Lab_Med_2011_Nr2.vp

MOKSLO DARBAI SCIENTIFIC PAPERS Laboratorinë medicina. 2011, t. 13, Nr. 2(50), p. 65 74. Blastø dauginio atsparumo vaistams tyrimo tëkmës citometru reikðmë diagnozuojant ûminæ leukemijà Miglë Janeliûnienë 1, 2 Rëda Matuzevièienë 1, 2 Zita Kuèinskienë 1, 2 1 Vilniaus universiteto Medicinos fakulteto Fiziologijos, biochemijos ir laboratorinës medicinos katedra Department of Physiology, Biochemistry and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, Vilnius University 2 Vilniaus universiteto ligoninës Santariðkiø klinikø Laboratorinës diagnostikos centras Center of Laboratory Diagnostics Vilnius University Hospital Santariðkiø Clinics El. paðtas: migle.janeliuniene@santa.lt Santrauka Ávadas. Nors tai kant in ten sy vø gy dy mà daþ niau siai pa sie kia ma vi sið - ka ûmi nës leu ke mi jos re mi si ja, li ga ne re tai at si nau ji na. Vie na svar biau - siø ûmi nës leu ke mi jos at kry èio prie þas èiø pik ty bi niø làs te liø dau gi nis at spa ru mas vais tams. Jo pa to ge ne zë je es mi ná vaid me ná at lie ka trans - memb ra ni niai ne ðik liai, uþ tik ri nan tys ci to tok si niø me dþia gø ið stû mi - mà ið làs te lës. Vie ni reikð min giau siø to kiø siur bliø p-gli kop ro tei nas (p-gp) ir su dau gi niu at spa ru mu vais tams su si jæs bal ty mas 1 (angl. multidrug resistance protein 1, MRP1). Padidëjusi jø ekspresija turi átakos ûmi nës leu ke mi jos re mi si jos daþ niui, jos truk mei ir il ga lai kiam li go - niø iðgyvenamumui. Darbo tikslas. Nustatyti tëkmës citometriniø blastø dauginio at - sparumo vaistams tyrimø reikðmæ diagnozuojant ûminæ leukemijà. Ly - gin ta p-gp ir MRP1 eks pre si ja bei funk ci nis ak ty vu mas blas tuo se ir ki to - se kraujo làstelëse. Nustatyta struktûriniø ir funkciniø dauginio atspa - ru mo vais tams ro dik liø ko re lia ci ja, taip pat ðiø ro dik liø ko re lia ci ja su ûmi nës leu ke mi jos po ti piu, blas tø imu no fe no ti pu ir jø skai èiu mi ávai - riais gy dy mo lai ko tar piais (mi ni ma lia lie ka mà ja li ga). Ty ri mo me dþia ga ir me to dai. Tir ta 30 ûmi ne leu ke mi ja ser gan - èiø li go niø: 19 su au gu siø jø (10 mo te rø, 9 vy rai, am þiaus vi dur kis 52,2 m.) ir 11 vai kø (10 ber niu kø, 1 mer gai të, am þiaus vi dur kis 54,8 mën.). Li go niams at lik ti blas tø imu no fe no ti po, mi ni ma lios lie ka - mo sios li gos ir dau gi nio at spa ru mo vais tams ty ri mai: nu sta ty ta p-gp ir MRP1 ekspresija ir funkcinis aktyvumas. Ty ri mo re zul ta tai. Pa ly gi nus dau gi nio at spa ru mo vais tams ro dik - liø reikð mes blas tø ir lim fo ci tø bei mo no ci tø po pu lia ci jo se, ras ti sta tis - tið kai pa ti ki mi be veik vi sø ro dik liø skir tu mai, pvz., t tes to re zul ta tas ti - riant blas tø ir lim fo ci tø p-gp eks pre si jos skir tu mus ly gus 0,024. Nors áro dy mø, kad esa ma ry ðio tarp p-gp ir MRP1 eks pre si jos bei kal cei no testo rezultatø, negauta, ryðys tarp atskirø struktûrinio atsparumo ele - men tø ga na stip rus (Pe ar so no ko re lia ci jos ko e fi cien tas 0,830). Ser gan - èiø jø ûmi ne lim fob las ti ne leu ke mi ja (ÛLL) MRP1 eks pre si ja bu vo ma - þes në nei ser gan èiø jø ûmi ne mie lo ge ni ne leu ke mi ja (ÛML): pvz., T-ÛLL atveju vidutinis fluorescencijos intensyvumas tik 78,667, o esant ÛML su mie lo disp la zi jos po þy miais jis sie kia 167,250. Kal cei no in dek sas (san - ty kis tarp blas tø ir lim fo ci tø kal cei no fluo res cen ci jos in ten sy vu mo) taip pat ma þes nis ÛLL gru pë je: pvz., B-ÛLL at ve ju jis ly gus 0,930, o ne pa - tiks lin tos ÛML at ve ju 1,600. Ti riant blas tø imu no fe no ti po ko re lia ci jà su DAV ro dik liais, gau tas sta tis tið kai pa ti ki mas ry ðys tarp þmo gaus LABORATORINË MEDICINA 2011, t. 13, Nr. 2(50) 65

leu ko ci tø II kla sës an ti ge nø ÞLA-DR eks pre si jos ir kal cei no in dek so, tarp CD7 ir p-gp eks pre si jos ÛML at ve ju bei tarp CD38 eks pre si jos ir kal cei no kie kio B-ÛLL at ve ju. Sta tis tið kai pa ti ki mo ry ðio tarp kal cei no kiekio ir blastø skaièiaus kuriuo nors gydymo momentu negauta. Statis - tið kai pa ti ki mi ry ðiai sie jo p-gp ir MRP1 eks pre si jà bei blas tø skai èiø diag no zuo jant ûmi næ leu ke mi jà 29 35 ir 79 90 gy dy mo die nà. Iðvados. Ga li me teig ti, kad su dau gi niu at spa ru mu vais tams su si - ju siø bal ty mø eks pre si jos ty ri mai ga lë tø bû ti átrauk ti á ûmi niø leu ke mi - jø diag nos ti kos al go rit mà. Funk ci niø ty ri mø ver tei áro dy ti bû ti ni to les ni ty ri mai, sie kiant pa ly gin ti ke le tà jø nu sta ty mo me to dø. At si ran dant at - spa ru mà vais tams ma þi nan èiø pre pa ra tø, tiks lin gi ir la bo ra to ri niai at - spa ru mo slo pi ni mo ty ri mai. Reikð mi niai þo dþiai: dau gi nis at spa ru mas vais tams, ûmi në leu ke mi - ja, tëkmës citometrija, kalceinas, p-gp, MRP1. ÁVADAS Ûmi në leu ke mi ja tai krau jo da ros sistemos neoplazija, pasireiðkianti ne - kon tro liuo ja mu ne su bren du siø krau - jodaros làsteliø (blastø) dauginimusi kau lø èiul puo se ir krau jy je. Ûmi në leukemija pagal blastø prigimtá klasi - fikuojama á ûminæ mielogeninæ (ÛML) ir ûminæ limfoblastinæ (ÛLL). Taikant in ten sy vià che mo te ra pi jà, dau gu mai ser gan èiø jø ûmi ne leu ke mi ja pa sie - kiama visiðka klinikinë ir morfologinë re mi si ja. Ta èiau ne re tai ði re mi si ja trun ka ne il gai ir li ga at si nau ji na. Nors visiðka remisija pasiekiama apie 70 80 % ÛML li go niø, il ga lai kis jø ið - gyvenamumas be ligos (angl. dis easefree sur vival) tesiekia 50 %. Ilgalaikis su au gu siø jø, ser gan èiø jø ÛLL, ið gy - ve na mu mas yra apie 45 72 %, o vai - kø 73 90 % [1 4]. Viena ið pagrindiniø ûminës leu - kemijos atsinaujinimo prieþasèiø yra piktybiniø làsteliø atsparumas vais - tams. Atspariø làsteliø gali bûti aptin - kama jau diagnozuojant ûminæ leuke - mijà arba dël savaiminiø mutacijø jø gali atsirasti vëliau. Atsparios vais - tams làstelës gali iðlikti per visà gydymà ir ið stum ti jaut rias làs te les [5]. Daþnai làstelës yra atsparios ne vie - nam, o dau ge liui struk tû rið kai ir funk cið kai skir tin gø vais tø (dau gi nis atsparumas vaistams, DAV). DAV ið - si vys ty mo bû dai ávai rûs: pa di dë ju si pernaðos baltymø ekspresija, molekuliø taikiniø tankio sumaþëjimas làste - lës membranoje, pagreitëjæs DNR atsinaujinimo procesas, làstelës ciklo re - guliacijos, apoptozës keliø pokyèiai vë - þinëse làstelëse, taip pat sumaþëjæs vaistø ásisavinimas ar pakitæs jø me - tabolizmas [6, 7]. Vienas labiausiai iðtirtø DAV me - cha niz mø tai tran smemb ra ni niø baltymø (vadinamøjø siurbliø) lemia - mas ci to tok si niø me dþia gø ið stû mi - mas ið vë þio làs te lës ir taip ma þë jan tis jø kaupimasis. Didþioji dalis ðiø siurbliø pri ski ria mi ATF su jun gian èios kasetës (angl. ATP bind ing cas sette, ABC) pernaðos baltymø superðeimai, dar vadinamai ABC neðikliais. Ðios su per ðei mos bal ty mø ap tin ka ma ir nevëþinëse làstelëse ir jie yra atsakin - gi uþ didelæ pernaðos funkcijø ávairo - væ, pvz., jai priklauso epitelio neðikliai CTFR (jø genai mutuoja cistinës fibrozës at ve ju), ke pe nø tul þies rûgð èiø ne - ðikliai cbat, uþ antigenø procesingà T lim fo ci tuo se at sa kin gi bal ty mai (TAP), cholesterolio ir fosfolipidø iðstûmimà ið làsteliø uþtikrinantys bal - tymai (ABCA1). Ðiuos baltymus ko - duo jan tys genai filogenezës metu kito ne daug ir tai ro do jø svar bà sau gant or ga niz mo làsteles nuo gamtoje esanèiø tok si nø (kse no bio ti kø). Þmo niø ir ki tø þin duo liø or ga niz muo se ðie ne ðik - liai uþtikrina toksinø paðalinimà ke - pe ny se ir inkstuose, kraujo ir smegenø bar je ro funk cio na vi mà, uþuo maz gi niø ir kamieniniø làsteliø apsaugà [8 10]. Pirmasis ir plaèiausiai apraðytas su dauginiu atsparumu vaistams susi - jæs membraninis siurblys p-glikopro - tei nas (p-gp). 1976 m. R. Ju lia no ir V. Ling ið sky rë p-gp ið at spa riø Ki ni - jos þiurkëno patelës kiauðidþiø làste - liø. P-gp yra ko duo ja mas 7-osios chro - mo so mos il ga ja me pe ty je esan èio MDR1 ge no. Tai 170 kda bal ty mas, susidedantis ið dviejø homologiðkø do - me nø, ku riø kiek vie nas tu ri po 6 trans memb ra ni nius hid ro fo bið kus segmentus ir adenozintrifosfato (ATF) molekulæ suriðanèià vietà. P-gp atsakin gas uþ to kiø sub stra tø, kaip ant ra - cik li nai, tak sa nai, vin ka al ka loi dai, epi po do fi lo tok si nai ir ki tø per na ðà [11]. Padidëjusi p-gp ekpsresija daþnai nustatoma kraujodaros sistemos neoplazijø (ÛML, ÛLL, limfomø) atvejais. Daþniau ji aptinkama tiems, kurie jau buvo gydyti citostatikais (antrinis atsparumas), ir iðsivysto dël atspariø làsteliø selekcijos gydant, taip pat dël vais tø nuo vë þio ak ty vin tos p-gp transkripcijos [12, 13]. Kadangi ÛL gali iðsivystyti ið p-gp fenotipà turinèios kamieninës kraujodaros làstelës, ðis þymuo gali bûti ekspresuojamas jau li gos pra dþio je, pvz., p-gp eks pre si - ja nustatoma net ~19 75 % negydytø ÛML atvejø. P-gp ekspresija diagno - zës me tu tu ri áta kos ne tik re mi si jos daþ niui, bet ir jos truk mei ir il ga lai - kiam ið gy ve na mu mui [14 18]. ÛLL atveju padidëjusi p-gp ekspresija ap - tin ka ma ~38 % at ve jø ir yra ne pri - klausomas blogos prognozës veiksnys tiek vai kams, tiek su au gu sie siems [19]. Kitas ATF sujungianèios kasetës bal ty mø su per ðei mai pri klau san tis baltymas, kuris dalyvauja DAV pato - genezëje su dauginiu atsparumu su - sijæs baltymas 1 (angl. multidrug re - sis tance pro tein 1, MRP1). Tai nuo ATF pri klau so mas memb ra ni nis siurb lys, ið stu mian tis ið làs te lës su glu ta tio nu su jung tas kse no bio ti nes medþiagas. MRP baltymø grupë susi - de da ið de vy niø MRP ho mo lo gø (MRP1 MRP9). Pir mà kar tà MRP1 ið - skyrë S. Cole su kolegomis ið doksoru - bicinui atsparios smulkialàstelinio vë - þio làs te liø li ni jos [20]. Tai 16-oje chro - mosomoje esanèio MRP1 geno koduo - jamas 160 kda N-glikozilintas anijoni - nis neðiklis, randamas ne tik làstelës membranoje, bet ir endoplazminiame tin kle bei Gol dþio kom plek se [21]. Nuo MRP1 pri klau somas at spa ru mo spekt ras pa na ðus, kaip ir p-gp. In vi tro padidëjusi MRP1 ekspresija siejama su atsparumu antraciklinams, vinka al ka loi da ms, epi po do fi lo tok si nams, kamptotecinams ir metotreksatui, bet ne tak sa nams ir mi tok san tro nui. MRP1 taip pat at sa ko uþ glu ta tio no, gliu ku ro no rûgð ties kon ju ga tø (pvz., 66 LABORATORINË MEDICINA 2011, t. 13, Nr. 2(50)

Blastø dauginio atsparumo vaistams tyrimo tëkmës citometru reikðmë diagnozuojant ûminæ leukemijà uþ de gi mo me dia to riaus cis tei nil leu - kotrie no LTC4), taip pat ne kon ju guo to bilirubino pernaðà [22]. ~50% naujø ÛML atvejø blastuose randama dides - në nei nor ma lio se krau jo làs te lë se MRP1 eks pre si ja [23]. At kri tu siø ÛML ligoniø MRP1 ekspresija didesnë nei naujai susirgusiøjø [24]. Daþnai pasitaiko MRP1 ir p-gp koekspresija [25, 26]. Ir nors izo liuo to MRP1 eks - presijos padidëjimo klinikinë reikðmë nëra visiðkai aiðki, miðri ekspresija turi ryðkià neigiamà átakà atsakui á gy dy mà ir li go niø ið gy ve na mu mui [27 29]. Pastaràjá deðimtmetá iðtirta ir ne - maþai kitø veiksniø, galinèiø sukelti leukemijos atsparumà gydymui. Krûties vëþio atsparumo baltymas (angl. breast can cer re sis tance pro tein, BCRP) evoliuciðkai skiriasi nuo kitø ABC neðikliø, tai vadinamoji pusinë mo le ku lë, ku rios fun cio na vi mui rei - kia, kad susiformuotø dimerai. BCRP substratai yra antraciklinai, topoizomerazës I inhibitoriai, làstelës ciklo in hi bi to riai ir me tot rek sa tas [30]. Nors BCRP ir p-gp sub stra tai pa na - ðûs, ma no ma, kad BCRP ga lë tø bû ti ver ti na mas kaip at ski ras, kli nið kai reikðmingas ABC neðiklis. Vis dëlto ðio þymens ekspresijos ribos ÛML ser - gantiems ligoniams plaèios ir kliniki - nei vertei árodyti dar reikalingi papil - domi tyrimai [31]. Plau èiø at spa ru mo bal ty mas (angl. lung re sis tance pro tein, LRP) buvo identifikuotas plauèiø vëþio làsteliø linijoje. Jis daug kuo panaðus á bal ty mus, at sa kin gus uþ me dþia gø pernaðà tarp branduolio ir citoplaz - mos [32]. Nustatyta ðio baltymo eks - presi jos kli ni ki në ver të ser gant ûmi ne leuke mi ja. Ke lios stu di jos áro dë, kad LRP eks pre si jos ly gis ko re liuo ja su ÛML remisijos daþniu, atsparumu gydy mui ir ben dru ið gy ve na mu mu. Taip pat buvo rasta padidëjusi LRP ekspre - sija atkritusiems ÛML ligoniams (ant - rinis atsparumas kaip atsakas á p-gp sukelto atsparumo reversijà), kuriems pir mi nës gy dy mo sche mos bu vo pa pil - dytos p-gp inhibitoriumi ciklosporinu [33, 34]. Topoizomerazë II yra antracikliniø ir epipodofilotoksinø làstelinis taikinys. Su ma þë jæs jos kie kis làs te lë je ko - re liuo ja su su ma þë ju siø jaut ru mu ðiems vaistams [35]. Nedidelë studija ty rë at kri tu siø li go niø, ser gan èiø ÛML, to poi zo me ra zës II ly gio ko re lia - cijà su gydymo baigtimi. Ligoniams, ku riems tam tik rais agen tais bu vo in - dukuotas didesnis topoizomerazës II lygis, buvo gautas geresnis atsakas á gydymà [36]. Visgi topoizomerazës II kie kio ir ak ty vu mo nu sta ty mas yra gana komplikuotas, nes klinikiniø më - giniø tyrimas pasiþymi dideliu varia - bilumu, o làsteliø kultûroje priklauso nuo làstelës ciklo fazës [37]. Nuo ci ta ra bi no pri klau so mas at - sparumas vaistams apibûdinamas su - ma þë ju siu de ok si ci ti din ki na zës (dck), kuri metabolizuoja citarabinà á aktyvià trifostato formà, ir padidëjusiu já me tabolizuojanèio fermento citidin de a mi na zës (CDD) ly giu. Ka dan gi citarabinas áeina á daugumà ÛML gydymo schemø, ðis atsparumo mechanizmas galëtø turëti klinikinës reikð - mës. Vie na stu di ja áro dë vy res niø ÛML serganèiø ligoniø atsparumo ci - tarabinui átakà ligos prognozei [38]. Apop to zës þy me nø (bcl-2 ir kt.) hi - perekspresija taip pat siejama su atsparumu vaistams làsteliø kultûrose, ta èiau pa ti ki mø duo me nø apie ko re - lia ci jà su gy dy mo re zul ta tais në ra daug [39]. Atsparumas vaistams gali bûti ti - riamas keliais bûdais. Tradiciniu bû - du DAV nustatomas tiriant làsteliø ið - gy ve ni mà (angl. cell sur vival as says) citotoksiniø vaistø aplinkoje. Didþiau - sias ðiø tyrimø trûkumas bûtinybë 3 4 dienas auginti làsteliø kultûras, to dël jis uþ ima daug lai ko ir yra sun - kiai pritaikomas pacientø mëginiams. Su atsparumu vaistams susijusiø baltymø mrnr gali bûti tiriama poli - merazës grandininës reakcijos su atvirkðtine transkriptaze metodu. Meto - das taip pat sun kiai pri tai ko mas kas - die në je klinikinëje praktikoje, be to, mrnr kiekis nebûtinai koreliuoja su DAV baltymø ekspresija ar funkcija. DAV baltymø ekspresija gali bûti nu sta to ma imu no his to che mi niais ar tëk mës citometrijos metodais, naudo - jant mo nok lo ni nius an ti kû nus prieð làstelës pavirðiuje esanèius ðiø balty - mø epi to pus. Su kur ti an ti kû nai ir prieð pavirðinius MRP1 epitopus, o kai ku rie an ti kû nai prieð p-gp, pri dë jus sub stra to, yra jaut rûs kon for ma ci - niams pokyèiams. Funk ci niai DAV ty ri mai nu sta to pernaðos baltymø aktyvumà. Dauge - lis tokiø tyrimø gali bûti atliekama tik moksliniø tyrimø laboratorijø sàlygo - mis (pvz., ra dio ak ty viø jø sub stra tø pernaðos tyrimai, ATF azës aktyvumo nustatymas). Labiausiai paplitæ fluores cen ci jos ma ta vi mais grin dþia mi funkciniai dauginio atsparumo vais - tams ty ri mai. Jie yra dvie jø ti pø: Pasiskirstymo tipo làstelës in - ku buo ja mos su fluorescencine medþiaga, kurià aktyviai perneða tam tikras bal ty mas. Ti ria mas me dþia gos pa si - skirstymas làstelëje ir uþ jos ribø arba pasiskirstymo pokyèiai per tam tikrà lai kà (ið me ti mo grei tis, angl. efflux rate). Labiausiai paplitæs ðio tipo tyri - mas rodamino-123 iðmetimo greièio matavimas. Deja, jis nëra tikslus dël ki tø ið me ti mo me cha niz mø, ne su si ju - siø su at spa ru mu vais tams, bei ne spe - cifiniø daþo fluorescencijos pokyèiø. Kau pi mo ti po fluo res cen ci në medþiaga kaupiama làstelëje dël jun - gimosi su vidulàstelinëmis struktûro - mis (pvz., kaip doksorubicinas jungia - si prie branduolio DNR) ar vidulàsteli - nës fermentinës modifikacijos (acetome tok si kal cei no vir ti mas kal cei nu) [40 45]. DARBO TIKSLAS Nustatyti ûmine leukemija serganèiø li go niø struk tû ri nio ir funk ci nio dau - gi nio at spa ru mo vais tams ty ri mo reikðmæ diagnozuojant ðià ligà ir prognozuojant jos eigà. DAR BO UÞ DA VI NIAI 1. Palyginti làstelës struktûrø, susi - ju siø su at spa ru mu vais tams (p-gp, MRP1), ekspresijà (struktû - rinis atsparumas) ir kalceino testo rezultatus (funkcinis atsparumas) svei kø ir ser gan èiø ûmi ne leu ke - mija asmenø kraujo ir kaulø èiul - pø làsteliø populiacijose. Palyginti blastø ir kitø kraujo làsteliø DAV rodiklius. 2. Nu sta ty ti, kaip p-gp ir MRP1 eks - pre si ja blas tø po pu lia ci jo je ko re - liuoja su blastø funkciniu atsparumu vais tams in vi tro. 3. Nustatyti DAV rodikliø koreliacijà su ûminës leukemijos potipiu (PSO klasifikacija). 4. Nustatyti DAV rodikliø koreliacijà su blas tø imu no fe no ti pu. 5. Nustatyti ankstyvos (iki 6 mën.) minimalios liekamosios ligos lygio koreliacijà su DAV rodikliais. TY RI MO ME DÞIA GA IR ME TO DAI Tir ta 30 li go niø, 2008 2009 me tais pirmà kartà susirgusiø ûmine leuke - mi ja: 19 su au gu siø jø, gy dy tø Vil niaus universiteto ligoninës Santariðkiø kli - ni kø He ma to lo gi jos, on ko lo gi jos ir transfuziologijos centre, ir 11 vaikø, gydytø Vilniaus universiteto vaikø ligoninës Onkohematologijos centre. Ið suaugusiøjø buvo 10 moterø ir 9 vyrai, jø am þiaus vi dur kis 52,2 me tø (18 74). Vai kø gru pë je bu vo 10 ber - niu kø ir vie na mer gai të, jø am þiaus vi dur kis 54,8 mën. (18 176). Taip pat ið tir ta 19 svei kø as me nø 10 vy rø ir LABORATORINË MEDICINA 2011, t. 13, Nr. 2(50) 67

9 mo te rys, ku riø am þiaus vi dur kis 48,6 me tø (26 66). Dviem atvejais buvo tirtas ligoniø ve ni nis krau jas, vi sais ki tais at ve - jais kau lø èiul pai. Kon tro li në je gru - pë je 13 do no rø bu vo tir tas ve ni nis krau jas, 6 do no rø kau lø èiul pai. Ûmine leukemija seganèiø ligoniø diagnozës pagal PSO klasifikacijà pa - teikia mos 1 len te lë je. Kiekvienam átrauktam ligoniui atlikti ðie tyrimai: blastø imunofenotipo tyrimas diagnozei nustatyti, blastø ty - rimas pagal parinktà minimalios lie - kamo sios li gos (MLL) þy me nø pa ne lá, DAV ty ri mai: p-pg ir MRP1 eks pre si - jos ir funkcinio aktyvumo nustatymas. Tyrimams punkcijos bûdu buvo ima - ma 4 5 ml kau lø èiul pø ir per pi la ma á du va ku u mi nius më gin tu vë lius su K 3 EDTA. Blastø imunofenotipo tyri - mas atliekamas per 24 valandas nuo më gi nio pa ë mi mo, funk ci nis at spa ru - mo vaistams tyrimas dël galimo ATF ið se ki mo per 6 val. nuo më gi nio pa ë - mimo. Li go niai gy dy ti pa gal adek va èias rizikos grupëms ligoninës patvirtintas gydymo shcemas. Per 6 mënesius buvo atliekami serijiniai MLL tyrimai. Vidu ti nið kai li go niams at lik ta po tris MLL ty ri mus (nuo 1 iki 7). Atsparumo tyrimams mëginiai bu - vo ruo ðia mi tai kant mo no nuk le a rø ið - skyrimo pagal tankio gradientà meto - dà. 4 ml Ficoll tirpalo buvo pilama á 15 ml centrifuginá mëgintuvëlá. Ant vir ðaus at sar giai uþ py lus 6 ml 1:1 PBS buferiniu tirpalu atskiesto kaulø èiul - pø ar krau jo më gi nio, cen tri fu guo ja ma 400 g re þi mu 30 min. kam ba rio tem pe - ratûroje. Atsargiai nusiurbtas susida - ræs mo no nuk le a rø sluoks nis per pi la - mas á kità mëgintuvëlá ir dukart nu - plaunamas Cell Wash tir pa lu, cen tri - fu guo jant po 10 min. 300 g re þi mu. Vë - liau hematologiniu analizatoriumi nu - sta èius làs te liø skai èiø, pa ruo ðia ma suspensija, kurioje bûtø 2 5 10 6 làs - teliø. Á tris mëgintuvëlius pripilama po 100 l paruoðtos làsteliø suspensijos ir 20 l 1:10 tit ruo tø APC þy më tø mo nok lo ni niø an ti kû nø prieð þmo - gaus CD45 (Becton Dickinson). In ku - buojama 20 min. kambario temperatû - ro je. Á kiek vie nà më gin tu vë lá pri de da - ma po 20 l 1:10 titruoto paruoðto AM kalceino tirpalo. Inkubuojama lygiai 10 min. 37 C tem pe ra tû ro je. Po 10 min. reakcija nutraukiama greitu cen tri fu ga vi mu (1 min. 2000 g, 15 sek. greitëjimas ir lëtëjimas). Nusiurbia - mas ir iðpilamas virðnuosëdinis skys - tis, o làs te lës re sus pen duo ja mos 0,5 ml reakcijos buferio su propidþio jodidu. Tëk mës ci to met ru ti ria ma kal - cei no fluo res cen ci ja FL1 gy vy bin gø (neigiamø propidþio jodidui) làsteliø 1 len te lë. Ûmine leukemija serganèiø ligoniø sudëtis pagal PSO diagnostikà Ta b le 1. Structure of acute leukemia patients according to WHO diagnostics po pu lia ci jo je. Ma ta vi mus re ko men - duojama atlikti ið karto po reakcijos, taèiau eant reikalui mëginiai gali bûti saugomi 4 C temperatûroje 24 val. be þymesnës átakos rezultatams. Duo me nø rin ki mui su ku ria ma FL1 (pir mojo fluorescencijos detektoriaus re gist ruo tø duo me nø) vien pa ra - metrë histograma ir FSC SSC (priekinës ir ðo ni nës spin du lio sklai dos), SSC CD45 (ðo ni nës sklai dos ir CD45 ekspresijos), CD45-FL1 (CD45 ekspre - si jos ir pirmojo fluorescencijos detekto riaus re gist ruo tø duo me nø) ir SSC-FL2 (ðoninës sklaidos ir antrojo fluo res cencijos detektoriaus registruo - tø duo me nø) tað ki nës his tog ra mos. Su ren ka mi duo me nys ið vi sø tri jø më - gintuvëliø, iðtyrus po 50 000 làsteliø. Analizuojant SSC-FL2 taðkinëje his - tog ra mo je at me ta mos ne gy vy bin gos (teigiamos propidþio jodidui) làstelës ir SSC-CD45 taðkinëje histogramoje nu brë þia mi blas tø, lim fo ci tø, mo no ci - Suaugusieji Vaikai Ne pa tiks lin ta ûmi në mie lo ge ni në leu ke mi ja 3 0 Mi ni ma liai di fe ren ci juo ta ûmi në mie lo ge ni në leu ke mi ja 2 0 Ûmi në mie lo ge ni në leu ke mi ja be ar su bren di mo po þy miais 4 0 Ûmi në mie lo mo no ci ti në ar mo no ci ti në leu ke mi ja 4 0 Ûminë mielogeninë leukemija su mielodisplaziniais pakitimais 4 0 Ûminë B-limfoblastinë leukemija / limfoma 2 8 Ûminë T-limfoblastinë leukemija / limfoma 0 3 1 pav. Kalceino fluorescencijos tyrimas tëkmës citometru Fig. 1. Flow cytometric analysis of calcein fluorescence tø ir gra nu lo ci tø re gio nai. Nu sta to - mas kalceino vidutinis fluorescencijos in ten sy vu mas (angl. mean flu o res - cence in ten sity MFI), ran da mas vi sø tri jø më gin tu vë liø kal cei no MFI vi - dur kis (1 pav.). Blastø, limfocitø ir monocitø popu - lia ci jos api brë þia mos pa gal ðo ni nës spindulio sklaidos ir CD45 paramet - rus, kal cei no eks pre si ja ver ti na ma taðkinëje ir vienparametrëje histogra - mose. Tëkmës citometru p-gp ir MRP1 ekspresija buvo nustatoma tiesioginiu imu nof luo res cen ci jos me to du. Më gi - niai ruoðti taikant lizuoto kraujo tech - ni kà (angl. Lysed Whole Blood). 100 l krau jo ar kau lø èiul pø bu vo in ku buo - jama su antikûnais làsteliø pavirðiaus daþymui (anti-p-gp PE, klonas 17F9, an ti-mrp1 FITC, klo nas QCRL-3, Pharmingen). Më gi nys li zuo ja mas eritrocitø lizës tirpalu (FACS Lysing So lu tion, Becton Dickinson), atlieka - 68 LABORATORINË MEDICINA 2011, t. 13, Nr. 2(50)

Blastø dauginio atsparumo vaistams tyrimo tëkmës citometru reikðmë diagnozuojant ûminæ leukemijà mos dvi plo vi mo pro ce dû ros. Më gi nys fiksuojamas Cell Fix tir pa lu, ku rio pa - grin dà su da ro pa ra for mal de hi das. Mëginiai tiriami FACS Canto tëk mës ci to met ru, duo me nys ren ka mi ir ana - lizuojami FACS Diva programa. Blas - tø populiacija apibrëþiama pagal ðoni - nës spin du lio sklai dos ir CD45 þy mens ekspresijà. Nustatomas þymenø viduti nis fluo res cen ci jos in ten sy vu mas (2 pav.). STATISTINË ANALIZË Ûmine leukemija serganèiø ligoniø ir svei kø as me nø at spa ru mo vais tams ro dik liø pa ly gi ni mui bu vo nau do ja - mas dviejø nepriklausomø imèiø t tes - tas. Ry ðiui tarp ávai riø at spa ru mo vaistams rodikliø nustatyti buvo nau - do ja mas Pe ar so no ko re lia ci jos ko e fi - cientas. Ðis koeficientas taip pat buvo taikomas ryðiui tarp DAV rodikliø ir blastø kiekio ávairiais gydymo etapais (intervaliniai kintamieji) nustatyti. Ka dan gi þy me nø eks pre si ja yra ranginio tipo, jos ir blastø atsparumo ro dik liø ry ðiui nu sta ty ti bu vo nau do - jamas Kendallo tau-b koreliacijos koe - ficientas. ANO VA tes tu pa tik rin ta, ar yra statistiðkai reikðmingø skirtumø tarp skirtingas diagnozes turinèiø ligoniø atsparumo vaistams rodikliø. REZULTATAI 1. Gau tos li go niø ir svei kø do no rø kal - cei no, MRP1 ir p-gp MFI reikð mës bei jø palyginimas pateikiamas 2 lentelë - je. Rasti ðie statistiðkai patikimi ser - gan èiø ûmi ne leu ke mi ja as me nø ir sveikø donorø ávairiø làsteliø populia - cijø su atsparumu vaistams susijusiø rodikliø skirtumai: li go niø gru pë je lim fo ci tø p-gp reikðmë didesnë (p=0,002), li go niø gru pë je mo no ci tø kal cei - no reikðmë maþesnë (p=0,013), ligoniø grupëje monocitø MRP1 reikðmë didesnë (p=0,04). Ka dan gi li go niø blas tø kal cei no, MRP1 ir p-gp reikð mës pa ti ki mai ne si - sky rë nuo kon tro li nës gru pës, pa ly gi - nome jas su kitø làsteliø populiacijø (limfocitø ir monocitø) atitinkamø ro - dik liø reikð më mis (3 ir 4 len te lës, 3 pav.). Beveik visø blastø populiacijos ro dik liø reikð më pa ti ki mai sky rë si nuo kitø populiacijø rodikliø. 2. Ry ðys tarp p-gp ir MRP1 eks pre - sijos blastø populiacijoje (struktûrinio atsparumo) ir blastø funkcinio atspa - rumo vaistams in vi tro, t. y. kal cei no 2 pav. MRP1 ir p-gp eks pre si jos ty ri mas tëk mës ci to met ru Fig. 2. Flow cytometric analysis of MRP1 and p-gp expression 3 pav. DAV rodikliø rezultatai ávairiose kraujo làsteliø populiacijose Fig. 3. Results of multidrug resistance parameters in different blood cell populations LABORATORINË MEDICINA 2011, t. 13, Nr. 2(50) 69

2 len te lë. Serganèiøjø ÛL ir sveikø donorø kalceino, kalceino indekso, MRP1 ir p-gp ekspresijos reikðmiø palyginimas (ne - priklausomø imèiø t testas) Ta b le 2. Comparison of calcein value, calcein index, MRP1 and p-gp expression between acute leukemia patients and healt - hy donors (independent samples t-test) Tiriamoji grupë Tiriamøjø skaièius MFI vidurkis Standartinis nuokrypis p reikðmë Blas tø kal cei nas Sergantieji ÛL 30 5242,533 2044,126 0,08 Blas tø kal cei no indek sas Kon tro li në gru pë 6 6856,143 2685,027 Sergantieji ÛL 30 1,253 0,241 0,708 Kon tro li në gru pë 6 1,317 0,344 Blas tø MRP1 Ser gan tie ji ÛL 30 121,500 47,042 0,919 Kon tro li në gru pë 6 123,429 34,058 Blastø p-gp Sergantieji ÛL 30 170,167 80,514 0,158 Limfocitø kalceinas Kon tro li në gru pë 6 125,286 25,766 Sergantieji ÛL 30 4400,800 1589,829 0,311 Kon tro li në gru pë 19 4826,842 1087,813 Limfocitø MRP1 Ser gan tie ji ÛL 30 76,800 10,580 0,260 Kon tro li në gru pë 19 71,789 44,120 Limfocitø p-gp Sergantieji ÛL 30 131,267 44,120 0,002 Mo no ci tø kalceinas Kon tro li në gru pë 19 96,316 16,941 Sergantieji ÛL 28 9719,464 4513,511 0,013 Kon tro li në gru pë 19 12806,579 3147,798 Mo no ci tø MRP1 Ser gan tie ji ÛL 30 253,400 123,731 0,004 Kon tro li në gru pë 19 164,842 24,548 Mo no ci tø p-gp Sergantieji ÛL 30 282,967 142,416 0,079 Kon tro li në gru pë 19 222,526 42,891 3 len te lë. Blastø ir limfocitø populiacijø kalceino, MRP1 ir p-gp ekspresijos reikðmiø palyginimas Ta b le 3. Comparison of MRP1 and p-gp expression values between blast and lymphocyte populations Ro dik lis Blastai Limfocitai MFI vidurkis Standartinis nuokrypis MFI vidurkis Standartinis nuokrypis p reikðmë Kal cei nas 5242,533 2044,126 4400,800 1589,829 0,075 MRP1 121,500 47,042 76,800 10,580 0,0008 p-gp 170,167 80,514 131,267 44,120 0,024 4 len te lë. Blastø ir monocitø populiacijø kalceino, MRP1 ir p-gp ekspresijos reikðmiø palyginimas Ta b le 4. Comparison of MRP1 and p-gp expression values between blast and monocyte populations Ro dik lis Blastai Monocitai MFI vidurkis Standartinis nuokrypis MFI vidurkis Standartinis nuokrypis p reikðmë Kal cei nas 5242,533 2044,126 9719,464 4513,511 0,0008 MRP1 121,500 47,042 253,400 123,731 0,0002 p-gp 170,167 80,514 282,967 142,416 0,04 5 len te lë. Ryðys tarp ávairiø atsparumo vaistams rodikliø (Pearsono koreliacijos koeficientas) Ta b le 5. Correlation between different parameters of multidrug resistance (Pearson correlation coeficient) Kalceinas MRP1 p-gp Kal cei nas Pearsono koreliacijos koeficientas 1 0,126 0,087 P reikð më 0,457 0,609 N 37 37 37 MRP1 Pe ar so no ko re lia ci jos ko e fi cien tas 0,126 1 0,830 P reikð më 0,457 0,000 N 37 37 37 p-gp Pearsono koreliacijos koeficientas 0,087 0,830 1 P reikð më 0,609 0,000 N 37 37 37 70 LABORATORINË MEDICINA 2011, t. 13, Nr. 2(50)

Blastø dauginio atsparumo vaistams tyrimo tëkmës citometru reikðmë diagnozuojant ûminæ leukemijà 6 len te lë. ANO VA tes to re zul ta tai, ro - dantys su dauginiu atsparumu vais - tams su si ju siø ro dik liø skir tu mus skir tin gà diag no zæ tu rin tiems li go - niams Ta b le 6. ANO VA test re sults sho w ing dif fe r en ces of mul tid rug re sis tan ce parameters between acute leukemia patients with different diagnoses p reikð më Kal cei nas 0,142 Kal cei no in dek sas 0,048 MRP1 0,013 p-gp 0,100 tes to re zul ta tø, ið reikð tas Pe ar so no ko re lia ci jos ko e fi cien tu ir pa teik tas 5 len te lë je. Mû sø re zul ta tai ne pa ro dë ry ðio tarp struktûrø, susijusiu su atsparumu vais tams (MRP1, p-gp), eks pre si - jos ir funkcinio atsparumo vaistams in vi tro, t. y. kal cei no tes to re zul ta tø (Pe - arso no ko re lia ci jos ko e fi cien tas ati tin - ka mai 0,126 ir 0,087). Ry ðys tarp at - ski rø struk tû ri nio at spa ru mo ele men - tø (MRP1 ir p-gp) ga na stip rus (Pe ar - so no ko re lia ci jos ko e fi cien tas 0,830, p<0,01). 3. ANOVA testo rezultatai parodë, kad skirtingà diagnozæ turintiems ligoniams patikimai skiriasi tik kalcei - no in dek so ir MRP1 reikð mës (p < 0,05) (6 len te lë). 7 len te lë je pa tei kia mos skir tin gà diag no zæ tu rin èiø li go niø su dau gi niu atsparumu vaistams susijusiø rodik - liø reikð mës. Ma to me, kad lim fob las ti ne leu ke - mija serganèiø ligoniø MRP1 ekspre - sija yra maþesnë (B-ÛLL atveju MFI ly gus 91,500, T-ÛLL at ve ju tik 78,667), o ligoniø, serganèiø mieloge - nine leukemija, ypaè ûmine mieloleu - ke mi ja su mo no ci ti niu kom po nen tu bei ûmi ne mie lo ge ni ne leu ke mi ja su mielodisplazijos poþymiais, ji yra gerokai didesnë (MFI atitinkamai 155,000 ir 167,250) (4 pav.). Kalceino indeksas taip pat maþes - nis sergant ûmine limfoblastine leuke - mi ja: B-ÛLL at ve ju jis ly gus 0,930, T-ÛLL at ve ju 1,233, o, pvz., ne pa - tiks lin tos ÛML ar ÛML su mo no ci ti - niu kom po nen tu gru pë se ati tin ka - mai 1,600 ir 1,550 (5 pav.). 4. Tyrëme galimus ryðius tarp tam tikrø blastø pavirðiaus þymenø eks - presi jos (imu no fe no ti po) ir su dau gi - niu at spa ru mu su si ju siø ro dik liø reikð miø. Ûmi nës B-lim fob las ti nës leuke mi jos / lim fo mos at ve ju tir ti þy - me nys CD34, TdT, CD45, CD38, CD66c, CD10, CD20, CD33. Ûmi nës T-lim fob las ti nës leu ke mi jos / lim fo - mos atveju tirti þymenys CD34, TdT, 7 len te lë. Su dauginiu atsparumu vaistams susijusiø rodikliø reikðmës skirtingà diagnozæ turintiems ligoniams Ta b le 7. Multidrug resistance parameters of patients with different diagnoses Diagnozë MFI vidurkis Standartinis nuokrypis Kal cei nas ÛML/NEP 4630,333 1809,0579 Kal cei no in dek - sas ÛML/MD 3560,500 1344,210 ÛML/BB+ÛML/SD 4508,000 774,330 ÛM MoL+ÛMoL 7570,500 1921,591 ÛML/MDS 6288,000 3071,996 B-ÛLL 4638,100 1633,819 T-ÛLL 5472,333 2098,601 ÛML/NEP 1,600 0,530 ÛML/MD 1,550 0,212 ÛML/BB+ÛML/SD 1,200 0,408 ÛM MoL+ÛMoL 1,550 0,129 ÛML/MDS 1,450 0,480 B-ÛLL 0,930 0,298 T-ÛLL 1,233 0,503 MRP1 ÛML/NEP 146,667 47,816 ÛML/MD 108,000 1,414 ÛML/BB+ÛML/SD 137,250 52,766 ÛM MoL+ÛMoL 155,000 30,078 ÛML/MDS 167,250 29,182 B-ÛLL 91,500 40,045 T-ÛLL 78,667 21,502 p-gp ÛML/NEP 228,333 100,401 ÛML/MD 147,000 1,414 ÛML/BB+ÛML/SD 183,500 107,090 ÛM MoL+ÛMoL 231,000 12,490 ÛML/MDS 218,000 98,031 B-ÛLL 120,200 65,518 T-ÛLL 131,333 7,506 4 pav. Ûmine leukemija serganèiø ligoniø MRP1 ekspresija Fig. 4. MRP1 expression in acute leukemia patients 5 pav. Ûmine leukemija serganèiø ligoniø kalceino indeksas Fig. 5. Calcein index in acute leukemia patients LABORATORINË MEDICINA 2011, t. 13, Nr. 2(50) 71

8 len te lë. Su dauginiu atsparumu vaistams susijusiø rodikliø reikðmiø koreliacija su blastø skaièiumi ávairiais gydymo eta - pais Ta b le 8. Correlation between multidrug resistance parameters and amount of blasts in different treatment time-points Kalceinas Kalceino indeksas MRP1 p-gp Diag no zë Pearsono koreliacijos koeficientas 0,095 0,329 0,466 0,382 p reikð më 0,618 0,076 0,009 0,037 N 30 30 30 30 11 15 d. Pe ar so no ko re lia ci jos ko e fi cien tas 0,243 0,183 0,150 0,078 p reikð më 0,289 0,427 0,517 0,735 N 21 21 21 21 29 35 d. Pe ar so no ko re lia ci jos ko e fi cien tas 0,013 0,049 0,417 0,436 p reikð më 0,949 0,806 0,027 0,020 N 28 28 28 28 35 78 d. Pe ar so no ko re lia ci jos ko e fi cien tas 0,369 0,398 0,492 0,394 p reikð më 0,328 0,289 0,178 0,294 N 9 9 9 9 79 90 d. Pe ar so no ko re lia ci jos ko e fi cien tas 0,042 0,023 0,584 0,598 p reikð më 0,833 0,906 0,001 0,001 N 28 28 28 28 ÞLA-DR, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD117. Ûmi nës mie lo ge ni nës leu ke mi jos at ve ju tir ti þy me nys CD34, CD117, ÞLA-DR, CD38, CD4, CD7, CD5, CD56, cmpo. Sta tis tið kai reikð min gø ry ðiø (kai p<0,05) beveik nerasta. Gau tas ry ðys tarp ÞLA-DR ir kal - cei no in dek so, tarp CD7 ir p-gp mie lo - ge ni nës leu ke mi jos at ve ju bei tarp CD38 ir kal cei no kie kio ûmi nës B-lim - foblastinës leukemijos / limfomos atve - jais (Kendallo tau-b koreliacijos koefi - cien tas ati tin ka mai 0,446, 0,412 ir 0,655, p reikð më 0,020, 0,028, 0,046). Ðie ry ðiai në ra la bai stip rûs. 5. Buvo tiriama su dauginiu atspa - ru mu vais tams su si ju siø ro dik liø reikðmiø koreliacija su blastø skaièiumi ávai riais gy dy mo eta pais (8 len te - lë). Sta tis tið kai pa ti ki mo ry ðio tarp kal cei no ar kal cei no ko e fi cien to ir blas tø skai èiaus ku riuo nors gy dy mo mo men tu ne gau ta. Sta tis tið kai pa ti - ki mi (p<0,05) vi du ti nið kai stip rûs ry - ðiai sie jo MRP1 ir p-gp ir blas tø skai - èiø diag no zës me tu, 29 35 ir 79 90 die nà. REZULTATØ APTARIMAS P-gp eks pre si ja ûmi ne ir lë ti ne leu ke - mija sergantiems ligoniams jau tirta ir Lie tu vo je (R. Ma tu ze vi èie nës dak ta ro disertacija Þmogaus ûminiø ir lëtiniø leukemijø làsteliø imunofenotipai: di - feren cia ci jos þy me nø eks pre si jos ty ri - mai ). Padidëjusi p-gp ekspresija rasta tiek ûmi nës mie lo ge ni nës leu ke mi jos, tiek ûmi nës B-lim fob las ti nës, tiek ûmi nës T-lim fob las ti nës leu ke mi jos atvejais (p-gp atitinkamai ekspresavo 27,50 % ± 12,32, 37,89 % ± 14,23 ir 19,00 % ± 10,10 blas tø). Ka dan gi da - bartinëje studijoje tokios ryðkios p-gp ekspresijos negavome (20 % teigiamà ribà siekë tik pavieniai atvejai), verti - no me vi dutiná fluorescencijos intensy - vu mà. Skir tin gai nei 2003 m. R. Ma tu - ze vi èie nës dar be, ðio je stu di jo je di - dþiausias p-gp reikðmes gavome ûmi - nës mie lo leu ke mi jos, ypaè ûmi nës mie lo ge ni nës leu ke mi jos su mo no - citiniu kom po nen tu, at ve ju (p-gp MFI 231,00), o ûmi nës B-lim fob las ti - nës ir ûminës T-limfoblastinës leuke - mijos atveju p-gp reikðmës buvo daug maþesnës (MFI atitinkamai 120,20 ir 131,333), ta èiau vis tiek pa ti ki mai skyrësi nuo sveikø asmenø limfocitø p-gp reikð miø (p 0,024) [46]. A. Takeshita su kolegomis lygino nor ma liø ir leu ke mi niø mie lob las tø p-gp ekspresijà ir nustatë, kad sveikø asmenø CD34+CD33 blastø populia - ci jo je p-gp eks pre si ja bu vo 12,2 ± 2,2 %, CD34+33+ po pu lia ci jo je 6,3 ± 3,1 %, o nau jai su sir gu siø ÛML ati tin ka mai 19,8 ± 6,6 % ir 12,9 ± 5,3 %. Mû sø dar be blas tus api - brëþëme kaip maþos ðoninës sklaidos làs te les, blan kiai eks pre suo jan èias CD45 þymená ir DAV tyrimuose linijai sa vi tø þy me nø ne nau do jo me. Ta èiau visoje blastø populiacijoje statistiðkai patikimø skirtumø tarp sveikø asme - nø ir ûmi ne leu ke mi ja ser gan èiø li go - niø p-gp ekspresijos negavome (MFI ati tin ka mai 170,167 ir 125,286) [47]. Mû sø darbe nepavyko árodyti kore - lia ci jos tarp p-gp ir MRP1 eks pre si jos ir funk ci nio ak ty vu mo. Skir tu mø tarp DAV baltymø ekspresijos ir jø funkci - jos pastebëta ir anksèiau. Pavyzdþiui, C. P. Leith su ko le go mis DAV funk ci - jai ávertinti naudojo DiOC 2 fluorescen - ciná daþiklá ir deðimèia ÛML atvejø nu sta të pa di dë ju sá funk ci ná DAV ak ty - vumà be ryðkesnës p-g ekspresijos, o ðeðiais atvejais p-gp ekspresija buvo pa di dë ju si be funk ci jos po ky èiø. Funk - ciniai DAV rodikliai taip pat koreliavo su CD34 ekspresija: CD34 ekspresija ras ta 31 ið 39 li go niø, ku riems ap tik - tas padidëjæs DiOC 2 iðmetimas, ir tik 5 ligoniams, kuriems DiOC 2 iðmeti - mas bu vo nor ma lus [48]. Mes sa vo darbe CD34 ekspresijos ryðio su paki - tu sia DAV funk ci ja áro dy mø ne ga vo - me, ta èiau pa vy ko áro dy ti ry ðá tarp ÞLA-DR ir kal cei no in dek so ir tarp CD7 ir p-gp mielogeninës leukemijos at ve ju bei tarp CD38 ir kal cei no ûmi - nës B-limfoblastinës leukemijos / limfomos atveju. Nu sta të me, jog kai ku rie DAV ro - dik liai, pa vyz dþiui, MRP1 ir p-gp eks - presija, koreliuoja su blastø skaièiumi diag no zës me tu, 29 35 ir 79 90 die nà (minimali liekamoji liga). A. Venditti su ko le go mis taip pat ap ti ko, kad ÛML MLL ly gis 3,5 10 4 po konsolidacijos koreliuoja su p-gp+ blastø fenoti - pu ir kitais blogos prognozës rodikliais [49]. J. F. San Mi gu el su ko le go mis ið - tyrë, kaip ÛML minimali liekamoji liga koreliuoja su funkcinio DAV tyrimo (rodamino-123 testas) rezultatais ligos pradþioje. Ligoniams, kuriems mini - mali liekamoji liga indukcijos pabaigo - je bu vo 5 10 3, diag no zuo jant ûmi - næ leukemijà buvo rastas gerokai di - des nis ro da mi no-123 ið me ti mas (56 % ± 24 %) ne gu tiems, ku riems mi - nimali liekamoji liga buvo maþenë nei 5 10 3 (32 % ± 31 %; p = 0,04) [50]. 72 LABORATORINË MEDICINA 2011, t. 13, Nr. 2(50)

Blastø dauginio atsparumo vaistams tyrimo tëkmës citometru reikðmë diagnozuojant ûminæ leukemijà IÐVADOS Svei kø as me nø ir ûmi ne leu ke mi ja ser gan èiø li go niø dau gi nio at spa ru mo vaistams rodikliai statistiðkai patiki - mai nesiskyrë, taèiau dauguma blastø DAV rodikliø skyrësi nuo atitinkamø kitø làsteliø rodikliø. Nors statistiðkai pa ti ki mos ko re lia ci jos tarp p-gp ir MRP1 ekspresijos blastø populiacijoje ir blas tø funk ci nio at spa ru mo vais - tams rodikliø negauta, taèiau ryðys tarp p-gp ir MRP1 eks pre si jos ga na stiprus. Ûminiø limfoblastiniø ir ûmi - niø mielogeniniø leukemijø DAV ro - dik liai sky rë si: ÛLL gru pë je ras tos ma þes nës MRP1 ir kalceino indekso reikð mës. MRP1 ir p-gp eks pre si ja ko - reliavo su blastø skaièiumi diagnozës me tu, 29 35 ir 79 90 die nà (mi ni ma - lia liekamàja liga). Galime teigti, kad DAV baltymø ekspresijos tyrimai galëtø bûti átrauk - ti á ÛL diagnostikos algoritmà. Funkciniø tyrimø vertei árodyti bûtinos to - lesnës studijos, kad bûtø galima paly - ginti keletà jø nustatymo metodø. At - sirandant DAV maþinanèiø prepara - tø, tikslingi ir laboratoriniai DAV slopinimo tyrimai. Gauta: 2011 05 13 Priimta spaudai: 2011 06 27 Summary THE SIGNIFICANCE OF BLAST MULTIDRUG RESISTANCE DETECTION BY FLOW CYTOMETRY IN DIAGNOSTICS OF ACUTE LEUKEMIA In tro duc tion. With a mod ern in ten sive che mo ther apy most of the pa tients suf - fer ing from acute leu ke mia achieve a com plete re mis sion. How ever, some of them even tu ally re lapse. One of the most sig nif i cant rea sons of re lapse is a multi - drug re sis tance of leu ke mic cells. Trans - membrane pumps, such as p-gp and MRP1, en sur ing the ex tru sion of cycto - toxic com pounds from the cell play a very im por tant role in the pathogenesis of the multidrug re sis tance. In creased ex pres - sion of these pro teins on the blast cells in flu ences a re mis sion rate, its length and sur vival of acute leu ke mia pa tients. The main goal of this study was to eval u - ate the im pact of flow cytometric as sess - ment of the multidrug re sis tance in the di ag nos tic al go rithm of acute leu ke mia. We com pared p-gp and MRP1 ex pres sion and func tional ac tiv ity in blast and other blood cell pop u la tions. We also de ter - mined the cor re la tion be tween struc - tural and func tional pa ram e ters of multi drug re sis tance. We searched for links be tween pa ram e ters of multidrug re sis tance and the or i gin and immuno - pheno type of acute leu ke mia as well, as for their re la tion to the level of min i mal re sid - ual dis ease at dif fer ent treat ment timepoints. Ma te rial and meth ods. 30 pa tients with acute leu ke mia were en rolled: 19 adults (10 fe males, 9 males, mean 52.2 years old) and 11 chil dren (10 boys, 1 girl, mean 54.8 months old). For each pa - tient blast immunophenotype was es tab - lished, multidrug re sis tance tests (p-gp ex - pres sion and func tional test) were car ried out and min i mal re sid ual dis ease level was eval u ated at 5 treat ment time-points. Results. We found sta tis ti cally re li able differences of multidrug resistance param - e ters be tween blast, lym pho cyte and mono - cyte pop u la tions (e.g., t-test re sult be tween blast and lym pho cyte p-gp ex pres sion was 0.024). Al though we did not find a cor re la - tion be tween p-gp and MRP1 ex pres sion and calcein as say re sults, cor re la tion be - tween individual elements of structural re - sis tance was rather strong (Pearson cor re - la tion co ef fi cient was 0.830). Pa tients with acute lympho blastic leu ke mia (ALL) had a lower MRP1 ex pres sion than pa tients with acute myeloid leu ke mia (AML), e.g. in case of T-ALL its mean flu o res cence in - ten sity was 78.667 and in case of AML with myelodysplastic fea tures it was even 167.250. Calcein in dex (re la tion be - tween calcein value in blast and lym pho - cyte pop u la tions) was also lower in ALL group, e.g. in case of B-ALL it was 0.930, and in case of AML it was 1.600. We found a sta tis ti cally sig nif i cant cor re la - tion be tween HLA-DR ex pres sion and calcein in dex and be tween CD7 and p-gp ex pres sion in case of AML, also be tween CD38 ex pres sion and calcein value in case of B-ALL. Sta tis ti cally re li able links be tween calcein value and min i mal re sid - ual dis ease at any time-point of treat - ment were not proven. Cor re la tion was found be tween p-gp and MRP1 ex pres - sion and min i mal re sid ual dis ease at days 29 35 and 79 90. We sug gest that the de ter mi na tion of the multidrug re sis tance pro tein ex pres - sion could be in tro duced into rou tine di - ag nos tics of acute leu ke mia. The value of func tional tests should be in ves ti gated fur ther and sev eral de tec tion meth ods should be com pared. As in hib i tors of multidrug re sis tance ap pear in the mar - ket, lab o ra tory tests of multidrug re sis - tance inhibition would be useful. Keywords: multidrug re sis tance, acute leu ke mia, flow cytometry, calcein, p-gp, MRP1. LITERATÛRA 1. Rees JKH, Swirsky D, Gray RG, Heyhoe FG. Prin ci pal re sults of the Medical Research Council s 8 th acute myeloid leu kae mia trial. Lan cet 1986; 328: 1236 41. 2. Greer JP, Foerster J, Lukens JN, Rodgers GM, Paraskevas F, Glader B. Wintrobe s clin i cal he ma tol ogy. 11 th ed. Philadelphia, PA: Lippincott Wil liams & Wilkins, 2003. 3. Longo DL. Ma lig nan cies of lym phoid cells. In: Kasper DL, Braunwald E, Fauci AS, et al. Har ri son s prin ci ples of in ter nal med i cine. 16 th ed. New York: McGraw-Hill Pro fes sional, 2004. 4. Cortelazzo S, Ponzoni M, Ferreri AJ, Hoeltzer D. Lymphoblastic lym phoma. [Jour nal ar ti cle]. Crit Rev Oncol Hematol 2011, Jan 25. 5. Goldie JH, Coldman AJ. Quan ti ta tive model for mul ti ple lev els of drug re sis - tance in clin i cal tu mors. Can cer Treat Rep 1983; 67: 923 30. 6. Goldstein LJ, Galski H, Fojo A, Willingham M, Lai S, Gazdar A, et al. Ex pres sion of a multidrug re sis tance gene in hu man can cers. J Natl Can cer Inst 1989; 2: 116 24. 7. Borst P. Ge netic mech a nisms of drug re sis tance: a re view. Acta Oncol 1991; 30: 87 105. 8. Dean M, Rzhetsky A, Allikmets R. The hu man ATP-bind ing cas sette (ABC) trans porter superfamily. Ge nome Res 2001; 11: 1156 66. 9. Klein I, Sarkadi B, Varadi A. An in ven - tory of hu man ABC pro teins. Biochem Biophys Acta 1999; 1461: 237 62. 10. Hrycyna CA, Zhang S, Ramachandra M, Ni B, Pastan I, Gottesman MM. Func tional and mo lec - u lar char ac ter iza tion of the hu man multidrug trans porter. In: Gupta S, Tsuruo T. Multidrug re sis tance in can - cer cells. Chichester, Eng land: Wiley, 1996; p. 29. 11. Juliano RL, Ling V. Sur face glycopro - tein mod u lat ing drug per me abil ity in chi nese-ham ster ovary cell mu tants. Biochim Biophys Acta 1976; 455: 152 62. 12. Fojo AT, Ueda K, Slamon DJ, Poplack DG, Gottesmann MM, Pastan I. Ex pres sion of a multidrug-re - sis tance gene in hu man tu mors and tis - sues. Proc Natl Acad Sci 1987; 84: 265. 13. Kohno K, Sato S, Takano H, Matsuo K, Kuwano M. The di rect ac ti va tion of hu - man multidrug re sis tance gene (mdr1) by anticancer agents. Biochem Biophys Res Commun 1989; 165: 1415 21. 14. Sato H, Gottesmann MM, Goldstein LJ, Pastan I, Block AM, Sandberg AA, et al. Ex pres sion of the multidrug re sis tance gene in myeloid leukemias. Leuk Res 1990; 14: 11 21. 15. Ma rie JP, Zittoun R, Sikic BI. Multi - drug re sis tance (mdr1) gene ex pres sion in adult acute leukemias: cor re la tions LABORATORINË MEDICINA 2011, t. 13, Nr. 2(50) 73

with treat ment out come and in vi tro drug sen si tiv ity. Blood 1991; 78: 586 92. 16. Zhou DC, Ma rie JP, Suberville AM, Zittoun R. Rel e vance of mdr1 gene ex - pres sion in acute myeloid leu ke mia and com par i son of dif fer ent di ag nos tic meth ods. Leu ke mia 1992; 6: 879 85. 17. Pirker R, Wallner J, Geiss ler K, Linkesch W, Haas OA, Bettelheim P, et al. Mdr1 gene ex pres sion and treat - ment out come in acute myeloid leu ke - mia. J Natl Canc Inst 1991; 83: 708 12. 18. Leith CP, Kopecky KJ, Godwin J, McConnell T, Slo vak ML, Chen IM, et al. Acute myeloid leu ke mia in the el - derly: as sess ment of multidrug re sis - tance (MDR1) and cytogenetics dis tin - guishes bi o logic sub groups with re - mark ably dis tinct re sponses to stan - dard chemotherapy. A Southwest Oncol ogy Group study. Blood 1997; 89: 3323 9. 19. Goasquen JE, Dossot JM, Far del O, Le Mee F, Le Gall E, Leblay F, et al. Ex - pres sion of the multidrug re sis tanceas so ci ated glycoprotein (P-170) in 59 cases of de novo acute lymphoblastic leu ke mia: prog nos tic im pli ca tions. Blood 1993; 81: 2394 8. 20. Cole SPC, Bhardway G, Gerlach JH, Mackie JE, Grant CE, Almquist AJ, et al. Overexpression of a tranporter gene in multidrug-re sis tant hu man lung can cer cell line. Sci ence 1992; 258: 1650 4. 21. Lautier D, Canitrot Y, Deeley RG, Cole SP. Multidrug re sis tance me di - ated by the multidrug re sis tance pro - tein (MRP) gene. Biochem Pharmacol 1996; 52: 967 77. 22. Paul S, Breuninger LM, Tew KD, Shen H, Kruh GD. ATP-de pend ent up - take of nat u ral prod uct cytotoxic drugs by mem brane ves i cles es tab lishes MRP as a broad spec i fic ity trans porter. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 6929 34. 23. Hart SM, Ganeshaguru K, Hoffbrand AV, Prentice HG, Mehta AB. Ex pres sion of the multidrug resitanceassociated protein (mrp) in acute leukemia. Leu ke mia 1999; 48: 2163 8. 24. Schnei der E, Cow an KH, Bader H, Toomey S, Schwartz GN, Karp JE, et al. In creased ex pres sion of the multi - drug re sis tance-as so ci ated pro tein gene in re lapsed leu ke mia. Blood 1995; 85: 186 90. 25. Slapak CA, Mizunuma N, Kufa DW. Ex pres sion of the multidrug re sis tance as so ci ated pro tein and P-glycoprotein in doxorubicin-se lected hu man myeloid leu ke mia cells. Blood 1994; 84: 3113 21. 26. Schuurhuis GJ, Broxterman HJ, Ossenkoppele GJ. Func tional multi - drug resitance phe no type as so ci ated with com bined overexpression pf Pgp/mdr1 and mrp to gether with 1- -arabinofuranosylcytosine sensitiv - ity may pre dict clin i cal re sponse in acute myeloid leu ke mia. Clin Can cer Res 1995; 1: 81 93. 27. Legrand O, Simonin G, Zittoun R, Maria JP. Com par i son of MDR1, MRP and LRP ex pres sion with in vi tro drug sen si tiv ity in vivo re sponse to treat - ment in fresh blast cells from adult myeloid leu ke mia pa tients [Abstact]. Blood 1997; 90: 180. 28. Van der Kolk DM, De Vries EGE, Koning JA, Van Den Berg E, Müller M, Vellenga E. Ac tiv ity and ex pres sion of the multidrug re sis tance pro tein MRP1 and MRP2 in acute myeloid leu ke mia cells, tu mor cell lines, and nor mal hematopoietic CD34+ pe riph eral blood cells. Clin Can cer Res 1998; 4: 1727 36. 29. Baer MR, Swann VL, Shollo MM, et al. Fre quent co ex is tence of mul ti ple mech - a nisms of multidrug re sis tance in acute myeloid leu ke mia cells. Blood 1997; 90: 181a. 30. Ross DD. Novel mech a nisms of drug re - sis tance in leu ke mia. Leu ke mia 2000; 14: 467 73. 31. Ross DD, Karp JE, Chen TT, Doyle LA. Ex pres sion of breast can cer re sis tance pro tein in blast cells from pa tients with acute leu ke mia. Blood 2000; 96: 3658. 32. Dal ton WS, Scheper RJ. Lung re sis - tance-re lated pro tein: de ter min ing its role in multidrug re sis tance. J Natl Can cer Inst 1991; 91: 1604 5. 33. Filipits M, Pohl G, Stranzl T, Suchomel RW, Scheper RJ, Jager U, et al. Ex pres sion of the lung re sis tance pro tein pre dicts poor out come in de novo acute myeloid leu ke mia. Blood 1998; 91: 1508 13. 34. List AF, Spi er CS, Gro gan TM, Johnson C, Roe DJ, Greer JP, et al. Over expression of a ma jor vault trans - porter pro tein lung re sis tance pro tein pre dicts treat ment out come in acute myeloid leu ke mia. Blood 1996; 87: 2464 9. 35. Gieseler F, Glasmacher A, Kampfe D, Wandt H, Nuessler V, Valsamas S, et al. Topoisomerase II ac tiv i ties in AML blasts and their cor re la tion with cel lu - lar sen si tiv ity to anthracyclines and epipodophyllotoxines. Leu ke mia 1996; 10: 1177 80. 36. Mainwaring M, Lynch J, Reddy V, Rimsza R, Rowe T, Bradshaw K, et al. Topoisomerase II lev els and DNA frag - mentation in leukemia blasts treated with topotecan fol lowed by etoposide + mitoxantrone (T-EM) in a time se quen - tial chemotherapy regimen [Abstract]. Blood 1999; 94 (Suppl 1): 381. 37. Kaufmann SH, Gore SD, Miller CB, Jones RJ, Zwelling LA, Schnei der E, et al. Topoisomerase II and the re sponse to antileukemic ther apy. Leuk Lymph 1998; 29: 217 37. 38. Norgaard JM, Olesen G, Kristensen JS, Pedersen B, Hokland P. Leu ke mia drug resistance and prognostic factors in AML. Eur J Haematol 1999; 63: 219 24. 39. Banker DE, Groudine M, Norwood T, Appelbaum FR. Mea sure ment of spon - taneous and therapeutic agent-induced apoptosis with BCL-2 pro tein ex pres - sion in acute myeloid leu ke mia. Blood 1997; 89: 243 55. 40. Kaspers GJL, Pieters R, Weerman AJP. Drug re sis tance in leu ke mia and lymphoma III (Advances in experimen - tal med i cine and bi ol ogy). 3rd ed. Springer, 1999. 41. Musto P, Cascavilla N, Di RN, Ladogana S, La Sala A, Melillo L, et al. Clin i cal rel e vance of immunocyto - chemical detection of multidrug-associ - ated P-glycoprotein in haematologic ma lig nan cies. Tumori 1990; 76: 353 9. 42. Kaspers GJL, Pieters R, Van Zantwijk CH, et al. In vi tro drug sen si - tiv ity of nor mal pe riph eral blood lym - pho cytes and child hood leu ke mic cells from bone mar row and pe riph eral blood. Br J Can cer 1991; 64: 469 74. 43. Futscher B, Abbaszadegan MR, Somann F, Dal ton WS. Anal y sis of MRP mrna in mitoxantrone-se lected, multi drug-re sis tant hu man tu mor cells. Biochem Pharmacol 1994; 47: 1601 8. 44. Feller N, Kuiper CM, Lankelma J, Ruhdal JK, Scheper RJ, Pinedo HM, Broxterman HJ. Func tional de tec tion of MDR1/P170 and MRP P190-me di - ated multidrug re sis tance in tu mor cells by flow cytometry. Br J Can cer 1995; 72: 543 8. 45. Lamy T, Drenou B, Grulois I, Far del O, Jacquelinet C, Goasguen J, et al. Multi-drug resistant (MDR) activity in acute leu ke mia de ter mined by rhodamine 123 efflux as say. Leu ke mia 1995; 9: 1549 56. 46. Matuzevièienë R. Þmogaus ûminiø ir lë ti niø leukemijø imunofenotipai: di fe - ren cia ci jos þymenø ekspresijos tyrimai: dak ta ro dis.: biomed. mokslai: me di ci - na (07B) / VU. Vilnius, 2003. 90 p. 47. Takeshita A, Shinjo K, Ohnishi K, Ohno R. Ex pres sion of Multidrug-re sis - tance P-glycoprotein in myeloid pro - gen i tor cells of dif fer ent phe no type: com par i son be tween nor mal bone mar - row cells and leu kae mia cells. Br J Haemat 1996; 93: 18 21. 48. Leith CP, Chen IM, Kopecky KJ, Appelbaum FR, Head DR, Godwin JE, et al. Cor re la tion of multidrug re sis - tance (MDR1) pro tein ex pres sion with func tional dye/drug efflux in acute myeloid leu ke mia by multiparameter flow cytometry: iden ti fi ca tion of dis cor - dant MDR-/efflux+ and MDR1+/effluxcases. Blood 1995; 86: 2329 42. 49. Venditti A, Buccisano F, Del Poeta G, Maurillo L, Tamburini A, Cox C, et al. Level of min i mal re sid ual dis ease af ter con sol i da tion ther apy pre dicts out come in acute myeloid leu ke mia. Blood 2000; 96: 3948 52. 50. San Miguel JF, Mar ti nez A, Macedo A, Vidriales MB, Lopez Berges C, Gon za - lez M, et al. Immunophenotyping In - ves ti ga tion of min i mal re sid ual dis ease is a use ful ap proach for pre dict ing re - lapse in acute myeloid leu ke mia pa - tients. Blood 1997; 90: 2465 70. 74 LABORATORINË MEDICINA 2011, t. 13, Nr. 2(50)