MOKSLAS, TEORIJA IR PRAKTIKA SCIENCE, THEORY & PRACTICE Laboratorinë medicina. 2010, t. 12, Nr. 2(46), p. 82 86. Hemopoezës kamieniniø làsteliø tyrimø apþvalga Adomas Bukauskas 1 Rëda Matuzevièienë 2, 3 1 Vilniaus universiteto Medicinos fakultetas Vilnius University, Faculty of Medicine El. paðtas: adomas1985@gmail.com 2 Vilniaus universiteto Medicinos fakulteto Fiziologijos, biochemijos ir laboratorinës medicinos katedra Vilnius University, Faculty of Medicine, Department of Physiology, Biochemistry and Laboratory Medicine 3 Vilniaus universiteto ligoninës Santariðkiø klinikø Laboratorinës diagnostikos centras Vilnius University, Hospital Santariðkiø Klinikos, Centre of Laboratory Diagnostics Santrauka He mo po e zi në ka mie ni në làs te lë tai dau gia ga lë ne di fe ren ci juo ta làs te - lë, ið ku rios ky la vi sos lim foi di nës, mie loi di nës, me ga ka rio ci ti nës ir erit - roi di nës li ni jos làs te lës, ga lin èios pa keis ti su nai kin tà he mo po e zi næ sis - te mà. Tai ge riau siai ið tir tos ka mie ni nës làs te lës, o jø transp lan ta ci ja aktyviai taikoma klinikinëje praktikoje. Nuolat gausëjantys ir tobulë - jan tys ty ri mai su tei kia vis dau giau in for ma ci jos apie he mo po e zi në se ka - mieninëse làstelëse vykstanèius biologinius procesus, jø funkcijas, savy - bes ir nau do ji mo re ge ne ra ci në je me di ci no je ga li my bes. Straips ny je pa - tei kia ma ben dra in for ma ci ja apie he mo po e zi nes ka mie ni nes làs te les. Ap þvel gia mi he mo po e zës ka mie ni niø làs te liø ir pirm ta kø in vi tro (il ga - laikes kultûras pradedanèiø làsteliø, akmeninio grindinio zonas for - muo jan èiø làs te liø ir ko lo ni jas for muo jan èiø làs te liø) ir in vivo (kon ku - ren ci nës re po pu lia ci jos ir kse no ge ni niø transp lan ta tø) ty ri mai, taip pat at krei pia mas dë me sys á ge ne ti nius ty ri mus ir nau jà vaiz da vi mo tech ni - kà bio liu mi nes cen ci ná vaiz di ni mà. De ta liai nag ri në ja mas pir ma sis nu - sta ty tas ir daþ niau siai nau do ja mas þmo gaus he mo po e zës ka mie ni niø làs te liø þy muo CD34 bei jo ty ri mo me to di kos. Ap þvel gia mi ki ti pa vir - ðiaus bei me ta bo li niai þy me nys. Ak cen tuo ja mi ir di fe ren ci juo tø krau jo làs te liø þy me nys, bû din gi T lim fo ci tams, B lim fo ci tams, NK làs te lëms, mie loi di nës ir erit roi di nës kil mës làs te lëms, jø reikð më ið ski riant ið krau jo ka mie ni nes he mo po e zës làs te les. Pa mi në ti nau jie ji he mo po e zës ka mie ni niø làs te liø þy me nys: ALDH, SLAM, ðo ni nës po pu lia ci jos làs - te lës ir CD201. Pa tei kia ma nau jau sia in for ma ci ja apie vi sa me pa sau ly je at lie ka mø he mo po e zës ka mie ni niø làs te liø transp lan ta ci jos mas tà. Api - ben dri na mi au to lo gi niø ir alo ge ni niø he mo po e zës ka mie ni niø làs te liø transp lan ta ci jos pra na ðu mai ir trû ku mai, taip pat tai ky mo re ge ne ra ci - në je me di ci no je in di ka ci jos. Reikð mi niai þo dþiai: he mo po e zës ka mie ni në làs te lë, CD34, fe no ti pas, re ge ne ra ci në me di ci na. ÁVADAS Kamieninë làstelë tai làstelë, galinti atsinaujinti dalijimosi bûdu visà organizmo gyvenimà ir diferencijuotis á bet ku rià ið dau giau ne gu 200 rû ðiø su - brendusiø organizmo làsteliø. Jø ðal - tiniai yra embrioninës ir suaugusio or - ga niz mo kamieninës làstelës: hemopoe zi nës, me zen chi mi nës, ner vi nës, epi - te li nës, odos ir kitos kamieninës làstelës. Iki ðiol dau giau sia ið tir tos þmo - gaus he mopoezës kamieninës làstelës (HKL). Hemopoezës kamieninë làstelë daugiagalë nediferencijuota làste - lë. Ið jos ky la vi sos lim foi di nës, mie loi - dinës, megakariocitinës ir eritroidinës linijos làstelës, kurios gali pakeisti su - naikintà hemopoezinæ sistemà. Ernes - tas A. McCul lo chas ir Ja me sas E. Til - las yra moks lo apie þmo gaus he ma to - poezës kamienines làsteles pradinin - kai [1]. Þmo gaus HKL ran da ma kau lø èiul puo se, krau jy je, ke pe ny se ir bluþ - ny je. Kau lø èiul puo se taip pat ran da - mos kitos dvi kamieniniø làsteliø po - puliacijos: endotelio pirmtakai ir stro - mos kamieninës làstelës, sudaranèios 82 LABORATORINË MEDICINA 2010, t. 12, Nr. 2(46)
Hemopoezës kamieniniø làsteliø tyrimø apþvalga specifinæ mikroaplinkà kraujo làste - lëms. Þi no mos dvie jø li ni jø HKL: il ga - laikës, pasiþyminèios dideliu telome - razës aktyvumu, ir trumpalaikës, ku - rios diferencijuojasi á limfoidinius ir mieloidinius pirmtakus. HKL gali di - fe ren ci juo tis á su bren du sias krau jo làsteles ir atkurti savo populiacijà ne - vykstant diferenciacijai. HKL kieká or - ganizme lemia pusiausvyra tarp atsi - naujinimo, diferenciacijos, migracijos ir apop to zës. HKL gau na mos ið kau lø èiulpø ir mobilizuoto periferinio krau - jo, virkð te lës krau jo bei emb rio no. Re - miantis naujausiais in vivo tyrimais he mo po e zës ka mie ni nës làs te lës ga li di fe ren ci juo tis ne tik á krau jo, bet ir á rau me nø, ke pe nø, krau ja gys liø bei odos audinius. Gausëjantys kamieni - niø làsteliø tyrimai pateikia vis dau - giau þi niø, pra ple èian èiø re ge ne ra ci - nës medicinos taikymo galimybes [2, 3]. IN VIVO IR IN VITRO TYRIMAI 1 pav. Subrendusiø kraujo làsteliø diferenciacijos ið hemopoeziniø kamieniniø làsteliø schema Fig. 1. Sche matic rep re sen ta tion of the pro duc tion of ma ture blood cells by dif - ferentiation of hematopoietic stem cells Kairëje pusëje HKL ir labiau diferencijuotoms làstelëms nustatyti daþniausiai naudojami làs te liø pavirðiaus þymenys. Repopuliuojanèios kamieninës làstelës nustatomos kon ku - ren ci nio pakeitimo (CRU, angl. competitive repopulating unit) ir imunodeficitiniø peliø (NOD/SCID, angl. non obese diabetic/severe combined immunodeficiency) ksenogeniniø trans plan ta tø tyrimais. Ilgalaikes kultûras pradedanèios làstelës (LTC-IC, angl. Long term culture-initiating cell) ir akmeninio grindinio zonas formuojanèios làstelës (CAFC, angl. cob ble stone area-form ing cell) tyrimais nustatomi labai primityvûs pirmtakai. Di de - lio proliferacinio potencialo kolonijas formuojanèios làstelës (HPP-CFC, angl. high proliferative potential colony-forming cells) ir granulocitø, eritrocitø, makrofagø, me ga ka - rio ci tø kolonijas formuojantys vienetai (CFU-GEMM, angl. colony-forming-unit-granulo - cyte, eryth ro cyte, macrophage, megakaryocyte) yra daugiagaliai pirmtakai ir primityvesni uþ linijinius pirmtakus (CFU-GM, angl. col ony-form ing-unit-granulocyte, macrophage; CFU-G, angl. colony-forming-unit-granulocyte; CFU-M, angl. colony-forming-unit-macrophage; CFU-Mk angl. colony-forming-unit-megakaryocyte; BFU-E, angl. burst-formingunit-erythroid; CFU-E, angl. colony-forming-unit-erythrocyte). Subrendusios làstelës at - pa þás ta mos pagal morfologines, funkcines savybes ir specifinius antigeninius þymenis. Perspausdinta ið Bert Wognum, Mini re view. Hematopoietic stem cells. He mo po e zi nës krau jo làs te lës ti ria - mos in vi tro ir in vivo me to dais (1 pav.). In vi tro ti ria mos làs te liø pirm ta kø (ko lo ni jas for muo jan èios làstelës; angl. Col ony form ing cell CFC), kamieniniø làsteliø (ilgalaikes kul tû ras pra de dan ti làs te lë; angl. Long- term cul ture-ini ti at ing cell LTC-IC) ar ba ir pirm ta kø, ir ka mie ni - niø làs te liø kul tû ros ( ak me ni nio grindinio zonas formuojanèios làste - lës; angl. Cob ble stone area form ingcells CAFC). Ðiais ty ri mais ret ros - pektyviai matuojamas tiriamø làste - liø kraujodaros pajëgumas, t. y. iðau - gus ko lo ni joms ka mie ni nës làs te lës daþniausiai nebeaptinkamos [4]. Il ga lai kiø kul tû rø (angl. Longterm cul tures LTC) ty ri mai at lie ka - mi stro mos làs te liø ter pë je, ku ri re gu - liuoja hemopoeziniø làsteliø augimà, iðskirdama stimuliuojanèius ir slopi - nan èius sig na lus. Ti riant il ga lai kes kultûras pradedanèià làstelæ LTC-IC, il ga lai kiø kul tû rø tu ri nys yra su ren - kamas ir persëjamas á metilceliuliozës pa grin du pa ruoð tà ter pæ, pa pil dy tà he mo po e zi niais au gi mo fak to riais. Ieðkoma ið pirminës ilgalaikës kultû - ros primityviø làsteliø diferencijavu - siø kolonijas formuojanèiø làsteliø. At lie kant ak me ni nio grin di nio zonas formuojanèios làstelës CAFC ty - ri mà, fa zi nio kon tras to mik ro sko pu ieð ko ma tam sios fa zës he mo po e zës làsteliø ( akmeninio grindinio zonø), esanèiø po stromos làsteliø sluoksniu. Làstelës, po 5 8 savaièiø gebanèios di - ferencijuotis á kolonijas formuojanèias làsteles, manoma, yra kilusios ið labai pri mi ty viø làs te liø, va di na mø LTCpradedanèiosiomis làstelëmis, o làste - lës, kurios sudaro kolonijas formuo - jan èias làs te les CFC per trum pes ná laikotarpá, diferencijuojasi ið maþiau primityviø pirmtakø [5]. CFC tyrimais skaièiuojami daugia - galiai pirmtakai ir eritroidinës, granu - lo ci tø, mo no ci tø/mak ro fa gø, B-lim foi - diniø, megakariocitø linijos pirmtaki - nës làstelës. Làsteliø suspensija pasë - jama á pusiau stangrià terpæ (metilce - liuliozës arba agaro), papildytà ávai - riais ci to ki nais. Þi no ma ne ma þiau kaip 20 he mo po e zi niø ci to ki nø, tarp jø ka mie ni niø làs te liø fak to rius (angl. stem cell fac tor SCF), trombopoetinas (TPO), in ter leu ki nas-3 (IL-3) ir erit ro po e ti nas (EPO). CFC iden ti fi - kuojamos ir suskaièiuojamos remiantis morfologiniais subrendusiø làste - liø po þy miais. Ke liø li ni jø ko lo ni jos susiformuoja ið primityvesniø pirmta - kø negu susiformavusios ið vienos lini - jos. In vi tro tyrimais galima patikrinti kamieninës làstelës aktyvumà ið spë - jamos kamieniniø làsteliø populiacijos arba konkretaus gydymo taikant HKL efek tà [4]. Ka mie ni niø làs te liø imu no fe no ti - pà, gebëjimà gráþti á kaulø èiulpus, pri - gijimo greitá, atsakà á citokinus, repo - puliaciniø làsteliø savybes patogiau - sia stebëti atliekant transplantacijos tyrimus. Daugiausia informacijos gau - na ma ið kon ku ren ci nës re po pu lia ci jos ir kse no ge ni niø transp lan ta tø ty ri mø rezultatø analizës. At lie kant kon ku ren ci nës re po pu - liacijos (angl. Com pet i tive re pop u lat - ing unit CRU) tyrimà, nedidelis kie - kis ðeimininko kaulø èiulpø làsteliø (kon ku ren ci niø) su mai ðo mas su do no - ro HKL populiacija. Donorinës ir kon - LABORATORINË MEDICINA 2010, t. 12, Nr. 2(46) 83
kurencinës làstelës paþymimos skir - tin gais ge ne ti niais þy me ni mis, daþ - niau siai ti ro zi no fos fa ta ze CD45.1/Ly5.1 ir CD45.2/Ly5.2. Pe lës apðvitinamos, suleidþiamas HKL mi - ði nys (do no ri nës ir kon ku ren ci nës làs - telës, kurios skiriasi genetiniais þyme - ni mis) ir ste bi ma nuo 4 iki 6 më ne siø tuomet praktiðkai visos subrendusios làs te lës yra ki lu sios ið pri mi ty viø HKL. Vertinama, kokia dalis subren - dusiø kraujo làsteliø yra kilusios ið do - no ri niø HKL. Kse no ge ni niø transp lan ta tø ty ri - mai þmo gaus HKL transp lan tuo ja - mos imu no de fi ci to bûk lës pe lëms (angl. Non obese di a betic/se vere com - bined im mu no de fi ciency NOD/SCID), ku rios ne ga li at mes ti kse no ge ni nio transp lan ta to. NOD/SCID peliø tyrimas suteikia in - formacijos apie gebëjimà atkurti þmo - gaus HKL ir primityvius pirmtakus. Tokios làstelës vadinamos NOD/SCID ar ba tie siog SCID re po pu liuo jan èio - mis làstelëmis (angl. Se vere com bined im mu no de fi ciency mice re pop u lat ing cells SRC). Ðie ty ri mai ge riau siai at - spindi HKL gebëjimà atkurti ilgalaikæ daugialinijinæ kraujodarà. SRC tyri - mai áro dë skir tu mus tarp pa èiø HKL. HKL skiriasi proliferacijos potencialu vie nos pri gy ja grei tai ir il gam lai - kui, ki tos vë liau ir trum pes niam lai - kui, t. y. tu ri ma þes ná pro li fe ra ci ná po - tencialà [6]. Mazurier ir kt., at li kæ ty - ri mus, ku riuo se NOD/SCID pe lei tie - siogiai á ðlauná suleido CD34 +, CD38 low ir CD36 làsteliø, nustatë naujà HKL klasæ. Ðios greitosios SRC uþtikrino mieloidiniø ir eritroidiniø làsteliø re - generacijà per dvi savaites po transp - lantacijos [7]. Chemokinas SDF-1 ir jo receptorius CXCR4 yra labai svarbûs HKL grá þi mui á kau lø èiul pus ir jø pri - gijimui [8]. Padidinus SDF-1 aktyvu - mà nau do jant in hi bi to rius, ku rie ne - leidþia pro te o li zës fer men tams inak ty - vuoti SDF-1, padidëjo gráþimas á kaulø èiulpus ir prigijimas pelës Lin SCA-1 + ir þmo gaus CD34 + ir Lin làsteliø reci - pien tëms pe lëms (NOD/SCID) [9]. KI TI TY RI MO ME TO DAI Ge nø funk ci jà pa to gu tir ti per ke liant genus á HKL. Tam pa si tel kia mi ret ro - virusai ir lentivirusai. Retrovirusø ir len ti vi ru sø per ke lia mø ge nø tiks las yra eks pre suo ti per kel tus HKL ge nus ir tokiu bûdu iðtaisyti hematologinius sutrikimus visam laikui. Vis dëlto visi onkoretrovirusiniai vektoriai gali in - tegruotis á genomà atsitiktine tvarka, daþniausiai aktyviose chromatino vie - to se, ir pa si þy më ti mu ta ge ni niu po vei - kiu. Ge nø pri si jun gi mo vie ta ti ria ma 2 pav. HKL repopuliacija tikruoju laiku Fig. 2. Real time HSC re pop u la tion Nuotraukos darytos nuo 5 iki 79 dienos po transplantacijos. Ankstyvøjø pirmtakø làsteliø pri gi ji mà ir dauginimàsi þymi pradiniai þidiniai. Viso kûno stiprûs signalai rodo prigijimà ir ilgalaikiø repopuliaciniø HKL hematopoezæ. polimerazës grandinine reakcija. Ge - ne tið kai modifikuotos þmogaus HKL yra puiki medþiaga tirti ankstyvàjà he mo po e zæ mo le ku li niu lyg me niu [10]. Bio liu mi nes cen ci nis vaiz di ni mas sudaro sàlygas stebëti po transplanta - cijos vykstanèià repopuliacijà tikruoju laiku (2 pav.). Suleistà D-liuciferinà paveikia transplantuotos pelës HKL jonvabalio liuciferazë ir iðspinduliuojami fotonai. Juos aptinka didelës ski - riamosios gebos kameros. Ðis metodas leido pirmà kartà pamatyti hemopoe - zës mas tà transp lan tuo to je pe lë je. Vaizdinimui galima taikyti ir magne - ti nio re zonanso tomografijà, vieno fo - to no emi sijos kompiuterinæ tomografijà (angl. Sin gle pho ton emis sion com - puted tomography SPECT), po zit ro - nø emisinæ tomografijà (angl. pos i tron emis sion to mog ra phy PET). Ðios mo - lekulinës ir vaizdinës technikos gali - my bës pa dës ge riau su pras ti HKL mig ra ci jà skir tin go mis sà ly go mis ir realiu laiku in vivo [11]. FENOTIPAS CD34 pirmasis nustatytas þmogaus hemopoeziniø kamieniniø làsteliø þy - muo ir daþniausiai naudojamas þmo - gaus HKL populiacijoms gauti. CD34 yra làstelës pavirðiaus glikoproteinas, tarp làs te li nis ad he zi jos fak to rius. CD34 ekspresuojamas 1 5 % normaliø, tu rin èiø bran duo lius kau lø èiul pø làsteliø pavirðiuje, apie 1 % virkðtelës krau jo làs te liø ir ma þiau nei 0,1 % pe - ri fe ri nio krau jo làs te liø pa vir ðiu je. Dauguma, jeigu ne visos, þmogaus làs - teliø, galinèiø atkurti visavertæ krau - jodarà recipientams po mieloabliaci - jos, ekspresuoja CD34. Atliekant dau - gelá autologiniø ir alogeniniø transp - lantacijø tyrimø, kliniðkai buvo stebë - tas CD34 praturtintø transplantatø prigijimas. Citotoksiniai vaistai, cito - ki nai G-CSF, GM-CSF, SCF ir TPO nu trau kia he mo po e zi niø làs te liø ir mik ro ap lin kos sà vei kà, pa di din da mi CD34 + làsteliø koncentracijà kraujyje; ðios làs te lës su ren ka mos at lie kant leukaferezæ [12]. CD34 + kie kis skai - èiuo ja mas tëk mës ci to met ru tri mis me to di ko mis: Mi lan/mul lhou se, ISHAGE (angl. International Society for Hematotherapy and Graft) (vie nos ir dualios platformos) [13], ProCount. Greitas prigijimas matomas perpylus >2 10 6 làs te liø/kg [14]. CD34 làs te lës ið gry ni na mos imu nof luo res cen ci nës ci to met ri jos (angl. Flu o res cence-ac ti - vated cell sorter FACS) ar ba imu no - magnetiniu (tiesioginiu ir netiesioginiu) metodais, pasitelkus anti-cd34 an ti kû nus. CD34 në ra ide a lus HKL þy muo, nes CD34 eks pre suo ja ne tik HKL ir pirm ta kai, ta èiau ir la biau di - ferencijuotos kraujo làstelës. Kita vertus, eg zis tuo ja pri mi ty ves nës HKL CD34 làs te lës, ku rios pri gy ja NOD/SCID pe lë se, sti mu liuo ja mos di - ferencijuojasi á CD34 + in vi tro ir in vivo. CD34 taip pat ne eksp re suo ja CD38, c-kit(cd117) ir FLT3 ir Lin, bet ekspresuoja CD133 [15]. KITI ÞMONIØ HKL ÞYMENYS Þmo niø HKL pa vir ðiaus þy me nys yra Lin, CD34, CD38, CD43, CD45RO, CD45RA, CD59, CD90, CD109, CD117 CD133, CD166 ir HLA-DR. Me ta bo li - niai þy me nys/da þik liai ro da mi - nas-123 (mi to chon dri joms), Hoechst33342 (dau gi nio at spa ru mo vaistams (angl. Multidrug re sis tance) pom pos P-gp ak ty vu mui), pi ro ni nas-y (RNR), BAAA (aldehido dehidrogenazës aktyvumui). Tëkmës citometru ga - li ma ið gry nin ti HKL ir pri mi ty vius pirm ta kus iki ho mo ge nið ku mo. CD34 + làsteliø populiacijà ámanoma dar la - biau ið gry nin ti at ren kant làs te les, eks pre suo jan èias Thy-1+ (CD90), CD38, Thy-1 + (CD90) + CD38, CD133 +. Grei tas ir nuo la ti nis neut ro - 84 LABORATORINË MEDICINA 2010, t. 12, Nr. 2(46)
Hemopoezës kamieniniø làsteliø tyrimø apþvalga Len te lë. Diferencijuotø làsteliø þymenys Ta b le. Lineage cell markers Làsteliø linija Làstelës pavirðiaus antigenai T lim fo ci tø CD7, 2, 3, 4, 8 B lim fo ci tø CD19, 20 NK làs te liø CD56, 57 Mie loi di niø làs te liø CD33, 15 Erit roi di niø làs te liø filø ir trombocitø skaièiaus didëjimas buvo pasiektas perpylus >0,8 10 6 CD34 + Thy-1 + HKL/kg [16]. La bai ið - gry nin tos ka mie ni nës làs te lës dau - giausia naudojamos eksperimentams, o klinikoje vienas þymuo, paprastai CD34. Labai iðgrynintø làsteliø nau - do ji mo pra na ðu mà nu sve ria prak ti - niai sunkumai ir didelë kaina. DI FE REN CI JUO TØ KRAU JO LÀSTELIØ ÞYMENYS HKL ir pirmtakai neekspresuoja làs - te lës pa vir ðiaus þy me nø, bû din gø su - brendusioms kraujo làstelëms bei mie - loidinës ir limfoidinës linijos làstelëms (þr. lentelæ). Paðalinus mieloidinës ir lim foi di nës li ni jos làs te les, HKL ir pirmtakø kiekis padidëja nuo 20 iki 500 kartø, priklausomai nuo naudotø þymenø, pradinio làsteliø santykio ir paðalinimo efektyvumo. Ðis paðalini - mo metodas daþnai atliekamas prieð tolesná primityviø hemopoeziniø làste liø gry ni ni mà FACS me to du, nes su - trumpinamas rûðiavimo laikas ir ið - gryninamos làstelës. HKL ir primity - vûs pirm ta kai ga li bû ti dar la biau ið - gry nin ti imu no mag ne ti niu ið sky ri mo me to du. Pa ða li na mos su bren du sios (Lin + ) làstelës ir mieloidinës bei limfoidinës linijos làstelës, ekspresuojanèios CD38 +, CD71 +, HLA-DR + ir CD45RA +, nes ðie þy me nys ne eksp re - suojami arba labai silpnai ekspresuoja mi dau ge lio HKL, ta èiau >90 % Lin làs te liø eks pre suo ja ðiuos þy me nis [17]. CD 33 làsteliø paðalinimas netinka kamieninëms làstelëms iðgryninti, nes prieðingai, nei anksèiau manyta, ðis þymuo ekspresuojamas primityviø pirmtakø [18]. Norëdami gauti labai iðgrynintas þmogaus kamienines làs - te les, ða li ni mo me to dà tu rë tu me de - rin ti su Lin làsteliø, ekspresuojanèiø Thy-1(CD90), c-kit(cd117) ir CD133, surinkimo metodu. NAUJIEJI HKL ÞYMENYS Al de hi do de hid ro ge na zë yra vi du làs - te li nis fer men tas, ku ris ap sau go kau lø èiul pø pirm ta kus nuo al ki li - Glikoforinas A nan èio cik lo fos fa mi do po vei kio, inak - ty vin da mas jo me ta bo li tà 4-hid rok si - cik lo fos fa mi dà. Þmo gaus ir pe lës he - mo po e zës ka mie ni nës làs te lës nu sta - to mos tëk mës ci to met ru, nau do jant flo res cuo jan èius ALDH sub stra tus [19]. Di dþiau sia ALDH eks pre si ja ma to ma Lin ir CD34 + CD38 þmo - gaus kau lø èiul pø làs te liø po gru py je [20]. Mikrogardeliø metodu identifikuo - ti signaliniø limfocitø aktyvacijos mo - le ku liø (angl. Sig nal ing lym pho cyte ac ti va tion mol e cule SLAM) ðei mos þy me nys at ski ria tik ras pe liø HKL (CD150 +, CD244,CD48 ) nuo pri mi ty - viø pirm ta kø (CD244 +, CD150, CD48 ) [21]. Tai tri jø þy me nø kom - plek sas, ku ris ga li bû ti taip pat efek ty - viai nau do ja mas ið gry ni nant HKL, kaip ir dabartiniai sudëtingesni deri - niai. Kartu tiriami kiti HKL þymenys (Sca-1 +, c-kit + ir Lin ) padidina HKL gry nu mà. Nau jai siais duo me ni mis, þmo niø SLAM þy me nis eks pre suo ja ne tik HKL, bet ir pri mi ty vûs pirm ta - kai [22]. Pa skelb ta áro dy mø, kad yra dar primityvesniø làsteliø populiacijø, ku - rias at ski ria ne pa vir ði niø þy me nø eks pre si ja, bet ge bë ji mas pa ða lin ti fluo res cuo jan èius DNR ri ðan èius ro - damino-123 ir Hoechst33342 daþiklius per làs te lës pa vir ðiaus ABC (angl. ATP- bind ing cas sette) pom pas [23]. Ðios ðoninës populiacijos (ÐP) làste - lës ne ekspresuoja mieloidinës ir limfoidinës kilmës pirmtakø þymenø ir CD34, yra Sca-1 + ir gali repopuliuoti pe liø he mopoezinæ sistemà. Pelës ÐP kaulø èiulpø làstelës buvo repopuliuo - jan èios HKL, taip pat po transp lan ta - ci jos ge bë jo di fe ren ci juo tis á kar dio - miocitus ir endotelio làsteles. Taigi, ÐP fe no tipas bûdingas hemopoezës ir ne he mo po e zës ka mie ni nëms làs te - lëms [13]. HKL ÐP ty ri mai pa tvir ti no, kad dauguma yra tyliosios làstelës, bet ádo mu, kad tiek ty lio sios, tiek cik le esanèios HKL vienodai veikia he mo po e zëje, bent jau peliø eksperimen ti në se sistemose [24]. ÐP làstelës yra Lin, taigi gali bûti naudojamos paðalinti subrendusias làsteles ir su - trumpinti tëkmës citometrijos rûðiavi - mo lai kà. En do te lio bal ty mo C re cep to rius (CD201) la bai tin ka pe liø (bet ne þmo - gaus) HKL nu sta ty ti, nes kau lø èiul pø CD201 +, Lin, c-kit +, Sca-1 + CD34 làs - telës pasiþymi dideliu HKL aktyvumu, tai gi ðis þy muo ga li bû ti bû din gas tik roms HKL [25]. CD201 eks pre si ja koreliuoja su ÐP fenotipu ir tradiciniu Lin Kit + Sca-1 + CD34 HKL fenotipu. HKL TAI KY MAS RE GE NE RA CI NË JE ME DI CI NO JE Medicininëje praktikoje HKL transplantacija pradëta taikyti nuo 1959 me - tø ir kas met jø vis dau gë ja. Re mian tis 2009 metø pirmàja pasauline atliktø transplantacijø apþvalga, 2006 metais ið vi so bu vo at lik ta 51 421 HKL transp - lan ta ci ja, ið jø 22 163 alo ge ni nës (43 %) ir 29 258 au to lo gi nës (57 %) [26]. Hemopoezines kamienines làsteles galima naudoti autologinëje ir aloge - ni në je transp lan ta ci jo je. Sëk min gai alo ge ni nei transp lan ta ci jai at lik ti transplantatas ir recipientas turi ati - tik ti nuo 6 iki 10 an ti ge nø, to dël sun - ku surasti imunologiðkai atitinkantá donorà. Alogeniniai transplantatai në - ra su da ry ti vien tik ið HKL, bet juo se yra ir limfoidinës kilmës làsteliø, ku - rios gali sukelti transplantato prieð ðeimininkà ligà. Kita vertus, alogeni - niniai transplantatai kartais pasiþymi transplantato prieð leukemijà povei - kiu. Pagrindiniai autologiniø transp - lan ta tø trû ku mai yra transp lan ta to prieð leu ke mi jà ar ba transp lan ta to prieð navikà atsako nebuvimas ir kontaminacija vëþinëmis ir ikivëþinëmis làs te lë mis. Ið gry nin tuo se au to lo gi - niuo se HKL transp lan ta tuo se në ra vë - þiniø làsteliø, o iðgryninti alogeniniai HKL transplantatai nesukelia transp - lantato prieð ðeimininkà ligos [27]. Pagrindinës transplantacijos indika ci jos: leu ke mi jos ir lim fo mos, ne kraujo kilmës vëþiui gydyti taikoma dideliø doziø chemoterapija (kitø organø vëþys, pvz., germinaciniai sëklidþiø navikai, neuroblastoma), taip pat ágimtas arba ágytas kaulø èiulpø nepakanka - mumas (aplazinë anemija), hemoglobinopatijos, autoimuninës ligos: sisteminë raudonoji vilkligë, sisteminë sklerozë, ir kai kurios genetinës ligos, pvz., sfingoli - pidozës, mukopolisacharidozës [27]. Postûmá naudoti HKL suteikë ir regeneracinës medicinos mastà pra - plëtë nemieloabliacinës chemoterapijos taikymas. Ðiuo metu intensyviai tyrinëjamos galimybës naudoti kaulø èiulpø làsteles kardiologijoje ðirdies ne pa kan ka mu mui, ûmi niam mio kar - do in fark tui gy dy ti. Gauta: 2010 04 30 Priimta spaudai: 2010 06 28 LABORATORINË MEDICINA 2010, t. 12, Nr. 2(46) 85
Summary HEMATOPOIETIC STEM CELLS RESEARCH REVIEW Hematopoietic stem cell the sin gle pluripotent cell that can give rise to all lym phoid, myeloid and erythroid cell lin - eages, and re pop u late an ab lated hema - to poietic sys tem. So far these are the most in ves ti gated stem cells and are used for trans plan ta tion in clin i cal prac tice. Increasing quantity of research studies give more in for ma tion about bi o log i cal pro cesses in hematopoietic stem cells, their functions, characteristics and applica tion po ten tial in re gen er a tive med i - cine. This ar ti cle pro vides back ground in - for ma tion about hematopoietic stem cells. In vi tro (long-term culture-initiating cell, cob ble stone area-form ing cell, col ony form - ing cell) and in vivo (com pet i tive re pop u lat - ing unit, xenogeneic trans plan ta tion) as - says of hematopoietic stem cells and pro - gen i tors are re viewed and at ten tion is drawn on ge netic as says and im ag ing tech - nique bio luminescence im ag ing. The first rec og nized and most fre quently used hematopoietic stem cells marker CD34 is ana lysed in de tail. Other sur face and met a bolic mark ers are also dis cussed. Lin eage mark ers ex pressed on T cells, B cells, NK cells, myeloid and erythroid lin eage cells and their role in hemato - poietic stem cells en rich ment are high - lighted. New hema to poietic stem cell mark ers are ana lysed: ALDH, SLAM, Side pop u la tion cells and CD201. The article contains the newest information on allogenic and auto logic trans plan ta - tion fre quency world wide. Fi nally, over - view of allo geneic and autologous hema - to poietic stem cell trans plan ta tion advantages and dis ad van tages as well as trans plan ta tion indications is presented. Keywords: hematopoietic stem cell, CD34, phe no type, re gen er a tive med i cine. LITERATÛRA 1. Becker AJ, Mc CE, Till JE. Cy to log i cal dem on stra tion of the clonal na ture of spleen col o nies de rived from trans - planted mouse mar row cells. Na ture 1963; 197: 452 4. 2. Orkin SH, Zon LI. Hematopoiesis and stem cells: plas tic ity ver sus de vel op - men tal het er o ge ne ity. Nat Immunol 2002; 3: 323 8. 3. Assmus B, Honold J, Schächinger V, Britten MB, Fischer-Rasokat U, Leh - mann R, et al. Transcoronary trans - plan ta tion of pro gen i tor cells af ter myo car dial in farc tion. N Engl J Med 2006; 355(12): 1222 32. 4. van Os RP, Dethmers-Ausema B, de Haan G. In vi tro as says for cob ble stone area- form ing cells. LTC-IC, and CFU-C. In: Hematopoietic stem cell pro to cols. 2 nd ed. Totowa, NJ: Humana Press, 2008; 143 57. 5. Miller CL, Eaves CJ. Long-term cul - ture-initiating cell assays for human and murine cells. In: Hematopoietic stem cell pro to cols. 1 st ed. Totowa, NJ: Humana Press Inc, 2002; 123 41. 6. McKenzie JL, Gan OI, Doedens M, Wang JC, Dick JE. In di vid ual stem cells with highly variable proliferation and self-renewal properties comprise the human hematopoietic stem cell com part - ment. Nat Immunol 2006; 7: 1225 33. 7. Mazurier F, Doedens M, Gan OI, Dick JE. Rapid myeloerythroid re pop u - lation after intrafemoral transplanta - tion of NODSCID mice re veals a new class of hu man stem cells. Nat Med 2003; 9: 959 63. 8. Kollet O, Pe tit I, Kahn J, Samira S, Dar A, Peled A, et al. Hu man CD34 + CXCR4 sorted cells har bor intra - cellular CXCR4, which can be func tion - ally ex pressed and pro vide NOD/SCID repopulation. Blood 2002; 100: 2778 86. 9. Christopherson KW 2nd, Pa ga nes - si LA, Napier S, Porecha NK. CD26 in - hi bi tion on CD34 + or Lin eage hu man um bil i cal cord blood do nor hema to - poietic stem cells/hematopoietic pro - gen i tor cells im proves long-term en - graft ment into NOD/SCID/Beta2 null Immuno deficient mice. Stem Cells Dev 2007; 16: 347 54. 10. Tse W, Bunt ing. The ex pand ing tool kit for hematopoietic stem cell re search. In: Hematopoietic stem cell pro to cols. 2 nd ed. Totowa, NJ: Humana Press, 2008; 3 18. 11. Lin Y, Molter J, Lee Z, Gerson SL. Bio - luminescence im ag ing of hemopoietic stem cell re pop u la tion in murine mod - els. Hematopoietic stem cell pro to cols. 2 nd ed. Totowa, NJ: Humana Press, 2008; 295 306. 12. Wognum B. Hematopoietic stem cells mini-re view. Avail able at: www.stemcell.com/tech ni cal/ Hematopoietic%20Mini-Re view.pdf 13. Gajkowska A, Oldak T, Jastrzewska M, Machaj EK, Walewski J, Kraszewska E, et al. Flow cytometric enu mer a tion of CD34+ hematopooietic stem and pro gen i tor cells in leuka - pheresis prod uct and bone mar row for clin i cal trans plan ta tion: a com par i son of three meth ods. Folia Histochem Cytobiol 2006; 44: 53 60. 14. Breems DA, van Hennik PB, Kusa - dasi N, Boudewijn A, Cornelissen JJ, Sonneveld P, et al. In di vid ual stem cell qual ity in leuka pheresis prod ucts is re - lated to the num ber of mo bi lized stem cells. Blood 1996; 87: 5370 8. 15. Kimura T, Asada R, Jianfeg W, Kimura T, Morioka M, Matsui K, et al. Identification of long-term repopulat - ing po ten tial of hu man cord blood-de - rived CD34-flt3- se vere com bined immuno- de fi ciency-re pop u lat ing cells by intra-bone mar row in jec tion. Stem Cells 2007; 25: 1348 55. 16. Reitsma MJ, Lee BR, Uchida N. Method for pu ri fi ca tion of hu man hema to poietic stem cells by flow cyto - metry. In: Hematopoietic stem cell pro - to cols. 1 st ed. Totowa, NJ: Humana Press, 2002; 59 77. 17. Mayani H, Dragowska W. Lans - dorp PM. Characterization of functionally dis tinct subpopulations of CD34+ cord blood cells in se rum-free long- term cultures supplemented with hematopo - ie tic cytokines. Blood 1993; 82: 2664 72. 18. Taus sig DC, Pearce DJ, Simpson C, Rohatiner AZ, Lis ter TA, Kelly G, et al. Hematopoietic stem cells ex press mul - ti ple myeloid mark ers: im pli ca tions for the or i gin and tar geted ther apy of acute myeloid leu ke mia. Blood 2005; 106: 4086 92. 19. Lioznov MV, Freiberger P, Kröger N, Zander AR, Fehse B. Al de hyde de hyd - ro genase ac tiv ity as a marker for the qual ity of hematopoietic stem cell trans plants. Bone Mar row Trans plant 2005; 35: 909 14. 20. Christ O, Lucke K, Imren S, Leung K, Ham il ton M, Eaves A, et al. Im proved pu ri fi ca tion of hematopoietic stem cells based on their el e vated al de hyde de - hydro genase ac tiv ity. Haematologica 2007; 92: 1165 72. 21. Kiel MJ, Yilmaz OH, Iwashita T, Terhorst C, Mor ri son SJ. SLAM fam ily re cep tors dis tin guish hematopoietic stem and pro gen i tor cells and re veal en do the lial niches for stem cells. Cell 2005; 121: 1109 21. 22. Weksberg DC, Cham bers SM, Boles NC, Goodell MA. CD150-side pop u la tion cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells. Blood 2008; 111: 4414 5. 23. Goodell MA, Rosenzweig M, Kim H, Marks DF, DeMaria MA, Paradis G, et al. Dye efflux stud ies sug gest that hema topoietic stem cells ex press ing low or un de tect able lev els of CD34 an ti - gen ex ist in mul ti ple spe cies. Nat Med 1997; 3: 1337 45. 24. Goodell MA, Brose K, Paradis G, Conner AS, Mul li gan RC. Iso la tion and functional properties of murine hematopo ie tic stem cells that are rep li cat ing in vivo. J Exp Med 1996; 183: 1797 806. 25. Balazs AB, Fa bian AJ, Esmon CT, Mul - li gan RC. En do the lial pro tein C re cep - tor (CD201) ex plic itly iden ti fies hema - topoietic stem cells in murine bone mar row. Blood 2006; 107: 2317 21. 26. Gratwohl A, Baldomero H, Aljurf M, Pasquini MC, Bouzas LF, Yoshimi A, et al. for the World wide Net work of Blood and Mar row Tran. Hematopoietic Stem Cell Trans plan ta tion: A Global Per - spec tive. JAMA 2010; 303: 1617 24. 27. Domen J. Wag ers A, Weismann IL. Re - gen er a tive Med i cine 2006; 13 34. 86 LABORATORINË MEDICINA 2010, t. 12, Nr. 2(46)