LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS Artūras Blažaitis OKSIDUOTŲ DIDELIO TANKIO LIPOPROTEINŲ IR FIBRINOGENO REIKŠMĖ TROMBOCITŲ AKTYVUMUI Baigiamasis magistro darbas Darbo vadovė prof. dr. Aušra Mongirdienė Kaunas, 2018 m.
Turinys SANTRAUKA... 4 SUMMARY... 5 PADĖKA... 6 INTERESŲ KONFLIKTAS, ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS... 7 SANTRUMPOS... 8 ĮVADAS... 9 1. LITERATŪROS APŽVALGA... 10 1.1. Oksidantų susidarymo keliai... 10 1.2. Oksidantų reikšmė vystantis trombozei... 11 1.2.1. Oksidantų poveikis fibrinogenui... 11 1.2.2. Nitrotirozinas... 12 1.2.3. Baltymų nitrinimo mechanizmai... 12 1.2.4. DTL reikšmė trombocitų funkcijai... 13 1.2.5. Oksiduotas DTL... 14 1.3. Trombocitai ir arterinės trombozės vystymasis... 15 1.4. Lėtiniu širdies nepakankamumu sergančių pacientų hemostazės pokyčiai... 16 2. TYRIMO METODIKA... 17 2.1. Pacientų atranka... 17 2.2. Tiriamosios medžiagos surinkimas ir apdorojimas... 19 2.2.1. Kraujo serumo mėginiai... 19 2.2.2. Kraujo plazmos mėginiai... 20 2.3. Duomenų apdorojimas... 21 3. REZULTATAI... 22 3.1. Tiriamųjų charakteristika... 22 3.2. Rodmenų palyginimas tarp grupių... 22 3.3. Tirtų rodmenų sąsajos su vaistais... 24 2
3.4. Tirtų rodmenų tarpusavio sąsajos... 26 4. REZULTATŲ APTARIMAS... 30 IŠVADOS... 34 LITERATŪROS SĄRAŠAS... 35 PRIEDAI... 40 3
SANTRAUKA Magistro darbo autorius. Artūras Blažaitis Magistro darbo pavadinimas. Oksiduotų didelio tankio lipoproteinų ir fibrinogeno reikšmė trombocitų aktyvumui. Tyrimo tikslas: įvertinti oksiduotų DTL ir fibrinogeno reikšmę trombocitų agregacijos intensyvumui. Tyrimo uždaviniai: 1. Ištirti fibrinogeno ir oksidacijos produktų: oksiduotų didelio tankio lipoproteinų, ditirozino ir nitrotirozino koncentracijas, sergančiųjų lėtiniu širdies nepakankamumu kraujyje. 2. Ištirti trombocitų agregacijos intensyvumą sergančiųjų lėtiniu širdies nepakankamumu kraujyje. 3. Nustatyti sąsajas tarp fibrinogeno, oksiduotų didelio tankio lipoproteinų, ditirozino ir nitrotirozino koncentracijų bei trombocitų agregacijos intensyvumo. Tyrimo objektas. Tyrimui buvo atrinkta 60 ligonių, kurie buvo nuo 2017 m. kovo 31 d. iki 2018 m kovo 19 d. gydyti Lietuvos sveikatos mokslų univesiteto ligoninės Kardiologijos klinikoje dėl paūmėjusio lėtinio širdies nepakankamumo. Atlikta demografinių duomenų ir bendro kraujo tyrimo retrospektyvinė analizė. Taip pat ištirta pacientų lipidogramos, oksiduotų didelio tankio lipoproteinų ir nitrotirozino koncentracijos kraujo serume bei ditirozino, fibrinogeno koncentracijos ir trombocitų agregacijos intensyvumas kraujo plazmoje. Tyrimo metodai. Lipidų koncentracijai nustatyti buvo naudojami standartiniai metodai su Synchron DxC 800 (Beckman Coulter) analizatoriumi. Oksiduoto didelio tankio lipoproteinų ir nitrotirozino koncentracijos buvo tiriamos imunofermentiniu ELISA metodu. Trombocitų agregacija buvo nustatoma trombocitais turtingoje plazmoje naudojant agregometrą (Chrono-Log, JAV) standartiniu Borno metodu. Netrombocitonėje plazmoje nustatoma fibrinogeno koncentracija Clauss metodu, naudojamas analizatorius STA Compact Max. Ditirozino koncentracija buvo tiriama spektrofluorimetru Perkin Elmer LS-55. Statistinei duomenų analizei naudotas Mann-Whitney U ir Spearman koreliacijos testai. Rezultatai ir išvados. Didžiausia ditirozino koncentracija rasta IV funkcinės klasės ligonių grupėje. Rasta tendencija: didėjant pacientų NYHA funkcinei klasei, tolygiai didėja oksiduotų didelio tankio lipoproteinų koncentracija. Fibrinogeno ir nitrotirozino koncentracijos tarp tiriamųjų grupių reikšmingai nesiskyrė. Trombocitų agregacija intensyviausia rasta NYHA III grupėje. Nitrotirozino koncentracija tiesiogiai koreliavo su oxdtl ir atvirkščiai su DTL koncentracija. Ditirozino koncentracija koreliavo su VTT. Trombocitų agregacijos intensyvumas tiesiogiai koreliavo su trombocitų skaičiumi ir neigiamai su ditirozino koncentracija. 4
SUMMARY Author of Master Thesis. Artūras Blažaitis Full title of Master Thesis. Significance of oxidative high density lipoproteins and fibrinogen in platelet activity. The aim of study was to evaluate the effect of oxidized HDL and fibrinogen on platelet aggregation intensity. Objectives. 1. Measure the concentrations of oxidized high density lipoproteins, fibrinogen, dityrosine and nitrotyrosine in patiens with chronic heart failure. 2. Measure the intensity of platelet aggregation in patients with chronic heart failure. 3. To establish correlations between the concentrations of oxidized high density lipoproteins, fibrinogen, dityrosine and nitrotyrosine and the intensity of platlet aggregation. Patients and methods. For the study, 60 patients were selected which were treated from March 31, 2017 to March 19, 2018 at the Cardiology Clinic of the Lithuanian University of Health Sciences due to the exacerbation of chronic heart failure. Retrospective analysis of total blood test and demography data was done. Concentration of lipids were measured using standard methods by Synchron DxC 800 (Beckman Coulter) analyzer. Oxidative high density lipoproteins and nitrotyrosine concentrations were measured using ELISA method. Platelet aggregation was detected in platelet-rich plasma using an aggregator (Chrono-Log, USA) by standard Born method. In platelet-poor plasma was measured fibrinogen concentration using the Clauss method by STA Compact Max analyzer. Concentration of dityrosine was measured using the Perkin Elmer LS-55 spectrofluorometer. Mann-Whitney U and Spearman s correlation tests were used for statistical analysis. Results and conclusions. The highest dityrosine concentration was found in the IVth function group. A trend has been found: the increase of NYHA functional class increases the oxidized high density lipoprotein concentracion. There were no significant correlation found between fibrinogen and nitrotyrosine concentrations. The most intensive platlet aggregation was found in NYHA IIIrd group. The concentration of nitrotyrosine was directly correlated with oxdtl, and negatively correlated with DTL concentration. Dityrosine directly correlated with MPV. There were direct correlation between platelet aggregation intensity with platelet count and negatively correleted with dityrosine concentration. 5
PADĖKA Darbo autorius nuoširdžiai dėkoja medicinos studijų studentams Renatui Treiniui ir Evelinai Sabeckytei padedant atrinkti tiriamuosius pacientus. Medicinos biologo asistentui Viliui Skipskiui atliekant trombocitų agregacijos tyrimus. Laboratorinės medicinos klinikos dėstytojai Rasai Steponavičiūtei nagrinėjant tyrimų metodikas bei organizuojant tyrimų atlikimą. Bei darbo vadovei prof. dr. Aušrai Mongirdienei už puikų darbo organizavimą ir pagalbą rašant baigiamąjį darbą. 6
INTERESŲ KONFLIKTAS, ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS Autoriui interesų konflikto nebuvo. Etikos komiteto pavadinimas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Bioetikos centras Leidimo numeris BEC-LMB(M)-174 Leidimo išdavimo data 2016-12-22 1 priedas. 7
SANTRUMPOS ADP adenozino difosfatas ADR adrenalinas ApoAI apolipoproteinas AI DKS diastolinis kraujo spaudimas DTL didelio tankio lipoproteinai FpA fibrinopeptidas A FpB fibrinopeptidas B GP glikoproteinas KSIF kairiojo skilvelio išmetimo frakcija LMTL labai mažo tankio lipoproteinai LP lipoproteinai LŠN lėtinis širdies nepakankamumas MPO mieloperoksidazė MTL mažo tankio lipoproteinai NYHA Niujorko širdies asociacija (angl. New York Heart Association) oxdtl oksiduoti didelio tankio lipoproteinai p statistinis reikšmingumas R Spearman koreliacijos koeficientas RDR reaktyvios deguonies rūšys SKS sistolinis kraujo spaudimas TxA2 tromboksanas A2 VTL vidutinio tankio lipoproteinai VTT vidutinis trombocitų tūris vwf von Willebrand o faktorius 8
ĮVADAS Pacientams, sergantiems lėtiniu širdies nepakankamumu (LŠN) 11 44 % pasitaiko trombozinės komplikacijos (1). Manoma, kad viena iš komplikacijų priežasčių gali būti didesnis susidarančių oksidantų kiekis kraujyje asmenims, kurie serga širdies ir kraujagyslių ligomis (2,3). Normaliomis sąlygomis oksidantų žmogaus organizme susidaro kaip normalaus metabolizmo metu, tačiau patofiziologinėmis sąlygomis jų kiekis padidėja (4). Oksidantai gali aktyvinti trombocitus. Viena iš grandžių oksiduoto fibrinogeno susidarymas, kas lemia nitrotirozino ir ditirozino koncentracijos padidėjimą kraujyje (5,6). Fibrinogenas yra baltymas, per kurį trombocitai jungiasi tarpusavyje, todėl oksiduota jo forma galėtų lemti agregacijos intensyvumo pokyčius (7). Kita iš grandžių poveikis trombocitams per lipoproteinus. Didelio tankio lipoproteinai (DTL) slopina trombocitų aktyvumą per SR-B1 receptorių. Maža DTL koncentracija kraujyje siejama su didesne širdies ir kraujagyslių ligų rizika (8). Ne tik dėl reikšmės vystantis aterosklerozei randama ir daugiau DTL funkcijų: priešuždegiminė, antitrombozinė ir antioksidacinė (9). Yra manoma, kad pacientams, sergantiems širdies ir kraujagyslių ligomis, viena iš trombozinių komplikacijų priežasčių gali būti ta, kad oksiduota DTL forma nebegali jungtis prie SR-B1 receptorių ir dėl to negali slopinti trombocitų (10 12). Atradus sąsajų tarp oksiduotų DTL ir fibrinogeno koncentracijos bei trombocitų agregacijos rodmenų, galima būtų pagrįsti DTL antitrombotinį poveikį. Tai galėtų keisti ir gydymo strategiją mažinant trombotinių komplikacijų riziką antioksidantais. Darbo tikslas įvertinti oksiduotų DTL ir fibrinogeno reikšmę trombocitų agregacijos intensyvumui. Darbo uždaviniai: 1. Ištirti fibrinogeno ir oksidacijos produktų: oksiduotų didelio tankio lipoproteinų, ditirozino ir nitrotirozino koncentracijas, sergančiųjų lėtiniu širdies nepakankamumu kraujyje. 2. Ištirti trombocitų agregacijos intensyvumą sergančiųjų lėtiniu širdies nepakankamumu kraujyje. 3. Nustatyti sąsajas tarp fibrinogeno, oksiduotų didelio tankio lipoproteinų, ditirozino ir nitrotirozino koncentracijų bei trombocitų agregacijos intensyvumo. 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA 1.1. Oksidantų susidarymo keliai Oksidantai formuojasi kaip normalus aerobinio metabolizmo produktas, tačiau patofiziologinėmis sąlygomis šių medžiagų kiekis didėja (4). Reaktyvios deguonies rūšys (RDR) labai reaktyvios molekulės, kurios žmogaus organizme susidaro dėl normalaus ląstelių metabolizmo ir aplinkos veiksnių. Šios molekulės gali pažeisti nukleino rūgštis ir baltymus, o todėl gali kisti jų funkcijos (13,14). RDR priskiriama - superoksido anijono radikalas ( O _ 2 ), vandenilio peroksidas (H2O2) ir hidroksilo radikalas ( OH). Šios molekulės susidaro tarpiniuose etapuose kuomet yra redukuojamas deguonis. Deguonies radikalų gali susidaryti lipiduose kaip alkilo ar peroksilo radikalai. Taip pat, biologinėse sistemose randamas vienas iš dujinių radikalų azoto oksidas. Azoto oksidas sąveikaudamas su superoksido anijono radikalu sudaro peroksinitritą. Ši molėkulė neturi laisvo radikalo, tačiau yra stiprus oksidantas (4). Dauguma oksidantų yra endogeninės kilmės, kitaip tariant, juos gamina pačios organizmo ląstelės. Įprasto aerobinio kvėpavimo metu, mitochondrijos naudoja deguonį ir redukuoja jį iki vandens (1 pav.) (4,15). 1.1. pav. Normalaus metabolizmo oksidantų susidarymo reakcija. O _ 2, H2O2 ir OH susidarymas vyksta nuosekliai jungiantis elektronams prie O2. Reakcijoje dalyvauja citochromo oksidazė, kuri ir prijungia elektronus, o energiją gamina mitochondrijos. Pritaikyta iš (15). Leukocitai ir kitos fagocituojančios ląstelės kovoja su bakterijomis, parazitais ir virusais infekuotomis ląstelėmis naudodamos oksidantų mišinį, sudarytą iš NO, O _ 2, H2O2 ir HOCl. Šie oksidantai apsaugo žmogaus organizmą nuo patogenų invazijos, tačiau gali iššaukti oksidacinius DNR pažeidimus ir sąlygoti mutacijas, kurios gali prisidėti prie kancerogeninio proceso (15). Hipochloritinė rūgštis (HOCl) svarbi imuninės sistemos veikloje. Šis oksidantas pagaminamas leukocito viduje, chloro jonus oksiduojant su vandenilio peroksidu, veikiant mieloperoksidazei, kuri katalizuoja šią reakciją. HOCl taip pat yra priskiriama RDR, nes yra O2 metabolito H2O2 produktas (16). Mažas šių medžiagų kiekis yra naudingas žmogaus organizmui, tačiau pertėklius gali sąlygoti rimtus sveikatos sutrikimus. 10
1.2. Oksidantų reikšmė vystantis trombozei Trombozė tai susidaręs kraujo krešulys, kai to nereikia. Normoje krešuliai susidaro pažeidus kraujagyslę siekiant išvengti nukraujavimo. Trombų formavimąsi sąlygoja daugybė veiksnių: amžius, vaistų vartojimas, gretutinės ligos, gyvenimo būdas. Taip pat vienas iš veiksnių gali būti oksidantai, kurie gali keisti krešėjimo procese dalyvaujančių baltymų struktūrą ir funkciją. Trombocitai agreguoja kibdami vienas su kitu per fibrinogeno molekules, todėl fibrinogenas svarbus kraujo krešėjimo sistemoje. Jis taip pat gali būti paveiktas oksidantų (2,3). 1.2.1. Oksidantų poveikis fibrinogenui Fibrinogenas gaminamas hepatocituose ir išskiriamas į kraują, kur šio baltymo gyvavimo puslaikis yra maždaug 3 dienos. Fibrinogenas yra 340 kda baltymas, sudarytas iš dviejų porų trijų skirtingų grandinių, kurios vadinamos Aα, Bβ ir γ. Tai hemostazėje svarbiausias baltymas. Fibrinogeną taip pat gali oksiduoti oksidantai. Oksiduoto fibrinogeno struktūra ir funkcija gali keistis (7,17). Fibrinogeno virtimas fibrinu pasireiškia fibrinogeno skilimu į fibrino monomerus ir fibrinopeptidus. Fibrino monomerai sukimba ir sudaro fibrino krešulį. XIIIa krešėjimo faktorius, kuris yra trombino suaktyvinta XIII faktoriaus forma, prisijungia prie fibrino. Fibrino jungtims susidaryti yra reikalingi ir kalcio jonai. Fibrinogeno oksidacijos metu susidaro ditirozino kryžminiai ryšiai ir, priklausomai nuo oksidanto dozės, padidėja karbonilų kiekis molekulėje. Oksiduojant fibrinogeno molekulę, oksiduojamos tam tikros aminorūgštys: histidinas, prolinas, argininas ir lizinas. Mokslininkai, tyrinėdami oksiduoto fibrinogeno savybes, šį baltymą oksiduoja įvairiais oksidantais. Fibrinogeną oksiduojant geležies askorbatu, pailgėja fibrinopeptido A (FpA) ir fibrinopeptido B (FpB) atpalaidavimo laikas, dėl šios priežasties yra uždelsiama fibrino polimerizacija ir tai pakeiča susidariusią fibrino struktūrą (18). Fibrinogeno oksidacija hipochloritu (HOCl) sumažina fibrino polimerizacijos stiprumą. Yra nustatyta, kad veikiant fibrinogeną HOCl yra oksiduojamos trys metionino liekanos, Met 476, Met 367 ir Met 78, kurios atitinkamai išsidėsčiusios Aα, Bβ ir γ grandinėse. Dažniausiai oksiduojamas Met 476 ir būtent dėl šio metionino oksidacijos krešulio pluoštas tampa plonesnis, o tankis didesnis (19). Nitrinto fibrinogeno koncentracija siejama su vainikinių arterijų ligomis, jo koncentracija didėja esant veninėms tromboembolijoms. Apskritai padidėjusi nitrinto fibrinogeno koncentracija siejama su arterijų ir venų trombozėmis (20). Nitrinimas vyksta per tirozino aminorūgštis, kurių yra fibrinogeno β grandinėje. Iš nitrinto fibrinogeno sudarytam krešuliui būdingi stori, susukti pluoštai, 11
didelės poros. Kai kuriose studijose teigiama, jog in vitro bandymuose, lyginant fibrinogeną su nitrintu fibrinogenu, nerandama jokių fibrinolizės greičio, ar susidariusių produktų skirtumų. Taip pat nepastebima jokios įtakos trombocitų agregacijai. Tačiau, tose pačiose studijose teigiama, kad nitrintas fibrinogenas pagreitina krešulio susidarymą (19). 1.2.2. Nitrotirozinas Tai - aminorūgšties tirozino oksidacinė modifikacija, kurios metu prie tirozino molekulės hidroksifenilo žiedo yra prijungiama nitro grupė. Ateroskleroze sergančių pacientų kraujagyslių pažeidimų vietose ir kraujo plazmoje yra randami pakitę baltymai, kurių struktūroje aptinkamas nitrotirozinas. Nepaisant to, kad nitrinimo išeiga yra ganėtinai žema, epidemiologinės studijos rodo reiškmingą koreliaciją tarp nitrintų plazmos baltymų koncentracijos ir širdies ir kraujagyslių ligų. Nitrotirozino koncentracija gali būti tiriama, siekiant prognozuoti ligos vystymąsį ar sprendžiant gydymo klausimus aterosklerozės atveju (5,6,21,22). 1.2.3. Baltymų nitrinimo mechanizmai Baltymų nitrinimas susideda iš dviejų etapų (1.2. pav.). Pirmame etape vienas vandenilio atomas atskeliamas nuo fenolio žiedo ir laikinai susiformuoja tirozilo radikalas (Tyr ). Antrojo etapo metu, azoto dioksido radikalas ( NO2) jungiasi prie tirozilo radikalo ir susiformuoja nitrotirozinas. 1.2. pav. Nitrotirozino susidarymo schema. Pritaikyta iš (22). 12
Pirmąjį oksidacijos etapą gali sukelti ne vienas, o keli oksidantai hidroksilo radikalas ( OH), azoto dioksido radikalas ( NO2), karbonilo radikalas ( CO _ 3 ), iš lipidų kilęs alkilas (LO ) ir peroksilo radikalas (LOO ) (22). Pirmieji trys oksidantai yra gauti produktai vykstant eilei reakcijų, kur reakcijos pradžią inicijuoja radikalai, atsiradę normalaus ląstelių metabolizmo būdu (23). Azoto oksido radikalas sąveikauja su superoksido anijono radikalu ir sudaro peroksinitritą. NO + O 2 ONOO (1) Pastarasis jungiasi su vandeniliu ir išskiria hidroksilo ir azoto dioksido radikalus. ONOO + H + OH + NO 2 (2) Taip pat, peroksinitritas gali jungtis su anglies dioksidu ir tokiu būdu susidaro azoto dioksido bei karbonilo radikalai. ONOO + CO 2 NO 2 + CO 3 (3) Tuo tarpu, mieloperoksidazė gali inicijuoti abu etapus, nes išskiria didesnį kiekį NO2 (5,21,22). Kadangi šie oksidantai yra reikšmingi nitrotirozino susidarymui, tad tiriant nitrotirozino koncentraciją, galima atrasti sąsajų tarp oksidantų ir trombocitų agregacijos intensyvumo. 1.2.4. DTL reikšmė trombocitų funkcijai Lipoproteinai (LP) yra dalelės, susidedančios iš lipidų ir baltymų, kurie laikosi kartu nekovalentinių ryšių pagalba. Žinomos 5 pagrindinės LP rūšys: didelio tankio lipoproteinai (DTL), mažo tankio lipoproteinai (MTL), chilomikronai, labai mažo tankio lipoproteinai (LMTL) ir vidutinio tankio lipoproteinai (VTL). Lipidų koncentracijos pokyčiai kraujyje lemia daugybės ligų atsiradimą ir vystymąsį. Didelė MTL koncentracija kraujyje siejama su širdies ir kraujagyslių ligomis. Mažo tankio lipoproteinų dalelės kaupiasi arterijose ir laikui begant gali suformuoti aterosklerozines plokšteles. Aterosklerozė padidina isulto, širdies ar kraujagyslių ligų išsivystymo tikimybę. DTL šalina cholesterolį iš arterijų ir gražina jį į kepenis, todėl dėl šios ir kitų širdies apsauginių savybių neretai yra vadinamas,,geruoju cholesteroliu (24 26). Teigiama, jog DTL būdingas antioksidacinis, priešuždegiminis ir antitrombotinis poveikis (9). DTL antitrombotinis aktyvumas pasireiškia tiesiogiai veikiant trombocitus juos slopinant (27). Slopinimas vyksta jungiantis DTL prie B klasės I tipo receptoriaus, kuris vadinamas (angl. Scavenger receptor class B type I (SR-BI)). Antritrombotinės ypatybės siejamos ir su krešėjimo kaskados slopinimu 13
bei krešulio fibrinolize. Be to, DTL skatina išskirti azoto oksidą ir prostacikliną, kurie stipriai slopina trombocitus (8). SR-BI yra pagrindinis didelio tankio lipoproteinų receptorius, kurio yra ant įvairių ląstelių paviršiaus, įskaitant hepatocitus ir endotelio ląsteles. Šis receptorius yra transmembraninis baltymas ir priklauso CD36 super šeimai. Prie SR-BI receptoriaus gali jungtis labai įvairūs ligandai, įskaitant natyvinius ir oksiduotus lipoproteinus (28). Be to, SR-BI yra randama ir ant žmogaus trombocitų paviršiaus. Sumažėjęs šių receptorių kiekis siejamas su suintensyvėjusia trombocitų agregacija (27). 1.2.5. Oksiduotas DTL Esančios kraujyje RDR oksiduoja ir DTL esančius darinius. Taip susidarę oksiduoti didelio tankio lipoproteinai (oxdtl) praranda savo savybes slopinti trombocitus. Nustatyta, kad DTL oksidavimui svarbus neutrofilų fermentas mieloperoksidazė, lemianti RDR susidarymą (25). ApoAI oksidacija vyksta per tirozino molekules jas nitrinant (NO2-Tyr) ir chlorinant (Cl-Tyr). Būtent šių oksiduotų komponentų kiekis ženkliai padidėja pacientams, kurie serga koronarine širdies liga (11,12). Oksidacijos metu pakinta DTL sudėtis, dėl to prarandama DTL funkcija slopinti trombocitus (1.3. pav.). Šie pokyčiai siejami su padidėjusia aterosklerozės ir koronarinės širdies ligos rizika. 1.3. pav. DTL pokyčių oksidacijos metu schema. DTL vidiniai komponentai yra esterifikuotas cholesterolis (CE) ir nedidelis kiekis trigliceridų (TG). Išorinį DTL sluoksnį sudaro laisvasis cholesterolis (FC), ApoAI, paraoksonazė (PON1), fosfolipidai (PL) ir kiti įvairūs baltymai. Kuomet DTL praranda savo funkciją, padidėja TG kiekis, sumažėja PON1 kiekis, sumažėja ApoAI kiekis bei tampa oksiduota forma, į išorinį sluoksnį įterpiama MPO ir baltymas serumo amiloidas A (SAA) ir fosfolipidai tampa oksiduota forma (OxPL). Pritaikyta iš (10). 14
1.3. Trombocitai ir arterinės trombozės vystymasis Pirminė trombocitų funkcija yra po sužalojimo užsandarinti pažeistą kraujagyslės sienelę ir stimuliuoti atstatomąsias endotelio savybes (29). Po endotelio pažeidimo iš Weibel-Palade kūnelių, kurie yra endotelyje, išskiriamas ir paleidžiamas į cirkuliaciją von Willebrand o faktorius (vwf), kuris subendotelyje prilimpa prie kolageno pažeistame plote. Trombocitai gali susijungti su imobilizuotu vwf per glikoproteino Ib-V-IX (GPIb-V-IX) kompleksą, kuris yra ant trombocito membranos. Ši vwf ir GPIb-V-IX sąveika yra trumpalaikė ir sukibimas yra nestabilus, tačiau sąveika inicijuoja trombocitų aktyvinimą. Tai lemia tolesnę papildomų receptorių sąveiką, tokių kaip integrinų αiibβ3, α2β1, ir GPVI su vwf ir kolagenu, atitinkamai šios sąveikos sąlygoja tvirtesnį trombocitų sukibimą. Aktyvuoti trombocitai išskiria savo granulių turinį, tame tarpe ir trombocitus aktyvuojančią medžiagą tromboksaną A2 (TxA2). Tolesnis trombocitų prikibimo stabilizavimas pažedimo vietoje užtikrinamas dėl kitų trombocitų aktyvinimo. Aktyvuoti trombocitai sudaro paviršių jungtis kitiems trombocitams. Trombocitai jungiasi per fibrinogeną, kuris yra susijungęs su skirtingų trombocitų paviršiuje esančiais integrinais αiibβ3. Tokiu būdu yra sukeliama trombocitų agregacija (1.4. pav.) (8). 1.4. pav. Trombocitų adhezijos ir agregacijos schematinis vaizdas po kraujagyslės pažeidimo. 1) Normaliomis sąlygomis, trombocitai cirkuliuoja ramybės būsenoje. 2) Po endotelio pažeidimo, plazmos vwf prisijungia prie kolageno pažeistame plote. Ši sąveika inicijuoja cirkuliuojančius trombocitus susijungti su GPIb-V-IX kompleksu ant trombocitų membranos. 3) Trumpalaikė sąveika sulėtina trombocitus ir jie pasklinda virš pažeistos kraujagyslės sienelės vietos. Sąveiką tarp trombocito ir kolageno sutvirtina integrinas α2β1. Kuomet GPVI susijungia su kolagenu, tai lemia tolimesnę trombocitų aktyvaciją. 4) Aktyvuoti trombocitai deformuojasi ir sukuria tokią formą, kad galėtų prisijungti kiti trombocitai. 5) Po aktyvacijos, trombocitai atpalaiduoja savo granulių turinį (pvz., ADF), toliau sintetina ir atpalaiduoja trombocitus aktyvuojančią medžiagą TxA2. 5) Integrinas αiibβ3 savo aktyvioje formoje jungiasi su fibrinogenu ir ši sąveika sukuria tiltą tarp dviejų aktyvuotų trombocitų. Pritaikyta iš (8). 15
1.4. Lėtiniu širdies nepakankamumu sergančių pacientų hemostazės pokyčiai Nustatyta, kad pacientų sergančių lėtiniu širdies nepakankamumu (LŠN), kraujo krešėjimo sistema yra aktyvesnė. Tai gali padidinti arterijų ir venų tromboembolijų atsiradimo tikimybę. Endotelio pažeidimas ar disfunkcija yra vienas iš ženklų LŠN atvejais. Tokiems pacientams yra nustatomas fibrinogeno, VIII faktoriaus - vwf komplekso ir D-dimerų koncentracijos padidėjimas. Fibrinogeno ir vwf padidėjimas siejamas su neigiama prognoze, pavyzdžiui prieširdžių virpėjimo sutrikimu, o tai yra pagrindinis rizikos veiksnys širdies nepakankamumo atveju. Taip pat šių kraujo krešėjimo žymenų padidėjimas yra susijęs su padidėjusia koronarinės širdies ligos rizika (1,30,31). Pagal (32) autorius yra pateikiama 1.1 lentelė, kurioje nuorodyti hemostazės pokyčiai, kur pacientų sergančių LŠN rezultatai lyginami su sveikais asmenimis. 1.1 lentelė. Lėtiniu širdies nepakankamumu sergančių pacientų trombocitų aktyvumo rodmenų pokyčiai lyginant su sveikais asmenimis (pritaikyta iš (32)). Trombocitų aktyvumo žymenys Stebimas pokytis β-tromboglobulinas Osteonektinas vwf Trombocitų faktorius 4 P-selektinas Tromboksanas Trombocitų agregacija Kadangi trombocitai agreguodami kimba vieni su kitais per fibrinogeno molekules, oksidantų paveiktos šios molekulės galėtų lemti agregacijos intensyvumo pokyčius. Tiriant oxdtl ir fibrinogeno oksiduotas formas galima tikėtis atrasti sąsajų su DTL bei trombocitų agregacijos rodmenimis. 16
2. TYRIMO METODIKA 2.1. Pacientų atranka Tyrimui buvo atrinkti tik tie ligoniai, kurie buvo nuo 2017 m. kovo 31 d. iki 2018 m. kovo 19 d. gydyti LSMU ligoninės Kardiologijos klinikoje dėl paūmėjusio LŠN. Šie pacientai per paskutines dvi savaites nevartojo antiagregantų ir nebuvo kitų trombocitų agregacijos įtakojančių veiksnių. Lėtinio širdies nepakankamumo diagnozė nustatoma remiantis diagnostikos ir širdies nepakankamumo gydymo gairėmis, kurias yra patvirtinusi Europos kardiologų draugija (angl. The European Society of Cardiology). Buvo renkami II-IV funkcinės klasės pagal NYHA (angl. The New York Heart Association) klasifikaciją pacientai. Ši klasifikacija grupuoja pacientus nuo pirmos iki ketvirtos kategorijos ir yra paremta pacientų apribojimai fizinio aktyvumo metu (33): I klasė Nepasireiškia jokie simptomai ir jokie apribojimai įprasto fizinio aktyvumo metu. Pavyzdžiui, silpnas dusulys vaikštant, lipant laiptais ir pnš. II klasė Lengvi simptomai (lengvas dusulys ir/ar angina) ir nedideli apribojimai įprasto fizinio aktyvumo metu. III klasė Juntami ryškūs apribojimai fizinio aktyvumo metu, dusulys pasireiškia nuėjus 20-100 metrų. Patogu tik ramybės būsenoje. IV klasė Dideli apribojimai. Simptomai jaučiami net ramybės būsenoje. Dažniausiai lovoje gulintys pacientai. Tyrime sutikę dalyvauti pacientai buvo 23 87 metų amžiaus. Kiekvienoje grupėje buvo po 20 pacientų (2.1 lentelė). 2.1 lentelė. Tirtos imties charakteristika. Rodmuo Funkcinė grupė Skirtumo patikimumo palyginimas tarp grupių, p reikšmė NYHA II N = 20 Lytis Vyrai = 13 Moterys = 7 Amžius, metais Med. = 63,5 Min. = 23 Max. = 87 SKS, mm Hg Med. = 130 Min. = 102 Max. = 169 NYHA III N = 20 Vyrai = 10 Moterys = 10 Med. = 68 Min. = 38 Max. = 82 Med. = 131 Min. = 100 Max. = 168 NYHA IV N = 20 Vyrai = 11 Moterys = 9 Med. = 69,5 Min. = 44 Max. = 87 Med. = 133,5 Min. = 90 Max. = 176 NYHA II ir NYHA III NYHA III ir NYHA IV NYHA II ir NYHA IV 0,262 0,500 0,374 0,308 0,275 0,112 0,454 0,487 0,428 17
DKS, mm Hg Med. = 80 Min. = 68 Max. = 109 Trombozių komplikacijos Buvo = 3 (15 %) Nebuvo = 17 (85 %) TRM, x 10 9 /l Med. = 225 Min. = 113 Max. = 499 VTT, fl Med. = 10,95 Min. = 7,70 Max. = 12,80 LEU, x 10 9 /l Med. = 6,02 Min. = 4,30 Max. = 14,60 NE, x 10 9 /l Med. = 3,79 Min. = 3,20 Max. = 5,17 LY, x 10 9 /l Med. = 1,17 Min. = 0,60 Max. = 1,91 MO, x 10 9 /l Med. = 0,64 Min. = 0,25 Max. = 0,82 KSIF, % Med. = 45 Min. = 23 Max. = 55 AKFi vartojimas Vartojo = 13 (65 %) = 7 (35 %) Beta blokatorių vartojimas Diuretikų vartojimas Nitratų vartojimas Heparino vartojimas Kalcio kanalų blokatorių vartojimas Vartojo = 12 (60 %) = 8 (40%) Vartojo = 4 (20 %) = 16 (80%) Vartojo = 1 (5 %) = 19 (95%) Vartojo = 0 (0 %) = 20 (100 %) Vartojo = 1 (5 %) = 19 (95%) Med. = 80 Min. = 60 Max. = 112 Buvo = 1 (5 %) Nebuvo = 19 (95 %) Med. = 222,5 Min. = 126 Max. = 304 Med. = 10,85 Min. = 9,60 Max. = 12,60 Med. = 80 Min. = 60 Max. = 112 Med. = 3,82 Min. = 2,35 Max. = 4,36 Med. = 1,41 Min. = 0,72 Max. = 2,60 Med. = 0,60 Min. = 0,35 Max. = 1,27 Med. = 40 Min. = 10 Max. = 55 Vartojo = 12 (60 %) = 8 (40 %) Vartojo = 10 (50 %) = 10 (50 %) Vartojo = 9 (45 %) = 11 (55 %) Vartojo = 2 (10 %) = 18 (90 %) Vartojo = 0 (0 %) = 20 (100 %) Vartojo = 1 (5 %) = 19 (95 %) Med. = 80 Min. = 60 Max. = 94 Buvo = 4 (20 %) Nebuvo = 16 (80 %) Med. = 202 Min. = 86 Max. = 713 Med. = 11,45 Min. = 10,20 Max. = 12,50 Med. = 80 Min. = 60 Max. = 94 Med. = 3,75 Min. = 2,94 Max. = 4,90 Med. = 1,19 Min. = 0,63 Max. = 1,85 Med. = 0,69 Min. = 0,26 Max. = 1,08 Med. = 25,5 Min. = 10 Max. = 55 Vartojo = 11 (55%) = 9 (45 %) Vartojo = 7 (35 %) = 13 (65 %) Vartojo = 4 (20 %) = 16 (80 %) Vartojo = 1 (5 %) = 19 (95 %) Vartojo = 1 (5 %) = 19 (95 %) Vartojo = 3 (15 %) = 17 (85 %) 0,095 0,278 0,229 0,322 0,187 0,500 0,492 0,193 0,107 0,356 0,043 0,018 0,407 0,497 0,228 0,237 0,159 0,439 0,038 0,044 0,465 0,434 0,241 0,102 0,044 0,019 <0,001 0,500 0,264 0,170 0,376 0,262 0,102 0,088 0,088 0,653 0,500 0,500 0,756 1,000 0,500 0,500 0,756 0,302 0,302 18
CD skirtų vaistų vartojimas Digoksino vartojimas MMMH vartojimas Tiroksino vartojimas Insulino vartojimas Varfarino vartojimas Vartojo = 0 (0 %) = 20 (100 %) Vartojo = 0 (0 %) = 20 (100 %) Vartojo = 1 (5 %) = 19 (95 %) Vartojo = 0 (0 %) = 20 (100%) Vartojo = 1 (5 %) = 19 (95 %) Vartojo = 3 (15 %) Vartojo = 1 (5 %) = 19 (95 %) Vartojo = 6 (30 %) = 14 (70 %) Vartojo = 3 (15 %) = 17 (85 %) Vartojo = 3 (15 %) = 17 (85 %) Vartojo = 0 (0 %) = 20 (100%) Vartojo = 7 (35 %) = 13 (65 %) Vartojo = 0 (0 %) = 20 (100 %) Vartojo = 3 (15 %) = 17 (85 %) Vartojo = 1 (5 %) = 19 (95 %) Vartojo = 0 (0 %) = 20 (100%) Vartojo = 2 (10 %) = 18 (90 %) Vartojo = 3 (15 %) 0,500 0,500 1,000 0,010 0,225 0,115 0,302 0,302 0,756 0,115 0,115 1,000 0,500 0,244 0,500 0,137 0,137 0,669 = 17 (85 %) = 17 (85 %) SKS sistolinis kraujo spaudimas; DKS diastolinis kraujo spaudimas; TRM trombocitų skaičius; VTT vidutinis trombocitų tūris; LEU leukocitų skaičius; NE neutrofilų skaičius; LY limfocitų skaičius; MO monocitų skaičius; AKFi angiotenziną konvertuojančio fermento inhibitoriai; CD cukrinis diabetas; MMMH mažos molekulinės masės heparinas; KSIF kairiojo skilvelio išmetimo frakcija; N tiriamųjų skaičius; Med. rezultatų mediana; Min. mažiausias rezultatas imtyje; Max. didžiausias rezultatas imtyje. 2.2. Tiriamosios medžiagos surinkimas ir apdorojimas Pacientų kraujo ėminiai buvo imami ryte, kai prieš tai pacientai buvo nevalgę 8-12 valandų. 2.2.1. Kraujo serumo mėginiai Ėminiai, skirti gauti kraujo serumui, buvo imami į vakuminius mėgintuvėlius (5 ml) su koaguliacijos aktivatoriais. Kraujui sukrešėjus po 15 min., mėginiai buvo centrifuguojami 20 min. prie 1000x g (3000 aps./min. greičiu) kambario temperatūroje. Lipidų koncentracijai nustatyti buvo naudojami standartiniai metodai su Synchron DxC 800 (Beckman Coulter) analizatoriumi. 19
Naudoti reagentai: Bendrai cholesterolio koncentracijai - SYNCHRON SYSTEMS Cholesterol reagent REF 467825; DTL koncentracijai - SYNCHRON SYSTEMS HDLD Cholesterol reagent REF650207; MTL koncentracijai - SYNCHRON SYSTEMS direct LDLD Cholesterol reagent REF969706; Triacilglicerolio koncentracijai - SYNCHRON SYSTEMS Triglycerides GPO REF445850. Likusi serumo dalis buvo užšaldoma -80 ºC temperatūroje tolimesniems tyrimams. Surinkus pakankamai pacientų, tiriamosios medžiagos buvo atšildytos. Oksiduoto didelio tankio lipoproteinų ir nitrotirozino koncentracijos buvo tiriamos serume imunofermentiniu metodu naudojant atitinkamus reagentų rinkinius: Human oxidized high density lipoprotein (Ox-HDL0 ELISA Kit CSB-E16552h (Cusabio biotech Co, Kinija) ir Nitrotyrosin ELISA K7829 (immune diagnostic AG). 2.2.2. Kraujo plazmos mėginiai Trombocitų agregacijos tyrimui, kraujo ėminiai buvo imami į 3,5 ml vakuminius mėgintuvėlius su 3,8 proc. natrio citratu. Tyrimui buvo reikalinga trombocitinė ir netrombocitinė plazmos. Norint paruošti trombocitais turtingą plazmą, mėgintuvėliai buvo centrifuguojami 15 min. prie 100x g (1000 aps./min. greičiu) kambario temperatūroje. Trombocitais neturtinga plazma paruošiama likusį kraują centrifuguojant 30 min. prie 1000x g (3000 aps./min. greičiu) kambario temperatūroje. Trombocitų agregacija buvo nustatoma trombocitais turtingoje plazmoje naudojant agregometrą (Chrono-Log, JAV) standartiniu Borno metodu (34). Naudoti reagentai: adenozino difosfatas - ADP (3,8 mmol/l; Chrono-Log P/N 384) ir adrenalinas - ADR (4,5 mmol/l). Netrombocitonėje plazmoje nustatoma fibrinogeno koncentracija Clauss metodu, naudojamas analizatorius STA Compact Max, naudojant reagentus STA Fibrinogen (Diagnostica Stago). Ditirozino koncentracija buvo tiriama spektrofluorimetru Perkin Elmer LS-55 (ex 310, em 410) ir išreikšta santykiniais fluorescencijos vienetais. 20
2.3. Duomenų apdorojimas Duomenų analizė atlikta naudojant statistinės analizės programos IBM SPSS Statistics 21.0 versiją (IBM Corporation, JAV). Apskaičiuotos atskirų grupių kiekybinių dydžių medianos, mažiausios ir didžiausios vertės, kadangi tiriamųjų imtys sudarė mažiau negu 30 pacientų grupėje. Mann Whitney U testas naudotas lyginti kiekybinius duomenis tarp grupių imčių. Siekiant nustatyti kiekybinių požymių tarpusavio ryšį naudotas Spearman koreliacijas koeficientas. Statistiškai reikšmingas skirtumas apibrėžtas, kai p < 0,05. 21
3. REZULTATAI 3.1. Tiriamųjų charakteristika Iš viso tyrime dalyvavo 60 asmenų. Iš jų 34 (56,7 %) vyrai ir 26 (43,3 %) moterys. Visi tyrime dalyvavę asmenys sirgo lėtiniu širdies nepakankamumu. Buvo pasirinkti II, III ir IV pagal NYHA klasifikaciją funkcinių klasių ligoniai, kur kiekvienoje grupėje buvo po 20 pacientų. Kiekvienam iš jų buvo ištirta trombocitų agregacija, lipidograma, fibrinogeno, ditirozino, oxdtl bei nitrotirozino koncentracijos. 3.2. Rodmenų palyginimas tarp grupių Lyginant tarp NYHA grupių pacientų trombocitų agregacijos tyrimus matoma tendencija, kad didėjant funkcinei klasei iš II į III, trombocitų agregacija skatinta tiek su ADP, tiek su ADR didėja. Dar labiau sunkėjant pacientų būklei (iš III į IV grupę), sumažėja. Statistiškai reikšmingas trombocitų agregacijos skirtumas rastas tik tarp NYHA III ir IV grupių (p = 0,039). III grupės pacientų trombocitų agregacija, skatinta su ADP ir ADR buvo intensyviausia (3.1. lentelė). 3.1. lentelė. Trombocitų agregacijos rezultatai ir jų palyginimas tarp grupių. Tirtas rodmuo Rezultatas Skirtumo patikimumo palyginimas tarp grupių, p reikšmė NYHA II NYHA III NYHA IV NYHA II ir NYHA III NYHA III ir NYHA IV NYHA II ir NYHA IV Trombocitų agregacija, skatinta su ADP, % Med. = 75 Min. = 52 Max. = 90 Med. = 78 Min. = 61 Max. = 92 Med. = 71,5 Min. = 51 Max. = 91 0,294 0,039 0,140 Trombocitų agregacija, skatinta su ADR, % Med. = 80,5 Min. = 60 Max. = 100 Med. = 87 Min. = 58 Max. = 102 Med. = 83,5 Min. = 51 Max. = 99 0,094 0,182 0,465 ADP adenozino difosfatas; ADR adrenalinas; p statistinis reikšmingumas; Med. rezultatų mediana; Min. mažiausias rezultatas imtyje; Max. didžiausias rezultatas imtyje. Analizuojant pacientų lipidogramos tyrimų rezultatus yra matoma tendencija, jog bendro cholesterolio koncentracija, esant sunkiausiai pacientų būklei, yra didžiausia. DTL ir MTL koncentracija tarp ligonių grupių nesiskiria. Rasta, kad trigliceridų (TG) koncentracija II funkcinės klasės ligonių grupėje yra didžiausia (p = 0,011). Sunkėjant pacientų būklei, koncentracija mažėja (3.2. lentelė). 22
3.2. lentelė. Lipidogramos rezultatai ir jų palyginimas tarp grupių. Tirtas rodmuo Rezultatas Skirtumo patikimumo palyginimas tarp grupių, p reikšmė NYHA II NYHA III NYHA IV NYHA II ir NYHA III NYHA III ir NYHA IV NYHA II ir NYHA IV Bendras cholesterolis, mmol/l Med. = 4,43 Min. = 3,04 Max. = 6,06 Med. = 4,42 Min. = 2,57 Max. = 8,59 Med. = 4,91 Min. = 2,81 Max. = 8,34 0,410 0,420 0,497 MTL, mmol/l Med. = 2,85 Min. = 1,71 Max. = 4,19 DTL, mmol/l Med. = 1,04 Min. = 0,72 Max. = 2,31 Trigliceridai, mmol/l Med. = 1,46 Min. = 0,66 Max. = 2,19 Med. = 2,94 Min. = 1,63 Max. = 5,41 Med. = 1,09 Min. = 0,44 Max. = 1,88 Med. = 1,34 Min. = 0,24 Max. = 4,35 Med. = 2,94 Min. = 1,52 Max. = 5,84 Med. = 1,15 Min. = 0,67 Max. = 2,01 Med. = 1,00 Min. = 0,59 Max. = 2,29 0,465 0,444 0,497 0,434 0,149 0,143 0,382 0,112 0,011 MTL mažo tankio lipoproteinai; DTL didelio tankio lipoproteinai; p statistinis reikšmingumas; Med. rezultatų mediana; Min. mažiausias rezultatas imtyje; Max. didžiausias rezultatas imtyje. Tiriant fibrinogeno ir nitrotirozino koncentracijas ir lyginant jas tarp skirtingų funkcinių klasių pacientų, nerandama jokiu reikšmingų skirtumų. Tačiau pažymėtina, kad skaitinės fibrinogeno ir nitrotirozino vertės didžiausios III funkcinės klasės ligonių grupėje, kaip kad ir trombocitų agregacijos rodmenys. Matoma tendencija, kad didėjant NYHA funkcinei klasei, didėja oxdtl ir ditirozino koncentracija. Ditirozino koncentracijos skirtumas tarp II ir IV grupių yra statistiškai reikšmingas (p = 0,048) (3.3. lentelė). 3.3. lentelė. Fibrinogeno, ditirozino, oxdtl ir nitrotirozino rezultatai ir jų palyginimas tarp grupių. Tirtas rodmuo Rezultatas Skirtumo patikimumo palyginimas tarp grupių, p reikšmė NYHA II NYHA III NYHA IV NYHA II ir NYHA III NYHA III ir NYHA IV NYHA II ir NYHA IV Fibrinogenas, g/l Med. = 4,09 Min. = 2,35 Max. = 7,69 Med. = 4,20 Min. = 2,01 Max. = 6,73 Med. = 4,08 Min. = 2,59 Max. = 6,06 0,356 0,487 0,342 Ditirozinas oxdtl, x 10 2 pg/ml Nitrotirozinas Med. = 7,48 Min. = 3,37 Max. = 9,85 Med. = 2,779 Min. = 0,373 Max. = 8,814 Med. = 3,665 Min. = 1,117 Max= 11,021 Med. = 8,13 Min. = 4,87 Max. = 13,96 Med. = 3,181 Min. = 0,496 Max. = 14,61 Med. = 4,142 Min. = 2,093 Max= 28,322 Med. = 8,44 Min. = 6,13 Max. = 11,04 Med. = 3,465 Min. = 0,712 Max= 18,134 Med. = 3,928 Min. = 1,743 Max= 93,577 0,096 0,410 0,048 0,320 0,389 0,265 0,241 0,209 0,460 x 10 2 nm oxdtl oksiduoti didelio tankio lipoproteinai; p statistinis reikšmingumas; Med. rezultatų mediana; Min. mažiausias rezultatas imtyje; Max. didžiausias rezultatas imtyje. 23
3.3. Tirtų rodmenų sąsajos su vaistais Kadangi LŠN sergantys pacientai vartoja įvairius vaistus, ieškojome, ar vartoti vaistai gali turėti tam tikros įtakos tyrimų rezultatams. Rasta, kad vartoti vaistai mūsų tirtos imties trombocitų agregacijos rodmenims reikšmės neturėjo (3.4. lentelė). Rasta, jog beta blokatorių vartojimas tiesiogiai silpnai koreliuoja su MTL (R = 0,256, p = 0,048). Trigliceridų koncentracija tiesiogiai vidutiniškai stipriai koreliuoja su kalcio kanalų blokatorių vartojimu ir silpnai tiesiogiai koreliuoja yra su varfarino vartojimu (atitinkamai R = 0,324, p = 0,012; R = 0,265, p = 0,041) (3.5. lentelė). Stebima, jog diuretikų vartojimas tiesiogiai silpnai koreliuoja su oxdtl koncentracija (R = 0,289, p = 0,025) bei vidutinė tiesioginė koreliacija stebima tarp nitratų vartojimo ir fibrinogeno koncentracijos (R = 0,351, p = 0,006) (3.6. lentelė). Šios tiesioginės koreliacijos rodo, jog išvardintų vaistų vartojimas nežymiai, tačiau didina MTL, trigliceridų, oxdtl ir fibrinogeno rodmenų koncentracijas. 3.4. lentelė. Trombocitų agregacijos rezultatų koreliacija su pacientų vartojamais vaistais. Vartojamas vaistas Koreliacija tarp rodmenų Trombocitų agregacija, skatinta su ADP, % N = 60 Trombocitų agregacija, skatinta su ADR, % N = 60 R p R p AKFi 0,069 0,600-0,176 0,179 Beta blokatoriai -0,093 0,482-0,114 0,387 Diuretikai 0,112 0,393-0,061 0,644 Nitratai 0,041 0,758 0,176 0,179 Heparinas 0,169 0,196 0,026 0,842 KKB 0,047 0,721-0,040 0,761 CD vaistai 0,120 0,360-0,094 0,474 Digoksinas 0,067 0,609 0,100 0,448 MMMH 0,047 0,721 0,066 0,615 Tiroksinas 0,104 0,430 0,155 0,238 Insulinas -0,203 0,119 0,084 0,523 Varfarinas 0,022 0,866-0,009 0,943 ADP adenozino difosfatas; ADR adrenalinas; AKFi angiotenziną konvertuojančio fermento inhibitoriai; KKB kalcio kanalų blokatoriai; CD cukrinis diabetas; MMMH mažos molekulinės masės heparinas; N tiriamųjų skaičius; R Spearman koreliacijos koeficientas; p statistinis reikšmingumas. 24
3.5. lentelė. Lipidogramos rodmenų koreliacija su pacientų vartojamais vaistais. Vartojamas Koreliacija tarp rodmenų vaistas Bendras cholesterolis, mmol/l N = 60 MTL, mmol/l N = 60 DTL, mmol/l N = 60 Trigliceridai, mmol/l N = 60 R p R p R p R p AKFi 0,157 0,230 0,122 0,352 0,129 0,325 0,142 0,280 Beta blokatoriai 0,221 0,089 0,256 0,048 0,120 0,359 0,094 0,473 Diuretikai -0,159 0,225-0,079 0,548-0,164 0,209-0,125 0,341 Nitratai 0,100 0,446 0,122 0,355 0,151 0,251 0,085 0,519 Heparinas -0,019 0,887-0,109 0,407-0,034 0,797 0,207 0,113 KKB 0,120 0,361-0,002 0,989 0,111 0,397 0,324 0,012 CD vaistai -0,086 0,511-0,071 0,588-0,098 0,457 0,038 0,776 Digoksinas -0,055 0,675-0,058 0,660 0,086 0,512-0,097 0,461 MMMH 0,071 0,588 0,021 0,874 0,148 0,259-0,030 0,822 Tiroksinas 0,038 0,776 0,002 0,987 0,117 0,373 0,119 0,364 Insulinas -0,170 0,194-0,113 0,392-0,210 0,108-0,026 0,841 Varfarinas 0,167 0,202 0,203 0,119-0,072 0,582 0,265 0,041 MTL mažo tankio lipoproteinai; DTL didelio tankio lipoproteinai; AKFi angiotenziną konvertuojančio fermento inhibitoriai; KKB kalcio kanalų blokatoriai; CD cukrinis diabetas; MMMH mažos molekulinės masės heparinas; N tiriamųjų skaičius; R Spearman koreliacijos koeficientas; p statistinis reikšmingumas. 3.6. lentelė. Fibrinogeno, ditirozino, oxdtl ir nitrotirozino rezultatų koreliacija su pacientų vartojamais vaistais. Vartojamas vaistas Fibrinogenas, g/l N = 60 Koreliacija tarp rodmenų Ditirozinas N = 60 oxdtl, x 10 2 pg/ml N = 60 Nitrotirozinas x 10 2 nm N = 60 R p R p R p R p AKFi -0,077 0,560-0,025 0,848 0,037 0,780-0,056 0,669 Beta blokatoriai -0,065 0,624-0,078 0,554 0,115 0,383-0,222 0,088 Diuretikai -0,254 0,050-0,206 0,114 0,289 0,025-0,163 0,212 Nitratai 0,351 0,006 0,185 0,157-0,046 0,725-0,029 0,826 Heparinas 0,117 0,375-0,049 0,711 0,117 0,375 0,143 0,276 KKB 0,075 0,570 0,040 0,761-0,075 0,570-0,120 0,361 CD vaistai 0,165 0,207 0,041 0,754-0,101 0,440-0,147 0,264 Digoksinas 0,061 0,645-0,071 0,588 0,015 0,910 0,182 0,164 MMMH -0,050 0,702-0,082 0,534 0,113 0,389 0,005 0,968 Tiroksinas -0,051 0,700 0,108 0,411-0,223 0,087-0,095 0,471 Insulinas 0,035 0,789 0,068 0,603 0,015 0,907-0,135 0,305 Varfarinas 0,002 0,986-0,076 0,564-0,006 0,965-0,030 0,818 oxdtl oksiduoti didelio tankio lipoproteinai; AKFi angiotenziną konvertuojančio fermento inhibitoriai; KKB kalcio kanalų blokatoriai; CD cukrinis diabetas; MMMH mažos molekulinės masės heparinas; N tiriamųjų skaičius; R Spearman koreliacijos koeficientas; p statistinis reikšmingumas. 25
3.4. Tirtų rodmenų tarpusavio sąsajos Rasta atvirkštinė silpna koreliacija tarp trombocitų agregacijos, skatintos su ADR ir diastoliniu kraujo spaudimu (R = -0,294, p = 0,022) bei su trombocitų skaičiumi (R = 0,303, p = 0,019). Matoma priešinga, silpna koreliacija tarp trombocitų agregacijos, skatintos su ADP ir ditirozino koncentracijos (R = -0,296, p = 0,022) (3.7. lentelė). 3.7. lentelė. Trombocitų agregacijos rodmenų koreliacija su tirtųjų lytimi, amžiumi, AKS, KSIF ir laboratoriniais tyrimais. Rodmuo Trombocitų agregacija, skatinta su ADP, % N = 60 Koreliacija tarp rodmenų Trombocitų agregacija, skatinta su ADR, % N = 60 R p R p Lytis -0,106 0,420-0,036 0,785 Amžius, metai -0,060 0,651-0,053 0,687 SKS, mm Hg 0,077 0,558-0,085 0,518 DKS, mm Hg -0,037 0,781-0,294 0,022 Trombozių komplikacijos 0,037 0,780 0,146 0,266 KSIF, % -0,052 0,694 0,063 0,633 TRM, x 10 9 /l 0,303 0,019 0,009 0,944 VTT, fl -0,219 0,093-0,159 0,225 LEU, x 10 9 /l -0,044 0,740-0,087 0,507 NE, x 10 9 /l 0,019 0,883 0,039 0,769 LY, x 10 9 /l -0,108 0,410-0,046 0,728 MO, x 10 9 /l -0,148 0,259-0,083 0,527 Bendras cholesterolis, mmol/l -0,038 0,775 0,039 0,769 MTL, mmol/l -0,030 0,817 0,145 0,269 DTL, mmol/l 0,064 0,628-0,070 0,595 Trigliceridai, mmol/l -0,124 0,345-0,025 0,850 Fibrinogenas, g/l -0,072 0,585 0,092 0,486 oxdtl, x 10 2 pg/ml -0,030 0,817 0,024 0,855 Nitrotirozinas, x 10 2 nm -0,055 0,676-0,042 0,751 Ditirozinas -0,296 0,022 0,039 0,765 ADP adenozito difosfatas; ADR adrenalinas; AKS arterinis kraujo spaudimas; KSIF kairiojo skilvelio išmetimo frakcija; SKS sistolinis kraujo spaudimas; DKS diastolinis kraujo spaudimas; TRM trombocitų skaičius; VTT vidutinis trombocitų tūris; LEU leukocitų skaičius; NE neutrofilų skaičius; LY limfocitų skaičius; MO monocitų skaičius; MTL mažo tankio lipoproteinai; DTL didelio tankio lipoproteinai; oxdtl oksiduoti didelio tankio lipoproteinai; N tiriamųjų skaičius; R Spearman koreliacijos koeficientas; p statistinis reikšmingumas. Lipidogramos tyrimų rezultatai statistiškai reikšmingai skiriasi tarp LŠN sergančių pacientų lyčių (3.8. ir 3.9. lentelės). Nors didesnė rizika sirgti širdies ir kraujagyslių ligomis būdinga vyrams, tačiau šio darbo rezultatai rodo, jog visų lipidogramos komponentų koncentracijų medianos yra didesnės 26
moterų tarpe (3.9. lentelė). Statistiškai reikšmingai tarp vyrų ir moterų nesiskyrė tik TG koncentracijos, nors skaitinė vertė irgi matoma didesnė moterų grupėje (p = 0,078). 3.8. lentelė. Lipidogramos rodmenų koreliacijia su tirtųjų lytimi, amžiumi, AKS, KSIF ir laboratoriniais tyrimais. Rodmuo Bendras cholesterolis, mmol/l N = 60 Koreliacija tarp rodmenų MTL, mmol/l N = 60 DTL, mmol/l N = 60 Trigliceridai, mmol/l N = 60 R p R p R p R p Lytis 0,371 0,004 0,271 0,036 0,390 0,002 0,229 0,078 Amžius, metai 0,092 0,486-0,055 0,674 0,283 0,029 0,080 0,545 SKS, mm Hg 0,255 0,049 0,145 0,269 0,268 0,038 0,025 0,849 DKS, mm Hg 0,231 0,076 0,150 0,254 0,167 0,202 0,133 0,310 Trombozių 0,041 0,755 0,093 0,478 0,040 0,764-0,263 0,069 komplikacijos KSIF, % 0,284 0,028 0,211 0,105 0,168 0,200 0,290 0,025 TRM, x 10 9 /l 0,263 0,042 0,219 0,093 0,141 0,281 0,298 0,021 VTT, fl 0,216 0,097 0,131 0,320 0,202 0,122 0,068 0,608 LEU, x 10 9 /l 0,078 0,553 0,170 0,194-0,002 0,985-0,089 0,498 NE, x 10 9 /l 0,104 0,427 0,105 0,424 0,025 0,850-0,027 0,839 LY, x 10 9 /l -0,031 0,815-0,017 0,897-0,043 0,743 0,175 0,181 MO, x 10 9 /l -0,309 0,016-0,325 0,011-0,097 0,462-0,250 0,054 Fibrinogenas, g/l -0,019 0,883 0,007 0,957 0,057 0,663 0,071 0,590 oxdtl, -0,038 0,772-0,37 0,779 0,045 0,734-0,205 0,117 x 10 2 pg/ml Nitrotirozinas, -0,199 0,128-0,161 0,219-0,285 0,027-0,083 0,528 x 10 2 nm Ditirozinas -0,011 0,935 0,043 0,742-0,111 0,397 0,047 0,722 AKS arterinis kraujo spaudimas; KSIF kairiojo skilvelio išmetimo frakcija; MTL mažo tankio lipoproteinai; DTL didelio tankio lipoproteinai; SKS sistolinis kraujo spaudimas; DKS diastolinis kraujo spaudimas; TRM trombocitų skaičius; VTT vidutinis trombocitų tūris; LEU leukocitų skaičius; NE neutrofilų skaičius; LY limfocitų skaičius; MO monocitų skaičius; oxdtl oksiduoti didelio tankio lipoproteinai; N tiriamųjų skaičius; R Spearman koreliacijos koeficientas; p statistinis reikšmingumas. Šiame darbe gaunama silpna tiesioginė koreliacija tarp bendro cholesterolio koncentracijos ir trombocitų skaičiaus (R = 0,263, p = 0,042) ir tarp trigliceridų koncentracijos su trombocitų skaičiumi (R = 0,298, p = 0,021). Statistiškai reikšminga vidutinė neigiama koreliacija stebima tarp bendro cholesterolio koncentracijos ir monocitų skaičiaus (R = -0,309, p = 0,016) ir tarp MTL koncentracijos ir monocitų skaičiaus (R = -0,325, p = 0,011). Vertinant DTL koncentracijos sąsają su nitrotirozino koncentracija LŠN sergančių pacientų serume, stebima priešinga silpna koreliacija tarp šių rodmenų (R = -0,285, p = 0,027) (3.8. lentelė). 27
Ditirozino koncentracija Rasta, kad bendro cholesterolio koncentracija silpnai tiesiogiai koreliuoja su sistolinio kraujo spaudimu (SKS) (R = 0,255, p = 0,049) ir silpnai tiesiogiai koreliuoja su kairiojo skilvelio išmetimo frakcija (KSIF) (R = 0,284, p = 0,028). Taip pat gaunama tiesioginė silpna koreliacija tarp DTL ir SKS (R = 0,268, p = 0,038) ir tiesioginė silpna koreliacija tarp trigliceridų koncentracijos ir KSIF (R = 0,290, p = 0,025). Šios sąsajos rodo, jog didėjant įvardintų lipidų koncentracijoms, nežymiai didėja atitinkami kraujo spaudimo rodikliai tiriamojoje imtyje (3.8. lentelė). 3.9. lentelė. Lipidogramos rodmenys tarp LŠN sergančių pacientų lyčių. Rodmuo Vyrai N = 34 Moterys N = 26 Bendras cholesterolis, Med. = 4,17 Med. = 5,28 mmol/l Min. = 2,57 Min. = 2,88 Max. = 8,34 Max. = 8,59 MTL, mmol/l Med. = 2,75 Med. = 3,30 Min. = 1,63 Min. = 1,52 Max. = 5,84 Max. = 5,46 DTL, mmol/l Med. = 1,02 Min. = 0,44 Max. = 2,31 Trigliceridai, mmol/l Med. = 1,14 Min. = 0,24 Max. = 2,29 Med. = 1,22 Min. = 0,87 Max. = 1,88 Med. = 1,50 Min. = 0,59 Max. = 4,35 p reikšmė 0,004 0,036 0,002 0,078 MTL mažo tankio lipoproteinai; DTL didelio tankio lipoproteinai; Med. rezultatų mediana; Min. mažiausias rezultatas imtyje; Max. didžiausias rezultatas imtyje; N tiriamųjų skaičius, p statistinis reikšmingumas. Rasta vidutinio stiprumo tiesioginė koreliacija tarp vidutinio trombocitų tūrio (VTT) rodmenų ir ditirozino koncentracijos (R = 0,366, p = 0,004) (3.1 pav.). Neigiama vidutinė koreliacija stebima tarp oxdtl ir fibrinogeno koncentracijos (R = -0,344, p = 0,007) ir silpna tiesioginė koreliacija tarp oxdtl ir nitrotirozino koncentracijos (R = 0,278, p = 0,031) (3.10. lentelė). 16 14 12 10 8 6 4 2 0 7 8 9 10 11 12 13 14 VTT, fl 3.1 pav. Ditirozino koncentracijos priklausomybė nuo vidutinio trombocitų tūrio. 28
3.10. lentelė. Fibrinogeno, ditirozino, oxdtl ir nitrotirozino koreliacija su tirtųjų lytimi, amžiumi, AKS, KSIF ir laboratoriniais tyrimais. Rodmuo Fibrinogenas, g/l N = 60 Koreliacija tarp rodmenų Ditirozinas N = 60 oxdtl, x 10 2 pg/ml N = 60 Nitrotirozinas x 10 2 nm N = 60 R p R p R p R p Lytis -0,129 0,325 0,039 0,768-0,029 0,825-0,216 0,098 Amžius, metai 0,167 0,203 0,142 0,278 0,108 0,411-0,090 0,493 SKS, mm Hg 0,027 0,840-0,051 0,698-0,073 0,579-0,238 0,068 DKS, mm Hg 0,197 0,131-0,162 0,217-0,167 0,201-0,132 0,313 Trombozių -0,007 0,957 0,059 0,652-0,226 0,082-0,051 0,699 komplikacijos KSIF, % -0,042 0,752-0,055 0,674-0,100 0,446-0,185 0,157 TRM, x 10 9 /l 0,155 0,238-0,070 0,594-0,107 0,418-0,117 0,374 VTT, fl 0,118 0,371 0,366 0,004-0,180 0,169 0,140 0,286 LEU, x 10 9 /l 0,121 0,358 0,119 0,365-0,007 0,959 0,116 0,376 NE, x 10 9 /l 0,194 0,137 0,095 0,472-0,220 0,092 0,077 0,561 LY, x 10 9 /l -0,091 0,488-0,108 0,410 0,028 0,833-0,121 0,356 MO, x 10 9 /l 0,161 0,219 0,119 0,366 0,143 0,275 0,138 0,294 oxdtl, -0,344 0,007-0,203 0,120 1,000-0,278 0,031 x 10 2 pg/ml Nitrotirozinas x 10 2 nm -0,042 0,749 0,066 0,614 0,278 0,031 1,000 - Ditirozinas 0,101 0,444 1,000 - -0,203 0,120 0,066 0,614 AKS arterinis kraujo spaudimas; KSIF kairiojo skilvelio išmetimo frakcija; oxdtl oksiduoti didelio tankio lipoproteinai; SKS sistolinis kraujo spaudimas; DKS diastolinis kraujo spaudimas; TRM trombocitų skaičius; VTT vidutinis trombocitų tūris; LEU leukocitų skaičius; NE neutrofilų skaičius; LY limfocitų skaičius; MO monocitų skaičius; N tiriamųjų skaičius; R Spearman koreliacijos koeficientas; p statistinis reikšmingumas. 29