METODĄ... 34 4.1.1 FENOLINIŲ JUNGINIŲ KIEKIO ĮVERTINIMAS... 34 4.1.2 FLAVONOIDŲ KIEKIO ĮVERTINIMAS... 37 4.1.3 RADIKALO SURIŠIMO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS... 38 4.2 FENOLINIŲ JUNGINIŲ ĮVERTINIMAS, TAIKANT EFEKTYVIĄJĄ SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJĄ SU REAKCIJOS DETEKTORIUMI... 40 2

4.3 LAKIŲ JUNGINIŲ KOKYBINIS IR KIEKYBINIS ĮVERTINIMAS, KEIČIANT KIETAFAZĖS MIKROEKSTRAKCIJOS IŠ VIRŠERDVĖS IR TIESIOGINĖS VIRŠERDVĖS INJEKCIJOS OPTIMIZAVIMO SĄLYGAS... 46 4.3.1 KIETAFAZĖS MIKROEKSTRAKCIJOS IŠ VIRŠERDVĖS LAKIŲ JUNGINIŲ KOKYBINIS IR KIEKYBINIS ĮVERTINIMAS... 46 4.3.2 INJEKCIJOS IŠ VIRŠERDVĖS LAKIŲ JUNGINIŲ KOKYBINIS IR KIEKYBINIS ĮVERTINIMAS... 47 4.4 LAKIŲ JUNGINIŲ IDENTIFIKAVIMAS IR KIEKYBINIS ĮVERTINIMAS, TAIKANT DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS-MASIŲ SPEKTROMETRIJOS METODĄ... 50 IŠVADOS... 52 LITERATŪROS SĄRAŠAS... 54 3

SUTRUMPINIMAI PEE - propolis ekstrahuotas etanoliu. KFME - kietafazė mikroekstrakcija. MSK minimali slopinanti koncentracija. BTEX - benzenas, toluenas, etilbenzenas ir ksilenas. PDMS polidimetilsiloksanas. ESC efektyvi skysčių chromatografija DC-MS dujų chromatografija-masių spektrometrija DPPH- 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil ABTS - 2,2'-azino-bis(3-ethilbenzotiazolinas-6-sulfoninė rūgštis) 4

SANTRAUKA Bičių pikis įvairios augalinės kilmės, dervinga bičių susrenkama žaliava, į kurią dar priemaišoma vaškų, žiedadulkių ir eterinių aliejų.(petelinc T ir kt., 2013) Šį biologiškai aktyvių medžiagų mišinį bitės naudoja kaip dezinfekavimo ir konservavimo priemonę, o farmacijoje naudojama gydymo ar profilaktinio sveikatos palaikymo tikslams. Bičių pikis pasižymi nevienodomis biologinį aktyvumą turinčiomis medžiagomis, jos priklauso nuo augalinės ir geografinės kilmės, bičių rūšies, klimatologinių sąlygų ir kt. Todėl šiame darbe kokybiškai ir kiekybiškai įvertinamos nelakios ir lakios medžiagos, pritaikant skirtingus cheminės analizės būdus. Farmokologinis aktyvumas priklauso nuo flavonoidų, fenolinių junginių ir jų esterių. (Petelinc T ir kt., 2013, Farooqui T ir Farooqui A. 2012) Bendram fenolinių junginių, flavonoidų ir radikalo surišimo aktyvumo kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui taikomas spektrofotometrinis metodas. Šio metodo privalumas junginio gebėjimas sugerti, elektromagnetinę spinduliuotę, prie tam tikro bangos ilgio. Fenoliniai junginiai, flavonoidai ir radikalo surišimas absorbuoja matomos šviesos spinduliuotę. Kiekybiniam junginių kiekiui įvertinti naudojamas Lamberto-Bero dėsnis ir etaloninių rutino ir galo rūgšties kalibracinių tiesių funkcija. Fenolinių junginių kiekiai metanoliniuose pikio ekstraktuose svyravo nuo 105.4 mggre/g iki 652 mggre/g, flavonoidų kiekiai nuo 7.8 mgre/g iki 169.1 mgre/g, o radikalo surišimo aktyvumas nuo 301.1 mgre/g iki 389.6 mg RE/g. Kituose straipsniuose (PEE) ekstraktuose reikšmingos fenolinių junginių koncentracijos laikomos nuo 18 mg GRE/100ml iki 164 mg GRE/100ml (Savickas A. ir kt., 2010). Fenolinių junginių identifikavimas ir kokybininė bei kiekybinė analizė atlikta, taikant efektyviosios skysčių chromatografijos su elektrocheminiu detektoriumi metodą. Šis metodas pagrįstas tuo, kad junginiai identifikuojami ir kiekybiškai įvertinami elektrocheminio detektoriaus pagalba. Detektorius matuoja elektronų strautą, kurį sukuria junginio cheminės reakcijos: oksidacija ar redukcija. Kokybiškai įvertinami antioksidantai, esantys bičių pikyje, pagal bendrus smailių plotus, esant tam tikrai įtampai. Didžiausiu antioksidantų kiekiu pasižymėjo Šiaulių rajono pikis. Šiuose tyrimuose Šiaulių rajono bičių pikis pasižymėjo labiausiai, tiek fenoliniais junginiais, tiek ir antioksidantų kiekiu. Bičių pikio rinkimo metai turėjo didelės įtakos lakių ir nelakių junginių sudėčiai. Ženkli junginių autooksidacija buvo Urugvajuje rinkteme pikyje 2008 iais metais, Lietuvoje rinktame 2008 iais metais. Lenkijoje rinktame pikyje buvo labai didelis vaškų kiekis, todėl junginių koncentracijos yra mažesnės, nei minima straipsniuose. Lakiųjų junginių identifikavimas, kokybinis ir kiekybinis įvertinimas buvo atliktas, taikant dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodą. Lakūs junginiai identifikuojami pagal masių spektrus, panaudojant masių spektrų biblioteką NIST (JAV). Norint pagertinti 5

kokybinį ir kiekybinį lakių junginių išgavimą, buvo keičiamas bandinio ph ir joninė jėga prieš injekcijas - kietafazė mikroekstrakcija iš viršerdvės ir tiesiog iš viršerdvės, kurie lyginami pagal lakių junginių išgavimą. Geriausias išgavimas buvo KFME iš viršerdvės, kadangi net ir daliniai lakūs junginiai absorbuojami ant PDMS (polidimetisilaksano) sorbento, o iš viršerdvės vyksta tiesioginė injekcija į kolonėlę. Tirpalas su šarmu, pagerino lakių junginių išgavimą, tiek ir KFME iš viršerdvė, tiek ir iš viršerdvės injekcijos metodams. SUMMARY Propolis has pharmacological activities are reported to arise from its flavonoids and phenolic acids, and their esters. (Petelinc T ir kt., 2013) Propolis is a resinous material that is collected by bees from certain plants. Furthermore bees add wax, pollen and essential oils. This biologically active meterial is used as a desinfection and conservation agent in beehives and in pharmacy is used as therapeutic remedy or for preventative health maintenance. Propolis has various biological activity and this depends on the different factors: plant and geographical origin, species of bees, climatic conditions and etc. Propolis has pharmacological activities are reported to arise from its flavonoids and phenolic acids, and their esters. (Petelinc T ir kt., 2013, Farooqui T ir Farooqui A. 2012) Therefore in this research work are evaluated non-volatile and volatile compounds, through different chemical analysis.qualitative andquantitativeassessment of the total phenolic compounds, flavonoids and radical scavenging activity is carried out using the spectrophotometric methods. This method is specific for compounds which absorb electromagnetic radiation for given wavelength. Phenolic compounds, flavonoids and radical scavengers form complexes with certain reagents, which absorb visible light. For quantitative evaluation of compounds Beer-Lambert Law and functions of calibration curvesare used. It was determinedthat total phenolic compounds in methanolic extracts are from 105 mg GAE/g, up to 652 mg GAE/g, amount of flavonoids are from 7.8 mg RE/g up to 169 mg RE/g and radical binding activity is form 301 mg RE/g up to 389.6 mg RE/g. In other Lithuanian articles are mentioned significant phenolic compounds concentrations of (PEE), which ranged from 18 mg GAE/100ml up to 164 g GAE/100 ml. (Savickas A. and etc., 2010). Identification of phenolic compounds was carried out using HPLC with electrochemical detector. The electrochemical detector measures electron flow caused by the chemical reactions: oxidation or reduction. Qualitatively are evaluated antioxidants by the total peaks area. In this work characterized propolis from Šiauliai region. Šiauliai region propolis has the biggest concentracion of poliphenols, flavonoids. Significant auto-oxidation of compounds were in Uruguay propolis which collected in 2008 year and in Lithuania collected propolis in 2008 year. Propolis from Poland had lower concentracions of compounds because of very high wax content. 6

Identification, qualitativeand quantitative evaluation of volatile compounds was carried outby GC-MS. Volatile compunds were identified by mass spectra library NIST (USA). For attaining to improve output of volatile compounds, before injections: SPME from headspace and headspace, were modified samples. In this case more suitable method was SPME. The highest recovery was obtained using alkaline due to better propolis solubility at high ph. 7

ĮVADAS Kad suprasti bičių pikio cheminės sudėties skirtumus, reikia nepamiršti, kad pikis yra augalinės kilmės. Pikio gamybai bitės naudoja medžiagas iš įvairių augalų dalių, kurios pagamina jas tam tikro botaninio proceso metu. Kad ir susidariusios augalų žaizdos išskiria dervas, sakus, taip pat ant lapų ir pumpurų esantis vaškas. Kuo didesnę įvairovę bitės surenka šių medžiagų, tuo cheminė sudėtis yra įvairesnė. Todėl ir atliekama bičių pikio cheminė analizė iš skirtingų geografinių regionų, kad surasti koleriaciją tarp geografinės vietovės, augmenijos ir cheminės sudėties, taip pat identifikuoti junginius, kurie yra svarbūs gydymo aspektais. Šaime tiriamajame darbe bus atliekama kokybinė ir kiekybinė nelakių junginių analizė, taikant spektrofotometrijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodus ir lakių junginių, taikant dujų chromatografiją masių spektrometriją ir mėginio paruošimui taikoma kietafazė mikroekstrakcija (KFME) iš viršervės ir iš viršerdvės. Taip pat siekiant padidinti lakiųjų junginių išgavą, keičiama mėginių ph ir joninė jėga. Darbo tikslas: Nustatyti bičių pikio polifenolinius junginius, taikant spetrofotometrijos, efektryvios skysčių chromatografijos su elektrocheminiu detektoriumi metodus, taip pat identifikuoti lakius junginius ir pagerinti jų išgavimą, veikiant ph ir druskomis, taikant dujų chromatografijos - masių spetrometrijos metodą. Uždaviniai: 1. Įvertinti geografinės kilmės įtaką bičių pikio ekstraktų polifenolinių junginių sudėčiai ir antioksidacinėms savybėms. 2. Nustatyti surinkimo metų įtaką bičių pikio ekstraktų polifenolinių junginių sudėčiai ir antioksidaciėms savybėms. 3. Bičių pikio viršerdvės ir kietafazės mikroekstrakcijos optimizavimas. 4. Įvertinti bičių pikio geografinės kilmės įtaka lakių junginių sudėčiai. 5. Įvertinti bičių pikio surinkimo metų įtaka lakių junginių sudėčiai. 8

1. LITERATŪROS APŽVALGA 1.1 Bičių pikio kilmė ir rūšys Bičių pikis, medicinoje dar vadinamas propoliu. Bičių pikiui gaminti bitės naudoja augalines dervas, kurios išsiskiria iš augalų žaizdų, taip pat pumurų. Paprastai bitės surenka nuo beržų, drebulių, tuopų pumpurų, rečiau nuo eglių, pušų, kai kurių krūmų ir kitų augalų. Į augalinę dervą bitės primaišo vaško, seilių sekreto, žiedadulkių ir kitų priemaišų. Pagal paskirtį skirstomos dvi bičių pikio rūšys: 1. Pikis skirtas korių akučių lakavimui ir dezinfekavimui. Šiuo pikiu išteptas korys įgauna gelsvą spalvą, specifinį kvapą, atsparumą auktesnei temperatūrai. (Autorių kolektyvas, 1970) 2. Pikis skirtas avilio plyšiams užtaisyti, taip pat avilio vidun patekusių gyvūnų lavonams aplipdymui. (Autorių kolektyvas, 1970) 1.2 Bičių pikio fizikinės savybės Spalva: bičių pikio spalva yra įvairi. Ji priklauso nuo augalų, iš kurių surinkta derva. (Autorių kolektyvas, 1970) Pikio sudėtis ir spalva priklauso nuo geografinės kilmės ir ekosistemos (augalų rūšių). Yra žinoma, kad flavonoidų koncentracija turi įtakos biologiniam propolio veikimui ir spalvai. (Kosalec I., 2004). Vyraujanti Lietuviško propolio spalva tamsiai ruda (1 pav.). Braziliškas propolis dažniausiai yra raudonos spalvos. Turkiškas propolis žalias. Kūbietiškas propolis geltonos spalvos. Bičių pikio spalva skirtinga ir priklauso nuo geografinės ir botaninės kilmės. Kvapas: pikis pasižymi stipriu aromatu. Lietuviško bičių pikio aromatas beržų, tuopų. Bet vienareikšmiškai nenusakysi kokio aromato yra bičių pikis. Paviršius: šviežaus bičių pikio paviršius - blizgus, panašus į gintaro. Kuo senesnis bičių pikios, tuo tamsesnis (1 pav.), smulkesnis ir praradęs blizgesį. Lydimosi temperatūra: bičių pikis lydosi ne žemesnėje kaip 60 C temperatūroje. Tankis: sunkesnis už vandenį. Kuo sunkesnis už vandenį, tuo pikis yra grynesnis, turi mažiau vaško priemaišų. Tirpumas: bičių pikis visiškai ištirpsta stipriame šarme. Dalinai tirpsta eteryje, chloroforme, amoniake, etanolyje, metanolyje. 9

1 pav. Bičių pikio vizualiniai skirtumai. 1. 2012 metų rinkimo, Lietuviškas (Rudas) 2. 2012 metų rinkimo, Lenkiškas (Šviesus). 3. 2008 metų rinkimo, Urugvajietiškas. 4. 2006 metų rinkimo, Lietuviškas. 1.3. Fenoliniai junginiai naturalūs antioksidantai Visi augalai vykdo fotosintezės procesą, kurios metu redukuojamas CO 2 ir virsta sudėtine angliavandenio molekulės dalimi. Angliavandeniai yra panaudojami įvairiems junginiams sintezuoti, kurių pagrindą sudaro anglis, vieni iš tokių junginių fenoliniai junginiai. Fenoliniai junginiai augaluose yra gaunami dviejų katabolitinių procesų metu: glikolizė ir pentozės ciklo. (Vermerris W., ir Nicholson R., 2009)Fenoliniai junginiai labiausiai paplitusi antrinių metabolitų klasė. Augaluose fenoliniai junginiai dalyvauja fiziologinių procesų valdymuose: apsaugo nuo oksidacinio streso, kenksmingos spinduliuotės. Šie junginiai skirstomi į atskiras klases: fenolinės rūgštys, flavonoidai, stilbenai, kumarinai ir taninai (2 pav.) Fenolinės rūgštys skirstomos į du poklasius: hidroksibenzenoinės rūgštys ir hidroksicinamono rūgštys. Hidroksibenzenoinės rūgštys: galo, protokatecho, vanilino, siringo rūgštys. Hidroksicinamono rūgštys: para, meta, orto - kumaro, kavos, ferulo, sinapo rūgštys. Chlorogeno rūgštys - kavos rūgšties esteriai. Chlorogeno rūgštis dažniausiai aptinkamų hidrocinamono rūgščių augaluose. (Bravo L.ir kt., 1998). Flavonoidai sudaro didžiausią dalį 10

fenolinių junginių dalį. Augaluose flavonoidai dažniausiai randami kaip glikozilinti dariniai (Stalikas C., 2007). Flavonoidai skirstomi į šešis poklasius: flavonoliai, flavonai, flavanoliai, flavanonai, antocianidinai ir izoflavonoidai. Visi šie junginiai skiriasi benzeno žiedų, šoninėmių grupių skaičiumi, kurios paprastai būna: -H, -OH, -OCH 3. Hidroksilo grupių skaičius įtakoja antioksidacinį aktyvumą. Nuo antioksidanto OH grupės atskyla vandenilis ir vietoj jo surišamas laisvasis radikalas arba metalas (susidaro chelatai), taip sudarydamas stabilius junginius (Perron N., 2009) ( 3 pav.). Antioksidanto aktyvumas nustatomas pagal tai, kaip geba atiduoti elektroną ir redukuoti oksidantą. Geba susrišti ne tik biologinėse sistemose esančius radikalus, bet ir neradikalinės kilmės rūgštis, sintetinius radikalus, tokius kaip DPPH, ABTS ir.kt (Wojdyło A., 2007) 2 pav. Fenolinių junginių klasifikacija. (Vermerris W., ir Nicholson R., 2009) 3pav. Metalo ir polifenolio kompleksas (chelatas). Galolis, R=OH; Katecholis, R=H. (Perron N. Ir kt., 2009) Pagrindiniai fenoliniai junginiai: 1. Galo rūgštis yra randama tiek laisva forma, tiek ir kaip taninų molekulės dalis. Galo rūgšties randama beveik visuose augaluose, bet daugiausiai aptinkama: vynuogių uogose ir kai kuriuose vynų rūšyse (Weingerl V. 2012), žalioje ir juodoje arbatose (Henning S.M., 2003). 11

2. Chlorogeno rūgštis yra svarbi tarpinei lignino biosintezei. Šis junginys, senai žinomas kaip antioksidantas, stabdo gliukozės išsiskyrimą į kraują, sergant diabetu (Johnston K.L. 2003). Chlorogeno rūgštis padidina bendrą homocisteino koncentraciją plazmoje ir jo yra kavoje ir juodojoje arbatoje. Tie kurie geria kavą, jų organizme homocisteino koncentracija žymiai didesnė. (Olthof M.R, 2001) 3. Kavos rūgštis Nuo 1,2 iki 6,6% pacientų yra jautrūs bičių pikiui, tai sukelia alergenai: 3-metil-2-butenil kavos esteris ir feniletil kavos esteris. Benzilo salicilatas ir benzil cinamatas yra retesni alergenai. (Walgrave S.E., 2005) 4. Ferulo rūgštis - gryna rūgštis yra gelsvos spalvos milteliai. Ferulo rūgštis randama daugelyje augalų lapų ir sėklų. Tyrimai parodė, kad ferulo rūgštis mažina gliukozės kiekį kraujyje. (Sartori D.R.S., 2009) 5. Katechinas - stiprus antioksidantas, kuris sudaro ~30% žaliosios (Camellia sinensis) ir juodosios arbatos sausos lapų masės (Zaveri N.T., 2006) 6. Kumarinai hidroksicinaminė rūgštis. Turi tris izomerines formas: -orto, -para ir meta. P-kumarinas yra dažniausiai aptinkamas citrusiniuose augaluose. Turi stiprų antioksidacinį aktyvumą ir sumažina koncerogenų nitrozaminų susidarymą. (Ferguson L.R., 2005) 7. Kvarcetinas ir rutinas - stiprūs antioksidantai, dažniausiai aptinkami citrusiniuose vaisiuose. 1.4 Biologiškai aktyvios medžiagos bičių pikyje Propolis yra biologiškai aktyvių medžiagų kompleksas. Bičių pikio cheminė sudėtis priklauso nuo botaninės kilmės, geografinės kilmės, bičių rūšies, klimato sąlygų, tam tikru sezonu, ir kitų įtakojančių veiksnių. Be to, skirtingose bičių pikio rūšyse yra ne tik skirtinga cheminė sudėtis, bet ir skirtingos koncentracijos biologiškai aktyvių medžiagų, kurios įtakoja pikio kokybę. Todėl yra atliekami kokybiniai ir kiekybiniai tyrimai, taikant įvairius analizės metodus, kad medžiagų identifikavimas būtų efektyvesnis. Kiekviename propolio mėginyje yra identifikuojama daugiau kaip 80-100 cheminių junginių (Savickas A., 2005), kadangi jį sudaro ~50% dervų, ~30% vaško, ~10% eterinių aliejų, ~5% žiedadulkių, ir ~5% kitų medžiagų, (Savickas A., 2010; XU Yuanjun., 2009; Petelinc T ir kt., 2013))). Daugiausia identifikuojama tokių junginių: flavonoidų, fenolinių rūgščių (Kavos, Cinamono, p-kumaro, ferulo, p-hidroksibenzoinės, galo rūgštys) (Ramanauskienė K., 2013) ir jų esterių, alifatinių, aromatinių rūgščių ir jų esterių, (Savickas A., 2005; Bankova V, 2002) angliavandenių, aldehidų, amino rūgščių, ketonų, terpenoidų, (Savickas A., 2010), sudėtingų eterių, terpenų (bisabololo, pferostilbeno, fenolinio trigliceroido), organinių rūgščių (benzoinė, vanilinė) vanilono ir ir izovanilino aldehidų, betuleno, betulenolo ir kt. (Baltuškevičius A., 12

2003), vitaminų (B1, B2, B6, C ir E) ir mineralų (aliuminio, cezio, kalcio, vario, geležies, lantano, mangano, gyvsidabrio, nikelio, sidabro, vanadžio ir cinko) (Savickas A., 2010). Bičių pikio ekstraktuose esantys fenoliniai junginiai pasižymi stipriomis antioksidacinėmis ir gydomosiomis savybėmis. Lietuviško bičių pikio tyrimai parodė reikšmingas fenolinių junginių koncentracijas (0,18-1,64 GEg/100 ml, išreikšta galo rūgšties ekvivalentu). Fenolinės rūgštys ir fenilpropanoidai (kavos rūgštis, chlorageno rūgštis, cinamono rūgštis, kumarino rūgštis, rūgštis, galo rūgštis, protokatecho (3,4 dihidroksibenzenkarboksirūgštis) rūgštis, buvo identifikuojamos naudojant efektyviąją skysčių chromatografiją. Didžiausios koncentracijos fenolinių rūgščių buvo nustatytos pikyje, kuris buvo surinktas vietovėse, kuriose yra pievų ir lapuočių miškų. (Savickas A., 2010) Tuopiniame ir Aigeiros pikyje vyraujantys fenoliniai junginiai: cinamono rūgštis ir jos esteriai. (Popova M., 2004). Kinietiškame, Vengriškame, Bulgariškame, Urugvajietiškame ir Argentinietiškame bičių pikyje vyraujančios fenolinės rūgštys yra pinokembrinas, chrizinas, galanginas ir tektochrizinas. (XU Yuanjun., 2009). Urugvajietiškame pikyje dažniausiai minima p-kumaro rūgtis, kaip pagrindinė fenolinė rūgštis (Zunini M.P., 2010) Viena iš fenolinių junginių grupių flavonoidai, kurie atlieka reguliavimo funkciją: kontroliuoja žiedų spalvą, apdulkinimą, žiedadulkių daigumą, sėklų brendimą, augalo augimą ir vystymąsi ir apsaugo nuo biotinių ir abiotinių veiksnių. Flavonoidai didelė grupė junginių, turinčių mažą molekulinę masę. Jie taip yra labai stiprūs antioksidantai. (Amalesh S., 2011) Ne mažiau svarbūs ir lakūs junginiai, esantys bičių pikyje. Skirtingos botaninės ir geografinės kilmės bičių pikiai turi skirtingą lakių junginių įvairovę. Pastarieji tyrimai parodė, kad bičių pikis iš Virurinės Europos pasižymi didele diterpenų koncentracija ir neįprastu antibakterinį aktyvumu. Manoma, kad diterpenų šaltinis kiparisinių (Cupressaceae) šeimos augalai. (Popova M. ir kt., 2010) Braziliško bičių pikio lakūs junginiai yra propenas, spatulenolis, acetofenonas, cinamalil alkoholis, benzilalkoholis, α-pinenas, β-linalolis ir kariofilenas. (XU Yuanjun., 2009), α-terpinenas pagrindinis junginys Turkiškame bičių pikyje. α-pinenas yra pagrindinis junginys Graikiškame bičių pikyje. (XU Yuanjun., 2009) Bičių pikyje daugiausiai identifikuojami terpenoidai, taip pat ne išimtis ir Lietuviškame pikyje. Terpenoidai - terpenai ir jų dariniai; terpenas junginys, susidedantis iš izopreno molekulės. Šių junginių buvo aptikta daugiausiai. Azulenas ir α-bizabololis būdingas Chamomila officinalis, valerenolis Valeriana off, citralis Mellissa off. Nemažai junginių farnezenas, kopaenas, kadinolis, kariofilenas, b-elemenas (Majienė D.,2004). B-elemenas tai nauja priešvėžinė medžiaga, kuris randama imbiero augale (Wang G., 2005), amorfenas ir kiti randami daugelio augalų eterinių aliejų sudėtyje; Melissa off, Mentha piperita, Origanum vulgare, Juniperus communis, Salvija officinalis, Rosmarinus off, Ocimum basilicum. 13

Identifikuota keletas diterpenų, pvz: giberilino rūgštis, kuri yra labai svarbi augalams, nes reguliuoja jų augimą. Nors daugelio šių junginių koncentracija nedidelė, tačiau jų įvairovė rodo, jog bitės medžiagas propolio gamybai surinko nuo įvairių pievose augančių arba kultūrinių augalų. (Majienė D.,2004) Lietuviškame pikyje nustatyta 11 aromatinių rūgščių esterių. Benzilbenzoato C 14 H 12 O 2 ir benzilcinamato koncentracijos yra daug didesnės nei kitų cheminių junginių. Šie du junginiai yra naudojami kaip silpnas vietinis anestetikas, mažinantis sudirgimą, taip pat veikia kaip antibakterinė medžiaga, dedamos į vaikiškus raminamuosius tepalus. Identifikuoti net 6 ftialo rūgšties esteriai, iš kurių didžiausia koncentracija diizobutilftalato C 16 H 22 O 4 (1 lentelė). (Majienė D.,2004) Nustatyta 9 alifatinių rūgščių esteriai. Iš nesočiųjų šios grupės junginių daugiausiai yra etiloleato (vaistų pramonėje naudojama, kaip pagalbinė medžiaga) ir etillaurato, kuris naudojamas kaip mikštiklis. Buvo rasta linoleno rūgštis, kurio organizmas turėtų gauti su maistu. Iš sočiųjų alifatinių rūgščių darinių daugiausiai yra dodekano, tetradekano ir palmitino rūgščių etilo esterių. (Majienė D.,2004) Fenolinių junginių buvo identifikuota nedaug, o laisvą OH grupę turi tik vienas junginys 2,4 dibutilfenolis C 14 H 22 O. Fenolinių junginių kiekis propolyje priklauso tuopų paplitimo toje vietovėje. (Majienė D.,2004) 1 lentelė: Propolio cheminė sudėtis Lietuviškame propolyje (68 identifikuoti junginiai) (pagal Majienė D, 2004) Cheminiai junginiai Terpenoidai Jon ų stautas, % b-elemenas 2,01 Giberelino rūgštis 0,03 Dihidroabieto rūgštis 0,04 a-bizabololis 1,08 a-longipinenas 0,08 a-kalakorenas 0,10 g-kariofilenas 0,10 Kalareno epoksidas 0,10 Valerenolis 0,10 8,9-0,11 dihidrocikloizolongifolenas g-jononas 0,15 b-kariofilenas 0,16 Adamantanas 0,20 Kariofilenas 0,20 a-kadinolis 1,23 Aromadendreno 0,24 epoksidas b-selinenas 0,27 Cis-jazmonas 0,27 Kariofilenolis 0,27 Kariofileno oksidas 3,31 a-amorfenas 3,33 Citralis 2,33 1b-farnezenas 0,34 Kopaenas 0,39 a-farnezenas 1,41 8,9-dihidroneoizolongifolenas 0,50 Alloaromadendreno oksidas 0,57 Ledeno oksidas 0,58 Izolongifolenas 0,66 1,2,3,4,5,6,7,8-oktahidroazulenas 2,73 Cikloizolongifolenas 0,85 10-dihidroizolongifolenas 2,96 Aromatinių rūgščių esteriai Dibutilftalatas C 14 H 22 O 1,12 Fenetilcinamatas C 17 H 16 O 2 0,17 Dioktilftalatas C 24 H 38 O 4 0,19 Etilheksilftalatas 0,23 Etilhidrocinamatas 0,28 Diizooktilftalatas 6,29 Aliletilftalatas 0,37 Etilcinamatas 0,42 Diizobutilftalatas 0,47 Benzilcinamatas 9,58 Benzilbenzoatas C 14 H 12 O 2 11,91 Alifatinės rūgštys ir jų esteriai Etilheksadekanoatas 2,03 2-etilheksil-2-propenatas 0,09 Etilstearatas 0,13 2,2-dimetilheptanoatas 0,16 14

Etillinolenoatas 0,19 Fenilmetilacetatas 0,22 Etiloleatas 2,38 Etiltetradekanoatas 1,97 Etillauratas 2,98 Kiti aromatiniai junginiai Cinamaldehidas 0,03 Difenilciklopropanas 1,05 7-metiladeninas 0,11 4-etilfenil-2-butanonas 0,11 4-etil-1,2-dimetilbenzenas 0,26 Imidazolas 0,45 Benzilchloridas 0,57 Benzaldehidas 0,65 Benzenolis 1,72 2,4-dibutilfenolis C 14 H 22 O 4,76 1,4-dimetil-2-pentenilbenzenas 1,95 Sotieji angliavandeniliai Oktadekanas CH 3 (CH 2 ) 16 CH 3 1,26 Nonakozanas 1,33 Eikozanas 0,49 Heneikozanas 0,72 Heptakozanas 0,86 15

1.5 Bičių pikio botaninė kilmė Šiuo metu gerai žinoma, kad vidutinio klimato zonoje, kurioje pagrindinis bičių pikio šaltinis yra juodosios tuopos (populus nigra) medžių pumpurai, pikis yra tipiškas savo chemine sudėtimi fenoliniais junginiais ir jų esteriais. Juodosios tuopos medžiai auga tik vidutinio klimato zonoje, kur jų nėra tropiniuose ir subtropiniuose regionuose. Dėl to atogrąžų regionų bičių pikis turi skirtingą cheminę sudėtį. Per pastarąjį dešimtmetį, Brazilijos žaliasis ir raudonasis pikis traukia tiek komerciniu, tiek moksliniu aspektu, nes pagrindinis Brazilijos bičių pikio šaltinis yra lapų derva (Baccharis dracunculifolia). Tarp pagrindinių junginių rasta p-kumarino rūgšties ir acetofenono, diterpenų, lignanų ir flavonoidų, kurių nerasi Europos pikyje. (Bankova V., 2005; Salatino A., 2005) 2 lentelė. bičių pikis skirtingos botaninės kilmės, su jam būdingomis veikliosiomis mežiagomis iš tam tikrų, tam regionui būdingų, augalų rūšių. ( pagal Bankova V., 2005; Salatino., 2011; Salatino A., 2005) 16

Taip pat nesenai mokslinikų dėmesį patraukė Kubietiškas bičių pikis. Jo pagrindinės medžiagos- polizoprenil benzofenonai, ir tai daro Kubos pikį išskirtiniu. Ši medžiaga iš augalo - Clusia rosea spp. (2 lentelė) (Bankova V., 2005). Benzofenonai efektyviausiai saugo nuo UVA ir UVB spinduliuotės. 1.6 Propolio antibakterinis ir antigrybelinis poveikis Lietuvoje propolio antimikrobinis aktyvumas yra tiriamas ir viename iš tyrimų buvo nustatyta, kad minimali stopinanti Lietuviško pikio koncentracija (MSK) (PEE- propolis ekstrahuotas etanoliu) priklauso nuo veikiamos bakterijos sienelės morfologijos ir fenolinių junginių koncentracijos PEE. (Savickas A., 2005) Bet vėlesni tyrimai parodė, kad antimikrobinis poveikis susijęs su fenolinių junginių koncentracijomis. Parenkant skirtingas koncentracijas, buvo paveikiamos dauguma bakterijų. (Savickas A.,2010) Be to, detalus vieno mėginio propolio cheminė sudėtis buvo nustatyta dujų chromatografijos metodu - masių spektrometrija. Nepaisant to, vis dar iki galo nėra žinoma cheminė sudėtis ir antimikrobinis aktyvumas. (Savickas A., 2005). Nacionalinio Londono širdies ir plaučių instituto specialistai nustatė, kad bioflavonoidai, kurių esama propolio sudėtyje, stabdo ir naikina antibiotikams atsparių bakterijų dauginimąsi. Be priešmikrobinio veikimo propolis skatina audinių regeneraciją, slopina uždegimą ir jo sukeltus simptomus, stimuliuoja imuninę sistemą, malšina skausmą, efektyviai veikia grybelius. (Gendrolis A, 2004) Kaip jau buvo minėta, kad propolio antimikrobinį aktyvumą lemia jo sudėtyje esantys fenoliniai junginiai (Savickas A.,2010), o tiksliau flavonoidai, benzoinė ir kavos rūgštys, kiti cheminiai junginiai, šių medžiagų kiekybinė sudėtis ir jų sinergistinis poveikis. (Pavilonis A, 2008). 3 Lentelė. Junginiai turintys biologinį aktyvumą, skirtinguose propolio tipuose ( pagal Bankova V., 2005) Propolio tipas: Europinis Braziliška s (Bacchari s tipo) Antibakterini s aktyvumas Flavanonai, flavonai, fenolinės rūgštys ir jų esteriai. Prenyl p- kumaro rūgštis, diterpenai. Priešuždegimin is Flavanonai, flavonai, fenolinės rūgštys ir jų esteriai. Priešnavikini s Kavos rūgštis, fenetil esteriai. Neidentifikuota. Prenyl p- kumaro rūgštis, benzofuranai Kepenims Kavos rūgštis, ferulo rūgštis, kavos rūgšties fenetilo esteriai. Prenyl p- kumaro r. flavonoidai, lignanai, Antioksidacin is poveikis Flavonoidai, fenoliai ir jų esteriai. Prenyl p- kumaro.r. flavoniodai Alerginė s reakcijo s 3,3 dimetil alil kavos esteris Neištirta 17

, diterpenai. Kubietiška s Prenyl benzofenonai Neištirta Prenyl benzofenonai Taivano Neištirta Neištirta Prenyl flavanonai Neidentifikuot a Neištirta Prenil benzofenonai Prenyl flavanonai Neištirta Neištirta Literatūros duomenimis, propolis yra netoksiškas antimikrobinis preparatas, kuris veikia gramteigiamąsias ir gramneigiamąsias bakterijas ir kurio antimikrobinis poveikis bakterijoms priklauso nuo bakterijų ląstelės sienelės struktūros bei jų genotipinės savybės nepalankiomis aplinkos sąlygomis sudaryti sporas. Tirštojo propolio ekstrakto ir išgryninto propolio ekstrakto antibakterinis poveikis gramteigiamosioms (Staphylococcus aureus ir Enterococcus faecalis) ir gramneigiamosioms (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ir Proteus mirabilis) bakterijoms panašus. Nors kokų (stafilokokų ir enterokokų) ir lazdelės formos bakterijų (ešerichijų ir pseudomonų) ląstelės sienelės struktūra skiriasi, tačiau ryškaus skirtumo tarp jų jautrumo tirštajam propolio ekstraktui ir išgrynintam propolio ekstraktui nebuvo. Klebsiella pneumonia sudaro kapsulę. Grybų Candida albicans jautrumas tirštajam ir išgrynintam propolio ekstraktui buvo stiprus.. Literatūroje nurodoma, kad propolio antimikrobinis poveikis priklauso nuo flavonoidų kiekio ir jis veikia gramteigiamuosius kokus, tuberkuliozės sukėlėjus bei gramneigiamąsias bakterijas. (Pavilonis A, 2008; XU Yuanjun., 2009 ). Tyrimai parodė, kad koreliacinė priklausomybė yra tarp PEE dozės dydžio ir paveiktų aerobinių mikroorganizmų gyvybingumo. Teigiama tiesinė koreliacija (R2-0,97, 0,98, 0,89 su B. subtilis, C. albicans ir E.coli) buvo nustatyta, kad PEE slopina mikrobinio deguonies suvartojimą ir gyvybingumą. Fenolinių junginių koncentracija 65-1,300 µg ml -1 Bacillus subtilis bakterijų deguonies suvartojimą sumažina 26-81%, Candida albicans 6-70%, Escherichia coli 6-54%. Ti viena iš daromų prielaidų, kaip veikia propolis aerobinius mikroorgazmus. (Majiene D, 2010) Propolio antibakterinis veikimas: Gram-teigiamas bakterija Bacillus cereus, Bacillus mesentericus, Corynebacterium spp., Corynebacterium diphtheriae, Diplococcus pneumonae, Enterococcus spp., Mycobacteria sp., Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Streptococcus: critecus epidermis faecalis mutans, pyogenes, viridans, sobrinus, (Bogdanov S. 2012) Gram- neigiamas bakterijas Branhamella catarrhalis, E. coli, Helicobacter pylori, Klebsiella ozaemae, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella: choleraesuis, dublin, enteritidis, exneri, 18

gallinarum, pullorum, paratyphi-a, paratyphi-b, typh;i Shigella: dysinteriae, sonnei(bogdanov S. 2012) Grybelį Aspergilus sp., Candida: albicans, guiliermondi, parapsilosis, tropicalis; Cryptococcus sp., Cryptococcus neoformans, Histoplasma encapsulatum, Madurella mycetomi, Microsporum: audoinini, canis, cepleo, distortum, ferrugeneum, gypseum; Piedra hortae, Phialophora jeanselmei, Saccharomyces sp., Trichophyton: sp., mentagrophytes, rubrum, Trichosporon cutaneum (Bogdanov S. 2012) Virusus Adenovirus, Coronavirus, Herpes symplex, Influenca A and B virus, Newcastle disease virus, Polio virus, Vaccinia, Rotavirus; Vesicular Stomatitis Virus, Coronar virus (Bogdanov S. 2012) Parazitus Cholomonas paramecium, Eimeria: magna, media, perforans; Giardia lambia, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzi (Bogdanov S. 2012) 1.7 Bičių pikio cheminė analizės būdai 1.7.1 Spektrofotometrija 4 pav. Spektrofotometro pricipinė schema (pagal Ambasta B.K., 2006) Spektrofotometras prietaisas matuojantis tiriamojo tirpalo pralaidumą ar sugėrimą fiksuotame bangos ilgyje. Spektrofotometrai klasifikuojami į du tipus: i) vieno spindulio spektrofotometras ii) dvigubo spindulio spektrofotometras (Ambasta B.K., 2006.) Spektrofotometrą susdaro penkios pagrindinės dalys: baltos šviesos šaltinis, difrakcinė gardelė, monochromatorius, kiuvetė ir detektorius. (5 pav.) Skirtingi tipai spektrofotometro naudojami: i) Braižyti sugertus spektrus (procentinis pralaidumas fikstuotame bangos ilgyje). ii) Identifikuoti cheminius junginius. iii) Nustatyti junginių stabilumą ( termogravimetrinė analizė). 19

iv) Nustatyti reakcijos greičiui, analizuojant reakcijos mechanizmus ir tarpnius susidariusius junginius. v) UV-matomos šviesos spektrofotometras naudojamas nustatyti geometrinių izomerų geometriją. (Ambasta B.K., 2006.) 6 pav. Elektomagnetinių bangų spektras. (Pavia D.L., 2005) UV ir matomos šviesos spektrofotometrija naudojama analitiniams tikslams. Šie analitiniai metodai yra paremti kolorimetrija, kai naudojant specifinius reagentus, vizualiai ar spektrofotometriškai, pagal spalvines reakcijas yra nustatoma junginio koncentracija. Tai būdas išmatuoti tam tikro tirpalo sugertos arba išspinduliuotos šviesos energiją pasirinktame bangos ilgyje, nes kiekviena medžiaga sugeria arba išspinduliuoja tam tikro bangos ilgio spinduliuotės energiją. (Thomas O ir Burgess C., 2007) Kiekybinės analizės pagrindą sudaro Lamberto-Bero dėsnis: Kuo daugiau ištirpusios medžiagos, tuo didesnė absorbcija ir mažesnis laidumas šviesai. Kiekybiniam junginių nustatymui reikalingos kalibracinės kreivės, kurioms naudojami keli standartai. Kiekvienas analitinis metodas turi standartines paklaidas, trikdžius ir kt. (Thomas O ir Burgess C., 2007) 1.7.2 Efektyvioji skysčių chromatografija Efektyvioji skysčių chromatografija leidžia vienu metu atskirti analizuojamus junginius kartu su galimais jų dariniais ar degazacijos produktais, tarp daugelio panašių medžiagų nustatyti mažų koncentracijų analites. (Skoog D A., 2008) Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC). Klasikinei kolonėlinei skysčių chromatografijai atlikti dažniausiai naudojamos stiklinės kolonėlės, pripildytos didelių nejudrios fazės dalelių. Tokių kolonėlių skersmuo siekia kelis centimetrus. Judri fazė yra leidžiama per kolonėlę naudojant hidrostatinį slėgį arba žemo slėgio (peristaltinius) siurblius. Gaunama maža skiriamoji geba, o skirstymo laikas labai ilgas. Moderniai efektyviajai skysčių chromatografijai naudojamos trumpos (5-15 cm) kelių mm vidinio skersmens plieninės kolonėlės, jos pripildytos labiau mažų (3-5µm) nejudrios fazės granulių. Judri fazė 20

pumpuojama per kolonėlę naudojant didelio slėgio siurblius. Dėl mažo granulių skersmens, atskyrimai efektyviojoje skysčių chromatografijoje, palyginti su klasikine kolonėline chromatografija, yra daug efektyvesnė. Kitaip nei stiklinėse kolonėlėse, ESC kolonėlėse linijinis tėkmės yra apie 100 kartų didesnis, todėl skirstymas yra daug greitesnis, o analizės laikas trumpesnis. Tačiau ypač mažas granulių dydis lemis didelį ESC kolonėlių hidrodinaminį pasipriešinimą. Šiam hidrodinaminiam pasipriešinimui įveikti būtina naudoti diselio slėgio siurblius. (Maruška A., 2005) 7 pav. Efektyviosios skysčių chromatografijos schema. 1,2 buferiai 3 - maišytuvas. 4 ESC siurblys (aukšto slėgio). 5- injektorius. 6 Kolonėlė 7 detektorius. 8 duomenų apdorojimo sistema. (Nollet L. M. L., ir Toldrá F., 2012) ESC metodams būdinga (lyginant su skysčių chromatografija): Didelė rezoliucija; Mažo diametro (4.6mm), nerudyjančio plieno, stiklinės arba titaninės kolonėlės; Kolonėlės įkrovimas su labai mažomis dalelėmis ( 3, 5 ir 10 μm); Plyginus didelis įeinamasis slėgis ir kontroliuojama judrios fazės tėkmė; Pastovaus strauto detektoriai, galintys susidoroti su mažu tėkmės strautu ir aptikti labai mažus kiekius; Greita analizė; (Skoog D.A.2008) ESC eliuento sudėtis yra vienas iš kintamųjų norint padaryti įtaką atskyrimo procesui. Nepaisant plataus tirpiklių pasirinkimo ESC yra išskiriamos kelios pagrindinės savybės: Grynumas Suderinami su detektoriumi Bandinio tirpumas Mažas klampumas 21

Cheminis inertiškumas (Skoog D.A.2008) Aukšto slėgio siurbliai priverčia tirpiklius judėti per įkrautą fazę. Svarbiausi privalumai : didelė rezoliucija, greitesnė analizė ir padidėja bandinio įkrovos talpa. Kita svarbi siurblio ypatybė - tėkmės greičio stabilizavimas. Šiuolaikinių siurblių parametrai: Tėkmės greičio ribos: 0.01 per 5mL/min Tėkmės greičio stabilumas: ne didesnis kaip 1% Didžiausias slėgis: iki 300 hpa Pageidaujama, kad turėtų integruota degazavimo sistemą, taip pat helio parpūtimą arba membraninį filtrą. (Skoog D.A.2008) ESC detektoriai gali būti atrankūs arba universalūs, todėl reikia atsižvelgti į analizuojamų junginių chemines ir fizikines savybes. Detektorių tipai: UV/ matomos šviesos Fiksuoto bangos ilgio Keičiamo bangos ilgio Diodų matricos Lūžio rodiklio Fluorescensinis Elekrtocheminis vienas jautriausių detektorių skysčių chromatografijoje. Masių spektrometrai Išgarinantys šviesos išbarstymo Elektrocheminiai detektoriai skiriasi analičių detekcija, dėl elektrodų, kurie dažniausiai skirstomi į : I. Amperometrinius elektrodus. Šiai elektrodais yra matuojamos analitės, gebančios oksiduotis arba redukuotis, o detektorius matuoja signalą per darbinį elektrodą praėjusi srovė.ant amperometrinio elektrodo sureaguoja tik nuo 1 % iki 5 % analičių. (Thomas F.G.ir kt, 2001) II. Kulonometrinius elektrodus. Šiais elektodais yra matuojamos analitės, gebančios oksiduotis arba redukuotis, o detektorius išmatuoja signalą, kurį sukuria analitės reakcijos metu. Teoriškai oksidavusios arba redukavusios analitės masė turi būti lygi išėjusiai iš kolonėlės (Thomas F.G.ir kt, 2001) 22

8 pav. Amperometrinio elektrodo detekcija. DE - darbinis elektrodas; PE- pagalbinis elektrodas; EE- etaloninis elektrodas. (Trijų elektrodų sistema) ( pagal Thomas F.G.ir kt, 2001) 9 pav. Kulonometrinis elektrodas. (16 kulonometrinių elektrodų, kas įtakoja labai didelį jautumą). (pagal Acworth I.N. ir kt, 1997) Šio atveju analizuojami junginiai fenoliniai. Fenoliniai junginiai yra elektrochemiškai aktyvūs ir gali būti matuojami elektrocheminiu detektoriumi, turinčiu kulonometinį elektrodą. Polifenolių oksidacija priklauso nuo : Radikalo tipo, esančio polifenolyje ( pvz: hidroksi, metoksi) Radikalų kiekio ( pvz: fenolis, katecholis) Radikalų vietos (pvz: meta, orto, para) (Acworth., 2011) Apibendrinus būtų galima teigti, kad lengviau oksiduojantiems junginiams, reikia mažesnio oksidacijos potencialo, o sunkiau oksiduojantiems aukštesnio oksidacijos potencialo. (Acworth., 2011) 23

1.7.3 Kietafazė mikroekstrakcija (KFME) Kietafazė mikroekstrakcija (KFME) greita ir efektyvi kietafazės ekstrakcijos metodo atmaina. Ši ekstrakcija yra paremta tuo, kad analitės sorbuojasi ant plono sorbento sluoksnio, kuriuo yra padengtas adatos vidus, o vėliau analitės termiškai desorbuojamos, tiesiai į kolonėlę. KFME gali būti naudojama kartu su dujų chromatografijos, efektyviosios skysčių chromatografijos ir kapiliarinės elektroforezės metodais. (Vas G., 2004) Idealią kombinaciją tarp MS ir KFME parodė eksponentiškai daugėjančių publikacijų skaičius per dešimtmetį. (Vas G., 2004) 1.7.4 Kietafazė mikroekstrakcija iš viršerdvės KFME iš viršerdvės skiriasi nuo KFME tuo, kad adata su sorbentu nėra įmerkiama į mėginį, o ji yra virš mėginio tam tikru atstumu ir veikiant terimiškai adsorbuojamos lakio medžiagos iš viršervės. Šioje ekstrakcijoje yra svarbios trys fazės: sorbento sluoksnis, viršervė ir bandinys (10 pav). Pirmiausiai iš bandinio išgaravusios analitės atsiduria viršerdvėje, o tada tik pasiekia sorbentą.viršervės KFME leidžia lakioms analitėms pasiekti pluoštą, o pats mėginys gali būti modifikuojamas (ph, jonine jėga ir.kt), taip išvengiant polimerinio pluošto sugadinimo. (Valduga E., 2010). Trūkumas: prarandama daugiau analičių iš viršerdvės adsobuojant, nei su paprastu KFME. 10 Pav. KFME iš viršerdvės ir paprasta KFME įmerkiama tiesiai į bandinį. (Wang Y,ir kt. 1997) KFME gali būti atliekama trimis skirtingais būdais: 1.Tiesioginė 2.Viršerdvės 3.Netiesioginė (Valduga E. 2010) 24

KFME yra sudėtingas daugiafazis pusiausvyrinis procesas. Šis ekstahavimo procesas laikomas baigtu, kai analičių paiskirstymas pasiekia pusiausvyrą, (Mills Graham V., 2000)o ją pasiekus viršerdvės analizės metu yra analizuojama dujų sąveika su skysta ar kieta bandinio medžiaga ( Yuwen Wang., 1997) Bet iškyla klausimas, kaip bandinio tūris, ekstrahavimo trukmė ir kiti parametrai įtakoja pusiausvyros vyksmo greitį ir efektyvumą. KFME pluoštas. Pluoštas parenkamas, pagal tai ar lakios arba dalinai lakios analitės. Taip pat ar reikalingas pluoštas, kuris adsorbuojantis ar absorbuojantis, tai priklauso nuo analičių koncentracijos ir taikymo. (Flórez Menéndez J.C. 2000) Dažniausiai naudojamas polidimetilsiloksanas (PDMS). Yra tendencija, kad PDMS pluoštas geriau adsorbuoja mažos molekulinės masės molekulias. O poliniai pluoštai, kaip PDMS išgauna iš bandinio mažiau nepolinių analičių, nei nepolinis pluoštas. (Shirey Robert E. 2000), kaip matome (11 pav.) PDMS gali būti naudojamas lakiems, nelakiems arba pusiau lakiems junginiams, taip pat taikomas dujų chromatografijoje ir skysčių chromatografijoje. (Mills Graham V. 2000) 11 pav. Absorbcijos ir desorbcijos procesai. (pagal Mills Graham V. 2000) Desorbcijos temperatūra dažniausiai svyruoja nuo 160 C iki 250 C. Optimali desorbcijos temperatūra yra apytiksliai lygi mažiausiai lakios analitės virimo temperatūrai. Ekstrakcijos temperatūra: Didėjant ekstrakcijos temperatūrai, difuzijos koeficientai vandenyje didėja ir ekstrakcijos trukmė mažėja, bet pasiskirstymo koeficientai tampa mažesni, t.y., mažėja nustatymo jautris. 25

Temperatūros kėlimas duoda du priešingus efektus. Pirmas, tai didinant temperatūra gerėja analičių difuzija iš mėginio ant sorbento, o visų antra, tai mažėja laikas per kurį turi būti pasiekta pusiausvyra. (Flórez Menéndez J.C. 2000) Tiesioginės KFME atveju mėginiai nekaitinami. (Valduga.E. 2010) Bandinio modifikavimas, keičiant ph ar joninę jėgą: joninė jėga kai dėl tam tikrų jonų padaugėjimo vandeniniame tirpale vandens kiekis mažėja ir dėl to netralių junginių pasiskirstymas gali padidėti, tuo pačiu didėja ekstrahuojamų analičių kiekis ekstrahente. Joninei jėgai padidinti dažniausiai naudojamas prisotintas NaCl tirpalas (išsūdymas), ypač tinka benzenui, (Flórez Menéndez J.C. 2000) taip pat naudojamos ir rūgštys ar šarmai, priklausomai nuo mėginio lakių analičių cheminių ir fizikinių savybių. Baziniai junginiai yra geriau išekstrahuojami iš aukštą ph turinčių tirpalų, o rūgštiniai junginiai iš žemą ph turinčių tirpalų. (Shirey Robert E. 2000) 1.7.5 Viršerdvės optimizavimas Viršerdvės metodas yra naudojamas lakiems junginiams, nes yra greičiau pasiekiama pusiausvyra ir didesnis atrankumas. Jeigu analitės yra nelakios, tada pats bandinys yra modifikuojamas, kad pagerinti analičių lakumą. (Mills Graham V. 2000) Viršerdvės analizės metu nerekomenduojama naudoti aukštą temperatūrą iki 0C, siekant išvengti viršslėgio buteliuke su mėginiu. Viršervės metodas benzenui, toluenui, etilbenzenui ir ksilenui (BTEX) yra padidintas jautrumas, lyginant su tiesiogininės injekcijos technologija. (Flórez Menéndez J.C. 2000) Iš pradžių viršerdvė buvo skirta tik aplinkos teršalų analizei (pvz., pesticidams ir aromatiniams angliavandeniliams), bet vėliau analizuojamų bandinių įvairovė išsiplėtė. (Mills Graham V. 2000) Metodas pasirenkamas, priklauso nuo analitės ir medžiaga savybių pirmiausia, lakumo ir poliškumo. 1.7.6 Dujų chromatografija Chromatografija labai svarbus cheminės analizės ir atskyrimo įrankis. Kadangi dažniausiai analizuojami bandiniai būna su priemaišomis ir nevalyti, tai atskyrimas yra svarbiausias kriterijus. Chromatografijos tipas pasirenkamas atsižvelgiant į norimų atskirti ir identifikuoti junginių fizikines ir chemines savybes. Šiuo atveju reikalingas lakių junginių atskyrimas, todėl naudojama dujų chromatografija, tai pagrindinis chromatografijos tipas, kuris taikomas analizinei chemijai. Dujų chromatografijs taikoma lakiems ir termiškai 26

stabiliems junginiams. Šis metodas jautriausias molekulėms, kurios turi mažą molekulinę masę ir mažą poliškumą. (Bouchonnet S. 2013) Pagrindinės dujų chromatografo dalys: judri fazė dujos (helio, argono ir kt.), injektorius, kolonėlė, detektorius, kompiuterinė sistema. 4 lentelė: tipiški dujų chromatografijos detektoriai. (pagal Thomson Higer Education, 2007; Gerhards P.ir kt, 2008) Tipas Bandinio pritaikymas Detekcijos ribos Liepsnos jonizacijos Angliavandeniliai 10-11 g/s (Gerhards P.,ir kt (FID) 2008) Terminio laidumo Universalus 10-8 g/s (Gerhards P.,ir kt 2008) Elektronų gaudyklė Halogeninti junginiai 5 fg/s Masių spektrometras Priderinamas 10-11 g/s(gerhards P.,ir kt (MS) 2008) Termoelektroninis Azoto ir fosforo junginiai 10-13 g/s(gerhards P.,ir kt 2008) 10-14 g/s(gerhards P.,ir kt 2008) Elektrolitinio laidumo Junginiai, kurie sudaryti iš halogenų, sieros ar azoto. Fotojonizacijos UV jonizuoti junginiai 10-12 g/s(gerhards P.,ir kt 2008) Furje IR Organiniai junginiai 0,2 iki 40 ng 12 pav. Dujų chromatografo-masių spektrometro schema. DUJŲ CHROMATOGRAFAS: sudaro injekcinė sistema, dujų padavimas, kolonėlė ir sąsaja. MASIŲ SPEKTROMETAS: jonų šaltinis, masių ir krūvio analizatorius, detektorius, vakuminė sistema (siurblys). (pagal Sparkman O.D. ir kt, 2011) 27

Dažniausiai naudojama DC-MS sistema, kuri yra taikoma aplimkos cheminei analizei, kvepalų, kosmetikos ir kvapiklių industrijoje (Bouchonnet S. 2013), kadangi kaip matome (4 lentelėje), bandiniai gali būti pritaikomi. Vienas iš būdų - bandinio modifikavimas. Dujų chromatografo-masių spektrometro analizės principas: lakios ar pusiau lakios analitės injektuojamos iš bandinio ir keliauja į kapiliarinę kolonėlę, kurioje vyksta junginių atkyrimas, vėliau patenka į jonizacijos kamerą, joje molekulės skyla iki jonų (fragmentacija). Masių spektrometras išanalizuoja jonų masės ir krūvio santikį m/z, pagal šiuos parametrus yra identifikuojami junginiai. 2. MEDŽIAGOS IR METODAI 2.1 Bičių pikio mėginiai 5 Lentelė. Bičių pikio bandiniai Kilmės šalis Rinkimo metai Tipas 1. Lietuva, Šiaulių raj 2012, rugpjūtis Vieno avilio 2. Lietuva, Šiaulių raj 2012, rugsėjis Vieno avilio 3. Lietuva, Šiaulių raj 2012, spalis Vieno avilio 4. Urugvajus 2008 Rinktinis 5. Urugvajus 2011 Rinktinis 6. Lietuva 2011 lapkritis, gruodis Rinktinis iš 400 kg partijos 7. Lietuva 2008 Rinktinis iš 450kg partijos 8. Lietuva 2012 Rinktinis iš 450kg partijos 9. Lenkija 2012 Rinktinis iš 300kg 2.2 Bičių pikio ekstrakcija Ekstraktas sukoncentruota medžiaga, kuri ekstahuojama tirpikliais, pritaikytais tam tikram mėginiui, atsižvelgiant į jo tirpumą. Ekstrahuoti galima su eteriais, etanoliu, vandeniu ar kitu tirpikliu. Gali būti ekstahuojama ir metanoliu, jeigu ekstrakatai naudojami tik tyrimo tikslais arba atkiriant 28

metanolį išgarinant arba ekstrahuojant su tirpikliais. 2.3. Spektrofotometrinis metodas Reagentai: 1. Bidistiliuotas vanduo (Merck, Vokietija); 2. Metanolis (CH 3 OH) 99,8% (Chempur, Vokietija); 3. Natrio karbonatas (Na 2 CO 3 ) (Eurochemicals, Lietuva); 4. Folin - Ciocalteu reagentas (Sigma-Aldrich, Šveicarija); 5. Acto rūgštis (CH 3 COOH) 99% (Lachema, Čekija); 6. Heksametilentetraaminas (C 6 Hi 2 N 4 ) 99,5% (Sigma - Aldrich, Pietų Korėja); 7. Aliuminio chloridas (AlC1 3 *6H 2 O) (Lachema, Čekija); 8. Natrio acetatas (Fischer Scientific, JAV); 9. 2,2- difenil-1-pikrilhidrazil hidratas - laisvasis radikalas (DPPH) (Sigma - Aldrich, Vokietija); 10. Acetonitrilas (ACN) 99,8% (J.T. Baker, JAV); 11.Rutinas (Sigma, Vokietija). 12.Natrio chloridas. (Čekija. LACHEMA) 13.Natrio hidroksidas. (Slovakija. EUROCHEMICALS ). 14.Fosforo rūgštis. Koncentruota. Bendro fenolinių junginių kiekio įvertinimas 1.Pagaminamas pradinis tirpalas (Natrio karbonato Na 2 CO 3 10g ir 50 ml bidistiliuoto vandens). Tirpalas laikomas (-2C). 2.Propolio ekstaktas buvo skiedžiamas 100 kartų (100 µl ekstrakto ir 10ml 5% metanolio). 3.Standartinio tirpalo koncentracijos (0,01-1,00 mg/ml). 4.Matavimai standartinio tirpalo: 100 µl rutino tirpalo, 2500 µl bidistiliuoto vandens, 500 µl pradinio tirpalo ir 100 µl Folin-Ciocalteu reagento (2N) ir laikome 30 min kambario temperatūroje, poto matuojame 60 nm bangoje. 5.Tokia pačia procedūra buvo atlikta su propolio ekstraktais. Kiekvienos žaliavos trys ekstrakatai, kurių kiekvieno buvo atlikti spektrofotometriniai matavimai. Flavonoidų kiekio įvertinimas 1.Pradinio tirpalo pagaminimas ( 60ml metanolio 99%, 3ml acetatinės rūgšties 33%, 12ml heksametilentetramino 5%, 9ml aliuminio chloride 10% ir 60 ml bidistiliuoto vandens. Tirpalas laikomas (-2C). 29

2.Propolio ekstaktas buvo skiedžiamas 100 kartų (100 µl ekstrakto ir 10ml 5% metanolio). 3.Standartinio tirpalo koncentracijos (0,01-1,00 mg/ml). 4.Matavimai standartinio tirpalo: 80 µl rutino tirpalo, 1920 µl pradinio tirpalo ir laikome 30 min (-2C) temperatūroje, poto matuojame 40 nm bangoje. 5.Tokia pačia procedūra buvo atlikta su propolio ekstraktais. Kiekvienos žaliavos trys ekstrakatai, kurių kiekvieno buvo atlikti spektrofotometriniai matavimai. Radikalo surišimo aktyvumo nustatymas 1.Pagaminamas buferinis tirpalas, kurio ph turi būti 5.5 (1, 01 g natrio acetate ir 125 ml vandens). 2.DPPH radikalinis tirpalas: (0,005 g DPPH, 62 ml acetonitrilo, 62 ml metanolio). 3.Sumaišome buferinį tirpalą su DPPH radikaliniu tirpalu ir pamatuojame absorbcija, kuri turėtų būti ~0,600. 4.Rutino tirpalų koncentracijos turi būti (0,05-0,25 mg/ml) 5.Rutino kalibracinei kreivei: µl rutino tirpalo, 3000 µl bendro radikalinio tirpalo ir laikome kambario temperatūroje 15 minučių, po to matuojame 515 nm bangoje. 6.Ta pati procedūra atliekama ir su ekstrakaias, tik vietoj rutino pilamas ekstraktas. 2.4 Efektyvioji skysčių chromatografija su elektrocheminiu detektoriumi Skysčių chromatografas su elektrocheminiu detektoriumi: esa (Model 542) (Pagaminta: JAV) Elektrocheminis detektorius: esa (Coul Array) (Pagaminta: JAV) Kolonėlė: esa (Pagaminta: JAV) NAUDOTOS SĄLYGOS: Naudoti buferiai: A: 50 mm natrio dihidroksifosfatas ph 3 + 1% MeOH, B: 100 mm natrio dihidroksifosfatas ph 3 + acetonitrilas + MeOH (30:60:10 v/v). Gradientas: t.( min) B% 5 0 % 46 100 % 56 100 % 57 10 % 63 0 % Kolonėlė: Esa ( L=80mm x ID = 4,6mm, 120 A porų dydis); 30