Lab_Med_2012_Nr3.vp

Transkriptas

1 MOKSLAS, TEORIJA IR PRAKTIKA SCIENCE, THEORY & PRACTICE Laboratorinë medicina. 2012, t. 14, Nr. 3(55), p Sepsio laboratorinës diagnostikos metodø apþvalga Raminta Jonikaitë 1 Silvija Kiverytë 1, 2 Zita Auðrelë Kuèinskienë 2 Santrauka Krau jo ta kos in fek ci jos yra svar bi di dë jan èio ser ga mu mo ir mir tin gu mo prie þas tis vi sa me pa sau ly je. Sëk min gai li gø baig èiai rei ka lin ga grei ta etio lo gi në diag nos ti ka ir lai ku pra dë tas gy dy mas tin ka mais an ti bio ti - kais [1, 2]. Ðiuo metu kraujo pasëlis laikomas aukso standartu nustatant krau - jo in fek ci jas. Jo spe ci fið ku mas di de lis, ta èiau jaut ru mà ma þi na ið anks ti - nis gy dy mas pla taus spek tro an ti bio ti kais ir lë tai au gan tys, le pûs kul ti - va vi mui sep sio su kë lë jai. Sep sio diag nos ti ka krau jo pa së liu yra il gas pro ce sas rei kia lauk ti, kol mik ro or ga niz mai dau gi na si ir pa sie kia di - de lá làs te liø skai èiø. Daþ niau siai pra ei na val., kol pa tvir ti na ma bak te ri nës kil mës in fek ci ja (iden ti fi kuo ja mas su kë lë jas ir áver ti na mas jo jautrumas antibiotikams), o grybinës infekcijos atveju uþtrukama il - giau nei 72 val., ir ga li bû ti, kad krau jo pa së lis bus ne igia mas [3]. Dël il - gai trun kan èio mik ro bio lo gi nio ty ri mo gy dy to jas daþ nai tu ri rem tis tik kli ni ki niais simp to mais ir ma þiau ið kal bin gais la bo ra to ri niais leu ko - ci tø kie kio, bio che mi niais þy me nø ty ri mais ar karð èia vi mu ir më gin ti at pa þin ti esa mà in fek ci jà. Todël kraujo infekcijoms nustatyti kuriami nauji, greitesni meto - dai, pa rem ti ne kul tû rø au gi ni mu [4, 5]. Vie nas ið po ten cia liø grei tøjø metodø yra taikinio amplifikacija sukëlëjo nukleorûgðèiø nustatymas po li me ra zës gran di ni ne re ak ci ja (PGR). Ðis diag nos ti kos me to das yra daug jaut res nis ir grei tes nis nei krau jo pa së lis. Ta èiau mo le ku li niai ty - rimai, kuriø diagnostika grindþiama bakterijø ribosomø RNR genø nu - sta ty mu, su si du ria su më gi niø tar ðos imant ëmi ná pro ble ma. To dël su - ma þë ja ðiø me to dø ana li ti nis spe ci fið ku mas ir jaut ru mas. Reikð mi niai þo dþiai: sep sis, krau jo in fek ci ja, krau jo pa së lis, mo le ku li - niai ty ri mai, po li me ra zës gran di ni në re ak ci ja (PGR). 1 Vilniaus universiteto ligoninës Santariðkiø klinikø Laboratorinës medicinos centras Centre of Laboratory Medicine of Vilnius University Hospital Santariskiu klinikos El. paðtas: raminta.jonikaite@gmail.com 2 Vilniaus universiteto Medicinos fakulteto Fiziologijos, biochemijos, mikrobiologijos ir laboratorines medicinos katedra Medical Faculty of Vilnius University, Department of Physiology, Biochemistry, Microbiology and Laboratory Medicine SANTRUMPOS AM an ti ma na nas, bp ba ziø po ra, CoNS plaz mos ne ko a gu liuo jan tys stafilokokai (angl. coagulase-negative staphylococci), CRB C re ak ty vu sis baltymas, C T slenks ti nis cik las (Cik - lasslenkstinis = Cy c le threshoid ), DODS dau - ginis organø disfunkcijos sindromas, EDTA etilendiamintetraacto rûgðties dinatrio druska, FISH fluorescencinë in situ hibridizacija (angl. flouresence in situ hibridisation), IL in ter leu ki - nas, KFU kolonijas formuojantys vie - netai (angl. colony forming unit, CFU), M man ga nas, MALDI- TOF masiø spektrometrijos me to das (angl. ma - trix-as sisted la ser desorption/ion iza - tion (MALDI), time-of-flight mass spec - trometer (TOF), MS ma sës spek tro - metrija, PCT prokalcitoninas, PGR polimerazës grandininë reakcija, PNA FISH peptidø nukleorûgðèiø FISH (angl. pep tide nu cleic acid, PNA), PVL Panton-Valentine leukocidinas, rdnr ri bo so mi në DNR, RITS re a - ni ma ci jos ir in ten sy vio sios te ra pi jos sky rius, RNR ri bo nuk le o rûgð tis, rrnr ri bo so mi në RNR, SSA se ru - mo amiloidas A, SUAS sisteminio uþ - degimo atsako sindromas, TL-PGR tik ro lai ko PGR (angl. real time PCR), TLR transmembraniniai atpaþinimo receptoriai (angl. toll-like receptor 2), UV ultravioletiniai spinduliai. 154 LABORATORINË MEDICINA 2012, t. 14, Nr. 3(55)

2 Sepsio laboratorinës diagnostikos metodø apþvalga Jau keletà deðimtmeèiø moksli - ninkai ir gydytojai intensyviai tyrinëja sepsio etiologijà ir pato - ge ne zæ. Ta èiau kol kas ðios li gos efek ty vi diag nos ti ka ir gy dy mas te bë - ra iðlikæ viena ið aktualiausiø ðiø die - nø pro ble mø. Skir tin go mis stra te gi jo - mis gydant sepsinæ bûklæ, pradedant nuo sis te mi nio uþ de gi mo at sa ko sin - dromo (SU AS), sep si nio ðo ko iki dau - gi nio or ga nø dis funk ci jos sin dro mo (DODS), svarbiausia yra tinkama an - tibiotikø terapija ir greitas pirminis gydymas, kuris turi didþiausià poveiká maþinant mirtingumà ir sergamumà, susijusá su sepsiu [1 3, 6]. Gydymas netinkamais antibiotikais didina mir - tingumà [1]. Nuolat praneðama apie pernelyg didelá mirtingumà ligoninë - se. Mirð ta 31,4 % sep siu ser gan èiø li - go niø. Daþ niau siai ið pra dþiø jie bû na gydomi netinkamai, todël pasireiðkia hospitalinë infekcija [1]. Sepsis yra sunki medicininë bûklë, kuri daþnai pasitaiko kûdikiams, se - ny viems þmo nëms, taip pat as me - nims, ku riø imu ni në sis te ma nu sil pu - si (po or ga nø per so di ni mo, ser gan - tiems hematologiniais navikais ar po ope ra ci jos, gy do miems in ten sy vio sios te ra pi jos sky riuo se). Sep sis ið lie ka bendra besivystanèiø ðaliø problema, daþ nis ga li siek ti iki 30 at ve jø 1000 naujagimiø. Taèiau ði problema yra iðlikusi ir turtingose ðalyse, pa - vyz dþiui, JAV nuo 2001 m. iki 2007 m. sergamumas sepsiu padidëjo 97 % ir sepsio gydymo iðlaidos siekia 12,3 mi - lijardo doleriø [7]. Kasmet uþfiksuojama tûkstanèiai sep sio at ve jø, 2007 me tais JAV apie [7]. Mirð ta mu mas nuo sun - kios ei gos sep sio yra nuo 28 % iki 60 %. Didþiausias mirðtamumas (~90 %), kai sepsio sukëlëjas yra Aspergillus [8]. Sunkiausia kraujo infekcija yra susi - ju si su sep si niu ðo ku, kai es mi nis veiksnys yra infekcijos vystymosi grei - tis. Kiek vie na pa vë luo to gy dy mo va - landa sepsinio ðoko atveju yra siejama su beveik 8 % sumaþëjusiu iðgyvenamumu [3]. Sunkaus sepsio atvejais iðgyvenamumas yra maþdaug 80 %, jei efektyvus gydymas paskiriamas per pirmàjà valandà nuo simptomø pra - dþios. Iðgyvenamumas sumaþëja apie 10 %, jei efektyvus gydymas neprade - damas per pirmàsias 24 valandas. 1. SEP SIO TER MI NO LO GI JA Sep sis yra apibrëþiamas kaip sistemi - në uþdegimo reakcija á kliniðkai aiðkø infekciná procesà. Jam bûdingi siste - mi nio uþ de gi mo at sa ko sin dro mo (SUAS) simptomai (pvz., temperatûra 36 C ar ba 38 C, tachikardija, daþ - nis 90 per minutæ, padaþnëjæs kvëpa - vimas, ákvepiama 20 kar tø per mi - nutæ arba pco 2 < 32 mmhg ir leu ko ci - tø skai èius ar ba làs te - liø/mm 3 ). Sun kios ei gos sep sis yra apibûdinamas kaip sepsis, komplikavæ sis or ga nø dis funk ci ja, hi po per fu zi - ja ir hipotenzija. Hipoperfuzija gali pa - si reikð ti hi per lak te mi ja, me ta bo li ne acidoze, oligurija, hipoksemija, trom - bocitopenija arba psichikos bûklës su - trikimais. Sepsinis ðokas yra ávar di - ja mas kaip sun kus sep sis su hi po ten - zija, iðliekanèia koregavus skysèius. Dau gi nis or ga nø dis funk ci jos sin - dro mas (DODS) diag no zuo ja mas, kai su trin ka ávai riø or ga nø funk ci jos ir homeostazës nebegalima palaikyti be gy do mø jø in ter ven ci jø [9]. 2. SEPSIO PATOLOGINË FIZIOLOGIJA Esant sepsiui infekciniai mikroorga - nizmai sukelia makroorganizmo atsakà: aktyvinama imuninë sistema, uþ - de gi mo reakcijos ir kraujo kreðëjimo sistema. Pirmiausia pasireiðkia ágim - to imuniteto atsakas ir uþdegimas tai galima vadinti ankstyvuoju sepsiu. Vë liau, sie kiant spe ci fið kes nio ir stipresnio imuninës sistemos atsako, ima veik ti ágy tas imu ni te tas. Ki tas svar bus as pek tas pa ki tu si ko a gu - lian tø ir an ti ko a gu lian tø pu siau svy ra (padaugëja koaguliantiniø ir sumaþë - ja an ti ko a gu lian ti niø veiks niø). Vë ly - vajam sepsiui bûdinga imunosupresi - ja ir apoptozë [6]. Galiausiai sukeliami au di niø pa þei di mai ir DODS. To kiu bûdu pakeièiami biocheminiø signalø per da vi mo keliai tiek ansktyvojo, tiek vë ly vo jo sepsio metu. Mak roorganizmo sistemos reakci - jos ir patogeniniø mikroorganizmø savy bës tu ri átakos sepsio eigai. Todël daþnai sepsis progresuoja nesant pir - minës infekcijos þidinio, nes problema daþniausiai bûna susijusi su mikroor - ganizmo savybëmis, tokiomis kaip di - delio laipsnio infekcija, superantige - nai ir kiti virulentiðki veiksniai (atsparumas opsonizacijai ir fagocitozei bei antibiotikams) [6]. 3. LA BO RA TO RI NË SEP SIO DIAG NOS TI KA 3.1. Sep sio su kë lë jø nu sta ty mas mik ro bio lo gi nio krau jo pa së lio me to du Kraujo pasëlis yra kraujo infekcijos la - boratorinës diagnostikos aukso stan - dartas. Átarus sepsá pirmiausia ima - mas kraujas mikrobiologiniam pasë - liui. Remiantis tarptautinio komiteto (The In ter na tional Com mit tee on Sur - viv ing Sep sis) re ko men da ci jo mis, kraujas turi bûti paimtas prieð pradedant antibiotikø terapijà, kad terapija bûtø tikslinë, kai bus gauti pasëlio re - zultatai. Todël per pirmà valandà po sepsio diagnozës, kol laukiama mikrobio lo gi nio ty ri mo at sa ky mo, gy dy to jai skiria plataus spektro antibiotikø em - pi rið kai, o per ki tas 6 val. nu sta to mas pir mi nis in fek ci jos ðal ti nis [10]. Po 24 val. ið nau jo tu ri bû ti áver ti na mas gydymas ir infekcijos ðaltinis. Trumpalaikis gydymas plataus spektro an - tibiotikais yra naudingas, já rekomen - duoja ir tarptautinis komitetas, nors daþniausiai pirmenybë teikiama tiks - linei terapijai [11]. Kai kuriais atve - jais netinkamas antibiotikø pasirinki - mas gali ne tik panaikinti chemotera - pijos poveiká, bet ir paskatinti vais - tams at spa riø bak te ri jø at si ra di mà. Sie kiant to ið veng ti rei kë tø nau do ti tikslingiau nukreiptà terapijà [12]. Terminas bakteriemija pradëtas var to ti dau giau nei prieð ðimt me tá m. Libmanas apraðë du bakterie - mijos atvejus, vaikø streptokokinæ li - gà, pasireiðkianèià kraujingu viduria - vi mu [13]. Po 9 me tø jis pa skel bë ið ty - ræs dau giau nei 700 krau jo pa së liø ir gaires, kaip jie turëtø bûti atliekami [14]. Nuo tada prasideda kraujo infek - cijø nustatymo metodø raida: atsirado standartizuoti kraujo ëmimo protoko - lai, buvo gerinamos terpës, pradëtos taikyti automatizuotos sistemos, ap - tinkanèios bakterijø ir grybø augimà. Naujausiomis automatizuotomis priemonëmis galima aptikti net labai ne - didelá bakterijø augimà [15]. Kraujo pasëlio skystosios terpës kokybës gerini mas, der vø, ku rios su ma þi na an ti - biotikø poveiká, ádiegimas labai padi - dino mikroorganizmø aptikimo gali - mybes [16]. Greitesnë kraujo infekcijø diagnostika leidþia anksèiau paskirti gydymà tinkamais antibiotikais, todël su ma þë ja ser ga mu mas ir mir tin gu - mas. Kraujo pasëliø metodø tobulini - mu bu vo ir yra sie kia ma ðiø tiks lø: ge - rin ti me to dø jaut ru mà, grei èiau nu - statyti diagnozæ ir sumaþinti antibioti - kø slopinamàjá poveiká kraujo pasëlio rezultatams. Kraujas daþniausiai surenkamas á du buteliukus (aerobinëms ir anaero - binëms bakterijoms), jie inkubuojami termostate 37 C temperatûroje. Inku - buo jant mik ro or ga niz mai dau gi na si. Kai au to ma ti nis ter mos ta tas uþ fik - suo ja krau jo pa së ly je pa gau së ju sias bak te ri jø ar mie liag ry biø kul tû ras (maþ daug po val. pa ë mus krau - jo) ðie mikroorganizmai identifikuo - jami natyviniame bei Gramo bûdu da - LABORATORINË MEDICINA 2012, t. 14, Nr. 3(55) 155

3 Raminta Jonikaitë, Silvija Kiverytë, Zita Auðrelë Kuèinskienë þy ta me krau jo te pi në liuo se. Re mian - tis tepinëliu, bakterijos klasifikuoja - mos á ko kus ar laz de les, á gram tei gia - mas ar gramneigiamas bakterijas ar - ba mieliagrybius. Ði informacija lei - dþia gydytojams parinkti antibiotikus empirinei terapijai. Toliau mikroorga - nizmai ið kraujo terpës persëjami ant agaro lëkðteliø. Iðaugusios bakterijø ko lo ni jos iden ti fi kuo ja mos fe no ti pi - niais me to dais. Tai gi mik ro or ga niz - mas gali bûti visiðkai identifikuotas vidutiniðkai per dvi dienas, bet gali uþtrukti ir ilgiau, jei mikroorganizmai iðrankûs, lëtai augantys arba netipiniai. Paprastai papildomos 24 val. yra bûtinos iðtirti mikroorganizmø jaut - rumà antibiotikams, nepaisant dauge - lio pa to bu li ni mø ir stan dar ti za vi mø ðiems procesams paspartinti [17]. Kraujo pasëlis tradiciðkai yra auk - so standartas ir vertingas diagnostið - kai tais atvejais, kai sudëtinga atlikti mik ro bio lo gi næ diag nos ti kà: en do kar - ditui, tulþies latakø, endovaskulinei ir skiepø infekcijai arba neþinomos kil - mës karðèiavimui ávertinti [18]. Vienas ið pagrindiniø kraujo pasë - liø apribojimø yra laikas, kol gaunami rezultatai. Kaip jau minëta, tai gali uþ truk ti 2 5 die nas ir il giau. To dël áta - rus lëtai augantá (My co bac te rium tu - ber cu lo sis) ar le pø mik ro or ga niz mà (Bar to nel la spp), empirinis gydymas pra de da mas ge ro kai anks èiau, nei kraujo pasëlio rezultatai tampa prieinami. Bûtent todël diagnostikos grei - èio tobulinimas yra bûtinas siekiant padidinti kraujo pasëlio klinikinæ nau - dà. Kraujo pasëliø jautrumas gali bûti pras tas ir lë tai au gan tiems bei le - piems mikroorganizmams. Kraujo pa - sëliai gali neaptikti iðrankiø mikroorga niz mø, ku rie ga li bû ti vi suo me në je ágy tos pneu mo ni jos prie þas tis, kaip antai Legionella pneumophila, Chla - my dia pneu mo niae ir My cop las ma pneu mo niae [19]. Be to, krau jo pa së lis pasiþymi maþu invaziniø grybiniø in - fek ci jø diag nos ti kos jaut ru mu, o re zul - ta tø rei kia lauk ti daug die nø. Taip pat kraujo pasëlyje yra sudëtinga auginti endokardito sukëlëjà Bar to nel la [20]. Daþnai pasitaikanti problema yra ta, kad kraujo pasëliø jautrumas labai ma þë ja, jei li go nis prieð imant krau jà pa së liui bu vo gy do mas an ti bio ti kais [21]. To dël su kur tos spe cia lios ter pës su dervomis, kurios suriða antibiotikus ir taip sumaþina slopinamàjá anti - biotikø poveiká [16]. Naudojant ðias prie mo nes, pa ge rë jo bak te ri jø au gi - mas kraujo pasëliø terpëse ir sykiu kraujo pasëliø jautrumas. Kraujo pa - sëliai gaunami neigiami daugiau kaip 50 % at ve jø, kai ma no ma, kad sep sis yra bakterinis ar grybinis [11]. Ne pai sant anks èiau mi në tø trû ku - mø, ne rei kë tø vi sið kai at si sa ky ti áprastinio kraujo pasëlio, bet ir negali - ma jo laikyti idealiu aukso standartu. Teigiamas kraujo pasëlis iðlieka svar - bus diagnostikos bûdas ir patvirtini - mas gy dy to jui. Ta èiau jis ke lia tris svarbius iððûkius mikrobiologijos la - boratorijai. Pirmas iððûkis laikas, per kurá gaunami kraujo pasëlio rezul - tatai, antras sepsio sukëlëjø nusta - tymo jautrumas, o treèias neigiamas prognozinis dydis. Aukðtas neigiamas prognozinis dydis yra labai svarbus ro - diklis, parodantis, kokia yra tikimybë, kad esant neigiamam rezultatui ëmi - ny je tik rai ne bu vo su kë lë jo. Reikð - minga paþanga siekiant patikimø ir kliniðkai reikðmingø rezultatø sietina su molekuliniais metodais. Taèiau ðiuo metu gydytojas dël il - gai trunkanèio mikrobiologinio tyrimo turi daþnai gráþti prie klinikiniø simptomø ir ne tokiø iðkalbingø laborato - riniø tyrimø (leukocitø kiekis, bioche - miniai þymenys ar karðèiavimas) ir mëginti identifikuoti esamà infekcijà Bio che mi niai þy me nys diag no zuo jant sep sá Biologinis þymuo geriausiai apibrëþti - nas kaip indikatorius, kurá galima ob - jektyviai ávertinti (iðmatuoti) ir kuris leidþia atskirti patologiná procesà nuo áprastø biologiniø procesø. C reaktyvusis baltymas (CRB) ir prokalcitoninas (PCT) vieni ið pir - møjø sepsio diagnostikai pradëtø nau - do ti bio che mi niø þy me nø, pa di di no diag nos ti kos jaut ru mà ir tiks lu mà. Tiek CRB, tiek PCT kon cen tra ci ja kraujyje paprastai padidëja daugiau nei 1000 kar tø, esant uþ de gi mui ir in - fekcijai [22]. CRB koncentracija kraujy je pra de da di dë ti val. nuo in - fekcijos pradþios. Todël jis nëra laiko - mas jaut riu þy me niu. PCT kon cen tra - ci ja pra de da di dë ti jau 2 4 val. nuo in - fekcijos pradþios ir didþiausia jo kon - cen tra ci ja bû na 6 8 val. [23]. Pa gal CRB koncentracijà serume galima atskirti bakterinæ infekcijà nuo grybi - nës. Jei CRB yra dau giau nei 100 mg/l, tai poþymis, kad infekcija yra bakteri - në. Grybinës infekcijos atveju CRB pa - pras tai ne vir ði ja 100 mg/l [24]. PCT yra stabili molekulë ir geras gydymo rodiklis [23]. Nepaisant ávairiausiø to - bulinimø, ðie metodai gali klaidinti, pateikdami klaidingai ir apgaulingai tei gia mø re zul ta tø, dël ku riø jie në ra idealûs þymenys [25]. To dël moks li nin kai nuo lat ieð ko naujø biologiniø sepsio diagnostikos þy me nø. Vie nas ið jø yra se ru mo ami - loi das A (SAA). Po 8 24 val. nuo sep sio pradþios ðio baltymo kiekis padidëja daugiau nei 1000 kartø. Palyginti su CRB, SAA koncentracija kraujyje pa - didëja greièiau ir prasidëjus sepsiui ji bû na di des në nei CRB ir ið lie ka aukð - ta [26]. Ma na nas (M) ir an ti ma na - nas (AM) krau jo se ru me cir ku liuo - jantys grybø antigenai gali bûti nau - dojami grybinës kilmës sepsio diag - nostikai kaip invazinës kandidozës ir aspergiliozës þymenys. Po ten cia lus sep sio þy muo yra IL-10 [27]. Taèiau citokinø, tokiø kaip interleukinai, cirkuliacijos laikas yra trumpas, todël galimi klaidingai nei - giami rezultatai, o tai riboja jø diag - nostinæ vertæ. Mak ro fa gai, mo no ci tai ir gra nu lo - citai ekspresuoja CD14 molekulæ. Ji vadinama tirpiu CD14-potipiu (angl. sol u ble CD14-sub type, scd14-st), bendrinis pavadinimas presepsinas. Esant ávai rioms pa to lo gi nëms bûk - lëms presepsino kiekis iðlieka norma - lus 294,2 ± 121,4 pg/ml, esant vie ti - nei in fek ci jai 721,0 ± 611,3 pg/ml, sis te mi nio uþ de gi mo at sa ko sin dro - mui 333,5 ± 130,6 pg/ml, sep siui 817,9 ± 572,7 pg/ml ir sunkios ei gos sep siui 1992,9 ± 1509,2 pg/ml (ti - riant che mi liu mi nes cen ci niu imu no - fer men ti niu me to du) [28]. Pri klau so - mai nuo sepsio sunkumo atitinkamai didëja ðios molekulës kiekis. Shozushi ma ir kt. tei gë, jog CD14 yra ge res - nis sep sio bio lo gi nis þy muo nei PCT ir CRB [28]. Klinikinis jautrumas ir spe - cifiðkumas didesnis nei kitø þymenø [29]. Taip pat nustatyta aiðki korelia - ci ja tarp APA CHE II ba lø, li gos sun - kumo indekso ir presepsino kiekio, o tai rodo, kad presepsino kiekis gali bû - ti naudingas kaip kriterijus, tiksliai atspindintis patologijà [29]. Naudingas biologinis þymuo yra lipo po li sa cha ri dus ri ðan tis bal ty mas. Tai ûmi nës fa zës bal ty mas (50 kda), sin te ti na mas ke pe ny se. Fi zio lo gi në - mis sàlygomis serume yra 5 15 mg/l, at si ra dus in fek ci jai jo kon cen tra ci ja didëja [30]. Jis yra specifinis bakteri - nëms in fek ci joms. Pav cnik-ar nol ir kt. teigë, jog lipopolisacharidus riðantis baltymas yra geresnis sepsio biologi - nis þy muo nei PCT, CRB ir CD14 [31]. Mieloidiniø làsteliø-1 ekspresuoja - mi tirpûs veikimo (angl. trig ger ing) re - ceptoriai yra kitas galimas biologinis sep sio þy muo. Ðis þy muo ypa tin gas tuo, kad ne in fek ci niø uþ de gi mo re ak - ci jø me tu re cep to riø raið ka në ra ak ty - vinama. PCT tokios savybës neturi, jo daugëja esant tiek infekciniam, tiek ne in fek ci niam uþ de gi mui [32]. Buvo árodyta, kad bakterinës in - fek ci jos at ve ju neut ro fi lø pa vir ðiu je padaugëja neutrofilø CD64 (ncd64) 156 LABORATORINË MEDICINA 2012, t. 14, Nr. 3(55)

4 Sepsio laboratorinës diagnostikos metodø apþvalga re cep to riø, o mo no ci tø pa vir ðiu je TLR-2 re cep to riø (angl. toll-like re cep - tor 2) raiðka. Keli tyrimai parodë, kad neutrofilø pavirðiaus CD64 receptoriø tyrimas gali bûti naudingas nustatant bakterines infekcijas, átarus sepsá. Ne - se niai bu vo áro dy ta, kad CD64 re cep - toriø, kaip infekcijos rodiklio, nustaty - mas pasiþymi dideliu jautrumu ir spe - ci fið ku mu [33]. Ti riant su au gu sius li - gonius buvo patvirtinta ir árodyta, kad gra nu lo ci tø re cep to riø raið ka tu ri di - delæ koreliacijà su kliniðkai diagno - zuota bakterine infekcija ir granuloci - tø CD64 receptoriø raiðkos tyrimai ga - li padëti nu spëjant pa cien to krau jo pa - sëlio rezultatus [34]. Da bar ti niø moks li niø ty ri mø re - zul ta tai ro do, kad kol kas në ra vie no idealaus biologinio þymens. Keli biolo - gi niai þy me nys tu ri bû ti nau do ja mi kartu pateikiant galutinius diagnosti - niø ty ri mø re zul ta tus (1 pav.) [35]. Sepsis daþnai pasireiðkia kartu su ki - tomis komplikacijomis (ligomis), todël vie no auk si nio bio lo gi nio þy mens ne - gali bûti. Todël tolimesni moksliniai tyrimai labiau kreipiami á keliø biolo - gi niø þy me nø de ri niø pa ieð kà Mo le ku li niai sep sio su kë lë jø nu sta ty mo me to dai Nau jø me to dø kû ri mo tiks las yra pa - di din ti esa mø me to dø jaut ru mà ir spe ci fið ku mà (ypaè lë tai au gan èiø ar - ba ne kul ti vuo ja mø mik ro or ga niz mø), su trum pin ti diag nos ti kos lai kà ir su - ma þin ti slo pi na mà já an ti bio ti kø po vei - ká. Áro dy ta, jog su au gu siø þmo niø, serganèiø kliniðkai reikðminga bakte - riemija, kolonijas formuojanèiø viene - tø skai èius (angl. col ony form ing unit, CFU) krau jy je yra ma þas nuo 1 iki 30 KFV/ml. Vaikams bakterijø kiekis kraujyje yra gerokai didesnis dau - giau nei 100 KFV/ml [36]. Ðis ro dik lis atspindi gyvà mikrobiologinæ kultûrà, ne at spin di ne þu vu siø bak te ri jø kie ká, nes jos negali sudaryti kolonijø, taip pat ir bakterijø DNR, kuri atsiranda kraujyje suirus mikroorganizmø làste lëms. Mo le ku li niai me to dai tam pa vis nau din ges ni dël grei tes nës diag nos ti - kos. Rezultatai gydytojui gali bûti pri - einami vis ankstesniame gydymo eta - pe. Per pastaruosius kelis deðimtmeèius buvo siûlomi ávairûs kraujo infek - cijø laboratorinës diagnostikos gerini - mo metodai. Antrame paveiksle patei - kiami galimi sepsio sukëlëjø diagnos - tikos metodai. Iðskiriami du pagrindi - niai sepsio sukëlëjø nustatymo bûdai: teigiamame kraujo pasëlyje ir tiesio - giai kraujyje. 1 pav. Sepsio kilmës tyrimo algoritmas CRB C reaktyvusis baltymas; TL-10 IFN- indukuojantis baltymas-10; PCT pro kal ci - to ni nas; SAS serumo amiloidas A [35] Fig. 1. Al go rithm for di ag nos ing the cause of sep sis CRP: C-cre ative pro tein; IP-10: IFN- -in duc ible pro tein-10; PCT: Procalcitonin; SAA: se - rum am y loid A [35] Sep sio su kë lë jo iden ti fi ka ci ja tei gia muo se krau jo pa së liuo se Teigiamame kraujo pasëlyje sepsio su - kë lë jus ga li ma nu sta ty ti tri mis bû - dais: bakteriologiniu tyrimu, sukëlëjo baltymø arba nukleorûgðèiø identifi - ka vi mu (2 pav.). Mik ro or ga niz mus ámanoma aptikti áprastiniu kraujo pa - së liu, jø rû ðá nu sta ty ti mo le ku li niu me to du per 2 6 val., o mikrobiologiniam ty ri mui rei kia dar ma þiau siai 24 val. su kë lë jams iden ti fi kuo ti ir jautrumui antibiotikams ávertinti. Nu kle o rûgð èiø nu sta ty mu grin - dþiami metodai gali bûti suskirstyti á dvi kategorijas: hibridizacijos ir amplifikacijos [3]. Hibridizacijos tyrimuo - se zondai yra oligonukleotidai, trum - pes ni nei 50 bp il gio, sie kiant ið veng ti jø pa èiø hib ri di za ci jos. Zon dai tu ri che mi liu mi nes cen ci næ ar ba fluo res - cen ci næ þy mæ. Jie kom ple men ta rûs trum pai rrnr sub vie ne to se kai. Zon - dai ir rrnr sudaro dvigrandinæ mole - ku læ, jei su tam pa su tai ki nio rrnr se - ka. Taip paþymëta dvigrandinë mole - kulë gali bûti aptikta. Perspektyviau - sia yra fluo res cen ci në hib ri di za ci ja (angl. flouresence in situ hibridisation, FISH), leidþianti teigiamuose kraujo pasëliuose greitai (per 2 val.) identifi - kuoti bakterijas [37]. Teigiamame kraujo pasëlyje gali - ma nustatyti sepsio sukëlëjus pagal tik jiems bûdingà specifinæ rrnr. Vie - 2 pav. Metodai, naudojami sepsio sukëlëjø diagnostikai FISH fluorescencinë in situ hibridizacija, PNA FISH peptidø nukleorûgðèiø fluo res cen - cinë in situ hibridizacija, MALDI-TOF masiø spektrometrijos me to das (angl. matrix-as - sisted laser desorption/ionization (MALDI), time-of-flight mass spec trom e ter (TOF) Fig. 2. Techniques for laboratory detection of bloodstream infections FISH: flu o res cent in situ hy brid iza tion, PNA FISH: pep tide nu cleic acid flu o res cent insitu hy brid iza tion, MALDI-TOF: ma trix-as sisted la ser desorption/ion iza tion time- offlight mass spectrometer LABORATORINË MEDICINA 2012, t. 14, Nr. 3(55) 157

5 Raminta Jonikaitë, Silvija Kiverytë, Zita Auðrelë Kuèinskienë nas ið to kiø me to dø yra PNA FISH (angl. pep tide nu cleic acid, PNA). Tai me to das, pa grás tas pep ti dø nu kle o - rûgð èiø FISH sà vei ka. Pa vyz dþiui, Stap h y lo coc cus au reus PNA FISH ty - ri me (Ad vandx, JAV) PNA zon dais nustatoma S. au reus 16S rrnr se ka [15]. Ðis tyrimas atliekamas per kelias va lan das iðsiaiðkinama, ar sep sio sukëlëjas yra S. au reus ar ne. To kiu paèiu principu sukurti jau ir kiti rinki - niai, kuriais nustatomi kiti bakteri - niai ir grybiniai sepsio sukëlëjai [38, 39]. Ið su kë lë jø nu sta ty mo me to dø, pa - grástø amplifikacija, daþniausiai tai - ko ma po li me ra zës gran di ni në re ak ci - ja PGR. Ðis me to das ga li bû ti nau do - jamas ne tik sukëlëjø identifikacijai, bet taip pat gali suteikti informacijos apie jø jautrumà antibiotikams: pa - vyzdþiui, galima nustatyti meticilinui atsparø Stap h y lo coc cus au reus MRSA [40]. Visi ðie metodai vadinami sukëlë - jui specifine PGR, taèiau jau atsiranda ko mer ci niø rin ki niø, pa rem tø dau gi - nës PGR me to du [41]. Vie nas ið jø yra Staph Plex sis te ma (QIAGEN, JAV). Tei gia ma me krau jo pa së ly je Gra mo daþymu aptinkami gramteigiami ko - kai. Tuo met StaphPlex sistema tiesio - giai ið krau jo pa së lio vie nu me tu nu - stato stafilokoko rûðá bei aptinka Pan - ton- Va l en ti ne leu ko ci di no (PVL) ir ke - lis sta fi lo ko kø at spa ru mo an ti bio ti - kams veiks nius. Staph Plex sis te ma gali aptikti 18 specifiniø Stap h y lo coc - cus ge nø. PGR pro duk tai yra iden ti fi - kuojami naudojant Lu mi nex su s pen - sion ar ray mikrosferø srauto analizës metodà. Tyrimas nuo kraujo pasëlio paruoðimo gali bûti atliktas per 5 val., o tai labai sutrumpina laikà, paprastai rei ka lin gà fe no ti pi niam iden ti fi ka vi - mui ir jautrumo antibiotikams tyri - mui [25]. Ðios pro ce dû ros yra veiks - min gos, bet bran gios ir (ar) joms at lik - ti reikia aukðtos kvalifikacijos specia - listø Sep sio su kë lë jo ap ti ki mas ir iden ti fi ka ci ja tie sio giai krau jy je PGR me to du 1993 m. PGR bu vo pir mà kar tà pa nau - dotas tiesiogiai aptikti bakterijà kraujyje. Tai buvo vienam sukëlëjui specifi - në PGR kon kre tiems su kë lë jams Sal mo nel la typ hi [42] ir M. avium [43]. Iðtirtø klinikiniø mëginiø skaièius buvo maþas, taèiau, lyginant su kraujo pasëliu, jautrumas buvo atitin - ka mai 92 % ir 80 %. Per vë les ná de - ðimtmetá atsirado ir kitiems sepsio su - kë lë jams spe ci fi niø PGR, tie sio giai taikomø kraujo mëginiams: M. tu ber - cu lo sis [44], E. co li [45] ir Ne is se ria me nin gi ti dis [46]. Daug dëmesio sulaukë S. pneu mo - niae PGR me to das, nes ið au gin ti ðá su - kë lë jà pa së ly je ga li bû ti su dë tin ga. Galimybë aptikti bakterijas kraujo pa - së ly je su ma þë ja iki 10 % pra ëjus 25 min. po in tra ve ni nio ce fo tak si mo suðvirkðtimo, o PGR aptikimo riba tuo me tu vis dar lie ka 100 % ir lai kui bë - gant lëtai maþëja. Kita naudinga PGR savybë yra greita diagnostika, kai áta - riama gyvybei pavojinga infekcija, pa - vyzdþiui, invazinë grybinë infekcija. PGR ty ri mø, skir tø in va zi nei as per gi - liozei [47] arba kandidemijai [48] nu - sta ty ti, jaut ru mas bu vo di de lis %. Pa grin di nis su kë lë jui spe ci fi niø PGR trû ku mas yra tas, kad jos yra tai - komos tik tada, kai átariama konkreti in fek ci ja, to dël ne nau din gos karð èiuo - janèiø ligoniø bendrajai diagnostikai. Siekiant iðspræsti ðià problemà buvo su kur ta dau gi në PGR. Ðiø die nø pub - likuotuose straipsniuose apie sepsá ak - tualiausia tema yra dauginë (plataus spektro) PGR. Vertinamas naujø ko - mer ci niø pla taus spek tro PGR rin ki - niø pranaðumas, palyginti su kraujo pasëliu [49 58]. Dauginës PGR atveju tuo pa èiu me tu at lie ka ma PGR ke - liems specifiniams sukëlëjams nusta - tyti. Corless ir kiti apraðë dauginës PGR ty ri mà ið krau jo ir sme ge nø skys - èio. Ðiuo tyrimu nustatomi trys sukë - lëjai, kurie yra daþniausia vaikø me - ningito ir sepsio prieþastis: N. me nin - gi ti dis (nustatymo jautrumas 88 %), S. pneu mo niae (91 %) ir Ha e mop hi lus in flu en zae (100 %) [59]. Uni ver sa liam bak te ri jø nu sta ty - mui kraujyje buvo sukurti keli plataus spek tro PGR metodai. Jie grindþiami 16S ir 23S rrnr genø amplifikavimu. Grybams kraujyje aptikti amplifikuo - ja mas 18S rrnr ge nas [60]. Ávai rios bakterijø rûðys turi skirtingus kiekius ðiø ge nø ko pi jø, su si ju siø su jø au gi mo tempu. PGR, pagrásta konservatyvaus 16S rrnr ge no nu sta ty mu, ið es mës sukuria galimybæ aptikti bet kurios kraujyje esanèios bakterijos DNR. Nu - statant tiesiogiai bakterijas kraujyje (be pasëlio), kraujas surenkamas á va - ku u mi ná krau jo më gin tu vë lá su ED TA. Toliau bakterijø DNR iðgryninama ir atliekamas nukleorûgðèiø amplifika - vimas. PGR produktus galima nusta - tyti skirtingais metodais: sekos anali - ze kapiliaru (angl. cap il lary se quenc - ing anal y sis), pi ro sek ve na vi mu ar hib - ridizacija su konkreèiu zondu bei tikro laiko PGR. Tik ro lai ko PGR (angl. real time PCR) dar kartais vadinama kiekybi - ne PGR (angl. qpcr quantitive) ar kinetine PGR greitai pakeitë áprasti - nius PGR pro duk tø nu sta ty mo me to - dus. Ðio metodo pranaðumas tas, kad amplifikacija ir aptikimas vyksta vie - nu metu uþdaroje sistemoje, kuri yra greitesnë ir sumaþina mëginiø tarðos rizikà. Metodas taip vadinamas todël, kad vyks tant PGR kiek vie no cik lo me - tu matuojama fluorescencija, kuri yra pro por cin ga su sin te tin tos DNR kiekiui. Ciklas, kurio metu fluorescen - ci ja pa sie kia slenks ti næ ri bà, va di - namas C T, ar ba slenks ti niu cik lu (Ciklas slenkstinis = Cy c le t hres hoid ). Nu sta ty - tas C T priklauso nuo mëginyje esanèios DNR ko pi jø skai èiaus. Kuo dau - giau yra tai ki nio DNR, tuo ma þes nis C T, tuo grei èiau DNR pa dau gi na ma ir fluorescencija pasiekia slenkstiná lygá. Signalo intensyvumas yra susijæs su stan dar ti nës krei vës fluo res cen ci ja, su kur ta am pli fi kuo jant þi no mø ver èiø DNR kiekius. Naudojamos DNR zon - dø sis te mos, ku riø fluo res cen ci ja, su - si jun gus su dvi gran dine DNR, pa di dë - ja. Todël zondams prisijungus prie tai - ki nio DNR fluo res cen ci ja pa di dë ja. Taip pat naudojami specialiø struktû - rø prad me nys, ku riems at si ra dus PGR produkto sudëtyje, jø fluorescen - cija iðauga. Todël ðis metodas kartais vadinamas kiekybine PGR, nes galima nu sta ty ti ab so liu tø DNR kie ká, DNR ko pi jø skai èiø ir san ty ki ná nu kle o - rûgðèiø kieká tiriamuose mëginiuose. Nustatant bakterijø kieká galima ste - bëti gydymo antibiotikais poveiká ar atskirti infekcijà (didelis kiekis) nuo uþ terð tu mo (ma þas kie kis). Pa vyz - dþiui, pneu mo ko ki ne pneu mo ni ja ser - ganèiø ligoniø S. pneu mo niae bakteri - jø DNR kie kis krau jy je yra su si jæs su didesne mirties tikimybe, sepsinio ðoko rizika ir mechaninës ventiliacijos po rei kiu [61]. Sep sio pla taus spek tro PGR ty ri - mø klinikinë interpretacija yra sudë - tinga dël keleto prieþasèiø: Teigiamas PGR signalas kartu su neigiamu to paties ligonio kraujo pasëliu gali bûti klaidingas rezultatas, ta èiau taip pat ga lë tø bû ti tie sa, nes PGR jautrumas yra didesnis [3]. Ant ro ji kli ni ki nio in ter pre ta vi - mo pro ble ma yra ta, kad pla taus spek - tro PGR metodu kraujyje aptinkamos visø bakterijø DNR, áskaitant gyvas, negyvas ir suirusias bakterijas. Dau - giau nei prieð tris de ðimt me èius Ber - geris apraðë teigiamà kraujo pasëlá tai buvo bakteriemija po dantø valymo [62]. Nuo to lai ko su kaup ta ne ma þai þiniø apie tai, kaip auginti bakterijas ið kraujo ëminiø. Svarbu suprasti, kad cirkuliuojanèiø DNR aptikimas krau - jy je yra ne tas pat kas bak te ri jø au gi - mas kraujo pasëlyje. Be to, bakterijø DNR foninis kiekis gali bûti pacientø kraujyje be tikrosios bakteriemijos ar net svei kø þmo niø krau jy je. To ká DNR fonà sunku atpaþinti ir jis gali trukdy LABORATORINË MEDICINA 2012, t. 14, Nr. 3(55)

6 Sepsio laboratorinës diagnostikos metodø apþvalga 1 lentelë. Sepsio sukëlëjai, kuriuos galima nustatyti SeptiFast metodu Ta ble 1. Mas ter list of de tect able mi cro or gan isms by the SeptiFast as say Gramteigiamos bakterijos Gramneigiamos bakterijos Grybai Staphylococcus aureus Escherichia coli Candida albicans Coagulase negative Staphylococcus Klebsiella (pneumoniae/oxyt.) Candida tropicalis Streptococcus pneumoniae Serratia marcescens Candida parapsilosis Streptococcus spp Enterobacter (cloacae/aerog.) Candida krusei Enterococcus faecium Proteus mirabilis Candida glabrata Enterococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa Aspergillus (fumigatus) MecA (MRSA) Acinetobacter baumanii Stenotrophomonas maltophilia ti nustatyti kraujyje esanèià tikrojo su kë lë jo DNR. Tre èio ji pla taus spek tro PGR problema yra padidëjusi tarðos rizika. Ði ri zi ka yra be veik vi suo se ty ri mo etapuo se: krau jo ëmi mo, DNR ið sky ri - mo ir PGR mi ði nio pa ruo ði mo. PGR re - agentai gali bûti uþterðti [18] bakteri - jø DNR. Net rin ki niai, nau do ja mi DNR ið skir ti ið krau jo, ir PGR re a gen - tai gali bûti uþterðti juos gaminant. Ge rai þi no ma, kad PGR uþ ter ðia nau - do ja mi fer men tai. Taq po li me ra zë ið - skiriama ið E. co li, ta èiau su ðiuo fer - men tu kar tu ga li ið si skir ti E. co li DNR. Be to, PGR tar ðos ðal ti niai ga li bûti ore esan èiø gry bo spo rø ino ku lia - cija, kai gaunamas klaidingai teigia - mas PGR rezultatas nustatant pelësi - nius gry bus. To dël, kaip ir krau jo pa - sëlio atveju, tarða visada turi bûti áta - riama, plataus spektro PGR metodu nustaèius netikëtà sepsio sukëlëjà. Yra keli pripaþinti bûdai, kaip su - maþinti PGR tarðà: UV, miðiniø fer - men ti niu pa grin du nau do ji mas ir ge ra dar bo prak ti ka [63]. Taip pat yra ne - áprastø metodø, pavyzdþiui, PGR cik - lø skaièiaus sumaþinimas arba aptiki - mo slenks èio (angl. thresh old) didini - mas, siekiant sumaþinti klaidingai tei - giamø rezultatø skaièiø, taèiau ðios priemonës taip pat sumaþina jautrumà. Pagrindinis klausimas iðlieka vie - nas kaip su de rin ti didelá jaut ru mà ir menkà specifiðkumà. Pradedant ðiuo gana siauru (tik sepsio sukëlëjo rûðiai nustatyti) pla - taus spek tro PGR tai ky mu, vis dar sun ku api brëþ ti kli ni ki næ nau dà, kai negaunama informacijos apie bakteri - jø jautrumà antibiotikams. Molekuli - nis Es ch e ri chia co li aptikimas kraujy - je tikriausiai leis nutraukti gydymà van ko mi ci nu. Ta èiau, kai E. co li jaut - rumo spektras dar neþinomas, nepai - sant grei tes nio ty ri mo, PGR ið va dø negalima interpretuoti, nors kliniki - niu at þvil giu tai bû tø svar bu (t. y. pa - keièiant empiriná karbapenemà arba treèio sios, ket vir to sios kar tos ce fa los - po ri nà tiks lin ges niu vais tu, pa vyz - dþiui, ampicilinu) Sepsio sukëlëjams nustatyti nau do ja mø mo le ku li niø ko mer ci niø rinkiniø apþvalga Dau gë ja ko mer ci niø rin ki niø, ku rie skirti sepsio sukëlëjams nustatyti tie - siogiai kraujyje. Visø jø tikslas pana - ðus per kuo trum pes ná lai kà aptikti kuo dau giau su kë lë jø. Can di da al bi - cans mik ro bio lo gi niam nu sta ty mui reikalingos 96 val., palyginti su 6 va - landas trunkanèiu DNR identifikavimu PGR me to du (SeptiFast) [54]. Lai - ko at þvil giu mo le ku li nës bio lo gi jos me to dai yra pra na ðes ni, kai abiem me to dais re zul ta tas yra ne igia mas. Mo le ku li niu me to du gau tà ne igia mà re zul ta tà ga li ma pra neð ti gy dy to jui jau po 6 30 val. (áskai tant më gi nio pri - statymo á laboratorijà laikà ir labora - to ri jos dar bo va lan das), o ne igia mi kraujo pasëlio rezultatai paaiðkëja ne anks èiau kaip po 5 die nø [64]. Dau gu - ma diagnostiniø molekuliniø tyrimø su da ry ti ið tri jø eta pø: nu kle o rûgð èiø gryninimo, amplifikacijos/aptikimo ir duo me nø ana li zës. Dau gu ma ko mer ci - niø rin ki niø tu ri CE þen klà, ta èiau ðiuo me tu në ra në vie no rin ki nio, tu - rinèio Maisto ir vaistø administracijos (angl. FDA Food and Drug Ad min is - tra tion) leidimà rinkiná naudoti JAV [5]. Populiariausiø rinkiniø sàraðas ir kiekvieno ið jø pagrindinës savybës pa teik tos 2 lentelëje. Sep ti Fast (Roche di ag nos tics, Ðveicarija) yra vienas ið pirmøjø mole - ku li nø rin ki niø, nau do ja mø Eu ro po je kraujo infekcijø diagnostikai in vi tro. Jis aptartas ne viename straipsnyje gre ti nant já su krau jo pa së liu [1, 49 58]. Tai yra pla taus spek tro tik ro laiko PGR. Ðiuo rinkiniu galima nu - statyti 25 sepsio sukëlëjus: 19 bakteri - jø ir 6 gry bø rû ðis (1 len te lë) [65]. 90 % ðiø sepsio sukëlëjø yra kraujo infekci - jø prieþastis. Jei aptinkama S. au reus, nau do ja mas pa pil do mai Sep ti Fast meca rin ki nys, nu sta tan tis, ar S. aureus yra atsparus meticilinui. SeptiFast jaut ru mas yra 30 KFV/ml, iðskyrus plazmos nekoaguliuojanèius sta fi lo ko kus (Stap h y lo coc ci CoNS), Strep to coc cus spp. ir Can di da glabrata: jø aptikimo jautrumas yra 100 KFV/ml [66]. Ta èiau yra ke le tas svar biø pa to ge nø, ku riø rin ki nys nu - sta ty ti ne ga li, pa vyz dþiui, Ne is se ria me nin gi ti dis. Nu kle o rûgð tys gry ni na mos ið 1,5 ml krau jo. Yra du nuo sek lûs eta - pai: me cha ni nis/fer men ti nis ar dy mas (làsteliø lizë) ir filtravimas per kolonë - liø stik lo pluoð tà (~3,52 val.) [65]. Þmo gaus DNR ið leu ko ci tø ir pa to ge - nø DNR ið ski ria mos kar tu. Ið gry nin - tos nukleorûgðtys iðpilstomos po 50 l trims tikro laiko PGR reakcijoms, ku - riose amplifikuojamos gramteigiamos, gram nei gia mos bak te ri jos ir gry bai. SeptiFast technologija amplifikuoja kin ta mà jà se kà, transk ri buo ja mà spacer (pro mo to ri nës se kos) re gio nà tarp 16S ir 23S da lies rrnr, ku ris ga li bûti naudojamas bakterijoms diferen - cijuoti. Toks taikinys buvo pasirinktas to dël, kad ðis ge nas tu ri daug ko pi jø ir metodas yra jautresnis. Liuminescen - ci niai zon dai nau do ja mi su kë lë jams nustatyti. SeptiFast tyrimas atlieka - mas maþ daug per 6 val., ta èiau moks - lininkai nuolat ieðko bûdø, kaip ðià diagnostikà palengvinti ir sutrumpinti. Todël vietoj áprastinio nukleorûgðèiø gryninimo dabar rekomenduojama taikyti greità automatiná DNR iðskyri - mà, pagrástà magnetinëmis nanodale - lëmis, naudojant MagNA nu kle o rûgð - ties iðskyrimo rinkiná (Roche Ap plied Sci ence). Iðskyrimas atliekamas maþ - daug per 34 min. Automatizuotas iðskyrimas ne tik sutrumpina bendrà dar bø ei gà nuo 6,54 val. iki 3,57 val., bet ir padidina tyrimo jautrumà [67]. Sep ti Test (MolZym, Vo kie ti ja) rinkinys turi unikalià mëginio ruoði - mo metodikà, kuri sumaþina þmogaus DNR kieká kraujo mëginyje. Leukoci - tai ðvel niai ardomi ir fer men tu DNa ze paðalinama þmogaus DNR. Toliau ar - LABORATORINË MEDICINA 2012, t. 14, Nr. 3(55) 159

7 Raminta Jonikaitë, Silvija Kiverytë, Zita Auðrelë Kuèinskienë 2 lentelë. Molekuliniai komerciniai rinkiniai, naudojami sepsio sukëlëjams nustatyti Ta ble 2. Current molecular tests for bloodstream infections Tyrimo trukmë Sepsio sukëlëjai Roche SeptiFast 6 val. + 2,5 val. (meca testas) 25 sukëlëjai + 1 vaisto atsparumà lemiantis genas Molzym SeptiTest SIRS-Lab Seegene Magicplex LOOXSTER /VYOO Sep sis 9~12 val. ~6 val. ~6 val. (nustatymas + identifikavimas) > 300 skirtingø sukëlëjø (tik sekvenuojant) 43 sukëlëjai + 5 vaisto atsparumà lemiantys genai > 90 sukëlëjø 25 identifikuojami + 3 vaisto atsparumà lemiantys genai PLEX-ID BAC Spec trum ~14 val. > 300 skirtingø sukëlëjø + 3 vaisto atsparumà lemiantys ge nai Ëminys Kraujas (1,5 ml) Kraujas (1 ml) Kraujas (5 ml) Kraujas (1 ml) Kraujas (1,5 ml) Ëminio paruoðimas Nëra MolYsis Rankinis MolYsis Rankinis Nukleorûgðèiø iðskyrimas Vidinë kontrolë (Iðskyrimo kontrolë) Rankinis (SeptiFastPrep Kit, MagNa Lyser Instrument) Bendra ampli fi ka ci - ja. Su patogeno DNR tame paèiame më gin - tuvëlyje (susintetinta dvigrandinë DNR mo - le ku lë) Genas taikinys ITS (Internal tran - scribed spacer) Amplifikacijos ir detekcijos metodai Amplifikacija. Analizuojama lydimosi kreivës Automatizuotas SelectNA Atskirta amplifikacija. Skirtinguose mëgintuvëliuose (Mastermix As say Internal Control) 16S rdnr (bakterijø) 18S rdnr (grybø) 1. Amplifikacija (arba TL-PGR) 2. Elektroforezë gelyje 3. Amplikonø gryninimas 4. Sekos analizë Rankinis Amplifikacija. Su patogeno DNR tame paèiame mëgintuvëlyje (þmogaus genas) 16S rdnr Elektroforezës gelis Automatizuotas SEEPREP12 Bendra amp li fi ka ci - ja. Su patogeno DNR tame paèiame mëgintuvëlyje (þmogaus genas) Konkretus kiekvieno sukëlëjo genas 1. Amplifikacija (amplikonø bankas) 2. Tesioginis am pli ko - nø nustatymas: a. Nustatymas Gram (+), Gram (-), grybai, vaistø atsparumo genai b. Identifikacija rûðies Magnetiniais rutuliukais su KingFisher Amplifikacija 16S rdnr Masiø spektrometrija domos bakterijø ir grybø làstelës su - dëtingesnëmis sàlygomis. PGR ampli - fikuoja 16S ribosomø DNR ir sekos yra naudojamos siekiant nustatyti mikroor ga niz mà më gi ny je. Te orið kai MolZym mëginio paruoðimo bûdas ga - li bû ti nau do ja mas su bet ku riuo ga li - nio tað ko PGR de tek ci jos mo le ku li niu tyrimu. SeptiTest jautrumas padidëjo iki 1000 kartø, palyginti su áprastine nu kle o rûgð èiø gry ni ni mo ko lo në liø me to du tech no lo gi ja. Þe miau sia ap ti - kimo riba (angl. lower limit of de tec - tion) yra 50 KFV/ml krau jo [68]. Ðio metodo trûkumas laisvai cirkuliuo - janèios kraujyje sukëlëjo DNR ardo - mos kar tu su þmo gaus leu ko ci tø DNR, todël sukëlëjai, kuriø membrana lengvai suardoma, gali bûti prarasti. Po amplifikacijos atliekama PGR produk to ana li zë elek tro fo re zës ge ly je. Prieðpaskutinis etapas yra amplikonø gryninimas ir tik tuomet atliekama PGR pro duk to se kos ana li zë (sek ve na - vimas). Galima nustatyti daugiau nei tris ðimtus skirtingø sepsio sukëlëjø. LO OX STER SIRS-Lab pro duk - tas naudoja metodikà, kuri atskiria bak te ri jø/gry bø DNR nuo þmo gaus DNR pagal DNR metilinimo skirtu - mus. Nukleorûgðtys iðskiriamos DNR gi mi nin gu mo (afi ni nës) chro ma tog - rafijos bû du ir am pli fi kuo ja mas 16S rdnr ge nas, nau do jant rin ki ná VYOO. Analitiniam tyrimo vertinimui svarbus sukëlëjo ir þmogaus DNR santykis, eukariotø DNR turi likti ne dau giau nei kaip 10 %. Tik tuo met þmogaus DNR nedaro átakos rezulta - tui ir amplifikacijos jautrumas padidë - ja deðimt kartø. Tokiu bûdu aptinkami nedideli sepsio sukëlëjø kiekiai [5]. PGR metodu gauti amplifkacijos pro - duk tai analizuojami elektroforezës ge - lyje. LO OX STER SIRS-Lab rinkiniu galima nustatyti 43 sepsio sukëlëjus ir penkis vaisto atsparumà lemianèius ge nus. Ma gic Plex Sep sis re al-ti me Test (Seegene, Pie tø Ko rë ja) tai tik ro lai ko PGR (TL-PGR) metodu pagrástas komercinis sepsio sukëlëjø nustatymo rinkinys. Apie ðá naujà dauginës rea - laus lai ko PGR rin ki ná MagicPlex Sep sis Real-time Test kol kas në ra pub li ka ci jø, to dël jo nau din gu mas diagnozuojant sepsá nëra plaèiai ávertin tas. Nau do jant ðá rin ki ná ga li ma greièiau nei per septynias valandas krau jy je ap tik ti 90 skir tin gø sep sio sukëlëjø ir nustatyti 21 bakterijos rû - ðá, 3 antibiotikø atsparumo genus ir 6 gry bø rû ðis. Ðiam tyrimui labai svarbus kraujo paëmimas. Kraujas turi bûti paimtas ypaè ste ri liai. Tie sio gi në su kë lë jø PGR gali bûti stipriai uþslopinta dël di de lio þmo gaus DNR fo no [69]. To dël taip pat svar bus yra pir ma sis eta pas: mëginio paruoðimas sukëlëjo DNR ið - skir ti (~1 val.). Þmo gaus DNR yra pa - ðalinima atliekant mëginio paruoðimà prieð DNR ið sky ri mo eta pà. Tai ge ro - kai padidina sukëlëjø PGR nustatymà kraujyje [68]. Mëginio paruoðimo ir au to ma ti zuo to DNR ið sky ri mo de ri - nys padeda paruoðti optimalø tirpalà, kuris tinkamas kraujyje esanèiø sep - sio sukëlëjø analizei didelio jautrumo PGR ir TL-PGR me to dais. Treèias etapas kraujyje esanèiø sukëlëjø DNR pagausinimas PGR me - todu. Ketvirtas etapas kraujo sepsio su kë lë jø at ran ka TL-PGR me to du. Galima aptikti daugiau nei 90 sukëlë - jø (3 len te lë, 4 len te lë), ir tai su da ro maþ daug 90 % vi sø áma no mø sep sio sukëlëjø, taip pat galima nustatyti ke - letà atsparumo vaistams genø (5 len - telë). Penktas etapas sepsio sukëlëjø identifikavimas TL-PGR metodu. Ðis etapas leidþia identifikuoti patogenus, kurie jau yra nustatyti ankstesniame atrankos etape. Ið viso galima identifikuoti 27 sukëlëjø rûðis. Ðie sukëlëjai 3 ir 4 lentelëse paþymëti þvaigþdutëmis. Ðia me rin ki ny je nau do ja mos dvi uni ka lios pa ten tuo tos tech no lo gi jos (DPO dual prim ing oligo nucleo - tide, READ real amlpicon de tec - tion), kurios lemia didelá tyrimo jaut - rumà ir specifiðkumà. 160 LABORATORINË MEDICINA 2012, t. 14, Nr. 3(55)

8 Sepsio laboratorinës diagnostikos metodø apþvalga 3 lentelë. Gramteigiamos bakterijos, kurias galima nustatyti Magicplex Sep sis Real-time Test metodu (gramteigiamø bak - terijø atranka) Ta ble 3. Gram-pos i tive bac te ria spe cies of sep sis caus ative patho gens spec i fied by Magicplex Sep sis Real-time Test (Gram-positive bacteria Screening) Streptococcus spp. Enterococcus spp. Staphylococcus spp. Atranka 40 rûðiø Atranka 3 rûðiø Atranka 30 rûðiø S. agalactiae* S. pyogenes* S. pneumoniae* Strep to coc cus alactolyticus Strep to coc cus anginosus Strep to coc cus aus tra lis Strep to coc cus bovis Strep to coc cus canis Strep to coc cus constellatus porûðis constellatus Streptococcus criceti Streptococcus cristatus Streptococcus downei Streptococcus dysgalactiae porûðis equisimilis Streptococcus pasteurianus Streptococcus equi Streptococcus ferus Streptococcus gallinaceus Streptococcus gallolyticus Streptococcus gordonii Streptococcus hyointestinalis Streptococcus iniae Streptococcus intermedius Streptococcus lutetiensis Streptococcus macacae Streptococcus macedonicus Streptococcus mitis Streptococcus mutants Streptococcus oralis Streptococcus parasanguinis Streptococcus parauberis Streptococcus infantis Streptococcus pseudopneumoniae Streptococcus ratti Streptococcus salivarius Streptococcus sanguinis Streptococcus sobrinus Streptococcus suis Streptococcus thermophilus Streptococcus uberis Streptococcus vestibularis E. faecalis* E. gallinarum* E. faecium* S. epidermidis* S. haemolyticus* S. aureus* Staphylococcus arlettae Staphylococcus auricularis Staphylococcus carnosus porûðis carnosus Staphylococcus capitis porûðis capitis Staphylococcus capitis porûðis ureolyticus Staphylococcus caprae Staphylococcus chromogenes Staphylococcus cohnii porûðis cohnii Staphylococcus cohnii porûðis urealyticus Staphylococcus delphini Staphylococcus equorum Staphylococcus gallinarum Staphylococcus hominis porûðis hominis Staphylococcus hominis porûðis novobiosepticus Staphylococcus hyicus Staph y lo coc cus kloosii Staphylococcus lentus Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus muscae Staphylococcus pasteuri Staphylococcus piscifermentants Staphylococcus sarprophyticus Staphylococcus schleiferi porûðis schleiferi Staphylococcus sciuri porûðis sciuri Staphylococcus simulans Staphylococcus warneri Staph y lo coc cus xylosus 4 lentelë. Gramneigiamø bakterijø ir grybø sàraðas, kuriuos galima nustatyti Magicplex Sep sis Real-time Test metodu (gramneigiamø bakterijø ir grybø atranka) Ta ble 4. Gram-negative bacteria/fungi species of sepsis causative pathogens specified by Magicplex Sepsis Real-time Test (Gram-negative bacteria/fungi Screening) Gramneigiamos bakterijos A* Gramneigiamos bakterijos B** Grybai*** Atranka (6) rûðiø Atranka (6) rûðiø Atranka (6) rûðiø Pseudomonas aeroginosa Acinetobacter baumannii Stenotr phomonas maltophilia Serratia marcesscens Bacteroides fragilis Salmonella typhi Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Proteus mirabilis Escherichia coli Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes Candida albicans Candida tropicalis Candida parapsilosis Candida glabrata Candida krusei Aspergillus fumigatus 5 lentelë. Atsparumo antibiotikams ge - nai, kuriuos galima nustatyti Magic - plex Sep sis Real-time Test metodu (at - sparumo antibiotikams genø atranka) Ta ble 5. Drug Re sis tance genes of sep - sis causative pathogens specified by Magic plex Sep sis Real-time Test (Drug Resistance Screening) Atranka 3 atsparumo genø vana vanb meca 3.4. Bak te ri jø nu sta ty mas krau jo pa së ly je MAL DI-TOF masës spektrometrijos metodu Nau jau siuo se straips niuo se ap ra ðo - mas vis labiau populiarëjantis masiø spektrometrija grindþiamas metodas ir siûloma já naudoti sepsio sukëlëjams nu sta ty ti. Vie nas ið jø yra MALDI-TOF ma siø spek tro met ri - jos (MS) me to das (angl. ma trix-as - sisted la ser desorption/ion iza tion (MALDI), time-of-flight mass spec - trom e ter (TOF). Tai bakterijø identifika vi mas pep ti dø spek tru. Me to das sëkmingai naudojamas áprastam bak - terijø identifikavimui bei tiesioginiam bakterijø identifikavimui kraujo pasë - lio skystojoje terpëje [70, 71]. Ði tech no lo gi ja në ra su dë tin ga. Bakterijø kultûra uþdedama ant me - ta li nio pa grin do ir vei kia ma sil pna rûgðtimi arba aromatiniais junginiais. LABORATORINË MEDICINA 2012, t. 14, Nr. 3(55) 161

9 Raminta Jonikaitë, Silvija Kiverytë, Zita Auðrelë Kuèinskienë Papildomai dar naudojamas tirpiklis mëginiui iðdþiovinti. Tuomet mëginys ástatomas á spektrometrà ir suþadinamas la ze riu. Aro ma ti niø jun gi niø ter - pë stipriai sugeria lazerio bangas, su - kelia bakterijø komponentø jonizacijà (dau giau sia bal ty mø, bet taip pat nu - kle o rûgð èiø ir jo nø). Mo le ku lës ga ri - namos. Jonai pereina prietaisà tobu - la me va ku u me, to dël ne su si du ria su jokia kita molekule, kol pasiekia de - tek to riø. TOF ma siø spek tro met ras veikia impulsiniu reþimu, todël kiek - vienas kitas duomenø paketas yra diskretus (atskiras) ir unikalus ávykis, priklausantis nuo taikiniø masës ir krûvio. Masës ir krûvio santykis (m/z) yra ly gia ver tis jo ni zuo tos mo le ku lës masei. Gautas spektras lyginamas su etaloniniu spektru ið spektrø banko ir mikroorganizmas identifikuojamas iki rû ðies ar gen ties. MALDI-TOF MS me to du iden ti fi - kuo ta apie 95,4 % bak te ri jø ið ko lo ni - jø. 84,1 % pavyko identifikuoti sukëlë - jø rû ðá ir 11,3 % bu vo nu sta ty ta gen tis, to dël ðis me to das yra vie nas ið kan di - datø pakeisti Gramo daþymà [71]. Metodo trûkumas tas, kad reikalingas laikas kultûrai uþauginti. Më - gi niai ana li zuo ja mi tik tuo met, kai mikroorganizmai uþauginami pasëlyje. Ne kul ti vuo ja mi or ga niz mai ðiuo me to du ne ga li bû ti iden ti fi kuo ja mi. Vis dëlto molekulinis mikroorganizmø iden ti fi ka vi mas krau jo pa së ly je yra greitesnis metodas nei standartinis fe - notipinis identifikavimo ir antibiotikø jaut ru mo ty ri mas, ku ris rei ka lau ja papildomø val., kai pasëlis tampa teigiamas. Automatizuotas MALDI-TOF MS bakterijø ir mieliø nustatymas tiesio - giai kraujo pasëlyje atsirado neseniai kaip alternatyvus metodas identifika - vimo procesui paspartinti [70]. Mikro - organizmai, augantys kraujo pasëlyje, turi bûti atskirti nuo skystosios terpës ir erit ro ci tø (ypaè he mog lo bi no), sie - kiant ið veng ti in ter fe ren ci jos MALDI- TOF ana li zës me tu. Krau jo pasëlio skystosios terpës baltymai su - LITERATÛRA 1. Garnacho-Montero J, Ortiz-Leyba C, Her re ra-melero I, Aldabo -Palla s T, Cay uela-dominguez A, et al. Mor tal ity and mor bid ity at trib ut able to in ad e - quate em pir i cal antimicrobial ther apy in pa tients ad mit ted to the ICU with sep sis: a matched co hort study. J Anti - microb Chemother 2008; 61: Nobre V, Sarasin FP, Pugin J. Prompt an ti bi otic ad min is tra tion and goal-di - rected hemodynamic sup port in pa - tients with se vere sep sis and sep tic shock. Curr Opin Crit Care 2007; 13(5): kuria stiprø signalà ir maskuoja mik - ro or ga niz mø bal ty mø pi kus. Ant ra sis reikalavimas nustatant mikroorganiz - mus kraujo pasëlyje yra jø koncentravi mas. MAL DI-TOF MS nu sta ty mo ge ba pri klau so nuo kul tû ros kon cen - tracijos [72]. Eksperimentuojant nu - statyta, kad bakterijos S. au reus ir E. co li gali bûti gerai identifikuojamos ið 10 7 ko lo ni jas su da ran èiø vie ne tø (KFV)/ml, o vi du ti nis KFV tei gia me kraujo pasëlyje yra 10 8 KFV/ml [73]. Ðiuo me tu vyks ta daug ty ri mø bandant nustatyti antibiotikø jautrumà MAL DI-TOF masiø spektrometrija. Tai yra fenotipine, o ne genotipø analize grindþiamas metodas. MALDI-TOF MS lei dþia iden ti fi - kuoti kraujo pasëlyje esanèias bakteri - jas dideliu jautrumu ir specifiðkumu. Tai uþ trun ka ma þiau kaip 2 val. po to, kai nu sta to mas bak te ri jø au gi mas, t. y. pra ëjus maþ daug 12 val. nuo ta da, kai kraujo pasëlio buteliukai ádedami á automatà [74]. Priklausomai nuo ga - min to jo, nau ji mo le ku li niai me to dai teoriðkai leidþia aptikti kraujo infekcijà ge res niu jaut ru mu, to kiu kaip trys bak te ri jø ir gry bø KFV/ml [5]. Ðiø me - todø taikymà daugiausia riboja auto - matizavimo iðlaidos, reagentø kaina ir bandymams atlikti reikalingø kvalifi - kuo tø dar buo to jø trû ku mas. Ne pai - sant efektyviø ir perspektyviø siste - mø, ke li au to riai nu sta të, kad pir mo - sios molekulinës sistemos gerai papil - do kraujo pasëlá, bet nëra jo pakaitalas [75]. Mokslo paþanga vyksta stulbinamu greièiu, senus laboratorijose nau - dojamus metodus keièia vis naujesni. Ne iðimtis ir sepsio laboratorinë diag - nos ti ka. Ide a lus sep sio diag nos ti kos me to das tu rë tø bû ti toks, ku riuo bû tø ga li ma nu sta ty ti sep sio su kë lë jà ir veiksnius, lemianèius atsparumà anti - biotikams, per kuo trumpesná laikà, kad tinkamas gydymas bûtø pradëtas kuo anks èiau [6]. Gauta: Priimta spaudai: Pe ters RP, van Agtmael MA, Danner SA, Savelkoul PH, Vandenbroucke- Grauls CM. New de - vel op ments in the di ag no sis of blood - stream in fec tions. Lan cet In fect Dis 2004; 4: Mancini N, Carletti S, Ghidoli N, Cichero P, Burioni R, Clementi M, et al. The era of mo lec u lar and other non-cul - ture-based methods in diagnosis of sep - sis. Clin Microbiol Rev 2010; 23(1): Ecker DJ, Sampath R, Li H, Massire C, Matthews HE, Toleno D, Hall TA, et al. Summary REVIEW OF LABORATORY METHODS IN THE DIAGNOSIS OF SEPSIS Raminta Jonikaitë, Silvija Kiverytë, Zita Auðrelë Kuèinskienë Sep sis is the most com mon cause of mor bid ity and mor tal ity in the hos pi - tal ized crit i cally ill pa tients world wide. Rapid eti o log i cal di ag no sis and the early ad min is tra tion of ad e quate anti - microbial ther apy are im por tant for successful outcome [1, 2]. Blood cul ture (BC) is con sid ered to be the di ag nos tic gold stan dard of blood stream in fec tions, with high spec - i fic ity in spe cies iden ti fi ca tion, thought slow-growing and fastidious organisms can reduce the sensitivity. The diagno - sis of sep sis with blood cul ture is a long pro cess. There is a ne ces sity to wait un - til the mi cro or gan isms mul ti ply and reach a large num ber of cells. Usu ally, bac te rial or i gin of the blood in fec tion is con firmed within h (a com plete mi cro bial iden ti fi ca tion and sus cep ti - bil ity pro file). Fun gal in fec tions are con firmed nor mally for more than 72 h, and it may be be cause of blood negativity [3]. Due to the long last ing mi cro bi o log i cal test, the phy si cian while identifying the infection has to rely solely on clin i cal symp toms and less el o quent lab o ra tory tests such as white blood cell count, bio chem i cal mark ers or fe ver. There fore, novel and faster lab o ra - tory meth ods for the di ag no sis of sep sis have been de vel oped [4, 5]. One of the po ten tial rapid meth ods is the method of target-amplification based on patho - gen nu cleic acid poly mer ase chain re ac - tion (PCR). This di ag nos tic method is much more sen si tive and faster than blood cul ture. Gen eral meth ods that use genes for ri bo somal RNA can cre ate problems with contaminating bacteria, caus ing im paired analytical specificity and sensitivity. Keywords: sep sis, blood in fec tion, blood cul ture, mo lec u lar di ag no sis, polymerase chain reaction (PCR). New tech nol ogy for rapid mo lec u lar di - ag no sis of blood stream in fec tions. Ex - pert Rev Mol Diagn 2010; 10; Rus sell JA. Man age ment of sep sis. New Engl J Med 2006; 355(16): Cost of hos pi tal treat ment for blood in - fection surges, especially for uninsured pa tients. nn/nn htm 8. Klingspor L, Jalal S. Mo lec u lar de tec - tion and iden ti fi ca tion of Candida and Aspergillus spp. from clin i cal sam ples 162 LABORATORINË MEDICINA 2012, t. 14, Nr. 3(55)