LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS Loreta Mikaliūnaitė LABORATORINĖS DIAGNOSTIKOS REIKŠMĖ DIAGNOZUOJANT MONOKLONINES GAMAPATIJAS Baigiamasis magistro darbas Darbo vadovas Doc. dr. Daiva Urbonienė Kaunas, 2019 m.
TURINYS SANTRAUKA... 2 SUMMARY... 5 PADĖKA... 7 INTERESŲ KONFLIKTAS... 7 ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS... 7 SANTRUMPOS... 8 ĮVADAS... 10 DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI... 12 1. LITERATŪROS APŽVALGA... 13 1.1 Monokloninių gamapatijų samprata ir aktualumas... 13 1.2 Monokloninių gamapatijų klasifikacija... 14 1.3 Monokloninių gamapatijų epidemiologija... 15 1.4 Monokloninių gamopatijų etiologija ir patogenezė... 16 1.4.1 Imunoglobulinų struktūra... 16 1.4.2 Lengvosios κ ir λ grandinės... 18 1.4.3 Monokloninis baltymas... 20 1.4.4 Monokloninio baltymo sukeliami susirgimai... 22 1.5 Monokloninių gamapatijų laboratorinė diagnostika... 23 2. TYRIMO METODIKA... 25 2.1 Tiriamieji asmenys ir tyrimo eiga... 25 2.2 Tyrimo metodai... 26 2.2.1 Serumo baltymų elektroforezė... 26 2.2.2 Serumo monokloninių baltymų nustatymas imunofiksacinė elektroforezė... 27 2.2.3 Imunoglobulinų laisvųjų lengvųjų kapa ir lambda grandinių koncentracijų nustatymas kraujo serume... 29 2.2.4 Imunoglobulinų lengvųjų kapa ir lambda grandinių koncentracijų nustatymas kraujo serume... 30 2.2.5 Kiti biocheminiai tyrimai... 31 2.3 Duomenų statistinės analizės metodai... 32 3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS... 33 IŠVADOS... 43 LITERATŪROS SĄRAŠAS... 44 2
SANTRAUKA Magistro darbo autorius. Loreta Mikaliūnaitė Magistro darbo pavadinimas. Laboratorinės diagnostikos reikšmė diagnozuojant monoklonines gamapatijas. Tyrimo tikslas. Įvertinti laboratorinių tyrimų pokyčius ir jų reikšmę monokloninų gamapatijų diferencinei diagnostikai. Tyrimo uždaviniai. Atlikti ir įvertinti inkstų funkcijos (kreatinino, agfg, šlapalo), serumo baltymų (bendro baltymo, albumino, imunoglobulinų G,A,M) patologinių rezultatų dažnį atsižvelgiant į pacientų su įtariama monoklonine gamapatija lytį. Atlikti ir įvertinti laisvųjų lengvųjų grandinių (FLC) rezultatų skirtumus atsižvelgiant į pacientų su įtariama monoklonine gamapatija lytį ir monokloninės gamapatijos tipą. Atlikti ir įvertinti M komponento buvimą baltymų elektroforezės (SPE) metodu, M komponento tipą baltymų imunofiksacinės elektroforezės (SPIFE) metodu bei palyginti abiem metodais gautus rezultatus. Nustatyti ir įvertinti M komponento tipus ir jų pasiskirstymą tarp dažniausiai diagnozuojamų monokloninių gamapatijų. Tyrimo objektas ir metodai. Tyrimui atrinkti pacientai, kuriems 2018 metais LSMU ligoninėje Kauno klinikose buvo atlikti M baltymo, imunoglobulinų κ, λ lengvųjų ir κ, λ laisvųjų lengvųjų grandinių kiekio ir jų santykio tyrimai bei kiti biocheminiai tyrimai, svarbūs monokloninių gamapatijų diagnostikai. SPE ir monokloninio baltymo tipo identifikavimas serume SPIFE metodu buvo atlikti naudojantis HYDRASYS 2 SCAN ir Interlab G26 sistemomis (Sebia, Prancūzija, Italija). Imunoglobulinų κ, λ lengvųjų ir κ, λ laisvųjų lengvųjų grandinių kiekis ir jų santykis serume nustatytas automatiniu analizatoriumi Immage 800 (Beckman Coulter, JAV), kiti biocheminiai tyrimai buvo atlikti naudojant klinikinės chemijos automatinę sistemą SYNCHRON UniCel DxC 800 (Beckman Coulter, JAV). Rezultatai. Tyrimo metu buvo išanalizuoti 52 pacientų (24 vyrų ir 28 moterų) laboratorinių tyrimų duomenys. Pagal diagnozes tiriamieji buvo suskirstyti į 8 grupes. Didžioji dalis pacientų buvo sergantys inkstų ligomis (57,7 proc.) ir daugine mieloma (26,9 proc.), o kitų ligų grupių pasiskirstymas sudarė nuo 3,8 proc. iki 1,9 proc. Vyrų grupėje patologiniai kreatinino, agfg ir šlapalo tyrimų pokyčiai buvo nustatyti reikšmingai dažniau nei moterų grupėje. Vyrų grupėje 46,2 proc. tiriamųjų ir moterų grupėje 13,0 proc. tiriamųjų buvo nustatytas viršijantis referentines ribas κ/λ laisvųjų lengvųjų grandinių santykis. Moterų grupėje šis rodiklis žemiau referentinių ribų buvo nustatytas 34,8 proc. tiriamųjų. Vyrų grupėje SPE metodu M komponentas buvo aptiktas 21,7 proc., o moterų grupėje 37,0 proc. tiriamųjų. Vyrų grupėje SPIFE metodu M komponento tipas buvo nustatytas 30,4 proc. tiriamųjų, o moterų 63,0 proc. Nustatyta, kad dažniausiai aptinkamas M komponento tipas tiek vyrų, tiek moterų grupėje buvo λ lengvosios grandinės. 3
Išvados. Vyrų grupėje kreatinino ir šlapalo koncentracijos, viršijančios referentines ribas, o agfg, nesiekiantis referentinių ribų, nustatyti statistiškai reikšmingai dažniau nei moterų grupėje. Kitų rodiklių patologinių rezultatų dažnis vyrų ir moterų grupėse reikšmingai nesiskyrė. κ/λ laisvųjų lengvųjų grandinių santykis, siejamas su blogesne ligos prognoze, moterų grupėje reikšmingai dažniau buvo nesiekiantis referentinių ribų, tuo tarpu, vyrų grupėje šis rodiklis reikšmingai dažniau buvo viršijantis referentines ribas. Pakitęs κ/λ laisvųjų lengvųjų grandinių santykis dažniausiai buvo aptinkamas sergantiesiems daugine mieloma. Vertinant M komponento (jo tipo) nustatymą skirtingais metodais, paaiškėjo, kad didžiajai daliai tirtų pacientų M komponentas aptinkamas SPIFE metodu, o SPE metodu tik dešimtadaliui. Taigi, diagnozuojant monoklonines gamapatijas, tikslinga įvertinti M komponento buvimą abiem metodais. Tyrimo rezultatai parodė, kad didžioji dalis tiriamųjų buvo sergantys inkstų ligomis ir daugine mieloma. Sergantiems inkstų ligomis M komponentas buvo λ lengvųjų grandinių tipo, tuo tarpu, sergantiems daugine mieloma vienodai dažnai buvo aptinkamos λ lengvosios grandinės ir IgG κ. 4
SUMMARY Author of Master Thesis. Loreta Mikaliūnaitė Title of Master's thesis. The Significance of Laboratory Diagnostics for Monoclonal Gammopathies. The aim. To evaluate changes of laboratory tests and their significance for diagnosis of monoclonal gammopathies. Objectives. To determine and evaluate the frequency of pathological tests results of renal function (creatinine, urea, agfr), serum proteins (total protein, albumin, immunoglobulins G, A, M) in relation to gender of patients with suspected monoclonal gammopathy. To determine and evaluate the differences of free light chain (FLC) results in relation to patient s gender and type of monoclonal gammopathy. To perform and evaluate the presence of M protein by serum protein electrophoresis (SPE) method and type of M component by serum protein immunofixation (SPIFE) method and to compare both methods. To identify and evaluate the types (composition) of M protein and their distribution among the most commonly diagnosed monoclonal gammopathy. Materials and methods. Patients consulted at The Hospital of Lithuanian University of Health Sciences (LSMU) Kauno klinikos in 2018 were selected for the study. M protein, immunoglobulin κ, λ light and κ, λ free light chain and their ratio, and other biochemical markers relevant to the diagnosis of monoclonal gammopathy were performed. According to the diagnoses, the subjects were divided into 8 groups. SPE and SPIFE were performed for M protein detection and type identification using the HYDRASYS 2 SCAN and Interlab G26 system s (Sebia, France, Italy). The amount of immunoglobulins κ, λ light and κ, λ free light chains and their ratio in serum were determined by the Immage 800 analyzer (Beckman Coulter, USA). Other biochemical serum markers (total protein, albumin, creatinine, urea, IgG, IgA, IgM) were tested using the SYNCHRON UniCel DxC 800 Clinical Chemistry Automatic System (Beckman Coulter, USA). Results. In the study, laboratory data from 52 patients (28 women and 24 men) were analyzed. According to the diagnoses, the subjects were divided into 8 groups. The majority of patients had kidney disease (57%) and multiple myeloma (26.9%), while the distribution of other disease groups ranged from 3.8%. up to 1.9 percent. In the male group, the abnormal changes in creatinine, urea and agfr were significantly higher than in the female group. 46.2% of men and 13.0% of women were found to be outside the upper reference limit for κ/λ free light chain ratio. In the female group, this ratio was below the reference limits for 34.8% women. In the male group using SPE method, M component was detected in 21.7% and in the female group 37.0% patients. By SPIFE method type of 5
M componet was detected for 63.0% women and 30.4% men. The most common type of M component was λ light chains in both genders. Conclusions. In the male group, the increased concentrations of creatinine and urea and the decreased agfr were found significantly more frequent than in the female group. The frequency of pathological results of other serum markers did not differ significantly between men and women. The decreased ratio of κ/λ free light chains was significantly more frequent in the female group, whereas in the male group increased ratio of κ/λ free light chains was more common. Abnormal κ/λ free light chain ratio was most commonly detected in multiple myeloma patients. The assessment of the M protein (its type) revealed that in the majority of the cases M-component detected by SPIFE, SPE method was informative only in 10% cases. Thus, in the diagnosis of monoclonal gammopathy it is adviceable to use both methods. The results of the study showed that the majority of patients had kidney disease and multiple myeloma. In patients with kidney disease M component was composed of λ light chain, whereas in multiple myeloma was composed of λ light chains and IgG κ. 6
PADĖKA Nuoširdžiai dėkoju savo baigiamojo magistro darbo vadovei doc. dr. Daivai Urbonienei už skirtą laiką, naudingus patarimus, pagalbą ruošiant baigiamąjį darbą. INTERESŲ KONFLIKTAS Atliekant šį darbą autoriui interesų konflikto nebuvo. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS Tyrimui atlikti ir archyvo duomenims naudoti gautas LSMU Bioetikos centro leidimas 2018 05 08 Nr. BEC LMB(M) 436. 7
SANTRUMPOS AL amiloidozė (angl. Amyloid light-chain AL amyloidosis) lengvųjų grandinių amiloidozė C Celsijaus laipsnis C domenas (angl. constant) pastovusis domenas CD Cukrinis diabetas CDR (angl. complementary-determining regions) hipervariabilios sritys CRAB (angl. C calcium elevation, R renal impairment, A anemia, B bone lesions) hiperkalcemija, inkstų veiklos sutrikimas, anemija, kaulų pažeidimas Fab (angl. fragment atigen binding) antigeną surišantis fragmentas Fc (angl. fragment crystallizable) kristalinis fragmentas FLC (angl. Free light chains) laisvosios lengvosios grandinės g (angl. Relative centrifuge force expressed in units of gravity) išcentrinė jėga agfg Apskaičiuotas glomerulų filtracijos greitis H (angl. heavy) sunkioji grandinė HCD (angl. Heavy-chain diseases) sunkiųjų grandinių liga HD Hemodializė HLC (angl. heavy chain/light chain) - serumo sunkiosios ir lengvosios grandinės IFN Inkstų funkcijos nepakankamumas IgA, IgD, IgE, IgG, IgM Imunoglobulinai (A, D, E, G, M) IKR interkvartilių ribos tarp 25-osios procentilės ir 75-osios procentilės J genai (angl. joining) jungimosi genai KMI Kūno masės indeksas 8
LDH Laktatdehidrogenazė Md Imties mediana MGRS (angl. monoclonal gammopathy of renal significance) monokloninė inkstams reikšminga gamapatija MGCS (angl. monoclonal gammopathy of clinical significance) monokloninė kliniškai reikšminga gamapatija MGUS (angl. monoclonal gammopathy of undetermined significance) monokloninė neaiškios reikšmės gamapatija MM (angl. multiple mieloma) dauginė mieloma MNRG Monokloninė neaiškios reikšmės gamapatija PCL (angl. plasma cell leukemia) plazmos ląstelių leukemija POEMS (angl. P polyneuropathy, O organomegaly, E endocrinopathy, M monoclonal gammopathy, and S skin changes) polineuropatija, oranomegalija, endokrinopatija, baltymas, odos ligų apraiškos RDM (angl. smoldering multiple mieloma SMM) rusenanti dauginė mieloma SBP (angl. solitary bone plasmacytoma) solitarinė kaulo plazmacitoma SEP (angl. Serum protein electrophoresis) serumo baltymų elektroforezė SEP (angl. solitary extramedullary plasmacytoma) ekstramedulinė plazmacitoma SPIFE (angl. Serum protein immunofixation electrophoresis ) serumo baltymų imunofiksacinė elektroforezė TEMPI (angl. T telangiectasias, E erythrocytosis with elevated erythropoietin level, M monoclonal gammopathy, P perinephric fluid collection, I intrapulmonary shunting) teleangiektazijos, eritrocitozė, monokloninė gamapatija, periferinis skysčių kaupimasis, intrapulmoninis šuntas V domenas (angl. variable) kintamasis domenas VM Valdenštremo makroglobulinemija χ 2 Chi kvadrato kriterijus 9
ĮVADAS Monokloninė gamapatija yra dažna senyvo amžiaus žmonių būklė. Monokloninių gamapatijų etiologija mažai žinoma, tačiau įvardijami rizikos veiksiai: šeiminė anamnezė, aplinkos veiksniai (kancerogenai, radiacija), lėtinės infekcijos, autoimuniniai sutrikimai, amžius, lytis (vyrams didesnė rizika), rasė (juodaodžiai serga dažniau), nutukimas, 2 tipo cukrinis diabetas (1, 2). Monokloninės gamapatijos gali varijuoti nuo asimptominių ikivėžinių būklių, tokių kaip monokloninė neaiškios reikšmės gamapatija (MNRG), rusenanti dauginė mieloma (RDM) iki piktybinių būklių dauginės mielomos, plazmacitomos, plazminių ląstelių leukemijos ir Valdenštremo makroglobulinemijos. Mažiau piktybinėms ligoms priskiriamos lengvųjų grandinių depozitų ligos, pirminė amiloidozė, POEMS sindromas (3). Kai kuriems pacientams su ikivėžinėmis būklėmis pasireiškia organų pažeidimai ir reikalinga terapinė intervencija, todėl tokia monokloninė gamapatija literatūroje nurodoma kaip monokloninė kliniškai reikšminga gamapatija. Labiausiai pažeidžiamas organas yra inkstai. Esant monokloninio baltymo hiperprodukcijai, jis gali pradėti kauptis inkstų glomeruluose ar kanalėliuose ir sukelti inkstų pažeidimus, progresuojančius į inkstų nepakankamumą. Sergantiems monoklonine gamapatija dažnais atvejais paveikiami inkstai, todėl neseniai buvo įvestas terminas monokloninė inkstams reikšminga gamapatija (4, 5). Kasmet MNRG užfiksuojami 6,2 atvejai 100000 žmonių, iš kurių 1 proc. gali progresuoti į piktybinį plazminių ląstelių susirgimą, pavyzdžiui, dauginę mielomą (6). Europoje per metus užfiksuojami 4,5 6,0 dauginės mielomos atvejai 100000 žmonių (7). Lietuvoje, Nacionalinio vėžio instituto duomenimis, 2012 metais buvo užfiksuoti 166 nauji mielominės ligos atvejai (8). Jungtinėse valstijose kasmet užfiksuojama apie 2200 naujų pirminės amiloidozės atvejų. Panašūs pirminės amiloidozės studijų epidemiologiniai duomenys buvo gauti ir kai kuriuose Europos regionuose (9). Labai svarbu kuo anksčiau diagnozuoti ligą ir pradėti gydymą, kad būtų pagerinta gyvenimo kokybė ir išvengta komplikacijų. Reguliariai stebint ir atliekant laboratorinius tyrimus pacientams su nustatyta monoklonine gamapatija, galima prailginti išgyvenamumą taikant naujesnius gydymo metodus (10, 11). Retesnis piktybinis plazminių ląstelių susirgimas yra Valdenštremo makroglobulinemija, kuri diagnozuojama 7,3 tarp vyrų ir 4,2 tarp moterų iš milijono atvejų (12). Monokloninės gamapatijos yra unikalios tuom, kad joms būdinga imunologiškai ir elektroforetiškai homogeninių monokloninių baltymų sekrecija. Monokloninis baltymas dar yra žinomas kaip M baltymas, paraproteinas ir monokloninis komponentas. Paraproteinai yra monokloniniai imunoglobulinai, kuriuos produkuoja vieno klono B ląstelės. Monokloninėms gamapatijoms būdingi visi penki imunoglobulinų tipai IgG, IgA, IgM, IgD, IgE. Dažniausiai serume aptinkamas tipas yra IgG, o rečiausiai IgE. Gali būti aptinkamas nepažeistas monokloninis 10
imunoglobulinas, laisvosios lengvosios grandinės, abiejų kombinacija, o retais atvejais, tik laisvosios sunkiosios grandinės. Kai kuriais monokloninių gamapatijų atvejais M baltymo produkcija gali būti labai maža arba jo išvis neprodukuojama (5, 13, 14). M baltymas yra svarbus biomarkeris diagnozuojant monoklonines gamapatijas, tačiau nėra vieno universalaus tyrimo, kuriuo būtų galima patikimai diagnozuoti visus atvejus. Tarptautinė mielominės ligos darbo grupė nurodo, jog geresnis diagnostinis specifiškumas ir jautrumas pasiekiamas, kai yra atliekama serumo ir šlapimo baltymų elektroforezė (SPE), imunofiksacinė elektroforezė (SPIFE) ir kiekybinis laisvųjųjų lengvųjų grandinių (FLC) matavimas (15, 16, 17). Tačiau duomenų apie šių tyrimų informatyvumą skirtingų monokloninių gamapatijų metu vis dar nepakanka. 11
DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI Tyrimo tikslas įvertinti laboratorinių tyrimų pokyčius ir jų reikšmę monokloninų gamapatijų diferencinei diagnostikai Tyrimo uždaviniai: 1. Atlikti ir įvertinti inkstų funkcijos (kreatinino, šlapalo, agfg), serumo baltymų (bendro baltymo, albumino, imunoglobulinų G,A,M) patologinių rezultatų dažnį atsižvelgiant į pacientų su įtariama monoklonine gamapatija lytį. 2. Atlikti ir įvertinti laisvųjų lengvųjų grandinių (FLC) rezultatų skirtumus atsižvelgiant į pacientų su įtariama monoklonine gamapatija lytį ir monokloninės gamapatijos tipą. 3. Atlikti ir įvertinti M komponento buvimą baltymų elektroforezės (SPE) metodu, M komponento tipą baltymų imunofiksacinės elektroforezės (SPIFE) metodu bei palyginti abiem metodais gautus rezultatus. 4. Nustatyti ir įvertinti M komponento tipus ir jų pasiskirstymą tarp dažniausiai diagnozuojamų monokloninių gamapatijų. 12
1. LITERATŪROS APŽVALGA 1.1 Monokloninių gamapatijų samprata ir aktualumas Monokloninės gamapatijos yra sutrikimai, kuriems būdingas homogeninio imunoglobulino (M baltymo) pikas serume arba šlapime, atsirandantis plazminių ląstelių pirmtako klono proliferacijos pasekoje (18). M baltymo kiekis, esant plazmos ląstelių mielomai, yra tarsi naviko žymuo ir atspindi naviko masę. Monokloninės gamapatijos yra susiję su per didele vienos rūšies lengvųjų grandinių gamyba, tai dažnais atvejais iškreipia laisvųjų kapa ir lambda lengvųjų grandinių kiekį serume. Normos atveju, kapa lengvųjų grandinių yra gaminama daugiau nei lambda, o patologijos atveju atvirkščiai. Kiekybinis monokloninių laisvųjų lengvųjų grandinių nustatymas yra svarbi diagnostikos priemonė įvairioms monokloninėms gamapatijoms (19). Sutrikimai gali būti gerybiniai nesukeliantys simptomų, pavyzdžiui, monokloninė neaiškios reikšmės gamapatija (MNRG) arba piktybiniai plazminių ląstelių ir limfoidiniai sutrikimai tokie kaip dauginė mieloma ir Valdenštremo makroglobulinemija (16). Etiologija nėra žinoma, tačiau, atlikti tyrimai patvirtina genetinių ir aplinkos veiksnių vaidmenį. MNRG ar dauginės mielomos sergamumo riziką padidina šeiminė anamnezė, radiacijos, jonizuojančios spinduliuotės poveikis, ypač jaunesniame amžiuje, taip pat afrikietiška etinė kilmė, antsvoris, vyresnis amžius, pesticidai (20). Tyrimais nustatyta, kad monokloninis baltymas daugiau nei 50 proc. atvejų aptinkamas atsitiktinai tiriant sergančius hipergamaglobulinemija, hipogamaglobulinemija arba esant asimptominiam serumo baltymų kiekio ir nusėdimo greičio padidėjimui, esant patologiniams serumo imunoglobulinų (IgG, IgA, IgM) kiekiams. Dėl M baltymo tikrinami pacientai, kuriems pasireiškia nugaros skausmas, anemija, inkstų nepakankamumas, reikšminga proteinurija, hiperkalcemija, esamam amžiui nebūdinga osteopenija, osteolitiniai kaulų pažeidimai, nepaaiškinama periferinė neuropatija. Labai retais atvejais gali būti aptinkamas M baltymas, bet vėlesniuose tyrimuose nebenustatomas (21). M baltymas gali būti aptinkamas atliekant baltymų elektroforezę, imunofiksacinę elektroforezę, imunoglobulinų kiekybinį nustatymą, serumo laisvųjų lengvųjų grandinių ir sunkiųjų, lengvųjų grandinių tyrimus. Taigi, laboratorija atlieka svarbų vaidmenį diagnozuojant ir stebint monoklonines gamapatijas (22). 13
1.2 Monokloninių gamapatijų klasifikacija Monokloninės gamapatijos apima kloninių plazminių ląstelių sutrikimų spektrą ir yra klasifikuojamos kaip žemo sunkumo navikiniai sutrikimai, ikivėžiniai ir piktybiniai navikai (22,23). Literatūroje nurodomi šie monokloninių gamapatijų tipai: monokloninė neaiškios reikšmės gamapatija (MNRG) (angl. monoclonal gammopathy of undetermined significance MGUS); dauginė mieloma (angl. multiple mieloma MM); rusenanti dauginė mieloma (RDM) (angl. smoldering multiple mieloma SMM); nesekretuojanti/mažai sekretuojanti dauginė mieloma; plazmos ląstelių leukemija (angl. plasma cell leukemia PCL); solitarinė kaulo plazmacitoma (angl. solitary bone plasmacytoma SBP); ekstramedulinė plazmacitoma (angl. solitary extramedullary plasmacytoma SEP); POEMS sindromas polineuropatija, oranomegalija, endokrinopatija, M baltymas, odos ligų apraiškos (angl. polyneuropathy, organomegaly, endocrinopathy, monoclonal gammopathy, and skin changes POEMS syndrome); Valdenštremo makroglobulinemija (VM) (angl. Waldenström macroglobulinemia WM); sunkiųjų grandinių liga (angl. Heavy-chain diseases HCD); lengvųjų grandinių amiloidozė (angl. Amyloid light-chain AL amyloidosis); imunoglobulinų depozitų liga. Šie sutrikimai skiriasi monokloninio baltymo tipu, kurį produkuoja pažeistos ląstelės (24). Kiekvienas monokloninis baltymas susideda iš dviejų sunkiųjų polipeptidinių grandinių ir dviejų tos pačios rūšies lengvųjų polipeptidinių grandinių. Pagal aminorūgščių kiekį ir seką, krūvį, tankį, angliavandenių kiekį sunkiosios grandinės yra skiriamos į 5 rūšis: α (alfa), γ (gama), δ (delta), ε (epsilon), μ (miu). Lengvųjų grandinių tipai yra kapa ir lambda (25). Galimi monokloninio baltymo tipai: IgG/kapa, IgG/lambda IgA/kapa, IgA/lambda, IgM/kapa, IgM/lambda, kapa lengvosios grandinės, lambda lengvosios grandinės bei IgG, IgA, IgM, IgD, IgE sunkiosios grandinės (26,27). Pagal pasaulio sveikatos organizaciją (angl. WHO) išskiriamos šios monokloninės gamapatijos (28): Monokloninė neaiškios reikšmės gamapatija; Plazminių ląstelių mieloma 1. Rusenanti (besimptomė) plazminių ląstelių mieloma; 2. Asekretorinė mieloma; 3. Plazminių ląstelių leukemija; Plazmacitoma 1. Solitarinė kaulo plazmacitoma; 2. Ekstraskeletinė (ekstramedulinė) plazmacitoma; Imunoglobulinų depozitų ligos 1. Pirminė amiloidozė (AL amiloidozė); 2. Sisteminė lengvųjų ir sunkiųjų grandinių depozitų liga; 14
Sunkiųjų grandinių liga; Plazmos ląstelių navikai su susijusiu paraneoplastiniu sindromu 1. Osteosklerotinė mieloma (POEMS sindromas); 2. TEMPI sindromas; Limfoplazmocitinė limfoma Valdenštremo makroglobulinemija Gerybinė monokloninė gamapatija, dabar visuotinai pripažinta kaip monokloninė neaiškios reikšmės gamapatija, pasireiškia daug dažniau nei dauginė mieloma (18). Ikivėžiniams susirgimams taip pat priklauso rusenanti dauginė mieloma. MNRG ir RDM gali progresuoti į piktybinį susirgimą dauginę mielomą (15). Išskiriami trys MNRG tipai: IgM MNRG, ne-igm (IgA, IgG) (angl. non-igm) MNRG ir lengvosios grandinės MNRG (angl. LC-MGUS) (23). Pastarasis tipas pasireiškia tik kapa arba lambda laisvųjų lengvųjų grandinių sekrecija (20). Pagal imunoglobulinų tipą dauginė mieloma skirstoma į IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, lengvųjų grandinių dauginę mielomą, ir nesekretorinę dauginę mielomą. Dažniausiai randamas M baltymo tipas sergant mielomine liga yra IgG (55 proc.), po to IgA (25 proc.) ir lengvosios grandinės (15 proc.). Rečiau nustatomas IgM tipas, o rečiausiai IgE (29, 30). 1.3 Monokloninių gamapatijų epidemiologija Monokloninių gamapatijų paplitimas didėja su amžiumi. Monokloninis baltymas aptinkamas maždaug 3 4 proc. vyresniems nei 50 metų, 5 proc. vyresniems nei 65 metų ir beveik 10 proc. 85 metų ir vyresniems (23). Didesnė rizika išsivystyti MNRG yra vyrams (4,0 proc.) nei moterims (2,7 proc.). Rasė taip pat yra kaip rizikos faktorius. Afrikiečiai ir Afrikos amerikiečiai turi 1,5 3 kartus didesnę riziką sirgti MNRG nei kaukazoidų populiacijos atstovai (25). Mayo klinikoje 1960 2010 metų laikotarpyje buvo ištirti 43 426 pacientai, kuriems diagnozuotas plazminių ląstelių sutrikimas. Didžiąją dalį visų diagnozuotų monokloninių gamapatijų sudarė MNRG (58 proc.), dauginė mieloma 18 proc., amiloidozė 9 proc., Valdenštremo makroglobulinemija 2,5 proc., rečiausiai diagnozuojama buvo solitarinė arba ekstramedulinė plazmacitoma (2 proc.). Klinikos duomenimis, maždaug 1 proc. pacientų, su MNRG diagnoze, būklė progresuoja į piktybinę plazminių ląstelių ligą, pavyzdžiui, dauginę mielomą, sisteminę lengvjųjų grandinių amiloidozę ar Valdenštremo makroglobulinemiją (31,23). Lengvųjų grandinių amiloidozės paplitimo dažnis išsivysčiusiose šalyse siekia 9 atvejus 1 milijonui gyventojų per metus. Vidutinis pacientų su šia diagnoze amžius yra 65 metai (32). Dauginė mieloma sudaro 1 proc. visų vėžio formų ir apytikriai 10 proc. visų hematologinių piktybinių susirgimų. Nacionalinio vėžio instituto 2012 metų statistikos duomenimis, Lietuvoje 15
nustatyti 166 mielominės ligos atvejai, moterų tarpe 89 atvejai, o vyrų tarpe 77 atvejai. Mirtingumas 76 atvejai (8). Paplitimo dažnis Europoje siekia 4,5 6,0 iš 100 000 žmonių per metus, o vidutinis amžius yra 72 metai. Mirtingumas siekia 4,1 iš 100 000 žmonių per metus. Kai kuriems pacientams gali būti pripažinta tarpinė asimptominė, bet labiau pažengusi būklė, vadinama rusenanti dauginė mieloma, kuri progresuoja iki dauginės mielomos. Per pirmuosius penkis metus po diagnozės nustatymo būklė progresuoja 10 proc. pacientų, per kitus penkis metus 3 proc. pacientų (7). Remiantis JAV epidemiologų duomenimis daugybinės mielomos dažnis yra 6,1 iš 100 000 žmonių per metus, jis didėja su amžiumi ir vyresnių nei 65 metų amžiaus žmonių grupėje siekia iki 30,4 iš 100 000 žmonių per metus. Vidutinis sergančiųjų daugine mieloma amžiaus dažnis baltosios rasės moterų tarpe yra 71 metai, o juodaodžių tarpe 67 metai (33). Dauginės mielomos sergamumo dažnis vyrams yra šiek tiek didesnis nei moterims. Afrikiečiams ir Afrikos amerikiečiams dauginės mielomos diagnozė nustatoma 2 3 kartus dažniau nei kaukazoidų populiacijos gyventojams (24). Valdenštremo makroglobulinemija yra retas piktybinis susirgimas sudarantis tik 1 2 proc. visų hematologinių piktybinių susirgimų. Per metus suserga 3 4 iš milijono žmonių. Valdenštremo makroglobulinemija yra pagyvenusių žmonių liga, vidutinis sergančiųjų amžius yra 70 metų (34). JAV per metus užfiksuojama 1400 naujų atvejų, iš kurių 1 proc. pacientų yra vyresni nei 40 metų amžiaus ir maždaug 60 proc. iš jų yra vyrai. Valdenštremo makroglobulinemija dažnesnė kaukazoidų populiacijoje lyginant su kitomis etinėmis grupėmis (24). Irane, Noor Pathobiology laboratorijoje, buvo tiriamas monokloninės gamapatijos potipių pasiskirstymas ir paplitimas. Remiantis atlikto tyrimo duomenimis labiausiai paplitęs monokloninio baltymo potipis yra IgG/kapa (33,5 proc), po to IgA/kapa (23,3 proc.), IgG/lambda (16,7 proc.), IgA/lambda (7,6 proc.), IgM/kapa (7,6 proc.), rečiau nustatyti potipiai biklonas (4,5 proc.). kapa lengvosios grandinės (3,5 proc.) ir lambda lengvosios grandinės (2 proc.), IgM/lambda (1 proc.) (27). Sunkiųjų grandinių (IgA, IgG, IgM) ligos yra reti B ląstelių limfomų variantai. Dažniausi susirgimai yra IgA tipo, o rečiausi IgM tipo (26). 1.4 Monokloninių gamopatijų etiologija ir patogenezė 1.4.1 Imunoglobulinų struktūra Imunoglobulinai (Ig) arba antikūnai yra glikoproteinai, sudaryti iš vieno ar daugiau vienetų, kiekviename iš jų yra keturios polipeptidinės grandinės: dvi identiškos sunkiosios H (angl. heavy) grandinės ir dvi identiškos lengvosios L (angl. light) grandinės κ arba λ (1 pav.) (35). Lengvosios grandinės yra būdingos visiems imunoglobulinams ir yra skiriamos į du tipus κ ir λ (kapa ir lambda). 16
Sunkiosios grandinės yra specifiškos kiekvienai imunoglobulinų klasei (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE). Lengvąsias grandines su sunkiosiomis grandinėmis jungia kovalentiniai ryšai (36). Kiekvienoje L ir H grandinėje yra vienas iš aminorūgščių sudarytas galinis kintamasis (angl. variable) V domenas ir vienas arba daugiau galinių pastoviųjų (angl. constant) C domenų. Domenai sudaryti iš dviejų β klosčių sluoksnių, kurie sujungti disulfidiniu tilteliu (37). Imunoglobulinų molekulės gali būti skaidomos pepsinu ir papainu. Pastarasis skaldo Ig molekulę į tris fragmentus: du identiškus Fab (angl. fragment atigen binding) antigeną surišančius fragmentus ir Fc (angl. fragment crystallizable) kristalinį fragmentą. Fab fragmentą sudaro lengvosios ir sunkiosios grandinės kintamasis domenas su CH1 domenu. Fc fragmentas sudarytas iš dviejų karboksilinėmis jungtimis susijungusių sunkiųjų grandinių, lanksto srities ir CH2 bei CH3 domenų. Fab fragmentus su Fc fragmentu jungia lanksto sritis (38). 1 pav. Žmogaus imunoglobulinų struktūra (pagal 39) 17
1.4.2 Lengvosios κ ir λ grandinės Kiekvienoje lengvojoje grandinėje yra apie 220 aminorūgščių, kurių molekulinė masė 25kDa. Genai, koduojantys κ ir λ lengvąsias grandines, atitinkamai išsidėstę 2-oje ir 22-oje chromosomose. Lengvųjų grandinių kintamasis domenas apima keturis, hidrofobinę šerdį sudarančius pagrindinius domenus, kuriuose yra po tris hipervariabilias sritis (angl. complementary-determining regions, CDR) CDR1, CDR2, CDR3. Hipervariabilių sričių įvairovė atspindi daugybę galimų kintamojo domeno ir jungimosi (angl. joining) J genų segmentų derinių, kurie koduoja lengvąsias grandines. κ lengvąją grandininę sudaro 40Vκ ir 5 Jκ segmentai, o λ lengvoji grandinė sudaryta iš 30 Vλ ir 8 Jλ segmentų (40). Lengvosios grandinės sintetinamos lygiagrečiai sunkiosioms grandinėms. Susidarius lengvųjų grandinių pertekliui, kuris, jei lieka nesusijungęs su imunoglobulinų sunkiųjų grandinių komponentu, patenka į kraują bei kraujo plazmą ir cirkuliuoja kaip laisvosios lengvosios grandinės (FLC angl. free lihgt chains) (2 pav.) (41). Laisvosios lengvosios imunoglobulinų grandinės yra šalutinis produktas, susidarantis antikūnų sintezės metu dalyvaujant galutinai subrendusiems B limfocitams. Imunoglobulinų sintezės metu sunkiųjų ir lengvųjų grandinių baltymai surenkami į endoplazminį tinklą (42). 2 pav. Imunoglobulino ir laisvųjų lengvųjų grandinių (FLC) struktūra (modifikuota pagal 42) Proksimaliniuose inkstų kanalėliuose reabsorbuojami filtruoti mažos molekulinės masės baltymai, tokie kaip Ig lengvos grandinės. Jos dar vadinamos Benz-Džonso baltymu ir cirkuliacijoje 18
gali pasirodyti kaip monomerai, kurių molekulinė masė apytiksliai 22 kda, ir kaip maždaug 44 kda molekulinės masės dimerai. Šių baltymų metabolizmas tiesiogiai susijęs su glomerulų filtracijos greičiu (43). Kiekviename inkstų nefrone yra glomerulai apgaubti porėta bazine membrana, kuri leidžia filtruoti serumo molekules į proksimalinius kanalėlius. Poros praleidžia molekules, kurių molekulinė masė varijuoja nuo 20 kda iki 60 kda. Baltymo molekulės, praeinančios pro glomerulų poras, absorbuojamos nepakitusios ir nesuskaidytos į proksimalinių kanalėlių epitelio ląsteles. Šis mechanizmas neleidžia baltymams ir peptidams patekti į šlapimą ir kasdien apdoroja nuo 10 iki 30 gramų laisvųjų lengvųjų grandinių (44). Normaliai funkcionuojanti limfoidinė sistema pagamina apytiksliai 500 miligramų per dieną laisvųjų lengvųjų grandinių, kurios filtruojamas ir katabolizuojamas inkstų proksimaliniuose kanalėliuose, o su šlapimu paprastai išskiriama tik apie 1-10 miligramų polikloninių lengvųjų grandinių (43, 45). Serumo monomerinės κ laisvosios lengvosios grandinės metabolizuojamos per 2 4 val. 40 proc. glomerulų filtracijos greičio, o dimerinės λ laisvosios lengvosios grandinės per 3 6 val. 20 proc. glomerulų filtracijos greičio, o didesnių polimerų katabolizmas vyksta daug lėčiau, pavyzdžiui, IgG pusinės eliminacijos laikas yra maždaug 21 diena esant minimaliam glomerulų filtracijos greičiui (3 pav.). 3 pav. Skirtingų imunoglobulinų pusinės eliminacijos laikas serume. A monomerinės κ serumo FLC, B dimerinės λ serumo FLC, C monomerinės κ serumo FLC esant inkstų nepakankamumui, D IgA, E IgG (modifikuota pagal 44) Apskaičiuota, kad κ laisvosios lengvosios grandinės yra produkuojamos du kartus greičiau nei λ, bet greitesnis jų pašalinimas užtikrina apie 50 proc. mažesnę koncentraciją serume. Laisvųjų lengvųjų grandinių pusinės eliminacijos laikas priklauso nuo inkstų būklės. Pacientams, kuriems yra visiškas inkstų funkcijos nepakankamumas, laisvųjų lengvųjų grandinių metabolizmas gali užsitęsti iki 19
2-3 dienų. Sergantiems lėtine inkstų liga, serumo laisvųjų lengvųjų κ ir λ grandinių koncentracijos padidėja dėl sumažėjusio glomerulų filtracijos greičio, tuomet, didesnę koncentracijos dalį pašalina retikuloendotelinės sistemos ląstelės per pinocitozę. Šio mechanizmo metu serumo laisvąsias lengvąsias κ ir λ grandines pašalina vienodu greičiu, santykinė serumo FLC koncentracija pasikeičia dėl didesnės κ produkcijos ir atsiranda nedidelis serumo laisvųjų lengvųjų κ ir λ santykio padidėjimas (44, 45, 46). Monokloninių laisvųjų lengvųjų grandinių nustatymas svarbus diagnozuojant monoklonines gamapatijas, pavyzdžiui, dauginę mielomą, Valdenštremo makroglobulinemiją, monokloninę neaiškios reikšmės gamapatiją taip pat lengvųjų grandinių mielomą, pirminę sisteminę amiloidozę, B limfocitų limfomą (41). Serumo FLC ištyrimas yra jautresnis lyginant su šlapimo FLC tyrimu (47). Sergant monoklonine gamapatija dominuoja viena nenormalių ląstelių linija, retais atvejais dvi ar trys. Nenormalios ląstelės (B ląstelės) gali gaminti nepažeistus imunoglobulinus, laisvąsias lengvąsias grandines be sunkiųjų, nepažeistus imunoglobulinus ir laisvąsias, retais atvejais gamina tik sunkiąsias grandines. Ląstelės gali gaminti imunoglobulinus su savitomis arba trūkstamomis aminorūgštimis arba kai kuriose nenormaliose ląstelėse gali pasireikšti klasės pozicijos pasikeitimas, todėl ląstelės gamina imunoglobulinus, turinčius dvi ar daugiau sunkiųjų grandinių klases(48). 1.4.3 Monokloninis baltymas Ankstyvieji B limfocitai, žymėti receptoriais (IgM), migruoja iš kaulų čiulpų į limfoidinius audinius ir ieško antigenų, kuriuos sutikę pradeda sekretuoti didelio afiniteto antikūnus ir palaiko imuninę atmintį. Plazmos ląstelės tai baigusios diferencijuotis B ląstelės, kurios koncentruojasi kaulų čiulpuose ir gamina imunoglobulinus. Monokloniniai imunoglobulinai atsirada proliferuojant vieno klono B ląstelėms (4 pav.). Polikloniniai imunoglobulinai produkuojami skirtingų B ląstelių klonų. Monokloninės B ląstelės ne visada produkuoja nepažeistus imunoglobulinus, pavyzdžiui, 20 proc. pacientų, sergančių mieloma, jos produkuoja tik monoklonines lengvąsias grandines (aptiktos šlapime vadinamos Benz-Džonso baltymu) (49). 20
4 pav. B ląstelių diferenciacija ir susiję piktybiniai susirgimai (modifikuota pagal 50) Monokloninės gamapatijos apibrėžiamos kaip heterogeninė grupė ligų, kurioms būdinga proliferacija vieno klono plazmos ląstelių, produkuojančių imunoglobuliną arba lengvąsias (rečiau sunkiąsias) grandines, randamas šlapime ar kraujyje kaip monokloninį (M) baltymą (51). Jis dar vadinamas paraproteinu arba M komponentu. Monokloninis baltymas aptinkamas išmatuojant IgG, IgA, IgM, koncentracijas serume, atliekant baltymų elektroforezę serume ir šlapime. Imunofiksacija naudojama baltymų elektroforezės metodu nustatytos monokloninio baltymo (monokloninės juostos) tipui identifikuoti; klonui patvirtinti ir sunkiosioms arba lengvosioms grandinėms identifikuoti (5 pav.) (49). 5 pav. Serumo baltymų elektroforezė (viršuje) ir imunofiksacija (apačioje). A normos atveju, B nustatytas M baltymas gama srityje yra IgG lambda tipo (modifikuota pagal 52) 21
1.4.4 Monokloninio baltymo sukeliami susirgimai Monokloninės gamapatijos apima grupę sutrikimų, turinčių skirtingą pasireiškimą, gydymą ir baigtį (22). Paraproteinų kloninė proliferacija gali pasireikšti dėl hematologinių piktybinių navikų arba ikivėžinės būklės. Dažniausi susirgimai yra dauginė mieloma, krioglobulinemija, limfoma, amiloidozė, Valdenštremo makroglobulinemija, monokloninė neaiškios reikšmės gamapatija (MNRG) ir POEMS (polineuropatija, organomegalija, endokrinopatija, M baltymo pikas ir odos ligų apraiškos) (53). M baltymai, kurie yra imunologiškai funkcionuojantys, gali sukelti ligą, pavyzdžiui, periferinę neuropatiją tiesiogiai prisijungdami prie organizmo antigenų. M baltymai, pavirtę į netirpius amiloidus, didina kraujo plazmos klampumą. Esant žemai temperatūrai, amiloidas gali nusėsti galūnėse, todėl sulėtėja kapiliarinio kraujo tėkmė. Didėjant M baltymo gamybai, masinis efektas gali pasireikšti išplitusioms kloninėms plazmos ląstelėms spaudžiant gretimas ląsteles, esančias kaulų čiulpuose, dėl to sumažėja eritrocitų gamyba vystosi anemija. Gali pasireikšti trombocitopenija, slopinamos monokloninio komponento nepaveiktos plazminės ląstelės, dėl silpnėjusios kaulų rezorbcijos pasireiškia hiperkalcemija ir kaulų pažeidimai. Dideli kiekiai cirkuliuojančio M baltymo gali paskatinti trombozę, audinių ir organų pažeidimus (54). Dauginės mielomos atveju galutinis organų pažeidimas apibrėžiamas vadinamosiomis CRAB (angl. C calcium elevation, R renal impairment, A anemia, B bone lesions) savybėmis: hiperkalcemija, inkstų veiklos sutrikimas, anemija, kaulų pažeidimai (21). Monokloniniai paraproteinai yra išskiriami į kraujotaką, filtruojami glomeruluose, reabsorbuojami ir hidrolizuojami proksimaliniuose kanalėliuose. Per daug gaminantis monokloninių laisvųjų lengvųjų grandinių, pavyzdžiui esant dauginei mielomai, sumažėja proksimalinių kanalėlių pajėgumas apdoroti visas filtruotas laisvasias lengvąsias grandines ir to pasekmė yra proteinurija, sumažėjęs glomerulų filtracijos ir padidėjęs eritrocitų nusėdimo greitis (55, 56). Kai kuriais atvejais, asmenims, kuriems diagnozuojama monokloninė neaiškios reikšmės gamapatija, net ir mažas monokloninio baltymo kiekis gali sukelti sunkius organų ar audinių pažeidimus. Dažnai žala nepripažįstama kaip monokloninės gamapatijos rezultatas, todėl monokloninės gamapatijos srities specialistai Fermand ir kt. praneša apie naują koncepciją, vadinamą monokloninę kliniškai reikšmingą gamapatiją (angl. monoclonal gammopathy of clinical significance MGCS). Ji apima inkstų, periferinių nervų, odos, akių ir hemostazės pažeidimus. Kadangi monokloninė gamapatija dažnai paveikia inkstus, dar yra vartojamas terminas monokloninė inkstams reikšminga gamapatija (angl. monoclonal gammopathy of renal significance MGRS). M baltymas gali sukelti glomerulų amiloido fibrilių depozitus, proksimalinę tubulopatiją su Fanconi sindromu, glomerulonefritą, atsirandantį dėl pirmo arba antro tipo krioglobulinemijos, imunotaktoidinę glomerulopatiją, inkstų monokloninių imunoglobulinų depozitų ligas, dėl kurių atsiranda inkstų 22
nepakankamumas (4, 57). Pacientai, su neaiškios kilmės inkstų nepakankamumu, kai inkstai normalaus dydžio ir šlapime randamos nuosėdos, turėtų būti tiriami dėl mielominės ligos, nes daugiau nei 90 proc. sergantiesiems inkstų (cilindrų) nefropatija yra dauginė mieloma. Monokloninio imunoglobulino kiekiai instuose paparastai apsiriboja imunoglobulino lengvosiomis grandinėmis, tačiau, tam tikrų ligų atvejais gali būti vien tik sunkiosios grandinės arba deponuojamas visas imunoglobulinas (58). Amiloido depozitai gali kauptis ne tik inkstuose, bet ir širdyje, kepenyse, virškinamajame trakte, periferinėje nervų sistemoje. Amiloidui kaupiantis miokardo ląstelėse sustorėja prieširdžių ir skilvelių sienelės. Tai gali sukelti laidumo defektus (4, 56). Dažniausiai pasitaikantis sunkiųjų grandinių susirgimas yra IgA tipo, vadinamas Seligmano liga. Pacientams paprastai pasireiškia lėtinis viduriavimas, melabsorbcija ir svorio sumažėjimas, kai kuriems didelė mezenterinė adenopatija. IgA sunkiosios grandinės liga dar žinoma kaip imunoproliferacinė plonojo žarnyno liga. IgG sunkiųjų grandinių susirgimams būdinga limfadenopatija, slenomegalija ir anemija. Skiriamasis bruožas gomurio edema. IgG tipo ligos gali būti susijusios su autoimuninėmis ligomis, kurios pasireiškia beveik trečdaliui pacientų: reumatoidinis artritas, autoimuninė hemolizinė aemija ir idiopatinė trombocitopeninė purpura. IgM sunkiųjų grandinių susirgimų klinikiniai požymiai primena lėtinę limfocitinę leukemiją kaulų čiulpuose būdingi limfocitai su vakuolėmis. Šio tipo, priešingai nei IgA ar IgG tipo, liga gali būti susijusi su padidėjusiu laisvosios lengvosios grandinės išsiskyrimu, nes kai kurios naviko ląstelės turi defektų tiek lengvųjų, tiek sunkiųjų grandinių surinkime (26). 1.5 Monokloninių gamapatijų laboratorinė diagnostika Monokloninių gamapatijų atrankai ir diagnostikai atliekama serumo ir šlapimo baltymų elektroforezė, baltymų imunofiksacinė elektroforezė, kiekybinis serumo laisvųjų lengvųjų grandinių įvertinimas, kaulų čiulpų ištyrimas (59). Rusenanti dauginė mieloma yra besimtomė kloninių plazmos ląstelių liga. Ji diagnozuojama remiantis nenormaliais kiekias randamu monokloniniu baltymu, kloninių plazminių ląstelių kaulų čiulpuose kiekiu, serumo laisvųjų lengvųjų grandiniu santykiu. Lengvųjų grandinių rusenančios dauginės mielomos potipio atveju monokloninių laisvųjų lengvųjų grandinių perteklius ekspresuojamas be imunoglobulinų sunklosios grandinės. Šiam potipui, dar vadinamam idiopatine Bens Džonso proteinurija, būdinga monokloninių laisvųjų lengvųjų grandinių pertekliaus išsiskirimas su šlapimu (60, 61). Dauginės mielomos atveju dar gali būti tiriamas beta 2-mikroglobulinas, kurio kiekis siejamas su didele naviko mase ir pablogėjusia inkstų funkcija. Naviko progresavimą rodo sisteminis uždegimas, kurį galima įvertinti pagal padidėjusį C-reaktyvaus baltymo kiekį ir neutrofilų 23
limfocitų santykį, dėl didelių citokinų kiekių sumažėjusią albumino koncentraciją. Laktatdehidrogenazė (LDH) serume yra dar vienas svarbus biožymuo naudojamas dauginės mielomos diagnostikai. LDH aktyvumas viršijantis normos ribas siejamas su padidėjusiu ligos agresyvumu ir padidėjusia naviko proliferacija, taip pat šis biožymuo parodo paciento išgyvenamumą (62, 63). Tarptautinės mielominės ligos darbo grupės (angl. International Myeloma Working Group) nurodyti diagnostiniai mielomos kriterijai pateikiami 1 lentelėje. 1 lentelė. Tarptautinės mielominės ligos darbo grupės monokloninių gamapatijų diagnostiniai kriterijai (modifikuota pagal 64, 63) Lengvųjų Ne-IgM IgM Dauginė grandinių RDM VM MNRG MNRG mieloma MNRG Diagnozė Plazminių ląstelių kiekis kaulų čiulpuose Limfoplazmocitų infiltracija kaulų čiulpuose <10 proc. <10 proc. 10 proc. 10proc. <10 proc. >10 proc. M baltymas serume <30 g/l <30 g/l <30 g/l <30 g/l M baltymas šlapime Laisvųjų lengvųjų grandinių santykis Padidėjęs 0,5 g per 24 valandas 0,5 g per 24 valandas 0,5 g per 24 valandas Padidėjęs CRAB kriterijus Nėra Nėra Nėra Nėra Yra Yra MNRG monokloninė neaiškios reikšmės gamapatija. RDM rusenanti dauginė mieloma. VM Valdenštremo makroglobulinemija. CRAB hiperkalcemija, inkstų veiklos sutrikimas, anemija, kaulų pažeidimas Sisteminė AL amiloidozė, dar vadinama pirmine amiloidoze, yra ekstraląstelinis monokloninio imunoglobulino lengvųjų grandinių fragmentų kaupimasis, kuris galiausiai lemia organų nepakankamumą. Dažniausiai pažeidžiami inkstai, širdis, kepenys ir periferinė nervų sistema (65). Diagnozei patvirtinti tiriamos laisvosios lengvosios grandinės serume. Pirmieji atrankiniai tyrimai yra serumo imunofiksacija ir imunoglobulinų lengvųjų ir laisvųjų lengvųjų grandinių kiekio nustatymas, serumo bei šlapimo baltymų elektroforezė (66, 67). AL amiloidozės atveju dominuoja lambda lengvosios grandinės (68). Organų pažeidimams įvertinti gali būti nustatomi įvairūs biomarkeriai, pavyzdžiui, esant inkstų pažeidimui, nustatoma >0.5 gramai baltymo paros šlapime. Pacientams su širdies amiloidoze aptinkamas padidėjęs NT-proBNP, o esant kepenų pažeidimams šarminė fosfatazė padidėja daugiau kaip 1,5 karto virš referentinių ribų (67). 24
TYRIMO METODIKA Darbas atliktas LSMU ligoninės Kauno klinikų Laboratorinės medicinos klinikoje. Tyrimui atlikti ir archyvo duomenims naudoti gautas LSMU Bioetikos centro leidimas 2018 05 08 Nr. BEC LMB(M) 436. 1.6 Tiriamieji asmenys ir tyrimo eiga Darbo objektas: LSMU ligoninės Kauno klinikose dėl monokloninių gamapatijų tirti ir gydyti pacientai. Atranka ir tyrimo eiga: surinkti klinikiniai bei laboratorinių tyrimų duomenys, apimantys 2018 01 01 2018 12 31 laikotarpį. Tyrimui buvo atrinkti pacientai, kuriems LSMU ligoninės Kauno klinikų Laboratorinės medicinos klinikoje buvo atliekami M baltymo, κ,λ lengvųjų ir κ,λ laisvųjų lengvųjų grandinių kiekio ir jų santykio bei kiti biocheminiai tyrimai, svarbūs monokloninių gamapatijų diagnostikai. Pasikartojantys pacientai į tyrimą nebuvo įtraukiami. Peržiūrėti imunofiksacinės elektroforezės tyrimų, atliktų 2018 01 01 2018 12 31 laikotarpiu, protokolai. Protokolų skaičius 205, iš jų buvo atrinkti 72 pacientai tirti ir gydyti stacionare, išskyrus chemoterpijos dienos stacionarą. Iš archyvo buvo iškeltos 52 ligos istorijos, surinkti demografiniai bei klinikiniai duomenys, apimantys amžių, lytį, diagnozę, gretutines ligas cukrinį diabetą, inkstų funkcijos nepakankamumą, atliekamas hemodializes. Tiriamiesiems buvo įvertinti šių laboratorinių tyrimų rezultatai: serumo baltymų elektroforezė agarozės gelyje, monokloninių baltymų nustatymas imunofiksacijos metodu serume, imunoglobulinų lengvųjų kapa/lambda grandinių koncentracijų ir jų santykio nustatymas kraujo serume imunoglobulinų laisvųjų lengvųjų kapa/lambda grandinių koncentracijų ir jų santykio nustatymas kraujo serume, kiti biocheminiai tyrimai bendro baltymo, albumino, kreatinino, apskaičiuoto GFG, šlapalo, IgG, IgA, IgM koncentracijos nustatymas serume. 25
1.7 Tyrimo metodai 1.7.1 Serumo baltymų elektroforezė Tyrimams atlikti buvo naudojama HYDRASYS 2 SCAN sistema (Sebia, Prancūzija). Nedidelė dalis tyrimų buvo atlikti su Interlab G26 (Sebia, Italija) analizatoriumi. Tyrimų atlikimo žingsniai ir naudojami reagentai skyrėsi, tačiau rezultatų vertinimas iš esmės nesiskyrė. Ėminiai, mėginių paruošimas ir laikymas Kraujas buvo paimtas naudojant vakuuminę sistemą į mėgintuvėlius be antikoagulianto laikantis standartinių rekomendacijų. Ėminiai buvo centrifuguojami 10 minučių esant 2000xg. Per dvi valandas nuo surinkimo serumas buvo atskirtas nuo ląstelių. Hemolizuoti serumo mėginiai nebuvo naudojami tyrimui. Plazmos mėginiai taip pat nebuvo naudojami vengiant klaidingo vertinimo dėl papildomai susidarančios fibrinogeno juostelės. Serumo mėginiai buvo laikomi šaldytuve 2 8 C temperatūroje iki 1 savaitės, o ilgesniam saugojimui mėginiai buvo užšaldomi -20 C temperatūroje. Metodo esmė Veikiant elektriniam laukui, ant šarminių (ph 9,1) agarozės gelio plokštelių baltymai atskiriami pagal jų krūvį. Išsiskiria albumino, α1, α2, β, γ globulinų frakcijos. Po baltymų elektroforetinio atskyrimo, agarozės gelio plokštelė denatūruojama, dažoma amido juodžiu, išblukinama, išdžiovinama. Atskirų baltymų zonų nudažytų elektroforegramų santykinių koncentracijų nuskaitymas atliekamas densitometru. Naudoti reagentai HYDRAGEL 15 PROTEIN(E) rinkinys (Sebia, Prancūzija). Reagentai buvo laikomi kambario 15 30 C temperatūroje, o liofilizuoti kontroliniai serumai šaldytuve 2 8 C temperatūroje. Neatidaryti reagentai buvo stabilūs iki ant pakuočių nurodyto termino pabaigos. Praskiestas kontrolinis tirpalas išliko stabilus 12 valandų laikant šaldytuve, o užšaldžius 6 mėnesius. Paruoštas blukinimo tirpalas buvo stabilus 1 savaitę laikant kambario temperatūroje. Praskiestas amido juodojo dažas išliko stabilus iki 1 mėnesio. Darbo eiga HYDRASYS 2 SCAN procedūra yra automatizuota: užnešamas bandinys ant agarozės gelio plokštelės, vyksta elektroforezinė migracija, gelio denatūracija ir dažymas, blukinimas, džiovinimas ir densitometrinis nuskaitymas. Rankinis darbas apėmė prietaiso paruošimą veikimui bei bandinių ir gelių paruošimą elektroforezei. 26
Rezultatų vertinimas Analizatorius skenuoja gelio plokštelę optinėje sistemoje (densitometre) ir pateikia skaitines reikšmes bei grafikus. Iš densitometrinių duomenų gauti grafikai rodo kiekvienos frakcijos procentinę vertę, o kiekvienos juostos koncentracijos vertė, išreikšta g/l, buvo automatiškai apskaičiuojama padauginus juostos procentinį dydį iš bendros baltymo koncentracijos mėginyje. Normos reikšmės nurodomos procentais. Pastabose aprašomos išsiskyrusios netipinės ar papildomos frakcijos. Rezultatų vertinimui naudotos šios pamatinės biologinės reikšmės: albuminas 53,8 65,2 proc., α1 globulinai 1,1 3,7 proc., α2 globulinai 8,5 14,5 proc., β globulinai 8,6 14,8 proc., γ globulinai 9,2 18,2 proc. 1.7.2 Serumo monokloninių baltymų nustatymas imunofiksacinė elektroforezė Tyrimams atlikti buvo naudojama HYDRASYS 2 SCAN sistema (Sebia, Prancūzija). Nedidelė dalis tyrimų buvo atlikti su Interlab G26 (Sebia, Italija) analizatoriumi. Tyrimų atlikimo žingsniai ir naudojami reagentai skyrėsi, tačiau rezultatų vertinimas iš esmės nesiskyrė. Ėminiai, mėginių paruošimas ir laikymas (žr. skirsnį 2.2.1. Ėminiai, mėginių paruošimas ir laikymas ) Metodo esmė Imunofiksacinės elektroforezės metodas pagrįstas baltymų atskyrimu, antigeno- antikūno sąveika bei specifinių baltymų vizualizacija. Tyrimas buvo atliekamas keliais etapais: pirmiausia baltymai atskiriami elektroforezės būdu agarozės gelyje; vėliau buvo vykdoma šių baltymų imunofiksacija elektroforetinės migracijos vienas takelis padengiamas fiksavimo tirpalu, o kiti skirtingais antiserumais (sunkiosios grandinės IgG, IgA, IgM ir kapa bei lambda lengvosiomis grandinėmis), kurie difunduoja į gelį ir nusodina atitinkamus baltymus, suformuojančius nuosėdų (antigeno- antikūno netirpus kompleksas) juostą; nusėdę tirpūs baltymai buvo pašalinami, o užfiksuoti baltymai nudažomi. Naudoti reagentai HYDRAGEL 4 IF rinkinys (Sebia, Prancūzija). Reagentai buvo laikomi kambario 15 30 C temperatūroje, antiserumai ir fiksacinis tirpalas šaldytuve 2 8 C temperatūroje. Neatidaryti reagentai išliko stabilūs iki ant pakuočių nurodyto termino pabaigos. Rūgštinio Violeto darbinis tirpalas buvo stabilus 6 mėnesius. Paruošti plovimo ir blukinimo tirpalai buvo laikomi kambario temperatūroje, tačiau atsiradus drumstumui nenaudojami. 27
Darbo eiga HYDRASYS 2 SCAN sistema imunofiksacija atliekama pusiau automatizuotai. Automatizuota dalis apėmė bandinių užnešimą ant agarozės gelio plokštelės, toliau buvo vykdoma elektroforetinė migracija, plovimas, džiovinimas, dažymas, blukinimas ir galutinis gelio džiovinimas. Rankinis darbas apėmė prietaiso paruošimą veikimui bei bandinių ir gelių paruošimą elektroforezei. Rezultatų vertinimas Vertinant buvo apžiūrimi gelio plokštelėje esantys takeliai ELP, IgG, IgA, IgM, kappa ir lambda. Šiuose takeliuose monokloninis baltymas buvo nustatytas, aptikus papildomą monokloninę juostą, kuri buvo aiškiai matoma, lygiais kraštais, o jos migracinis atstumas atitiko, padėtį palyginamajame ELP takelyje ( 6 pav.). Galimi rezultatų pateikimo variantai: Monokonas neišsiskyrė Išsiskyrė IgG kapa lengvųjų grandinių monoklonas Išsiskyrė IgG lambda lengvųjų grandinių monoklonas Išsiskyrė IgA kapa lengvųjų grandinių monoklonas Išsiskyrė IgA lambda lengvųjų grandinių monoklonas Išsiskyrė IgM kapa lengvųjų grandinių monoklonas Išsiskyrė IgM lambda lengvųjų grandinių monoklonas Išsiskyrė kapa lengvųjų grandinių monoklonas, nepriklausantis IgG, IgA, IgM klasėms Išsiskyrė lambda lengvųjų grandinių monoklonas, nepriklausantis IgG, IgA, IgM klasėms 6 pav. Imunofiksacinės elektroforezės gelio plokštelėse pavyzdžiai. A monoklonas neišsiskyrė, B išsiskyrė IgA lambda lengvųjų grandinių monoklonas (nurodyta rodyklėmis), C išsiskyrė IgG kapa lengvųjų grandinių monoklonas (nurodyta rodyklėmis) (pateikta LSMU ligoninės Kauno klinikų Laboratorinės medicinos klinikos nuotrauka) 28
1.7.3 Imunoglobulinų laisvųjų lengvųjų kapa ir lambda grandinių koncentracijų nustatymas kraujo serume Tyrimai buvo atlikti naudojantis automatiniu analizatoriumi IMMAGE 800 (Beckman Coulter, JAV) turbidimetriniu metodu. Ėminiai, mėginių paruošimas ir laikymas (žr. skirsnį 2.2.1. Ėminiai, mėginių paruošimas ir laikymas ) Metodo esmė Pirmiausia buvo atliekama kalibracija su žinomomis koncentracijomis sudaroma kalibracinė kreivė, pagal kurią buvo vertinami tiriamųjų mėginių rezultatai. Buvo matuojama tirpaus antigeno koncentracija tiriamąjį mėginį sumaišant su specifinių antikūnų turinčiu tirpalu reakcijos kiuvetėje, kurioje vyksta antigeno antikūno reakcija. Kirsdamas kiuvetę šviesos spindulys išsklaidomas ir jo išsklaidymas (nustatomas matuojant įprasto šviesos spindulio intensyvumo sumažėjimą) didėja, didėjant susidariusių netirpių imuninių kompleksų kiekiui. Susidaręs imuninių kompleksų kiekis buvo proporcingas antigenų koncentracijai. Naudoti reagentai Laisvųjų lengvųjų kapa grandinių reagentų rinkinys The Binding Site s Freelite Kappa Free Kit (Binding site, Didžioji Britanija): Laisvųjų lengvųjų lambda grandinių reagentų rinkinys The Binding Site s Freelite Lambda Free Kit (Binding site, Didžioji Britanija): Neatidaryti reagentų rinkiniai buvo laikomi 2 8 C temperatūroje, stabilūs išliko iki etiketėje nurodytos galiojimo datos pabaigos. Atidaryti reagentai, kalibratoriai ir kontrolinės medžiagos buvo laikomi 2 8 C temperatūroje ir išliko stabilūs 3 mėnesius. Skiediklis 1 buvo laikomas 15 25 C temperatūroje ir išliko stabilus iki etiketėje nurodytos galiojimo datos pabaigos. Darbo eiga Kapa ir lambda laisvųjųjų lengvųjų grandinių kalibracija buvo atlikta pradedant naujo serijos numerio reagentų rinkinius, esant nepatikimiems vidaus kokybės kontrolės rezultatams bei atlikus IMMAGE 800 analizatoriaus techninės priežiūros procedūras. Kontrolė buvo atliekama su kiekviena tiriamųjų mėginių grupe, taip pat po kalibracijos ir kiekvieną kartą atidarius naujus reagentus. Kapa ir lambda laisvųjų lengvųjų grandinių rezultatų skaitinės reikšmės buvo pateikiamos analizatoriaus. Rezultatų vertinimas Kapa ir lambda laisvųjų lengvųjų grandinių rezultatai buvo pateikiami skaitine reikšme miligramais litre (mg/l). Kapa laisvųjų lengvųjų grandinių rezultatų pamatinės biologinės reikšmės buvo 3,3 19,40 mg/l, lambda laisvųjų lengvųjų grandinių rezultatų pamatinės biologinės reikšmės 29
buvo 5,71 26,30 mg/l, o kapa/lambda laisvųjų lengvųjų grandinių santykio pamatinės biologinės reikšmės buvo 0,26 1,65. 1.7.4 Imunoglobulinų lengvųjų kapa ir lambda grandinių koncentracijų nustatymas kraujo serume Imunoglobulinų lengvųjų kapa (KAP) ir lambda (LAM) grandinių (laisvos ir surištos) koncentracijų nustatymas buvo atlikti naudojantis automatiniu analizatoriumi IMMAGE 800 (Beckman Coulter, JAV) nefelometriniu metodu. Ėminiai, mėginių paruošimas ir laikymas (žr. skirsnį 2.2.1. Ėminiai, mėginių paruošimas ir laikymas ). Metodo esmė Žmogaus serumo KAP ir LAM, jungdamiesi su specifiniais antikūnais, formuoja imuninius kompleksus. Šie kompleksai sukelia šviesos sklaidą, dėl tirpale susiformavusių dalelių imuninių kompleksų. Nefelometru buvo matuotas šviesos sklaidos (nukreiptosios šviesos) intensyvumas. Naudoti reagentai Reagentų rinkinys IMMAGE Immunochemistry Systems KAP ir LAM (BeckmanCoulter, JAV). Reagentų kasetės ir kalibravimo medžiaga buvo laikomos šaldytuve 2 8 C temperatūroje, o skiediklis ir buferis buvo saugomas 15 25 C temperatūroje. Neatidaryta kontrolinė medžiaga buvo laikoma -20 C temperatūroje, o atidarius šaldytuve 60 dienų. Darbo eiga Atlikdamas seriją kalibratoriaus praskiedimų skiedikliu, analizatorius automatiškai sudarė kalibracinę kreivę. Kalibracija buvo atlikta pradedant naujo serijos numerio reagentų rinkinius, esant nepatikimiems vidaus kokybės kontrolės rezultatams bei atlikus IMMAGE 800 analizatoriaus techninės priežiūros procedūras. Po kalibracijos buvo atliekama kontrolė. KAP ir LAM rezultatų skaitinės reikšmės buvo pateikiamos analizatoriaus. Rezultatų vertinimas KAP ir LAM rezultatų skaitinės reikšmės buvo pateikiamos gramais litre. Naudotos šios KAP pamatinės biologinės reikšmės: 6,29 13,5 g/l. LAM pamatinės biologinės reikšmės buvo 3,13 7,23 g/l, o Kapa/Lambda santykio pamatinės biologinės reikšmės buvo 1,53 3,29. 30
1.7.5 Kiti biocheminiai tyrimai Naudojant klinikinės chemijos automatinę sistemą SYNCHRON UniCel DxC 800 (Beckman Coulter, JAV), buvo atlikta: bendro baltymo, albumino, kreatinino, šlapalo, IgG, IgA, IgM koncentracijos nustatymas serume. Bendro baltymo koncentracijai serume nustatyti buvo naudotas SYNCHRON SYSTEMS Total Protein reagentų rinkinys. Tyrimo metodas pagrįstas biureto reakcija. Alkalino vario reagentas susijungė su mėginyje esančiu baltymu ir susidarė alkalino vario baltymo chelatas, kurio susidarymo greitis buvo proporcingas bendro baltymo koncentracijai mėginyje. Absorbcijos greičio pokytis buvo matuojamas esant 545 nanometrų bangos ilgiui. Rezultatų skaitinės reikšmės buvo pateikiamos gramais litre. Analizatoriaus bendro baltymo matavimo ribos 10 125 g/l. Albumino koncentracijai serume nustatyti buvo naudotas SYNCHRON SYSTEMS Albumin regentų rinkinys. Tyrimo metodas pagrįstas dichromatinės titrimetrijos ekvivalentinio taško nustatymu. Mėginyje esantis albuminas susijungė su bromkrezolio purpuniu reagentu sudarydamas kompleksą, kurio absorbcija buvo matuojama esant 600 nanometrų bangos ilgiui. Absorbcijos pokyčiai buvo tiesiogiai proporcingi albumino koncentracijai mėginyje. Rezultatų skaitinės reikšmės buvo pateikiamos gramais litre. Albumino matavimo intervalas 8 77 g/l. Kreatinino koncentracijai serume nustatyti buvo naudotas SYNCHRON SYSTEMS Creatinine reagentų rinkinys, buvo taikytas Jaffe tyrimo metodas. Mėginio kreatininui susijungus su šarminiu pikrato reagentu, susidarė raudonos spalvos kompleksas, kurio absorbcijos greitis esant 520 nanometrų bangos ilgiui buvo tiesiogiai proporcingas kreatinino koncentracijai mėginyje. Rezultatų skaitinės reikšmės buvo pateikiamos μmol/l. Analizinis diapazonas serume 0,0 2387 μmol/l. Apskaičiuotas glomerulų filtracijos greitis (agfg), kuris išreiškiamas ml/min/1,73m 2, buvo apskaičiuojamas pagal formulę: agfg=141 min. (kreatinino kiekis serume μmol/l /, 1) α maks. (kreatinino kiekis serume μmol/l /, 1) -1,209 0,993 amžius 1,018 (jei moteris). ( = 0,7 (moterims) arba 0,9 (vyrams), α= -0,329 (moterims) arba -0,411 (vyrams), min.= nurodomas mažiausias kreatinino kiekis serume/ arba 1, maks.= nurodomas didžiausias kreatinino kiekis serume/ arba 1) Šlapalo koncentracijai serume nustatyti buvo naudotas SYNCHRON SYSTEMS Urea Nitrogen or Urea reagentų rinkinys. Tyrimo metodas pagrįstas savituoju fermentiniu elektros laidžiu. Vykstant reakcijai, iš šlapalo susidarė amonio jonai ir bikarbonatas. Mėginio šlapalo koncentracija buvo tiesiogiai proporcinga tirpalo laidžio padidėjimui reakcijos metu per nustatytą laiką. Absorbcija buvo 31
matuojama esant 340 nanometrų bangos ilgiui. Rezultatų skaitinės reikšmės buvo pateikiamos mmol/l. Analizinis šlapalo diapazonas serume 0,0 57,0 mmol/l. Imunoglobulinų (IgG, IgA, IgM) koncentracijai serume nustatyti buvo naudotas SYNCHRON SYSTEMS Immunoglobulin G, Immunoglobulin A, Immunoglobulin M reagentų rinkinys, buvo taikytas imunoturbidimetrinis tyrimo metodas. Reakcijos metu imunoglobulinams susijungus su specifiniais antikūnais susidarė netirpūs antigenų antikūnų kompleksai. Esant 340 nanometrų bangos ilgiui, buvo matuojama absorbcija. Šis absorbcijos pokytis tiesiogiai proporcingas imunoglobulinų koncentracijai mėginyje ir buvo taikomas apskaičiuojant ir išreiškiant imunoglobulinų koncentraciją kalibracinės kreivės pagrindu. Rezultatų skaitinės reikšmės buvo pateikiamos gramais litre. Imunoglobulinų matavmo ribos serume: IgG 1,60 35,2 g/l, IgA 0,3 7,7 g/l, IgM 0,22 26,40 g/l. 1.8 Duomenų statistinės analizės metodai Tyrimo duomenų statistinė analizė buvo atlikta naudojantis IBM SPSS Statistics 20 (IBM Corporation, JAV) ir Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corporation, JAV) programomis. Analizės metu buvo taikytas Kolmogorov Smirnov testas nustatyti, ar duomenų skirstinys normalusis. Esant nenormaliam skirstiniui, duomenims analizuoti buvo taikomi neparametriniai testai, skaičiuojama mediana ir kvartiliai (interkvartilių ribos tarp 25-osios procentilės ir 75-osios procentilės). Nepriklausomų imčių lyginimui naudotas Kruskal Wallis ir Mann Whitney U testas. Neparametrinis Chi kvadrato (χ 2 ) kriterijus naudotas ivertinti kokybinių požymių tarpusavio ryšį, o mažoms imtims buvo taikomas tikslusis Fisher testas. Statistiškai reikšmingi rezultatai buvo laikomi, kai p<0,05. 32
2. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS Tiriamųjų imtį sudarė 52 pacientai, kurių amžiaus ribos nuo 28 iki 91 metų (imties mediana (Md) 67,5 metų, interkvartilių (IKV) ribos nuo 25-osios procentilės iki 75-osios procentilės 55,5; 75,0 metų). Tiriamojoje imtyje buvo 24 (46,2 proc.) vyrai ir 28 (53,8 proc.) moterys. Vyrų ir moterų amžius statistiškai reikšmingai nesiskyrė vyrų 66,0 (46,75; 74,0) metai, moterų 67,5 (59,25; 76,75) metai, p=0,215. Tiriamieji pagal diagnozes buvo suskirstyti į 8 grupes (2 lentelė). Grupės nr. Grupės pavadinimas 2 lentelė. Ligų paskirstymas į grupes. Grupei priskirtos diagnozės I Dauginė mieloma Dauginė mieloma II Valdenštremo makroglobulinemija Valdenštremo makroglobulinemija III MNRG MNRG IV Limfoproliferaciniai susirgimai V Amiloidozė Amiloidozė Folikulinė limfoma Limfmazgių gerybinis navikas VI Ekstramedulinė plazmacitoma Ekstramedulinė plazmacitoma VII VIII Inkstų ligos Kitos ligos Santrumpos: MNRG monokloninė neaiškios reikšmės gamapatija Kitas ūminis inkstų nepakankamumas Lėtinė inkstų liga, 2 stadija Lėtinė inkstų liga, 3 stadija Lėtinė inkstų liga, 4 stadija Lėtinė inkstų liga, 5 stadija Neaiškios ir nežinomos eigos navikas, nepatikslintas Kitas seropozityvus reumatoidinis artritas Pacientų pasiskirstymas pagal diagnozę yra pateikiamas 7 paveikslo diagramoje. Mūsų tyrimo duomenimis, daugiau nei pusei (57,7 proc.) pacientų buvo diagnozuota inkstų liga. Visi šie pacientai buvo tiriami dėl įtariamos monokloninės gamapatijos. Filadelfijos mokslininkai Wang CH ir Hogan JJ taip pat teigia, jog senyvo amžiaus pacientai, sergantys neaiškios kilmės inkstų liga arba proteinurija, turėtų būti tiriami dėl monokloninės gamapatijos (69). Ketvirtadaliui (26,9 proc.) tiriamųjų buvo nustatyta dauginė mieloma. Likusių ligų grupių pasiskirstymas sudarė nuo 3,8 proc. iki 1,9 proc. Literatūros šaltiniuose nurodoma, kad monokloninės gamapatijos, ypač dauginė mieloma, yra dažna inkstų pažeidimo priežastis dėl besikaupiančio M baltymo (70). 33
3,8 proc. I gr. Dauginė mieloma 57,7 proc. 26,9 proc. II gr. Valdenštremo makroglobulinemija III gr. MNRG IV gr. Limfoproliferaciniai susirgimai V gr. Amiloidozė 1,9 proc. 1,9 proc. 1,9 proc. 3,8 proc. 1,9 proc. N=52 VI gr. Ekstramedulinė plazmacitoma VII gr. Inkstų ligos VIII gr. Kitos ligos 7 pav. Pacientų pasiskirstymas pagal diagnozių grupes Santrumpos: MNRG monokloninė neaiškios reikšmės gamapatija Analizuojant duomenis buvo lyginamas ligų pasiskirstymas pagal lytį. Statistiškai reikšmingas ligų dažnio skirtumas tarp lyčių nenustatytas (žr. 8 pav.). 8 pav. Ligų grupių pasiskirstymas pagal lytį Santrumpos: MNRG monokloninė neaiškios reikšmės gamapatija 34
Tiriamieji, procentais Didžiausią dalį tiriamųjų sudarė sergantys inkstų ligomis ir daugine mieloma. Palyginus šias dvi diagnozes tarp lyčių, buvo nustatytas statistiškai reikšmingas dažnio skirtumas (χ 2 =5,692, p=0,017) (9 pav.). Inkstų ligomis dažniau sirgo vyrai nei moterys. Steiner N su bendraautoriais taip pat nustatė, kad vyrai dažniau nei moterys serga inkstų ligomis, susijusiomis su monoklonine gamapatija (71). O sergančiųjų daugine mieloma dažnis buvo didesnis moterų grupėje lyginant ją su vyrų grupe. Kitų diagnozių pasiskirstymas pagal lytį papildomai nevertintas dėl mažo tiriamųjų skaičiaus. 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 x 2 =5,692, p=0,017, N=44 85,7 Vyrai N=21 52,2 Moterys N=23 47,8 14,3 Dauginė mieloma Inkstų ligos Ligų grupės 9 pav. Dauginės mielomos ir inkstų ligų pasiskirstymas pagal lytį Mūsų darbe buvo įvertintas IFN, HD ir CD dažnis vyrų ir moterų grupėse (žr. 3 lentelę). Pastebėta, jog abiejose grupėse vienodai dažnai buvo diagnozuotas IFN, CD ir atliekama hemodializė. Rodiklis IFN HD CD 3 lentelė. Gretutinių ligų pasiskirstymas pagal lytį Vyrai N=24 n/n (proc.) 19/24 (79,2) 11/24 (45,8) 7/24 (29,2) Moterys N=28 n/n (proc.) 20/28 (71,4) 13/28 (46,4) 4/28 (14,3) p reikšmė 0,749 1,000 0,135 Santrumpos: IFN inkstų funkcijos nepakankamumas, HD hemodializė, CD cukrinis diabetas, p pasikliautinasis intervalas. 35
Mūsų tyrimo metu buvo lyginami bendro baltymo, albumino kiekių, inkstų būklę atspindinčių rodiklių (kreatinino, agfg, šlapalo), imunoglobulinų (G, A, M), κ ir λ lengvų grandinių, κ/λ lengvų grandinių santykio, κ ir λ laisvųjų lengvųjų grandinių, κ/λ laisvųjų lengvųjų grandinių santykio laboratoriniai rodikliai vyrų ir moterų grupėse (4 lentelė). Analizuojant kiekybinius rodiklius, nustatyta, kad šlapalo (p=0,029) ir κ/λ laisvųjų lengvųjų grandinių santykio (p=0,013) rezultatai buvo statistiškai reikšmingai didesni vyrų grupėje. Kitų tirtų rodiklių bendro baltymo, albumino, kreatinino, agfg, šlapalo, imunoglobulinų (G, A, M), κ ir λ lengvųjų grandinių, κ/λ lengvųjų grandinių santykio, κ ir λ laisvųjų lengvųjų grandinių statistiškai reikšmingų skirtumų tarp grupių nenustatyta (4 lentelė). Rodiklis, matavimo vienetai 4 lentelė. Laboratorinių rodiklių reikšmės vytų ir moterų grupėse. Vyrai N=24 Mediana (25-ta 75-ta procentilės) Moterys N=28 Mediana (25-ta 75-ta procentilės) p reikšmė Baltymas, g/l 66,5 (57,50; 71,50) 62,5 (59,0; 73,50) 0,941 Albuminas, g/l 35,5 (31,25; 39,75) 33,5 (28,25; 37,0) 0,146 Kreatininas, μmol/l 328,5 (162,50; 553,25) 194,0 (89,25; 482,0) 0,106 agfg, ml/min/1,73m 2 17,15 (8,20; 43,93) 21,6 (7,40; 62,23) 0,545 Šlapalas, mmol/l 17,25 (9,28; 24,65) 9,8 (5,75; 21,60) 0,029 IgG, g/l 9,8 (4,85; 17,31) 11,04 (5,55; 17,99) 0,623 IgA g/l 1,67 (1,14; 6,23) 1,14 (0,37; 2,49) 0,099 IgM, g/l 0,56 (8,20; 43,93) 0,71 (0,39; 1,35) 0,383 κ lengvosios grandinės, mg/l 7,3 (7,28) 12,5 (12,20) 0,333 λ lengvosios grandinės, mg/l 4,45 (4,27) 8,72 (8,28) 0,333 κ/λ lengvųjų grandinių santykis 1,64 (1,58) 1,43 (1,33) 0,333 κ laisvosios lengvosios grandinės, g/l 54,7 (11,04; 279,63) 30,8 (17,20; 57,20) 0,296 λ laisvosios lengvosios grandinės, g/l 30,3 (6,71; 89,25) 41,4 (19,10; 147,0) 0,190 κ/λ laisvųjų lengvųjų grandinių santykis 1,54 (0,95; 2,72) 0,87 (0,10; 1,23) 0,013 Santrumpos: agfg apskaičiuotas glomerulų filtracijos greitis, p pasikliautinasis intervalas. Vertinant kiekybinius rodiklius, ženklių pokyčių, išskyrus šlapalą ir κ/λ laisvųjų lengvųjų grandinių santykį, nenustatyta, todėl mūsų tyrimo metu vyrų ir moterų grupėse buvo vertinamas laboratorinių rodiklių patologinių rezultatų dažnis. Kreatininas, agfg, ir šlapalas inkstų būklę atspindintys rodikliai. Kreatinino koncentracija kraujyje priklauso nuo raumenų masės, todėl vyrų kreatinino referentinės ribos didesnės nei moterų (72). Vyrų grupėje inkstų funkcijos sutrikimams būdingi tyrimų pokyčiai kreatinino ir šlapalo koncentracijos, viršijančios referentines ribas, o agfg, nesiekiantis referentinių ribų, nustatyti statistiškai reikšmingai dažniau nei moterų grupėje (atitinkamai 36
kreatinino 95,8 proc. ir 67,9 proc., Fisher, p=0,014; šlapalo 95,8 proc. ir 60,7 proc., χ 2 =8,979, p=0,003; agfg 95,8 proc. ir 71,4 proc., Fisher, p=0,028). Mūsų tyrimo metu taip pat buvo analizuojami bendro baltymo, albumino, IgG, IgA, IgM, patologinių rezultatų dažniai vyrų ir moterų grupėse. Bendro baltymo ir albumino patologinių rezultatų dažnis vyrų ir moterų grupėse reikšmingai nesiskyrė (atitinkamai bendro baltymo 4,2 proc. ir 17,9 proc., Fisher=3,009, p=0,234; albumino 41,7 proc. ir 57,1 proc., Fisher=1,243, p=0,404). Analizuojant kiekybinius imunoglobulinų (G, A, M) duomenis, pastebėta, jog tiek vyrų, tiek moterų grupėse IgG patologinių rezultatų dažnis reikšmingai nesiskyrė (atitinkamai vyrų 30,8 proc, moterų 26,3 proc., Fisher=1,025, p=1,000). Vyrų ir moterų grupėse tiriant IgA koncentracijas, statistiškai reikšmingo patologinių rezultatų dažnio skirtumo nenustatyta (atitinkamai vyrų 30,8 proc., moterų 5,3 proc., Fisher=4,638, p=0,132). Moterų grupėje viršijanti referentines ribas IgM koncentracija nustatyta 15,8 proc. tiriamųjų, o vyrų grupėje buvo rastos tik normalios arba nesiekiančios referentinių ribų koncentracijos. IgM patologinių rezultatų dažnis reikšmingai nesiskyrė, Fisher=2,146, p=0,253. Analizavome κ ir λ laisvųjų lengvųjų grandinių, κ/λ laisvųjų lengvųjų grandinių santykio, κ ir λ lengvųjų grandinių, κ/λ lengvųjų grandinių santykio patologinių rezultatų dažnius vyrų ir moterų grupėse. Statistiškai reikšmingas patologinių rezultatų dažnio skirtumas (Fisher=8,225, p=0,015) buvo nustatytas vertinant κ/λ laisvųjų lengvųjų grandinių santykį vyrų ir moterų grupėse. Tyrimo duomenimis, žemiau referentinių ribų, šis rodiklis buvo nustatomas tik moterų grupėje 34,8 proc. tiriamųjų. Viršijantis referentines ribas κ/λ laisvųjų lengvųjų grandinių santykis vyrų grupėje buvo nustatytas 46,2 proc. tiriamųjų, o moterų grupėje 13,0 proc. tiriamųjų. Atlikome κ/λ laisvųjų lengvųjų grandinių santykio normalių ir patologinių rezultatų analizę pacientams su skirtingomis diagnozėmis (5 lentelė). Didžoji dalis tiriamųjų buvo sergantys daugine mieloma ir inkstų ligomis. Iš 5 lentelėje pateiktų duomenų matyti, jog statistiškai reikšmingai dažniau (Fisher=2,497, p=0,001) patologiniai κ/λ laisvųjų lengvųjų grandinių santykio rezultatai aptinkami esant mielominei ligai, tuo tarpu sergantiems inkstų ligomis patologinis rezultatas buvo gautas tik trečdaliui tiriamųjų. Matyti, jog esant monokloninėms gamapatijoms (Valdenštremo makroglobulinemija, limfoproliferaciniai susirgimai, ekstramedulinė plazmacitoma, amiloidozė ir kita) su maža tiriamųjų imtimi, κ/λ laisvųjų lengvųjų grandinių santykio patologiniai rezultatai nustatyti pavieniais atvejais arba visai nenustatyti. κ ir λ lengvųjų grandinių, κ/λ lengvųjų grandinių santykio tyrimai pacientams buvo atliekami itin retai arba visai neatliekami ir reikšmingo rezultatų dažnio skirtumo nebuvo nustatyta. 37
κ/λ santykio reikšmės 5 lentelė. κ/λ laisvųjų lengvųjų grandinių santykio rezultatų pasiskirstymas tarp pacientų su skirtingomis diagnozėmis I gr. n=13 n (proc.) II gr. n=0 n (proc.) III gr. n=1 n (proc.) IV gr. n=2 n (proc.) V gr. n=1 n (proc.) VI gr. n=1 n (proc.) VII gr. n=17 n (proc.) VIII gr. n=1 n (proc.) Normalus 3 (23,1) 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (100) 0 (0,0) 1 (100) 13 (76,5) 0 (0,0) Patologinis 10 (76,9) 0 (0,0) 1 (100) 0 (0,0) 1 (100) 0 (0,0) 4 (23,5) 1 (100) Santrumpos: I gr. Dauginė mieloma, II gr. Valdenštremo makroglobulinemija, III gr. MNRG (monokloninė neaiškios reikšmės gamapatija), IV gr. Limfoproliferaciniai susirgimai, V gr. Amiloidozė, VI gr. Ekstramedulinė plazmacitoma, VII gr. Inkstų ligos, VIII gr. Kitos ligos. Literatūros šaltiniuose nurodoma, jog kiekybinis κ ir λ laisvųjų lengvųjų grandinių bei jų santykio kiekis yra informatyvus rodiklis identifikuojant monoklonines gamapatijas, ypač lengvųjų grandinių ligas, tokias kaip lengvųjų grandinių mieloma. Aukštos κ ir λ laisvųjų lengvųjų grandinių koncentracijos serume ir patologinis jų santykio rezultatas yra susiję su padidėjusia inkstų pažeidimo rizika (73, 74). Dejoie T ir kt. tyrimų duomenimis, monokloninės serumo FLC koncentracijos, esančios virš referentinių ribų, buvo nustatytos visiems pacientas, kuriems buvo diagnozuota lengvųjų grandinių dauginė mieloma (75). Lenkijos mokslininkai Jurczyszyn A, Ochrem B taip pat aprašo atvejus, kuomet κ/λ santykio patologiniai rezultatai dažniausiai buvo nustatomi sergantiems daugine mieloma, o rečiau esant kitoms monokloninėms gamapatijoms (76). Klinikinės praktikos aspektas yra tas, kad esant inkstų nepakankamumui, serume gali būti aptinkamos serumo FLC patologinės reikšmės dėl sumažėjusio filtracijos greičio. Tačiau, Barselonos mokslininkai Campos ML ir kt. teigia, jog daugumai pacientų, sergančių inkstų nepakankamumu, kuris nebuvo sukeltas monokloninės gamapatijos, buvo gauti normalūs serumo FLC rezultatai, bet taip pat nurodoma, kad patologinis κ/λ santykio rezultatas yra proporcingas inkstų ligos progresavimui (77). Mūsų tyrime buvo analizuojami SPE ir SPIFE tyrimų duomenys vyrų ir moterų grupėse. Vyrų grupėje SPE buvo atlikta 95,8 proc. (n=23/n=24) tiriamųjų. 21,7 proc. tirtų vyrų nustatytas M komponentas. Moterų grupėje tyrimas atliktas 92,8 proc. (n=26/ N=28) tiriamųjų ir M komponentas nustatytas 37,0 proc. tiriamųjų. M komponentas skirtingų lyčių pacientams SPE metodu buvo nustatytas vienodai dažnai (Fisher=3,217, p=0,166). SPIFE buvo atlikta visiems tiriamiesiems vyrų grupėje ir 92,6 proc. tiriamųjų moterų grupėje (dviems iš jų SPIFE nebuvo atlikta). Šiuo metodu M komponentas (jo tipas) statistiškai reikšmingai dažniau buvo nustatomas moterų grupėje lyginant su vyrų grupe (atinkamai 63,0 proc. ir 30,4 proc., Fisher=8,074, p=0,014). Tyrimo metu vyrų ir moterų grupėse buvo lyginami pacientų, kuriems buvo atliktas M komponento nustatymas (SPE) ir jo tipo identifikavimas (SPIFE), rezultatai. Rezultatų pasiskirstymas pateikiamas 10 paveiksle. 38
A B 10 pav. M komponento (ar jo tipo) nustatymas skirtingais metodais vyrų (A) ir moterų (B) grupėse Santrumpos: SPE serumo baltymų elektroforezė, SPIFE serumo baltymų imunofiksacinė elektroforezė Mūsų tyrimo metu, buvo nustatyta, kad tiek vyrų, tiek moterų grupėse M komponentas (jo tipas) didžiajai daliai tiriamųjų buvo nustatomas SPIFE metodu, tuo tarpu, SPE metodu aptinkamas tik dešimtadaliui tiriamųjų. Vyrų grupėje M komponentas abiem metodais buvo nustatytas 50 proc. tiriamųjų, o moterų grupėje 44,4 proc. tiriamųjų, tačiau reikšmingo dažnių skirtumo tarp grupių nenustatyta. Smith J ir kt. bei Tsui AKY ir kt. tyrimais patvirtino, jog kokybinis SPIFE tyrimas turi didesnį jautrumą nei kiekybinis SPE taip pat Willrich MAV ir Katzmann JA atliktame tyrime nurodoma, jog, lyginant skirtingas monoklonines gamapatijas, SPIFE metodu M baltymas (jo tipas) buvo nustatomas dažniau, nei aptinkamas SPE metodu (15). Diferencijuojant SPIFE radinius pagal identifikuotų baltymų tipą, nustatyta, kad moterų grupėje tik monoklonas buvo nustatytas statistiškai reikšmingai dažniau (Fisher=10,864, p=0,021) nei vyrų grupėje (atitinkamai 50,0 proc. ir 25,0 proc.). Moterų grupėje buvo rastas monoklonas kombinacijoje su biklonu 7,1 proc. tiriamųjų ir monoklonas kombinacijoje su oligokloninėmis juostomis 3,6 proc. tiriamųjų, o vyrų grupėje buvo nustatytas monoklonas kombinacijoje su oligokloninėmis juostomis 4,2 proc. tiriamųjų. Moterų grupėje tik oligokloninės juostos buvo nustatytos 3,6 proc. tiriamųjų, o vyrų grupėje tik biklonas buvo rastas 4,2 proc. tiriamųjų, tačiau į skaičiavimus nebuvo įtraukti. Tyrimo metu SPIFE metodu buvo nustatyti monokloninio komponento tipai, kurių vertinimo variantai bei pasiskirstymas tarp lyčių pateikiamas 6 lentelėje. 39