Augimo faktoriø poveikis peliø miogeniniø làsteliø proliferacijai ir pavirðiniø þymenø ekspresijai

MOKSLO DARBAI SCIENTIFIC PAPERS Laboratorinë medicina. 2010, t. 12, Nr. 1(45), p. 20 24. Augimo faktoriø poveikis peliø miogeniniø làsteliø proliferacijai ir pavirðiniø þymenø ekspresijai Radvilë Malickaitë 1, 2 Laimutë Jurgauskienë 1, 2 Jolanta Bukauskaitë 3 1 Vilniaus universiteto Medicinos fakulteto Ðirdies ir kraujagysliø ligø klinikos Ðirdies chirurgijos centras Clinic of Cardiovascular Diseases Heart Surgery Centre at the Faculty of Medicine, Vilnius University 2 Vilniaus universiteto ligoninës Santariðkiø klinikø Laboratorinës diagnostikos centro Klinikinës imunologijos laboratorija The Laboratory of Clinical immunology, Center of Laboratory Diagnostics, Vilnius University Hospital Santariðkiø Clinics 3 Biochemijos instituto Vystymosi biologijos skyrius The Department of developmental Biology, Institute of Biochemistry Autorius kontaktams: Radvilë Malickaitë Vilniaus universiteto Ðirdies chirurgijos centras Santariðkiø g. 2, LT-08661 Vilnius Tel. +370 5 2365186 El. paðtas: radvile.malickaite@santa.lt Santrauka Ðio dar bo tiks las bu vo áver tin ti, kiek ir kaip mio kar do in fark to zo no je susidarantis uþdegimo veiksnys navikø nekrozës faktorius (TNF- ) ir au gi mo fak to riai, po ten cia lûs far ma ko te ra pi niai veiks niai, gra nu lo ci - tø ko lo ni jas sti mu liuo jan tis fak to rius (G-CSF) ir ka mie ni niø làs te liø au - gi mo fak to rius (SCF) vei kia grei tai be si dau gi nan èiø làs te liø cik là ir pa - vir ði niø þy me nø, svar biø di fe ren cia ci jai ir tarp làs te li niams ry ðiams, eks pre si jà. Ty ri mo me dþia ga ir me to dai. Mio ge ni niø làs te liø kul tû ros bu vo gau tos ið pe liø ko jy tës sker sa ruo þio rau mens au di nio. Làs te liø pro li fe ra - ci nis ak ty vu mas naudojant 5-bro m de ok siu ri di nà ir pa vir ði niø þy me nø eks pre si ja vei kiant TNF-, G-CSF, SCF ir G-CSF/SCF de ri niu buvo áver tin ti tëk mës ci to met ru. Re zul ta tai. Nu sta ty ta, kad di de lë (100 ng/ml) uþ de gi mo þi di niui bûdingo citokino TNF- kon cen tra ci ja slo pi no pro li fe ra ci ná pe lës mio ge - ni niø làs te liø ak ty vu mà, o di de lës (100 ng/ml) po ten cia liai far ma ko te ra - pi niø ci to ki nø SCF ir G-CSF do zës ne su kë lë reikð min go po vei kio làs te - liø pro li fe ra ci jai. En do te lio làs te liø pirm ta kams bû din gø þy me nø CD31 ir CD146 ti ria mo sios làs te lës ne eksp re sa vo. Pa vir ðiaus ad he zi jos re cep - to riaus CD44, da ly vau jan èio làs te lës ir làs te lës, làs te lës ir mat rik so sà - vei ko je, làs te liø ju dë ji me, eks pre si ja ne ki to. Ad he zi jos re cep to riø CD81 (TAPA-1) ir CD9 eks pre si ja dël TNF- po vei kio slo pi na ma, o au gi - mo fak to riø SCF ir SCF/G-CSF de ri nys jà ak ty vi na, kaip ir tran smemb - ra ni nio ti ro zi no ki na zës re cep to riaus SCF li gan do CD117. Iðvados. Di de lë uþ de gi mo þi di niui bû din go ci to ki no TNF- kon cen - tra ci ja slo pi na pro li fe ra ci ná pe lës mio ge ni niø làs te liø ak ty vu mà ir slo pi - na ad he zi jos re cep to riø CD81 (TA PA-1) ir CD9 eks pre si jà. Nors po ten - cia liai far ma ko te ra pi niø ci to ki nø SCF (100 ng/ml) ir G-CSF (100 ng/ml) po vei kis làs te liø cik lui mi ni ma lus, ðiø au gi mo fak to riø de ri nys (kiek vie - no po 100 ng/ml) reikðmingai aktyvina transmembraninio tirozino kina - zës re cep to riaus SCF li gan do CD117 eks pre si jà ka mie ni niø làs te liø pa - vir ðiu je. Au gi mo fak to riai ga li ap sau go ti re ge ne ra ci jai nau do ja mas làs - teles nuo neigiamo uþdegimui palankiø citokinø poveikio. Reikð mi niai þo dþiai: ka mie ni nës làs te lës, ci to ki nai, ad he zi jos re cep - to riai. ÁVADAS Pastaruoju metu pasaulio mokslinin - kai ir gydytojai itin domisi kamieninëmis làstelëmis. Nors teigiama, kad po - tencialios þmogaus kamieniniø làsteliø naudojimo galimybës ávairiø pato - loginiø bûkliø korekcijai yra beveik 20 LABORATORINË MEDICINA 2010, t. 12, Nr. 1(45)

Augimo faktoriø poveikis peliø miogeniniø làsteliø proliferacijai ir pavirðiniø þymenø ekspresijai neribotos, paskelbti klinikiniø tyrimø rezultatai taikant kamieniniø làsteliø terapijà ðirdies nepakankamumui gydyti parodë, kad daugeliu atvejø tera - pinis kamieniniø làsteliø poveikis ne - bu vo toks ge ras, kaip ti kë ta si ið ty ri - mø su eks pe ri men ti niais mo de liais [1 8]. Siekiant iðsiaiðkinti mechaniz - mus, kaip suaugusiojo organizme pa - þeistos làstelës yra pakeièiamos naujomis sveikomis làstelëmis, ir pritaikyti kamie ni nes làs te les au di niø re ge ne ra - cijai, reikia papildomø þiniø apie làste liø di fe ren cia ci jos me cha niz mus, làsteliø tarpusavio sàveikà, integravimosi á patologiná þidiná ypatumus, þû - ties mo le ku li nius me cha niz mus, ðiø procesø reguliacijà ir kitas fundamen - ta lias bio me di ci nos moks lø pro ble - mas. Mio kar do re ge ne ra ci jai tai ky tos ávai rios kil mës ka mie ni nës làs te lës: miob las tai (ið sker sa ruo þio griau èiø raumens iðskiriamos kamieninës làs - telës), kaulø èiulpai ir ið periferinio krau jo ið ski ria mos krau jo da ros ka - mieninës làstelës, vaisiaus kardiomio - citai ir embrioninës kamieninës làstelës, en do te lio làs te lës pirm ta kai [6]. Klinikiniais tyrimais buvo árodytas sàlyginis kamieniniø làsteliø implanta - vi mo á pa þeis tà mio kar dà pro ce dû ros saugumas ûminiu ir ilgalaikio stebëji - mo (iki 4 me tø) lai ko tar piu [1 5]. De - ja, paaiðkëjo, kad ilgalaikis poveikis në ra pa kan ka mas, kai rio jo skil ve lio ið va ro mo sios frak ci jos po ky tis ne - reikðmingas [7, 8]. Re ge ne ra ci jos tiks lu nau do ja mos kamieninës làstelës, suleistos á audi - niø paþeidimo zonà, patenka á uþdegi - mo mikroaplinkà. Vienas miokardo in - farkto zonoje susidaranèiø citokinø na vi kø ne kro zës fak to rius (TNF- ). Ka mie ni nëms làs te lëms ap sau go ti nuo þa lo jamojo uþ de gi mo fak to riø po - veikio galima naudoti kitus citokinus, pa vyz dþiui, au gi mo fak to rius. Þi no ma, kad ankstyvoje poinfarktinëje stadijo - je, kol dar ne þu vo kar dio mio ci tai, far - makoterapija gali sumaþinti þûvanèiø audinio làsteliø skaièiø ir galutinæ po - infarktinio rando zonà [9 14]. Perso - dinamø kamieniniø làsteliø kultûros papildymas augimo faktoriais, citoki - nais ar kitais vaistiniais preparatais taip pat ga li keis ti ðiø làs te liø dau gi ni - mosi ir diferenciacijos ypatumus in - tegruojantis á patologiná þidiná. DARBO TIKSLAS Ðio dar bo tiks las áver tin ti, kiek ir kaip miokardo infarkto zonoje susida - ran tis uþ de gi mo veiks nys na vi kø ne - kro zës fak to rius (TNF- ) ir au gi mo faktoriai, potencialûs farmakoterapi - niai veiksniai granulocitø kolonijas stimuliuojantis faktorius (G-CSF) ir kamieniniø làsteliø augimo faktorius (SCF) veikia greitai besidauginanèiø làs te liø cik là ir pa vir ði niø þy me nø, svarbiø diferenciacijai bei tarplàsteli - niams ryðiams, ekspresijà. TYRIMO MEDÞIAGA IR METODAI Miogeniniø làsteliø iðskyrimas ir palaikymas in vitro Ty ri mams naudojome miogeniniø làste liø kul tû ras, gau tas ið jau nø, 2 4 sa - vai èiø, pe liø ko jy tës griau èiø rau mens audinio. Ði darbo dalis atlikta laikan - tis Hu maniðko elgesio su eksperimentiniais gyvûnais chartijos reikalavimø ir ga vus LR Vals ty bi nës mais to ir ve - terinarijos tarnybos leidimà Nr. 0171 (2007-10-31) nau do ti la bo ra to ri nius gy vû nus Bio che mi jos ins ti tu to moks lo tiriamajam projektui. Pelei atlikus eu - tanazijà ið uþpakalinës kojos ðlaunies rau mens ste ri liai pa im tas 0,5 0,5 cm audinio gabalëlis merkiamas á pernaðos ter pæ (làsteliø augimo terpë be seru mo, su 200 U/ml pe ni ci li no ir 200 g/ml streptomicino). Laminari - nia me bokse nuplovus pernaðos terpæ, audinys nedelsiant smulkinamas me - cha ni niu bû du. Uþ py lus 1 5 ml 0,25 % tripsino, magnetine maiðykle maiðoma apie 10 min. Gau ta sus pen sija praskiedþiama augimo terpe su serumu ir cen tri fu guo ja ma 10 min. 1500 aps./min. grei èiu. Nuo së dos dar kar tà plau na mos cen tri fu guo jant. Su - rinktos làstelës sëjamos á kultivavimo in dus Is co vo mo di fi kuo to je Dal be ko ter pë je (IMDM), praturtintoje 20 % fe - ta li nio ver ðe liø se ru mo (FVS), 5 ng/ml bazinio fibroblastø augimo faktoriaus (bfgf) ir an ti bio ti kø pe ni ci li - no (100 U/ml) ir strep to mi ci no (100 g/ml). Ið maþ daug po 2 sa vai èiø su si da - riu sio ka mie ni niø làs te liø mo no - sluoks nio buvo gauta pirminë miogeniniø làsteliø kultûra, kuri vëliau per - sëta 1 2 kartus per savaitæ. Persëti skirtø làsteliø monosluoksnis flakonë - lyje apþiûrimas inversiniu mikrosko - pu ir atsiþvelgiama á terpës spalvà (au - gant làstelëms terpë rûgðtëja, todël in - di ka to rius fe no lio rau do na sis kei èia spal và ið raus vos á gel to nà), ter pës drums tu mà (ga li su kel ti nu slen kan - èios nuo substrato làstelës arba infek - cija). Persëjant augimo terpë nupila - ma, làs te liø mo nos luoks nis plau na - mas fos fa ti niu bu fe ri niu tir pa lu be Ca 2+ /Mg 2+ (80 mm Na 2 HPO 4, 20 mm NaH 2 PO 4, 100 mm NaCl) ar ba au gi mo ter pe be se ru mo ir dis per guo ja mas ED TA ir 0,25 % trip si no mi ði niu (Bio - log i cal In dus tries), paruoðtu santykiu 9:1. Flakonëlyje paliekama 0,5 ml tir - pa lo, in ku buo ja ma ter mos ta te 37 C 2 10 min. Kai làstelës disperguoja (su - apvalëja, plaukioja suspensijoje), sus - penduojamos pastovios kultûros augimo terpëje: IMDM terpëje, kurioje yra 10 % FVS, an ti bio ti kø ir 2 5 ng/ml bfgf (pagal làsteliø dauginimosi in - ten sy vu mà). Làs te lës skai èiuo ja mos Goriajevo kameroje naudojant ðviesiná mikroskopà; reikiamo tankio suspensija sëjama á naujus kultivavimo indus arba naudojama tyrimams. Pelës miogeniniø làsteliø paruoðimas tëkmës citometriniam proliferacinio aktyvumo tyrimui Proliferacinis aktyvumas tirtas nau - do jant BrdU Flow Kit (BD Bio s ci en ces, San Diego): taikant 5-bromdeoksiuri - di nà (BrdU), 10 l 1 mm vien kar ti nia - me Dalbeko fosfatiniame druskintame bu fe ri nia me tir pa le (DPBS, Sig ma) vienam kultivavimo terpës mililitrui. Ty ri mui nau do ta làs te liø kon cen tra ci - ja 1 2 10 6 ml, inkubacijos laikas 24 val. 37 C CO 2 in ku ba to riu je. Po in - kubacijos làsteliø monosluoksnis skai - dy tas ED TA ir 0,25 % trip si no mi ði niu, làs te lës plau tos 5 ml au gi mo ter pe RPMI-1640 cen tri fu guo jant 10 min. 1500 aps./min. grei èiu, ant ram plo vi - mui nau do tas fos fa ti nis drus kin tas buferinis tirpalas (PBS). Prieð daþymà monokloniniais antikûnais buvo tiria - mas làs te liø gy vy bin gu mas da þant làsteles tripano mëlynuoju. Tiriamøjø làsteliø membrana fiksuota ir jos pra - lai du mas pa di din tas nau do jant BD Cy to fix/cy to perm bu fe ri ná tir pa là (inkubacija 30 min. kambario tempe - ratûroje). Po inkubacijos làstelës plau - tos 1 ml vien kar ti niu Perm/Wash bu fe ri niu tir pa lu, cen tri fu guo jant jas 5 mi n u tes 1100 aps./min. grei èiu. Vë - liau làs te liø memb ra na veik ta BD Cyto perm Plus bu fe ri niu tir pa lu 10 min. ant le do ðal dy tu ve, po in ku ba - ci jos pa kar to ti nai plau tos Perm/Wash bu fe ri niu tir pa lu. Làs - te lës fik suo tos BD Cy to fix/cy to - perm bu fe ri niu tir pa lu 5 min. kam - ba rio tem pe ra tû ro je ir vël plau tos Perm/Wash bu fe ri niu tir pa lu. Áterpto BrdU kiekiui nustatyti làste lës in ku buo tos su DNa ze (1 val. 37 C tem pe ra tû ro je), da þy tos an ti-brdu FITC kon ju guo tu mo nok lo ni niu an ti - kûnu (20 min. kambario temperatûroje), plau tos PBS cen tri fu guo jant 5 min. 1100 aps./min. grei èiu. Taip pa - LABORATORINË MEDICINA 2010, t. 12, Nr. 1(45) 21

Radvilë Malickaitë, Laimutë Jurgauskienë, Jolanta Bukauskaitë ruoðtos làstelës analizuotos tëkmës ci - tometru FACSCalibur, ren kant ne di - desniu nei 400 numatytà slenkstá per - ëju siø ávy kiø per se kun dæ grei èiu. Pro - liferacinis aktyvumas vertintas pagal BrdU áter pi mà á DNR, skai èiuo tas G 0 /G 1, S ir G 2 + M fa zë se esan èiø làs te - liø pro cen tas (1 pav.). Citokinø poveikio proliferaciniam aktyvumui pagal BrdU áterpimà á DNR tyrimas Kartu su BrdU áterpimo tyrimu tiria - mosios làstelës kultivavimo indelyje veiktos uþdegimo þidiniui bûdingu ci - tokinu TNF- (Invitrogen) arba augimo faktoriais granulocitø kolonijas sti mu liuo jan èiu fak to riu mi (G-CSF, In vit ro gen) ir/ar ba ka mie ni niø làs te - liø faktoriumi (SCF, Invitrogen). Duo me nø apie tai, ko kio mis pro - porcijomis iðskiriami augimo faktoriai in vi vo esant mio kar do in fark tui ir ankstyvuoju laikotarpiu po jo, nëra. Þi no ma, kad TNF- yra uþdegimui palankus, citotoksiná atsakà ir apoptozæ medijuojantis citokinas, bet jis pasiþymi ir augimà bei diferenciacijà modu - liuojanèiomis savybëmis, pavyzdþiui, nustatytas skatinamasis poveikis pa - lydoviniø làsteliø aktyvacijai. Mano - ma, kad po vei kis pri klau so nuo ap lin - koje esamø augimo faktoriø (pvz., jei TNF- vei kia kar tu su IL-3 ir G-CSF, ska ti na mas krau jo da ros ka mie ni niø làs te liø au gi mas, o jei kar tu su G-CSF ir SCF jø au gi mas slo pi na mas). Kli - nikiniais tyrimais nustatyta, kad po - infarktinis gydymas G-CSF pagreiti - na iðeminës zonos gijimà, manoma, dël to, kad á uþ de gi mo þi di ná pri trau - kiami makrofagai ir didëja matrikso metaloproteinaziø ekspresija [14]. Yra duo me nø, kad G-CSF, ak ty vuo da mas Janus kinazës (Jak) transduktoriaus ir transkripcijos aktyvatoriaus (Stat) kelià, apsaugo kardiomiocitus ir endote lio làs te les nuo apop to zës. Li te ra tû - ros duo me ni mis, G-CSF kar tu su SCF maþi na pe liø mio kar do in fark to mo de - ly je in du kuo ja mø arit mi jø po in fark ti - niame miokarde daþná, galbût didin - dami koneksino 43 ekspresijà ir arte - rioge ne zæ [9, 15]. Norëdami nustatyti, koks yra ávai - riø TNF-, G-CSF ir SCF do ziø po vei - kis in vi t ro mio ge ni nëms làs te lëms, ið pra dþiø pa si rin ko me mo no te ra pi jà maþomis (5 ng/ml) ir atitinkamai dide - lëmis (100 ng/ml) augimo faktoriø do - zëmis. Kadangi maþø doziø poveikio ne bu vo (ne si sky rë nuo kon tro lës), to - lesniems tyrimas naudotos 100 ng/ml ci to ki nø kon cen tra ci jos. 1 pav. Miogeniniø làsteliø proliferacinio aktyvumo tëkmës citometrinis tyrimas Fig. 1. Miogenic cell proliferation assay using flow cytometry Miogeniniø làsteliø pavirðiniø þymenø ekspresijos nustatymas Tiriamajai làsteliø populiacijai áver - tinti buvo iðtirta jø pavirðiniø þymenø ekspresija [16 19]. Pasirinkti ðie þy - menys: tet ra spa ni nø ðei mos ad he zi jos re cep to riai CD81 (TAPA-1) ir CD9 (manoma, kad jø didþioji uþlàstelinë kilpa jungiasi su heterodimeriniø in - teg ri nø subvienetu, receptoriai svar - bûs ad he zi jai ir làs te liø ju dë ji mui, CD9 in du kuo ja mi to ge ne zæ ir ki na ziø ak ty vu mà); dau gia funk ci në làs te lës pa vir - ðiaus adhezijos molekulë CD44, svarbi làstelës ir làstelës, làstelës ir matrikso sàveikai, làsteliø judëjimui, gráþimui (angl. hou ming) á lim fi nius maz gus, che mo ki nø bei augimo faktoriø perna - ðai á làsteles, augimo signalø perdavi - mui sukeliant proliferacijà ar apopto - zæ; transmembraninis tirozino kina - zës re cep to rius, ka mie ni niø làs te liø fak to riaus (SCF) li gan das CD117 (c-kit); imu nog lo bu li nø su per ðei mos re - cep to riai: per duo dant sig na là da ly - vau jan tis gli kop ro tei nas CD90 (Thy-1), endotelio þymenys tromboci tø/en do te lio ad he zi jos mo le ku lë CD31 (an ti-pecam-1), da ly vau jan ti làstelei migruojant pro kraujagysliø endotelá ir tarpusavyje sàveikaujant en do te lio làstelëms, vykstant angioge - ne zei, uþ degimui, ir làstelës ir endotelio sà vei kai svar bus re cep to rius CD146. Fluo res cen ci jos ri bai tarp tei gia - mai ir neigiamai nusidaþiusiø làsteliø nu sta ty ti ir ga li mam ne spe ci fi niam ðvytëjimui atmesti ruoðtas mëginys su izo ti pi ne kontrole, pelës monokloniniu an ti kû nu prieð IgG1, ka pa, klo nas MOPC-21. Taikyta tiesioginë imunof - luorescencija, 100 l làsteliø suspen - sijos (koncentracija 4 10 6 làsteliø/ml) inkubuojant su 20 l reagento (FITC arba PE konjuguoto monokloninio an - ti kû no) prieð làs te lës pa vir ðiaus memb ra nos þy me ná. In ku buo ta kam - bario temperatûroje tamsoje ne maþiau kaip 30 min., po in ku ba ci jos làs te - lës du kar tus plau tos dviem PBS mi li - litrais ir analizuotos tëkmës citometru taikant Cel lqu est pro gra mà. Statistinë analizë Tyrimø rezultatai statistiðkai apdoro - ti nau do jant SPSS 13 pro gra mà. Duo - menys pateikiami apskaièiavus arit - metiná vidurká ir standartiná nuokry - pá. Skirtumas tarp grupiø ávertintas Stjudento testu, rezultatai buvo laiko - mi reikð min gais, kai p < 0,05. REZULTATAI IR APTARIMAS Pelës miogeniniø làsteliø gyvybingumas Pradedant tyrimà ið Biochemijos insti - tuto gautø làsteliø gyvybingumas da - þant tripano mëlynuoju siekë iki 95 %. Po inkubacijos su uþdegimui palan - kiais (TNF- ) ir potencialiai làsteles nuo þûties apsauganèiais (G-CSF ir SCF) citokinais geriausias làsteliø gy - vybingumas nustatytas po inkubacijos su G-CSF (85,7 ± 8,0 % vs. 76,0 ± 8,6 % kon tro li në se kul tû ro se, p = 0,07; ðe ðiø tyrimø rezultatø duomenys). Citokinø poveikio pelës miogeniniø làsteliø proliferaciniam aktyvumui pagal BrdU áterpimà á DNR tyrimas BrdU áterpimas á miogenines làsteles 24 val. vei kiant 100 ng/ml TNF- ma - 22 LABORATORINË MEDICINA 2010, t. 12, Nr. 1(45)

Augimo faktoriø poveikis peliø miogeniniø làsteliø proliferacijai ir pavirðiniø þymenø ekspresijai þëja (daugiau làsteliø lieka Go/G1 fa - zës, 46,4 ± 6,1 % vs. 33,5 ± 11,5 % kon - tro li niø, p = 0,05, ne daug làs te liø per - ei na á S fa zæ, 20,8 ± 8,9 % vs. 37,5 ± 11,4 % kon tro li niø, p = 0,02). Far ma ko te ra pi niø ci to ki nø G-CSF (100 ng/ml) ir SCF (100 ng/ml) ga li mas po vei kis pro li fe ra ci niam mio ge ni niø làsteliø aktyvumui minimalus. Farmakoterapiniø veiksniø átaka tarplàstelinëje sàveikoje dalyvaujanèiø pavirðiaus þymenø ekspresijai Endotelio làsteliø pirmtakams bûdin - gø þy me nø trom bo ci tø/en do te lio ad - he zi jos mo le ku lës CD31 (an ti- PECAM-1) ir sà vei kos su en do te lio làstelëmis receptoriaus CD146 mûsø tir tos pe lës mio ge ni nës làs te lës be veik ne eksp re sa vo nei kon tro li në je, nei ci - to ki nø pa veik to se kul tû ro se (eks pre si - jos ri bos 0,5 2 %). Ma no me kad tai yra ge ras mio ge ni niø làs te liø kul tû ros gry nu mo þy muo. Dau gia funk ci næ làs te lës pa vir - ðiaus adhezijos molekulæ CD44, daly - vaujanèià làsteliø tarpusavio sàveiko - je, làsteliø sàveikoje su matriksu, taip pat làsteliø judëjime ir chemokinø bei augimo faktoriø pernaðoje á làsteles, ekspresavo beveik visos tirtos làstelës, ðià ekspresijà menkai veikë tyrimui naudoti citokinai. Ad he zi jos re cep to rius CD81 (TAPA-1) ir CD9 kontrolinëje kultûro - je eks pre sa vo dau giau ne gu 70 % vi sø tirtø làsteliø. Citokinø poveikio suves - ti në pa tei kia ma 2 pav.: eks pre si jà kontro li në je kul tû ro je pri ly gi næ 0, ma - to me, kad vei kiant TNF- abie jø re - ceptoriø ekspresija silpnëjo CD81 vi - du ti nið kai 3,5 %, o CD9 15,5 %. Au gi - mo fak to riai, ypaè SCF ir SCF de ri nys su G-CSF, ad he zi jos re cep to riø eks - pre si jà ak ty vi no ati tin ka mai iki 94 % ir 74 % po 24 val. in ku ba ci jos su 100 ng/ml G-CSF, iki 95 % ir 80 % po 24 val. in ku ba ci jos su 100 ng/ml SCF, iki 84 % ir 82 % po 24 val. in ku ba ci jos su G-CSF ir SCF (abie jø po 100 ng/ml). Literatûroje skelbta, kad transmemb - ra ni nius pro tei nus CD9 ir CD81 eks - presuoja tiek pelës griauèiø raumens làstelës, tiek miogeniniø linijø làstelës. Mio ge ni nës di fe ren cia ci jos me tu ðiø proteinø ekspresija didëja, o tai - kant an ti kû nus prieð CD9 ir CD81 lë - tëja mioblastø susiliejimas ir miotu - buliø susidarymas [17], taigi, abu pro - teinai yra svarbûs miogeniniø làsteliø diferenciacijai. Nustatytas teigiamas augimo faktoriø poveikis ðiø adhezijos molekuliø ekspresijai gali bûti susijæs su didesnëmis galimybëmis migruoti á miokardo paþaidos þidiná. 1 lentelë. Miogeniniø làsteliø gyvybingumas dël citokinø poveikio Ta ble 1. In flu ence of cytokines on myogenic cell vi a bil ity Làstelës Gyvybingumas po 24 val. inkubacijos, % Kontrolinës 76,0 ± 8,6 TNF-, 100 ng/ml 73,6 ± 16,2 G-CSF, 100 ng/ml 85,7 ± 8,0* SCF, 100 ng/ml 78,8 ± 14,5 *p = 0,07 lyginant su kontrolinëmis làstelëmis. 2 lentelë. Tiriamøjø làsteliø ciklo kitimas (BrdU áterpimas) pagal citokinø poveiká Ta ble 2. Cell cycle (BrdU incorporation) under the influence of cytokines Làstelës Go/G1 (%) S (%) G2+M (%) Kontrolinës 33,5 ± 11,5 37,5 ± 11,4 11,5 ± 4,1 TNF-, 100 ng/ml 46,4 ± 6,1* 20,8 ± 8,9** 16,7 ± 9,0 G-CSF, 100 ng/ml 33,0 ± 14,5 40,4 ± 23,7 6,6 ± 4,1 SCF, 100 ng/ml 40,0 ± 11,6 36,0 ± 15,8 10,1 ± 2,8 * p = 0,05 lyginant su kontrolinëmis làstelëmis ** p = 0,02 lyginant su kontrolinëmis làstelëmis Mio ge ni niø pirm ta kø þy muo [19] tran smemb ra ni nis ti ro zi no ki na zës re cep to rius CD117 (c-kit) taip pat ak - tyviai ekspresuojamas tiriamøjø ka - mieniniø làsteliø pavirðiuje (72 % kon - tro li niø làs te liø). TNF- eks pre si jà slopina (iki 50 % làsteliø). Paþymëti - na, kad pa vie niai au gi mo fak to riai ekspresijos neveikë (69 % po inkubaci - jos su G-CSF ir 70 % su SCF), bet at - sa kas (iki 95 %) vei kiant au gi mo fak - to riø de ri niui bu vo ryð kus (2 pav.). Per duo dant sig na là da ly vau jan tá re cep to riø CD90 (Thy-1) ekspresuoja pusë kontroliniø làsteliø; ðià ekspresi - jà slopinamai veikia tik TNF- (eks - presija maþëja 13 %), augimo faktoriai reikð min go poveikio neturi. 25 20 15 10 5 0-5 -10-15 -20-25 % TNF-alfa G-CSF SCF Ankstyvoje poinfarktinëje stadijo - je, kol dar neþuvo kardiomiocitai, taikoma farmakoterapija gali sumaþinti þû van èiø au di nio làs te liø skai èiø ir ga lu ti næ po in fark ti nio ran do zo nà. Persodinamø kamieniniø làsteliø kul - tûros papildymas augimo faktoriais, citokinais ar kitais vaistiniais preparatais gali keisti ðiø làsteliø dauginimosi bei diferenciacijos integruojantis á patologiná þidiná ypatumus. Atlikus tyrimà gautos þinios apie kamieniniø làsteliø, taikomø eksperimentinei ar kli ni ki nei mio kar do ir krau ja gys liø endotelio regeneracijai, funkcines savybes padës tobulinti làstelinës tera - pijos metodus, derinant ðià terapijà su farmakologiniais veiksniais. G-CSF + SCF CD81 CD9 CD117 2 pav. Citokinø poveikis pelës miogeniniø kamieniniø làsteliø pavirðiaus þy me - nø ekspresijai Fig. 2. In flu ence of cytokines on myogenic mouse stem cells sur face mol e cules ex - pres sion LABORATORINË MEDICINA 2010, t. 12, Nr. 1(45) 23

Radvilë Malickaitë, Laimutë Jurgauskienë, Jolanta Bukauskaitë IÐVADOS Didelë (100 ng/ml) uþdegimo þidiniui bûdingo citokino TNF- kon cen tra ci ja slopina proliferaciná pelës miogeniniø làsteliø aktyvumà ir adhezijos recep - to riø CD81 (TA PA-1) ir CD9 eks pre si - jà. Nors far ma ko te ra pi niø ci to ki nø SCF (100 ng/ml) ir G-CSF (100 ng/ml) galimas poveikis làsteliø ciklui mini - ma lus, ðiø au gi mo fak to riø de ri nys (kiek vie no po 100 ng/ml) reikð min gai ak ty vi na tran smemb ra ni nio ti ro zi no ki na zës re cep to riaus, SCF li gan do CD117 ekspresijà kamieniniø làsteliø pavirðiuje. Augimo faktoriai gali apsaugoti regeneracijai naudojamas làs - te les nuo ne igia mo uþ de gi mui pa lan - kiø citokinø poveikio. Ðis darbas atliktas vykdant Lietuvos valstybinio mokslo ir studijø fondo remiamà projektà Fundamen ti niai ka mie ni niø làs te liø funkcionavimo mechanizmø tyrimai. Citoterapija 2, registracijos Nr. C-07023, su tar ties Nr. C-04/2007. Gauta: 2010 02 19 Priimta spaudai: 2010 03 31 LITERATÛRA 1. Menasche P, Hagene A, Scorsin M, Puozet B, Desnos M, Dubos D, et al. Autologous skel e tal myoblast trans - plan ta tion for car diac in suf fi ciency. First clin i cal case. Arch Mal Coeur Vaiss 2001; 94(3): 180 2. 2. Menasche P, Hagene AA, Vilquin JT, Desnos M, Abergel E, Pouzet B, et al. Autologous skel e tal myoblast trans - plan ta tion for se vere post in farc tion LV dys func tion. J Am Coll Cardiol 2003; 41(7): 1078 83. 3. Herreros J, Pros per F, Perez A, Gavira JJ, Gar cia-velloso MJ, Barba J, et al. Autologous intramyocardial in jec - tion of cul tured skel e tal mus cle-de - rived stem cells in pa tients with nonacute myocardial infarction. Eur Heart J 2003; 24(22): 2012 20. 4. Menasche P. Myoblast trans fer in heart fail ure. Surg Clin N Am 2004; 84: 125 39. 5. Dib N, Michler RE, Pagani FD, Wright S, Kereiakes DJ, Lengerich R, et al. Safety and fea si bil ity of auto - logous myoblast trans plan ta tion in pa - tients with ischaemic cardiomyopathy: four-year follow-up. Circulation 2005; 112(12): 1748 55. 6. Davani S, Deschaseaux F, Chalmers D, Tiberghien P, Kantelip JP. Can stem cells mend bro ken heart? Car dio vas cu - lar Re search 2005; 65: 305 16. 7. Steendijk P, Smits PC, Valgimigli M, van der Giessen WJ, Onderwater EE, Serruys PW. Intramyocardial in jec tion of skel e tal myoblasts: long-term fol - low- up with pres sure-vol ume loops. Summary IMPACT OF GROWTH FACTORS ON MIOGENIC MOUSE CELLS PROLIFERATION AND SURFACE MARKERS EXPRESSION Radvilë Malickaitë, Laimutë Jurgauskienë, Jolanta Bukauskaitë Background. Acute myo car dial in farc - tion is ac com pa nied by in creased lev els of proinflammatory cytokines, in clud ing TNF-. We aimed to an a lyze al ter na tions in myogenic mouse stem cells pro lif er a - tion as well as the sur face ex pres sion of ad he sion mol e cules and re cep tors, in - volved in cell dif fer en ti a tion and trans - endothelial mi gra tion. Ma te rial and meth ods. Skel e tal mus cle de rived myogenic cell lines were iso lated from 2 4 week old mouse leg musculus. Cell pro lif er a tion was as - sessed by flow cytometry us ing BrdU Flow Kit (BD Bio sci ences, San Diego). In - fluence of cytokines of pharmacological po ten tial TNF-, G-CSF, SCF and G-CSF/SCF com bi na tion on myogenic mouse stem cells pro lif er a tion as well as sur face mol e cules ex pres sion has been in ves ti gated. Nat Clin Pract Cardiovasc Med 2006; 3 (Suppl 1): S94 100. 8. Menasche P, Desnos M, Hagene AH. Rou tine de liv ery of mioblasts dur ing coronary artery bypass surgery: why not? Nat Clin Pract Cardiovasc Med 2006; 3 (Suppl. 1): S90 3. 9. Dawn B, Guo Y, Rezazadeh A, Huang Y, Stein AB, Hunt G, et al. Postinfarct cytokine ther apy re gen er - ates car diac tis sue and im proves left ven tric u lar func tion. Cir cu la tion Re - search 2006; 98: 1098 105. 10. Barile L, Chimenti I, Gaetani R, Forte E, Miraldi F, Frati G, et al. Cardiac stem cells: iso la tion, ex pan sion and ex per i men tal use for myo car - dial regeneration. Nat Clin Pract Cardiovasc Med 2007; 3 (Suppl 1): S9 14. 11. Ellison GM, Torella D, Karakikes I, Nadal- Ginard B. Myocyte death and re - newal: mod ern con cepts of car diac cel - lu lar ho meo sta sis. Nat Clin Pract Cardiovasc Med 2007; 4 (Suppl 1): S52 9. 12. Nienaber CA, Petzsch M, Kleine HD, Eckard H, Freund M, Ince H. Ef fects of granulocyte-col ony-stim u lat ing fac tor on mo bi li za tion of bone-marrowderived stem cells af ter myo car dial in - farc tion in hu mans. Nat Clin Pract Cardiovasc Med 2006; 3 (Suppl 1): S73 7. 13. Li Y, Takemura G, Okada H, Miyata S, Esaki M, Maruyama R, et al. Treat - ment with granulocyte col ony-stim u - lating factor ameliorates chronic heart Results. High (100 ng/ml) con cen tra - tions of TNF- in hib ited cells pro lif er a - tion; no stim u la tion of cell cy cle has been no ticed while us ing growth fac tors (G-CSF, SCF and G-CSF/SCF com bi na - tion). En do the lial pro gen i tor cell mark - ers CD31 and CD146 were not ex pressed. Nei ther TNF-, no G-CSF, SCF nor G-CSF/SCF combination has influenced the ex pres sion of ad he sion mol e cule CD44. Ex pres sion of CD81 (TAPA-1) and CD9 were in hib ited us ing TNF-, and in - duced only by G-CSF/SCF com bi na tion. SCF ligand CD117 ex pres sion was found to be twice as high af ter the in cu ba tion with growth fac tors com bi na tion in com - parison with controls. Con clu sions. It was shown, that high con cen tra tions of proinflammatory cytokine TNF- sup press myogenic stem cell pro lif er a tion, as well as ad he sion re - cep tors CD81 (TAPA-1) and CD9 ex pres - sion. No sig nif i cant ef fect of SCF (100 ng/ml) or G-CSF (100 ng/ml) on cell pro lif er a tion was es tab lished. The G-CSF/SCF com bi na tion (100 ng/ml each) ac ti vates trans-mem brane pro tein with ty ro sine kinase ca pac ity SCF ligand CD117 ex pres sion on myoblast cell line. Keywords: stem cell, cytokines, ad he - sion mol e cules. fail ure. Lab o ra tory in ves ti ga tion 2006; 86: 32 44. 14. Ince H, Nienaber ChA. Granulocytecolony-stimulating factor in acute myo - cardial infarction: future perspectives af ter FIRSTLINE-AMI and RE - VIVAL-2. Nat Clin Pract Cardiovasc Med 2006; 3 (Suppl 1): S114 8. 15. Sesti C, Hale SL, Lutzko C, Kloner RA. Granulocyte colony-stimulating factor and stem cell fac tor im prove con trac tile re serve of the in fracted left ven tri cle in - de pend ent of re stor ing mus cle mass. J Am Coll Cardiol 2005; 46: 1662 9. 16. Tachibana I, Hemler ME. Role of transmembrane 4 superfamily (TM4SF) pro teins CD9 and CD81 in mus cle cell fu sion and myotube main te - nance. The Jour nal of Cell Bi ol ogy 1999; 146(4): 893 904. 17. Hakomori S. Glycosynaptic micro do - main controlling tumor cell phenotype through al ter ation of cell growth, ad he - sion, and mo til ity. FEBS Lett 2009; dpi: 10.1016/j.febslet.2009.10.065. 18. Nykanen AI, Raisky O, Hollmen M, Krebs R, Tikkanen JM, Wu Y, et al. In - ter play be tween in flam ma tion and angiogenesis in car diac allo grafts therapeutic applications for VEGFR-1 and -2 in hi bi tions. J Heart Lung Trans - plant 2006; 25 (2S): S89 90. 19. Steele A, Jones OY, Gok F, Marikar Y, Steele P, Chamizo W, et al. Stem-like cells traf fic from heart ex vivo, ex pands in vi tro, and can be trans planted in vivo. J Heart Lung Trans plant 2005; 24: 1930 9. 24 LABORATORINË MEDICINA 2010, t. 12, Nr. 1(45)