Lab_Med_2016_Nr3.vp

Transkriptas

1 MOKSLO DARBAI SCIENTIFIC PAPERS Laboratorinë medicina. 2016, t. 18, Nr. 3(71), p Trumpø de novo iðkritø ir intarpø intensyvumo ávertinimas skirtinguose þmogaus genomo regionuose Laura Pranckënienë Vaidutis Kuèinskas Vilniaus universiteto Þmogaus ir medicininës genetikos katedra Department of Human and Medical Genetics, Faculty of Medicine, Vilnius University El. paðtas: Santrauka Darbo tikslas. De no vo mutacijos yra svarbiausias biologinis parametras, todël þinios apie jø savybes, daþná bei susidarymo mechanizmus turi daug átakos mûsø gebëjimui suprasti demografijos ir evoliucijos fenomenus. Nepaisant tiksliø DNR replikacijos ir reperacijos mechanizmø, kiekvienas þmogus turi vidutiniðkai 60 (25 60) nedideliø (<20 bp) de no vo mutacijø. Iki atsirandant didelës skiriamosios gebos viso genomo sekoskaitos technologijoms de no vo mutacijos buvo nustatomos tik atsitiktinai tiriant su liga susijusià genetinæ sritá. Dabar DNR sekoskaitos technologijø paþangos dëka de no vo mutacijos gali bûti identifikuojamos visame þmogaus genome. Ðio darbo tikslas panaudojus naujos kartos egzomo sekoskaitos duomenis atlikti trumpø de no vo iðkritø ir intarpø analizæ lietuviø ðeimø grupëje. Tyrimo medþiaga ir metodai. Ðio ty ri mo me tu bu vo analizuoja mi 48 triadø (tëvas, motina ir bent vienas vaikas) egzomø duomenys. Sekoskaita atlikta naujos kartos 5500 SOLiD Se quencer genetiniu analizatoriumi. Gauti duomenys apdoroti Lifescope ir GATK (angl. Genome Analysis Toolkit) 3.5 versijos bioinformaciniais árankiais. Tolesnei analizei panaudoti duomenys tik tø egzomø, kuriø padengimas buvo ne maþesnis nei 20 kartø. Klaidingai teigiamiems rezultatams atmesti panaudotos dvi filtravimo sistemos. Variantø apraðai gauti ANNOVAR bioinformaciniu árankiu, kuris su jun gë duo me nis ið 1000 ge no mø, ESP6500 pro jek tø, taip pat ið ClinVar duomenø bazës. Statistinë duomenø analizë atlikta versijos R paketu. Tyrimo rezultatai ir iðvados. Ðio ty ri mo me tu nu sta ty ti trum pi de no vo in tar pai ir ið kri tos pa pil do ku ria mà lie tu viø po pu lia ci jos re fe - ren ti næ ge no mo duo me nø ba zæ, o ap skai èiuo tas de no vo mu ta ci jø daþ nis (ver ti na mas kaip nuo lai ko pri klau so mas kin ta ma sis) at ei ty je ga lës bû ti tai ko mas rû ðiø ir (ar) po pu lia ci jø di ver gen ci jos ana li zei. Ðio ty ri mo me - tu ap skai èiuo tas de no vo in de liø daþ nis lie tu viø po pu lia ci jos eg zo me yra 1, Di dþi à jà vi sø nu sta ty tø de no vo mu ta ci jø da lá su da rë 1 4 nu - kle o ti dø il gio ið kri tos ar in tar pai. Pri klau so my bë tarp nu sta ty to de no vo mu ta ci jø skai èiaus ir chro mo so mos dy dþio bei ge nø tan kio chro mo so mo - se ne nu sta ty ta, o ko re lia ci ja tarp të vø am þiaus ir ly ti në se làs te lë se ávy - kusiø de no vo mutacijø nëra reikðminga. Reikð mi niai þo dþiai: de no vo mu ta ci jos, mu ta ci jø daþ nis, in de liai, lie - tu viø po pu lia ci ja, ge no mo va rian tai. ÁVADAS Tobulëjant didelës skiriamosios gebos vi so ge no mo se kos kai tos tech no lo gi - joms ir gautø duomenø analizës apdo - ro ji mo al go rit mams, ta po áma no ma kategorizuoti milijonus vieno nukleo - ti do po li mor fiz mø (VNP), in de liø 118 LABORATORINË MEDICINA 2016, t. 18, Nr. 3(71)

2 Trumpø de novo iðkritø ir intarpø intensyvumo ávertinimas skirtinguose þmogaus genomo regionuose (1 20 nt il gio ið kri tos ar in tar pai) bei struk tû ri niø va rian tø (>20 nt il gio se - kos). Po pu lia ci jai spe ci fi nis ge no mø variantø katalogas svarbus tiek klini - ki niams, tiek vi suo me nës svei ka tos ty ri mams, pa vyz dþiui, vi so ge no mo asociacijos ar maþo padengimo sekos - kaitos tyrimuose, siekiant palengvinti retø variantø priskyrimà poþymiui ar ligai dël ne vi so ar ne pa kan ka mo re fe - renti nio ge no mo duo me nø. Iðsamiai nustatyti ið tëvø nepavel - dëtus (de no vo) skir tin gus ge no mo va - riantus galima tik panaudojus specifi - næ tyrimø strategijà triadø (tëvas, motina ir bent vienas vaikas) genomo ar eg zo mo ty ri mà. Ty ri mo me tu ga li - ma áver tin ti, ku rie ge no mo va rian tai buvo pa vel dë ti vie no ið të vø ar ba ið abiejø, o kurie susidarë naujai. Tradi - ciðkai de no vo mutacijø savybës buvo tiriamos naudojant modelinius organiz mus, ana li zuo jant vi sið ku pe net ra - tið ku mu pa si þy min èias, do mi nan ti - nes, pagal Mendelio dësnius paveldi - mas li gas [2, 3] ir tai kant ly gi na mo sios bei po pu lia ci nës ge ne ti kos [4, 5] me to - dus. Pritaikius naujos kartos sekos - kaitos metodus gauta daug naujø þi - niø apie de no vo mutacijas. Ðiuo metu nu sta ty ta, kad vie no nu kle o ti dø po li - mor fiz mø daþ nis yra vi du ti nið kai 1, [6], o trum pø ið kri tø ir in tar - pø nuo 0, [7] iki 1, [8]. Þinios apie þmogaus mutacijø daþnius ir susidarymo modelius yra svarbios analizuojant tarprûðinius ir tarpopu - liacinius [9, 10] santykius, leidþia ap - tikti natûralià atrankà [6, 11] ir pa - brëþ ti es mi nius ge nø bruo þus. Olandø mokslininkø grupë nustatë, kad mutacijø daþnis didëja kartu su të vo am þiu mi [12, 13]. Të vo am þius pa - aiðkina apie 95 % bendro mutacijø daþ - nio þmoniø populiacijoje [1]. Apskaièiuo ta, kad per vie ne rius të vo me tus ly - tinëse làstelëse padaugëja nuo vienos iki dvie jø de no vo mutacijø. Tai lemia nepertraukiamas tëvo lytiniø làsteliø dalijimosi procesas, kuris tæsiasi visà vyro gyvenimà nuo embriono vystymosi iki primordialiniø lytiniø làsteliø. Ankstesni tyrimai parodë, kad epi - gene ti në ge no mo ap lin ka kin ta su am - þiu mi [14], to dël spon ta ni niø mu ta ci jø in ten sy vu mo ty ri muo se jai taip pat skiriama daug dëmesio [7]. Atsiþvel - gus á genetiniø srièiø replikacijos laikà, nustatyta asociacija tarp tëvo amþiaus ir de no vo mu ta ci jø vie tos ge no - me. Paaiðkëjo, kad jaunesniø (<28 me - tø) të vø vai kø ge no muo se de no vo mu - tacijø daþnis didesnis anksti besirepli - kuojan èiuo se ge no mo re gio nuo se, ta - èiau vy res niø të vø (>28 me tø) ge no - muose ði priklausomybë neaptikta [3]. Aso cia ci jos ne nu sta ty ta ir su ki tais epigenetiniais veiksniais, tokiais kaip chro ma ti no pri ei na mu mas, mo di fi ka - cijos ar rekombinacijos daþnis. Neatsiþvelgus á tëvo amþiø, dides - nis de no vo mutacijø daþnis yra funk - ciniuose regionuose. Nustatyta, kad de novo mutacijø daþnis egzonuose yra 1,22 % didesnis nei nekoduojanèiuose regionuose [12]. Remiantis GoNL pro - jekto analizës duomenimis apskaièiuo - ta, kad su lig kiek vie nais të vo am þiaus metais de no vo mutacijø dalis geniniuose regionuose didëja 0,26 %, taigi vidutiniðkai vaikas, gimæs 40 metø të - vui, turës dvigubai daugiau mutacijø ge ni niuo se ir apie 55 % dau giau tarp - geniniuose regionuose nei vaikas, gi - mæs 20 me tø të vui [4, 9]. Di des nis mu - tacijø daþnis ðiose genomo srityse, manoma, yra dël CpG dinukleotidø. Aiðkinama, kad metilintos CpG salelës þymi didelá mutavimo daþná turinèias genomo sritis, ir nors natûraliai evo - liucionuojanèios sekos turëjo pakankamai laiko dinukleotidø konteksto atþvilgiu iðsigryninti, iðgryninanèioji atranka funkciniuose regionuose iðlaikë hipermutabilius CpG [6, 15]. Taigi ga - lima daryti iðvadà, kad didëjant tëvo am þiui ne tik di dë ja de no vo mutacijø daþnis, bet kartu atsiranda mutacijø, susijusiø su DNR replikacijos laiku, susidarymo, pasiskirstymo chromoso - mose ir funkcinio poveikio pokyèiø. De no vo mutacijø pasiskirstymas visame genome ir tarp individø geno - mø nëra atsitiktinis. Pastebëtas dalies 1 pav. A. Aleliø balanso pasiskirstymas tarp de novo indeliø. De novo variantai su ma þa (<0,3) aleliø balanso reikðme vertinami kaip somatiniai, o va ri - an tai su didesniu nei 0,3 aleliø balansu kaip lytinëse làstelëse susidaræ de novo variantai. B. De novo indeliø il giø pasiskirstymas. Neigiamos reikðmës iðkritø ilgiai, tei gia - mos intarpø ilgiai, nt nu kleo ti dai. Fig. 1. A. Allele balance distribution of the de novo indels. De novo vari ants with low (<0.3) al lele bal ance are con sid ered to be so matic mu ta tions while with higher than 0.3 al leles bal ance are con sid ered to be germline mu ta tions. B. The indel length dis tri bu tion. Neg a tive val ues de le tions lengths, pos i tive the in - ser tion lengths, nt nu cleo tides. LABORATORINË MEDICINA 2016, t. 18, Nr. 3(71) 119

3 Laura Pranckënienë, Vaidutis Kuèinskas 2 pav. De novo indeliø ir tëvø amþiaus koreliacija. Lytinëse làstelëse susidariusiø de novo indeliø koreliacija su tëvo (kairiame grafike) ir motinos (deðiniame grafike) nëra reikðminga, atitinkamai r t =0,17, p=0,47 ir r m =0,16, p=0,49. Fig. 2. Correlation of de novo indels rate and par ents age. The cor re la tion be tween pa ter nal (or ma ter nal) age and the rate of germline indels is not sig nif i cant, re spec tively r t =0.17, p=0.47 and r m =0.16, p=0.49. de no vo mu ta ci jø gru pa vi ma sis po 2 3 mutacijas á klasterius, kuriuose nuo vie nos mu ta ci jos iki ki tos yra ~20 kb [1]. Vis gi á klas te rius gru puo ja - si tik apie treèdalis visø nustatomø de no vo mu ta ci jø, ir reikð min gø skir tu - mø tarp mutacijø klasteriø ir pavieniø mu ta ci jø re kom bi na ci jos daþ nio bei replikacijos laiko nenustatyta. Ðiame tyrime triadø tyrimo strate - gija leido nustatyti ir analizuoti ne tik skirtingø de no vo in de liø va rian tø, bet ir at ski rø ge no mo sri èiø de no vo mu ta - cijø daþná tirtoje lietuviø grupëje. TYRIMO MEDÞIAGA IR METODAI Tiriamoji medþiaga DNR, iðskirta ið veni nio krau jo leu ko ci tø fe no lio-chlo - ro for mo me to du. Ti ria mø jø gru pæ su - daro 48 triados, sudarytos ið tëvo, mo - ti nos ir bent vie no vai ko, ku riø bent trys kartos lietuviø tautybës ir gyvena tame pa èia me Lie tu vos et no ling vis ti - nia me re gio ne (Ðiau rës, Pie tø, Va ka rø Þe mai ti ja ir Ry tø, Pie tø, Va ka rø Aukð tai ti ja). Krau jas su rink tas ir DNR ið skir ta VU MF Þmo gaus ir me - dici ni nës ge ne ti kos ka ted ros (ÞMGK) darbuotojø. De no vo mu ta ci jø in ten sy - vumo tyrimui tiriamøjø egzomø se - kos kai ta at lik ta ÞMGK dar buo to jø 5500 SOLiD Se quencer ge ne ti niu ana li za to riu mi. Gau ti duo me nys ap - do ro ti Lifescope bioinformaciniu áran - kiu naudojant standartinius progra - mos parametrus. Kiekvienà triadà su - da ran èiø ti ria mø jø duo me nys su jung - ti ir sulyginti panaudojus programos GATK (angl. Ge nome Anal y sis Toolkit) 3.5 versijà. Siekiant iðvengti klaidingai teigiamø rezultatø, de no vo indeliø identifikavimui buvo taikomos dvi filtravimo sistemos. Pirmoji filtra - vimo sistema tolesnei analizei atrinko tik tuos va rian tus, kur ti ria mø jø ge - no ti pa vi mo kokybës rodiklis (GK) buvo 50, o fragmentø skaièius tiriamo - joje genetinëje srityje (DP) 10. At - rink ti va rian tai dar kar tà pa ly gin ti tarp triadà sudaranèiø asmenø. Toles - nei analizei atrenkami visi variantai, ku riuos tu ri pa li kuo nis, o abu të vai ne tu ri. Gau tiems duo me nims tai ky ta antroji filtravimo sistema atrinkti va rian tai, ku riø GK 50 ir ale liø ba - lansas (sekoskaitos fragmentø dalis, ku rio je nu sta ty tas de no vo in de lis) [0,3; 0,7]. Ge no ti po ho mo zi go tið ku - mas ver tin tas pa gal ge no ti po (GT) reikðmes: 1/1 homozigotinis, 0/1 he te ro zi go ti nis ge no ti pas. Va rian tø apraðai gauti ANNOVAR bioinformaci niu áran kiu, ku ris su jun gë duo me nis ið 1000 ge no mø, ESP6500 pro jek tø, taip pat ið Cli nvar duo me nø ba zës. Sta tis ti në duo me nø ana li zë at lik ta versijos R paketu. TYRIMO REZULTATAI Siekiant identifikuoti genomines pozi - ci jas, ku rio se yra de no vo in de liø (1 20 nt il gio ið kri tø ar in tar pø), bu vo pri tai ky tos dvi fil tra vi mo sis te mos, skirtos klaidingai teigiamø rezultatø atrankai. Pritaikius pirmàjà filtravi - mo sistemà (GK 50 ir DP 10) nu sta - tyta de no vo indeliø mediana yra 22, po antrosios (GK 50 ir ale liø ba lan sas [0,3; 0,7]) me dia na 1. Ap skai èiuo - tas de no vo indeliø daþnis egzome yra 1, (pasikliautinasis 95 % intervalas 1, , ). Di dþi à jà dalá visø nustatytø de no vo mutacijø su da rë 1 (51%), 2 (12 %), 3 (14 %) ir 4 (14 %) nukleotidø ilgio iðkritos ar in - tarpai (1 pav.). Priklausomybës tarp nustatyto de no vo mutacijø skaièiaus ir chromosomos dydþio bei genø tankio chro mo so mo se ne rasta (ati tin ka mai p=0,73 ir p=0,43). Ko re lia ci ja tarp të - vø amþiaus ir lytinëse làstelëse ávyku - siø de no vo mu ta ci jø (2 pav.) në ra reikð min ga. Dau giau nei 90 % vi sø nu - statytø trumpø de no vo ið kri tø ir in - tar pø yra in tro nuo se (3 pav.) ir reikð - mingo funkcinio poveikio neturi. REZULTATØ APTARIMAS IR DISKUSIJA Tiks liai nu sta ty ti de no vo mu ta ci jø daþ ná yra svar bu ti riant þmo gaus evo - liucijà. Visgi ávertinti de no vo mutaci - jø daþ ná yra daug sun kiau, nei nu sta - tyti de no vo ávyká genome. Pritaikius dvi naujas inovatyvias filtravimo sis - temas nustatytas trumpø de no vo in - tarpø ir iðkritø daþnis lietuviø popu - liacijos egzome yra 1, Pri tai - kytos filtravimo sistemos, kaip ir al - ternatyvi de no vo va rian tø nu sta ty mo 120 LABORATORINË MEDICINA 2016, t. 18, Nr. 3(71)

4 Trumpø de novo iðkritø ir intarpø intensyvumo ávertinimas skirtinguose þmogaus genomo regionuose 3 pav. De novo indeliø pasiskirstymas pagal funkcijà. 3 UTR 3 gale netransliuojama genetinë sritis. Fig. 3. Distribution of de novo indels func tion. 3 UTR un trans lated re gion. Denovo Gear programa [16], pagrásta Vater so no (angl. Watterson) statisti - niu áver èiu, at me të ~95 % klai din gai teigiamø rezultatø, kas árodo, kad va - riantø atranka vyko efektyviai. Ap - skaièiuotas de no vo indeliø daþnis yra didesnis, nei nustatytas kitø moksli - nin kø gru piø (1, [8], 0, [7]). Ðá skirtumà tikëtinai lemia tirta genomo dalis, kadangi þmogaus egzomas su da ro tik ~1,5 % vi so ge no mo, ir de no vo va rian tø daþ nio for mu liø var - dik lio de ter mi nan tës, bet ne fak tið kai nustatytas de no vo mutacijø skaièius. Koreliacijos tarp trumpø de no vo intarpø ir iðkritø daþnio egzome bei të vo ir mo ti nos am þiaus, kaip ir ki tuo - se mokslininkø populiaciniuose tyri - muose [8], nenustatyta. Prieþastis ga - lë tø bû ti ta, kad ðio ti po de no vo mu ta - ci jø ge no me yra tie siog per ma þai, kad bûtø nustatyta koreliacija tiek su tëvø am þiu mi, tiek su vie ta ge no me ar ge nø tan kiu chromosomose. Nustatyti visus genomo variantus yra svarbu ne tik geresniam populiaci - jos jautrio ir polinkio sirgti specifinë - mis ligomis supratimui, bet ir dides - niø kohortø klinikiniams bei populia - ciniams tyrimams ateityje. Taigi, sie - kiant uþ pil dy ti lie tu viø po pu lia ci jos vi so ge nomo katalogo de no vo variantø spragà, bûtini tolesni viso genomo de no vo mutacijø intensyvumo tyrimai. IÐVADOS Nustatytas trumpø de no vo intarpø ir iðkritø daþnis lietuviø populiacijos eg - zo me yra 1, Didþiàjà dalá visø rastø de no vo mutacijø sudarë 1 4 nu - kleotidø ilgio iðkritos ar intarpai. Pri - klausomybës tarp nustatyto de no vo mutacijø skaièiaus ir chromosomos dy - dþio ar genø tankio chromosomose ne - rasta, o koreliacija tarp tëvø amþiaus ir lytinëse làstelëse ávykusiø de no vo mu - tacijø nëra reikðminga. Ðiame tyrime nustatyti trumpi de no vo in tar pai ir ið - kritos papildo kuriamà lietuviø popu - liacijos referentinæ genomo duomenø bazæ, o apskaièiuotas de no vo mutacijø daþnis (vertinamas kaip nuo laiko pri - klausomas kintamasis) ateityje galës bûti taikomas analizuojant rûðiø ir (ar) populiacijø divergencijà. Straipsnis parengtas naudojant vi suo - tinës dotacijos projekto LITGEN (VP1-3.1-ÐMM-07-K ) duomenis. Gauta: Priimta spaudai: Summary AN EVALUATION OF DE NOVO INDELS INTENSITY IN THE DIFFERENT REGIONS OF HUMAN GENOME Laura Pranckënienë, Vaidutis Kuèinskas Background. De novo mu ta tions are the source of all evo lu tion ary ad ap ta tions and her i ta ble dis eases, there fore char ac - ter iz ing their prop er ties and the rate at which they arise is of fun da men tal im - por tance in stud ies of hu man ge nome evo lu tion. Due to tech ni cal lim i ta tions de cades of mu ta tion rate and prop er ties anal y ses have fo cused on a rel a tively small num ber of loci us ing fully penetrant dom i nant Men de lian dis eases and model or gan isms. How ever, ad - vances in sequencing technology allow for an empirical assessments of mutation in the whole ge nome. Thus the aim of this study was us ing new gen er a tion whole exome se quenc ing data to do anal y sis of de novo indels in Lithuanian population. Ma te rial and meth ods. The study group in cluded 48 fam i lies mother, fa ther and off spring. We used SOLiD 5500 se - quenc ing sys tem, Lifescope and GATK ver - sion 3.5 soft ware to de tect and an a lyze de novo mu ta tions in hu man exome. We em - ployed an ap proach to fil ter the ef fec tive num ber of genomic po si tions where we would be able to call de novo mutation. Functional annotation of genomic variants were per formed us ing ANNOVAR in clud - ing fre quen cies of genomic vari ants from 1000 Genomes pro ject (1000G), ESP6500 pro ject and ClinVar da ta base. Sta tis ti cal anal y sis was car ried out in the R pack age, ver sion Results and conclusions. The hu - man ge nome con tin u ously evolves as a re sult of the mu ta tion and se lec tion. Our iden ti fied dis tri bu tion of pri mary set of de novo mutations in Lithuanian popula - tion en riches cur rent state of sci en tific knowledge and Lithuanian reference ge - nome da ta base. Gath ered data and re - sults will be im por tant for fu ture clin i cal pop u la tion-based stud ies and larger co - horts. We es ti mate the mu ta tion rate of short germline indels to be The big ger part of all iden ti fied indels was de - le tions or in ser tions from 1 to 4 length of nu cle o tide. There was no re la tion ship be - tween the chro mo some size and num ber of de novo indels or den sity of genes in the chro mo somes. The cor re la tion be tween pa ter nal (or ma ter nal) age and the rate of germline indels is not sig nif i cant. Keywords: de novo mutation, mutation rate, indel, Lith u a nian pop u la tion, vari a - tion of ge nome. LABORATORINË MEDICINA 2016, t. 18, Nr. 3(71) 121

5 Laura Pranckënienë, Vaidutis Kuèinskas LITERATÛRA 1. Kong A, Gudbjartsson DF, Sainz J, Jonsdottir GM, Gudjonsson SA, Richardsson B, et al. A high-res o lu tion recombination map of the human ge - nome. Nat Genet 2002; 31: Kondrashov AS. Di rect es ti mates of hu - man per nucleotide mutation rates at 20 loci caus ing men de lian dis eases. Hum Mutat 2003; 21: Lynch M. Rate, mo lec u lar spec trum, and consequences of human mutation. Proc Natl Acad Sci 2010; 107: Hodgkinson A, Eyre-Walker A. Vari a - tion in the mu ta tion rate across mam - ma lian genomes. Nat Rev Genet 2011; 12: Schaibley VM, Zawistowski M, Wegmann D, Ehm MG, Nel son MR, St Jean PL, et al. The in flu ence of genomic con text on mu ta tion pat terns in the hu - man ge nome in ferred from rare vari - ants. Ge nome Res 2013; 23: Schmidt S, Gerasimova A, Kon dra - shov FA, Adzuhbei IA, Kondrashov AS, Sunyaev S. Hypermutable non-syn on y - mous sites are un der stron ger neg a tive se lec tion. PLoS Genet 2008; 4: e Kloosterman WP, Francioli LC, Hormozdiari F, Marschall T, Hehir- Kwa JY, Abdellaoui A, et al. Char ac ter - is tics of de novo struc tural changes in the hu man ge nome. Ge nome Res 2015; 25(6): Besenbacher S, Liu S, Izarzugaza JM, Grove J, Belling K, Bork-Jensen J, et al. Novel vari a tion and de novo mu ta - tion rates in pop u la tion-wide de novo as sem bled Dan ish trios. Nat Commun 201; 6: Saw yer SA, Hartl DL. Pop u la tion ge - netics of polymorphism and divergence. Ge net ics 1992; 132: Siepel A, Bejerano G, Pedersen JS, Hinrichs AS, Hou M, Rosenbloom K, et al. Evolutionarily con served el e ments in ver te brate, in sect, worm, and yeast genomes. Ge nome Res 2005; 15: Coo per GM, Stone EA, Asimenos G, NISC Com par a tive Se quenc ing Pro - gram, Green ED, Batzoglou S, Sidow A. Distribution and intensity of constraint in mam ma lian genomic se quence. Ge - nome Res 2005; 15: Francioli LC, Polak PP, Koren A, Menelaou A, Chun S, Renkens I, et al. Ge nome- wide pat terns and prop er ties of de novo mu ta tions in hu mans. Nat Genet 2015; 47(7): Michaelson JJ, Shi Y, Gujral M, Zheng H, Malhotra D, Jin X, et al. Whole- ge nome se quenc ing in au tism iden ti fies hot spots for de novo germ - line mu ta tion. Cell 2012; 151: Kong A, Frigge ML, Masson G, Besenbacher S, Sulem P, Mag nus - son G, et al. Rate of de novo mu ta tions and the im por tance of fa ther s age to dis ease risk. Na ture 2012; 488: Subramanian S, Kumar S. Neu tral sub sti tu tions oc cur at a faster rate in exons than in noncoding DNA in pri - mate genomes. Ge nome Res 2003; 13: Ramu A, Noordam, Schwartz RS, Wuster A, Hurles ME, Cart wright RA, et al. DeNovoGear: de novo indel and point mutation discovery and phasing. Nat Meth ods 2013; 10(10): LABORATORINË MEDICINA 2016, t. 18, Nr. 3(71)